Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Староверов, Сергей Александрович

• Староверов, Сергей Александрович
• доктор биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации доктор биологических наук Староверов, Сергей Александрович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения об иммунной системе

1.2. Коллоидное золото, его свойства и применение в медицине и биологии

1.3. Самоорганизующиеся системы на основе поверхностно активных веществ, их физико-химические и биологические свойства

1.4. Современные аспекты конструирования лекарственных средств на основе водно-дисперсных структур

1.5. Мицеллярно-гелевые структуры и их применение в ветеринарии и медицине

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты и обсуяздение собственных исследований

3.1. Получение поликлональных антител к ивермектину и его детекция в биологических жидкостях животных 79 3.1.1. Протокол определения ивермектина в плазме крови и молоке крупного рогатого скота

3.2. Получение поликлональных антител к диминазену 98 3.2.1. Протокол определения диминазена в плазме крови методом ВЭЖХ

3.3. Получение поликлональных антител к кленбутеролу

3.4. Изучение взаимодействия конъюгатов гаптен-коллоидное золото с клетками ретикулоэндотелиальной системы

3.5. Коллоидное золото как носитель высокомолекулярных антигенов при иммунизации

3.6. Мицеллярные системы на основе неионогенных поверхностно-активных веществ и их применение в конструировании лекарств

3.7. Разработка инъекционной лекарственной формы на основе диминазена и изучение ее фармакологических свойств

3.7.1. Конструирование инъекционной лекарственной формы на основе диминазена

3.7.2. Оценка эффективности новой лекарственной формы диминазена при бабезиозе крупного рогатого скота

3.7.3. Определение терапевтической дозы препарата при бабезиозах крупного рогатого скота

3.7.3.1. Титрация доз мицеллярного диминазена при бабезиозе крупного рогатого скота, вызванном В. bigemina

3.7.3.2. Титрация доз мицеллярного диминазена при бабезиозе крупного рогатого скота, вызванном В. divergens

3.7.4. Состав и физико-химические свойства Неозидина M

3.7.5. Изучение стабильности Неозидина M и рекомендации по установлению срока годности и условий хранения

3.7.6. Фармакотоксикологические свойства препарата на основе диминазена

3.7.6.1. Определение острой токсичности Неозидина M

3.7.6.1.1. Изучение острой токсичности на лабораторных животных

3.7.6.1.2. Изучение переносимости на целевых животных (влияние на организм)

3.7.6.2. Хроническая токсичность Неозидина M

3.7.6.3. Изучение местно-раздражающего действия Неозидина M

3.7.6.4. Изучение аллергизирующего действия Неозидина M

3.7.6.5. Изучение иммунотоксичности Неозидина M

3.7.7. Изучение фармакокинетических параметров препарата Неозидин M

3.7.7.1. Изучение фармакокинетики Неозидина на целевых животных

3.7.7.2. Определение остатков диминазена в молоке

3.7.8. Результаты широких испытаний антипротозойной эффективности Неозидина M

3.7.8.1. Эффективность Неозидина M при бабезиозах крупного рогатого скота

3.7.8.2. Эффективность Неозидина M при бабезиозах овец

3.7.8.3. Эффективность Неозидина M при бабезиозах лошадей 201 3.8. Разработка ветеринарного препарата наружного применения на основе мицеллярно-гелевой формы ивермектина 203 3.8.1. Подбор и разработка лекарственной формы

3.8.1.1. Влияние концентрации лутрола на вязкость системы лутрол/вода

3.8.1.2. Влияние концентрации кремофора EL на вязкость системы кремофор/вода

3.8.1.3. Влияние концентрации кремофора EL на вязкость системы кремофор/вода/лутрол

3.8.1.4. Влияние концентрации кремофора на реологические свойства системы кремофор/вода/глицерин

3.8.1.5. Совместное влияние лутрола и кремофора на вязкость системы лутрол/кремофор/вода

3.8.1.6. Влияние концентраций глицерина на вязкость гелевых субстратов

3.8.1.7. Влияние органических солей на вязкость гелеобразных систем

3.8.2. Состав и физико-химические свойства препарата «Ивермек-гель»

3.8.3. Изучение фармакологических свойств препарата «Ивермек-гель»

3.8.3.1. Изучение субхронической токсичности

3.8.3.2. Изучение сенсибилизирующих свойств

3.8.3.3. Изучение местно-раздражаюгцего действия

3.8.3.4. Изучение стабильности препарата и рекомендации по установлению срока годности и условий хранения

3.8.3.5. Изучение фармакокинетических свойств препарата «Ивермек-гель»

3.8.3.5.1. Изучение фармакокинетических свойств препарата «Ивермек-гель» на собаках

3.8.3.5.2. Изучение фармакокинетических свойств препарата «Ивермек-гель» на кроликах

3.8.3.5.3. Изучение фармакокинетических свойств препарата «Ивермек-гель» на кошках

3.8.3.6. Определение остаточных количеств ивермектина после применения препарата «Ивермек-гель»

3.8.3.7. Эффективность препарата «Ивермек-гель» при псороптозе кроликов

3.8.3.8. Эффективность препарата «Ивермек-гель» при акарозах собак

3.8.3.9. Эффективность препарата «Ивермек-гель» при акарозах кошек 246 Заключение и выводы 250 Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных»

В последнее время большое внимание исследователей в различных отраслях знаний уделяется оценкам новых возможностей, возникающих в связи с бурным развитием нанотехнологий. В том числе, это касается биохимии и фармакологии, где уникальные свойства наноструктурированных объектов создают весьма благоприятную основу для конструирования новых типов диагностических систем и лекарственных форм.

В литературе отмечается все больше сведений о применении носителей нанометрового диапазона размеров в качестве средств доставки антигенных и лекарственных веществ к иммунокомпетентным клеткам и пораженным органам макроорганизма. Эти результаты позволяют надеяться, что с помощью подобных систем можно значительно снизить токсичность и повысить эффективность действия традиционно используемых лекарственных препаратов. Весьма перспективным, в частности, оказывается применение наночастиц в качестве составных частей потенциальных лекарственных форм для конструирования противоопухолевых, противогрибковых, бактерицидных и антивирусных препаратов. Кроме того, в последнее время активно развиваются исследования, имеющие целью разработку вакцинных препаратов на основе нанометровых носителей и их применению в медицине и ветеринарии (Han et al., 2007).

В качестве корпускулярных носителей для биологически активных веществ используются такие структуры, как фуллерены и дендримеры, липосомы, полиакрилатные частицы, мицеллы, коллоидное золото (КЗ) и др. Известно, в частности, что инъекционное введение лабораторным животным КЗ может приводить к его накоплению в ретикулярных клетках лимфоидной ткани, активации клеточного и гуморального иммунного ответа (Дыкман и др., 2004; Дыкман, Богатырев, 2007). Кроме того, КЗ применяют как вектор для непосредственного внесения лекарственных веществ в очаги воспаления и в пораженные органы макроорганизма (КаШтшп е! а1., 2007).

Была показана возможность применения КЗ для терапевтического воздействия на злокачественные новообразования (РасюШ, 2004; Е1-8ауес1, 2005). Исследователи наносили на поверхность коллоидной частицы фактор некроза опухолей и вводили полученный конъюгат пораженным опухолями мышам. В итоге было установлено, что комплекс КЗ с фактором некроза менее токсичен и более эффективен в терапевтическом воздействии на опухоль по сравнению с нативным фактором, несмотря на то, что конъюгированный с золотыми наночастицами фактор вводился в организм в меньшей дозе. Однако биодинамика золотых частиц, вводимых в организм, изучена недостаточно. В известных работах авторы отмечают (Е1з1ег, 2004; 1л е1 а1., 2007), что частицы КЗ захватываются гепатоцитами, секретируются желчью и выводятся из организма с каловыми массами.

Конструирование терапевтических препаратов на основе мицелл также нашло широкое применение в современной ветеринарной медицине. Это связано с тем, что данная корпускулярная система позволяет использовать лекарственные субстанции, обладающие ярко выраженными гидрофобными свойствами (Логинова, Полозов, 2003).

Введение активного вещества эту систему в ряде случаев приводит к повышению биодоступности лекарственной формы, что способствует более высокой терапевтической активности и снижению дозировки препарата. Поэтому препараты, сконструированные на данной основе, обладают меньшей токсичностью.

Однако многие вопросы по биодинамике препаратов, сконструированных на основе корпускулярных носителей, остаются открытыми.

Таким образом, приведенное выше краткое резюме результатов проведенного нами анализа литературных данных свидетельствует об актуальности темы данной диссертации. Этот анализ позволяет также 8 констатировать, что ко времени начала наших исследований в этой области наблюдался дефицит сведении по: а) молекулярным и клеточным механизмам иммуномодулирующего действия наночастиц в составе комплексов с широким спектром разнообразных антигенов и примерам их использования для получения in vivo поликлональных антител к низкомолекулярным веществам (гаптенам); б) эффектам взаимодействий коньюгатов КЗ с антигенами (низкомолекулярными и высокомолекулярными) с имунокомпетентными клетками, а также аналогичным данным при использовании в качестве наноструктурированных носителей антигенов мицеллярных структур; в) примерам конструирования препаратов на мицеллярной и мицеллярно-гелевой основе и их применению в ветеринарной медицине.

Целью нашей работы было изучение механизмов взаимодействия высоко- и низкомолекулярных антигенов, ассоциированных с корпускулярными носителями (коллоидное золото и мицеллы), с клетками ретикулоэндотелиальной системы, разработка основ конструирования фармацевтических композиций с применением данных наноструктур и изучение их фармакодинамических свойств.

В соответствии с данной целью, в работе решались следующие основные задачи:

1. С использованием золотых наночастиц в качестве носителя антигенов и адъюванта получить поликлональные антитела против ряда лекарственных веществ (ивермектин, кленбутерол, диминазен) для их детектирования и анализа фармакодинамики в биологических жидкостях животных.

2. Исследовать особенности взаимодействий коньюгатов коллоидного золота с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.

3. Исследовать особенности взаимодействий комплексов мицеллярных структур с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценить эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов.

4. Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярной инъекционной лекарственной формы диминазена с применением неионогенного поверхностно-активного вещества, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.

5. Разработать физико-химические основы получения новой мицеллярно-гелевой формы ивермектина для наружного применения, оценить его фармакологические характеристики и терапевтические свойства.

В ходе реализации этой цели и задач были получены результаты, научная новизна которых заключается в следующем:

- впервые с применением коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта получены поликлональные антитела к низкомолекулярным веществам (ивермектин, диминазен и кленбутерол), использованные для определения и анализа ивермектина и диминазена в биологических жидкостях животных;

- впервые получены экспериментальные результаты, характеризующие взаимодействие низко- и высокомолекулярных веществ, коньюгированных с золотыми наночастицами, либо ассоциированных с мицеллами ПАВ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы, оценены эффекты их проникновения в фагоцитирующие клетки и влияние на дыхательную активность макрофагов;

- разработана новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств;

- сконструирована новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма для наружного применения на основе ивермектина, проведено изучение ее фармакологических и фармакодинамических свойств;

Полученные результаты имеют также определенную практическую значимость. Прежде всего, это касается данных об особенностях взаимодействий комплексов антигенов с использованными наночастицами с иммунокомпетентными клетками, позволяющих судить о возможных механизмах их иммуномодулирующих свойств. Это делает более эффективным решение задач получения iv vivo поликлональных антител к слабоиммуногенным антигенам, а также открывает перспективу разработке вакцин нового поколения. В частности, нами были разработаны и защищены патентами РФ адъювант для вакцин на основе мицеллярных структур и адъювант на основе КЗ. Кроме того, на основе сконструированной и защищенной патентом РФ лекарственной формы разработана фармацевтическая композиция для лечения заболеваний микробной и паразитарной этиологии. На основе данной композиции создано два препарата, прошедшие регистрацию и допущенные к производству как противопаразитарные и антимаститные гели. Был разработан и защищен патентом РФ препарат для лечения заболеваний кровепаразитарной этиологии. Данный инъекционный препарат прошел регистрацию и допущен к производству.

Результаты работы были представлены на Втором саратовском салоне изобретений, инноваций и инвестиций, 2006 г., ряде российских и региональных выставок.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Использование коллоидного золота в качестве носителя антигенов и адъюванта обеспечивает получение in vivo поликлональных антител против лекарственных веществ ивермектина, кленбутерола и диминазена, которые могут быть использованы для определения данных соединений в биологических жидкостях животных.

2. Взаимодействие конъюгатов золотых наночастиц с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии наночастиц золота происходит более интенсивно. При этом само коллоидное золото вызывает повышение дыхательной активности макрофагов.

3. Взаимодействие комплексов мицелл, полученных на основе неионогенных ПАВ, с низко- и высокомолекулярными антигенами с клетками ретикулоэндотелиальной системы приводит к их проникновению в фагоцитирующие клетки и вызывает стимулирование дыхательной активности макрофагов. Накопление низкомолекулярных веществ в фагоцитирующих клетках в присутствии мицеллярных наночастиц происходит более интенсивно. При этом сами неионогенные ПАВ активно проникают через мембраны клеток в цитоплазматическое пространство.

4. Разработанная новая инъекционная мицеллярная лекарственная форма диминазена (Неозидин М) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.

5. Разработанная новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма ивермектина для наружного применения (Ивермек-гель) является стабильной и обладает высокой терапевтической эффективностью.

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ

12

РАН) по планам НИР в рамках следующих бюджетных тем: «Разработка эффективных тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений», научный руководитель темы д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01890017743; «Комплексный иммунохимический анализ антигенных структур, определяющих ассоциативные взаимодействия микроорганизмов с растениями», научный руководитель темы д.х.н. профессор С.Ю. Щеголев, № гос. регистрации 01200606177 и в научно исследовательском отделе ЗАО «Нита-Фарм».

Частично данная работа получила финансовую поддержку РФФИ (гранты №№ 04-04-48224-а; 07-04-00301-а; 07-04-00302-а), МНТЦ (проект № 2426), Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором в сотрудничестве с д.б.н. Дыкманом JI.A. На защиту вынесены только те положения и результаты экспериментов, основная идея и реализация которых принадлежит автору данной диссертации.

В исследованиях также принимали участие сотрудники и аспиранты группы иммунотехнологии лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН Зайцева И.С., Пристенский Д.В., Аксиненко Н.М., Видяшева И.В., а также сотрудники ЗАО «Нита-Фарм» Ермилов Д.Н., Габалов К.П., Василенко O.A., Сазонов A.A., Сынкин С.Ю., Шведова О.В., Сидоркин В.А., Улизко М.А., Жемеричкин Д.А. и Семенов C.B., всем им автор выражает глубокую благодарность

Кроме того, следует отметить вклад в выполнение данной работы д.х.н. профессора С.Ю. Щеголева и д.б.н. снс В.А. Богатырева (ИБФРМ РАН) за участие в обсуждении результатов на всех ее этапах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлялись, докладывались и обсуждались на: Межд. научн. конф. «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», Саранск, Россия, 2001; 6-th, 7-th and 8-th John Humphrey advanced summer programme in immunology, Pushchino, Russia, 2002, 2005, 2007; 1-й per. конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», Саратов, Россия, 2002; 1-м межд. конгр. «Биотехнология - состояние и перспективы развития», Москва, Россия, 2002; VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, Россия, 2002; Всеросс. научн. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», Москва, Россия, 2003, 2004, 2005; VIII межд. конф. «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Саратов, Россия, 2003; Межд. научн.-практ. конф. «Актуальные проблемы инвазионной, инфекционной и незаразной патологии животных», Ставрополь, Россия, 2003; Межд. научн.-практ. конф. «Современные проблемы иммуногенеза, теории и практики борьбы с паразитарными болезнями с/х животных», Уфа, Россия, 2004; Межд. конф. «Основные достижения и перспективы развития паразитологии», Москва, Россия, 2004; X всеросс. научн. конф. «Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов», Саратов, Россия, 2004; V и VI всеросс. конф. молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии», Саратов, Россия, 2005, 2006; 9-й межд. Пущинской школе-конф. молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, Россия, 2005; Всеросс. конф. «Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты», Саратов, Россия, 2005; IX, X, XI and XII Int. school for junior scientists and students on optics, laser physics & biophotonics «Saratov Fall Meeting», Saratov, Russia, 2005, 2006, 2007, 2008; Int. multidiscipl. symp. «From experimental biology to preventive and integrative medicine», Sudak, Crimea, Ukraine, 2005; Межд. научн. конф. «Микробные биотехнологии», Одесса, Украина, 2006; III межрег. конф. молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов, Россия, 2006; Межд. научн.-практ. конф. «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных», Ульяновск, Россия, 2006; Матер, конф., посвященной 119-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, Саратов, Россия, 2006; 15-ой межд. конф. «Высокие технологии в биологии, медицине и геоэкологии», Новороссийск, Россия, 2007; 10-th Analytical Russia-German-Ukrainian Symp., Saratov, Russia, 2007.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 83 печатных работ, в том числе 4 патента и 20 статей, список которых приведен в конце автореферата (включая 18 статей в журналах из списка ВАК, 2 статьи в иностранных рецензируемых журналах).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Староверов, Сергей Александрович

Результаты исследования титров антител гр. Препарат Доза Титры антител Индекс иммуносупрес-сии

1ЕМ общие АТ

1 «Неозидин М» 1 мл/ 20 кг 0.92±0.4 2.4+0.5 3.4±0.3 0.9

2 Контроль — 1.2±0.1 2.9±0.5 4.1±0.3 —

Примечание: разница показателей относительно контроля статистически недостоверна (Р > 0.05).

Таким образом, Неозидин М практически не угнетает Т- и В- клеточное звено иммунитета и обладаем сравнительно мягким иммуносупрессивным действием.

3.7.7. Изучение фармакокинетических параметров препарата

Неозидин М

3.7.7.1. Изучение фармакокинетики на целевых животных

Исследование проводили на телятах черно-пестрой породы (6 голов) подобранных по принципу «аналогов» (вес, питание, содержание). Возраст 3-4 месяца, средний вес - 132+12 кг. Животные были здоровыми (определялась температура тела, пульс, величина зрачка, внешний вид и поведение). Животных разбили на 2-й группы по 3 головы. Первой группе вводили 5% Неозидин М. Второй группе вводили беренил в виде 7% водного раствора. Препараты вводили однократно, внутримышечно в максимальной дозе, согласно инструкциям по применению (1 мл на 20 кг живой массы).

На рис. 49 показана динамика концентрации диминазена в плазме крови телят после введения Неозидина М и беренила. При применении беренила отмечается резкое повышение концентрации (4.3±0.4 мкг/мл) диминазена в плазме крови в течение первых двух часов и его последующее снижение, которое выходит на плато через 72 ч и составляет 0.06±0.01 мкг/мл. После этого концентрация диминазена в плазме медленно снижается, и он обнаруживается вплоть до 192 ч после введения.

При применении Неозидина М постепенное повышение концентрации диминазена до 1.1±0.1 мкг/мл в плазме наблюдалось в течение четырех часов с момента введения. Затем отмечено его постепенное снижение, которое выходит на плато через 72 ч и составляет 0.06±0.01 мкг/мл. После этого концентрация диминазена в плазме медленно снижается, и он обнаруживается вплоть до 192 ч после введения. ig t, ч

Рис. 49. Динамика концентрации диминазена в плазме телят

Более низкая концентрация диминазена в плазме крови после применения Неозидина М объясняется более высокой степенью ее накопления в клетках крови по сравнению с водными растворами аналогов.

3.7.7.2. Определение остатков диминазена в молоке

Чувствительность используемого метода определения диминазена диацетурата в молоке составляет 32 мкг/кг, а предел определения - 16 мкг/кг. Анализ проб молока, полученного от животных после однократной внутримышечной инъекции Неозидина М, показал отсутствие диминазена в молоке в определяемых концентрациях во всех пробах. Полученные данные хорошо согласуются с литературными: Klatt и Schmidt (1991) определяли содержание диминазена в коровьем молоке методом HPLC (предел определения - 50 мкг/кг) через 7.5, 24, 31, 48, 55.5, 72, 240, 360 и 480 ч после обработки. Экскреция диминазена в молоко проверялась на четырех дойных коровах, каждая из которых была обработана одной внутримышечной дозой

3.56 мг/кг). Результаты показали, что концентрация диминазена в молоке всех четырех коров были ниже предела обнаружения во всех временных точках.

ФАО ВОЗ рекомендует следующие значения Максимального остаточного уровня в молоке крупного рогатого скота - MRL - 150 мкг/кг (2006). Рекомендованный максимальный остаточный уровень диминазена в молоке основан на пределе чувствительности аналитического метода.

Таким образом, содержание диминазена в молоке коров после однократной внутримышечной инъекции Неозидина М в дозе 2.5 мг действующего вещества/кг массы тела, ниже предела обнаружения во всех временных точках, и соответственно, ниже значений максимального остаточного уровня (MRL) диминазена для молока, рекомендованного ВОЗ.

На основании полученных результатов молоко от коров, обработанных Неозидином М можно употреблять без ограничений.

3.7.8. Результаты широких испытаний антипротозойной эффективности

Неозидина М

3.7.8.1. Эффективность Неозидина М при бабезиозах крупного рогатого скота

В современной литературе имеется большое количество данных по применению и эффективности препаратов на основе диминазена. Но все эти работы посвящены порошку диминазена, растворяемому в воде перед инъекцией (Mdachi et al., 1995; Jacobson et al., 1996; Tuntasuvan et al., 2003). Однако работа с препаратом диминазена ацетурата связана с рядом трудностей. Во-первых, сам препарат выпускается в больших фасовках и поэтому перед применением приходится готовить навески, что снижает стерильность используемого вещества. Во-вторых, в растворенном виде препарат хранится не более 1-2 дней при +4°С, что повышает стоимость лечения. Поэтому при проведении широких производственных испытаний мы стали акцентировать внимание на эффективности и безопасности разработанного нами препарата.

В связи с тем, что в экспериментах по титрации терапевтических доз Неозидина М было установлено, что при двух наиболее распространенных бабезиозах крупного рогатого скота, вызываемым В. bigemina и В. divergens, терапевтической дозой сконструированной нами новой лекарственной формы диминазена является доза 2.5 мг д.в./кг массы тела животного, и с целью снижения себестоимости лекарственного средства в дальнейшем широкие испытания пироплазмицидной эффективности проводили только с 5% вариантом препарата. Новую лекарственную форму диминазена всем животным водили в дозе 1 мл на 20 кг массы тела или 2.5 мг/кг по диминазену (активно действующему веществу).

Работу по изучению эффективности препарата при бабезиозах крупного рогатого скота проводили в разных регионах России в следующие сроки:

- при бабезиозе, вызванном В. bovis - в условиях Новгородской и Псковской областей летом 2003 и 2004 гг.;

- при бабезиозе, вызванном В. bigemina - в условиях Ставропольского и Краснодарского краев в период осенней 2003 г. (август-октябрь), весенней 2004 г. (апрель-май) и весенней 2005 г. (апрель-май) вспышек инвазии;

- бабезиозе, вызванном В.divergens — в условиях Ставропольского края в период весенней и летней 2004 г. (апрель-июль) и весенней 2005 г (апрель-май) вспышек заболевания.

Всего в процессе работы было задействовано 754 головы крупного рогатого скота разных половозрастных групп (быки-производители, коровы, молодняк старше года) и пород (черно-пестрая, симментальская, красно-пестрая, калмыцкая, айрширская, герефорд), спонтанно инвазированных бабезиозом в различной степени интенсивности. В результате проведенных исследований установлена 97-100% эффективность однократного применения 5% лекарственной формы мицеллярного Неозидина М при всех бабезиозах крупного рогатого скота (табл. 46).

Заключение и выводы

На протяжении последних лет биология и медицина существенно обогатились рядом новых достижений, связанных с применением наноматериалов. Однако многие вопросы данного направления до сих пор являются недостаточно поработанными. Так, при ярко выраженных плюсах применения наноносителей, конъюгированных с различными веществами, остается во многом открытым вопрос о механизмах взаимодействия данных комплексов с различными функциональными системами организма.

В данной работе мы рассмотрели ряд проблем, связанных с конструированием терапевтических средств на основе корпускулярных носителей и изучением их взаимодействий с иммунокомпетентными клетками для их использования в терапевтических и профилактических целях. Мы полагаем также, что эти данные могут способствовать развитию представлений о молекулярных и клеточных механизмах иммуномодулирующего действия наночастиц в составе их комплексов с антигенами.

В том числе было проведено изучение взаимодействия низкомолекулярных веществ, ассоциированных с коллоидным золотом, с клетками ретикулоэндотелиальной системы. Было установлено, что иммунизация лабораторных животных данными комплексами приводит к образованию поликлональных антител на низкомолекулярные вещества (ивермектин, диминазен и кленбутерол). При изучении взаимодействия комплексов низкомолекулярных веществ и коллоидного золота с перитонеальными клетками нам удалось определить локализацию данных веществ в цитоплазматическом пространстве, а так же установить роль коллоидного золота в более интенсивном накопление низкомолекулярных веществ в клетках.

С помощью метода иммунозолотого дот-анализа и полученных нами поликлональных антител мы исследовали биодинамику низкомолекулярных веществ (диминазена и ивермектина) в биологических жидкостях животных, и провели сравнение данного метода с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Последнее показало сопоставимость чувствительности определения антигенов обоими методами при существенно большей простоте иммуноанализа.

Проведенное нами изучение взаимодействия высокомолекулярных веществ, ассоциированных с КЗ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы показало, что данный антиген проникает в перитонеальные клетки животных и повышает их митохондриальное дыхание. Введение самого КЗ в популяцию перитонеальных клеток также приводило к повышению их ферментативной активности. Получив эти результаты, мы предположили, что золото обладает адъювантными свойствами. Для подтверждения этого предположения были проведены эксперименты с введением данного препарата в организм лабораторных животных. В ходе этих исследований мы установили, что комплекс КЗ с антигеном не только усиливает активность фагоцитирующих клеток, но и повышает титр антител к вводимому антигену, что косвенно может указывать на стимуляцию КЗ клеток лимфоидного ряда.

Аналогичные результаты мы получили и при использовании в качестве корпускулярных носителей мицелл, полученных при помощи неионогенных поверхностно активных веществ. В этой части работы мы исходили из того, что внесение в данную систему высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ должно обеспечивать получение препаратов, обладающих более высокой терапевтической эффективностью за счет повышения биодоступности активного вещества.

Мы установили, что поверхностно активные вещества проникают через мембрану перитонеальных клеток и накапливаются в их цитоплазме. При этом активные вещества вместе с мицеллообразующим агентом также проникают и накапливаются во внутриклеточном пространстве.

Кроме низкомолекулярных веществ, мы рассмотрели и действие высокомолекулярных соединений, заключенных в мицеллы. Установлено, что введение высокомолекулярного вещества в организм лабораторного животного повышает активность как неспецифических, так и специфических факторов иммунитета. Что может указывать на адъювантные свойства данного комплекса.

В качестве одного из низкомолекулярных активных веществ нами использовался диминазен. Это соединение (относящееся к группе ароматических диамидинов) известно как один из самых распространенных препаратов, применяемых в ветеринарии для борьбы с кровопаразитарными заболеваниями. Было показано, что разработанная нами новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена (Неозидин М) обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с исходной формой, что позволило нам снизить дозу применяемого препарата и тем самым уменьшить его токсичность.

На завершающем этапе нашей работы было установлено, что внесение мицеллярной системы в лутрольную основу может привести к формированию геля, содержащего в качестве активного вещества ивермектин и обладающего уникальными свойствами. Препарат, приготовленный на этой основе, показал хорошие терапевтические свойства при лечении ряда паразитарных заболеваний.

Полученные в настоящей работе результаты были нацелены как на пополнение фундаментальных знаний в областях биохимии и фармакологии, так и на их практическое использование. В этой связи отметим, что в настоящее время в нашей стране выпускается большое количество различных ветеринарных препаратов. Но в большинстве своем - это аналоги зарубежных разработок. Поэтому предложенные нами новые лекарственные формы на основе наноструктур можно рассматривать как развитие эффективных подходов к улучшению свойств уже имеющихся биологически активных I I веществ. Мы выражаем надежду, что это может послужить стимулом к разработке целой группы новых сравнительно недорогих лекарственных препаратов в ветеринарной медицине.

Исходя из результатов работы, можно сформулировать следующие выводы:

1. Установлено, что иммунизация лабораторных животных коньюгатами ивермектина, диминазена и кленбутерола с золотыми наночастицамиприводит к образованию поликлональных антител на данные низкомолекулярные вещества, обеспечивающих их применение для определения ивермектина и диминазена в биологических жидкостях животных с чувствительностью, сопоставимой с результатами метода ВЭЖХ.

2. Показано, что при взаимодействии с перитонеальными клетками коньюгатов низкомолекулярных веществ с золотыми наночастицами данные вещества локализуются в цитоплазматическом пространстве. При этом в присутствии коллоидного золота накопление низкомолекулярных веществ в клетках происходит более интенсивно.

3. Обнаружено, что при взаимодействии с клетками ретикулоэндотелиальной системы высокомолекулярных веществ, конъюгированных с золотыми наночастицами, данные антигены проникают в перитонеальные клетки и усиливают их митохондриальное дыхание. При этом введение самого коллоидного золота в популяцию перитонеальных клеток также приводит к повышению их ферментативной, активности. Введение комплекса наночастиц золота с антигеном в организм подопытного животного не только повышает активность фагоцитирующих клеток, но и увеличивает титр антител, полученных к вводимому антигену.

4. При использовании в качестве корпускулярных носителей низко- и высокомолекулярных антигенов мицелл, полученных с использованием неионогенных ПАВ, отмечено проникновение антигенов через мембрану перитонеальных клеток и накопление в цитоплазме.

5. При введении мицеллярного комплекса высокомолекулярного вещества в организм лабораторного животного установлено повышение активности как неспецифических, так и специфических факторов иммунитета, что указывает на адъювантные свойства также и данного комплекса.

6. Разработана новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена (Неозидин М). Установлено, что она является стабильной и обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с исходной лекарственной формой, что позволяет снизить дозу применяемого препарата и уменьшить его токсичность.

7. Сконструирована новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма для наружного применения на основе ивермектина (Ивермек-гель), оказавшаяся стабильной и обладающей высокой терапевтической эффективностью. Приготовленный на ее основе препарат показал хорошие терапевтические свойства при лечении ряда паразитарных заболеваний.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Староверов, Сергей Александрович, 2009 год

1. аАбдель Х.Г., Будовский А.Н. Влияние поверхностно-активных веществ гидрофильного и липофильного характера на коэффициент распределения аминазина и пропазина из жидкой лекарственной формы // Тр. ВНИИфармации. 1979. - Т. 17. - С. 87-95.

2. Абдель Х.Г., Будовский А.Н. Влияние поверхностно-активных веществ на физико-химические и резорбционные свойства ланоля // Тр. ВНИИфармации. 1979. - Т. 17. - С. 95-107.

3. Абрамов В.Е. Теоретические обоснования создания новых препаративных форм альбендазола и клозалбена для борьбы с эндо- и эктопаразитами с/х животных // Автор, дис. док. вет. наук. -М. 2000. 55 с.

4. Авакян О.М. Фармакологическая регуляция функции адренорецепторов. М.: Медицина, 1988. - 256 с.

5. Альберт А. Избирательная токсичность. Т. 2. - М.: Медицина, 1989. - 400 с.

6. Барбер X.P.K. Иммунобиология для практических врачей. М.: Медицина, 1980. - 355 с.

7. Безуглов С.Г., Колокольцев A.A. Химико-фармацевтическое производство за рубежом: Экспресс-информация. 1995. - № 1. -С. 33.

8. Беллман Г., Клаус-Херц Г., Реймер Х.К. Стерильный капельножидкий офтальмологический гель-препарат и способ его производства // Патент ЕР 96/00697. 1996.

9. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах. М: Наука, 1985. -41 с.

10. Березкина C.B. Микрокапсулированный нафтамон при трихострангилидозах овец // Матер. научн. конф. "Профилактика гельминтозов с/х животных в зонах отгонного животноводства и мелиорации земель". 1986. - С. 23-24.

11. Березкина C.B., Ашетов И.К., Мустафин А.И. Новая лекарственная форма нафтамона, нафтамон микрокапсулированный при стронгилятозах овец // Павлодарский ЦНТИ. Информ. листок № 69-86. 1996. - С. 4.

12. Березкина C.B., Головкина Л.П. Противопаразитарные препараты на основе аверсектина С // Ветинформ. 1998. - № 1. -С. 4.

13. Березкина C.B., Головкина Л.П., Дриняева В.А., Юркив В.А., Волокова Г.Н. Природные авермектины для лечения экто- и эндопаразитов животных // Матер, конф. «Систематика, таксономия и фауна паразитов», М.: Медицина, 1984. - С. 138139.

14. Богданова Л.А., Гончар A.M., Грачева С.Ф., Надолинная И.Г., Троицкий A.B. Гель для кожи рук // Патент РФ 93001110. -1995.

15. Болдырева A.A., Кульберг А.Я. Биохимия мембран. Рецепторы клеточных мембран. М.: Высшая школа, 1987. - 103 с.

16. Брондз Б.Д. Т-лимфоциты и их рецепторы в иммунологическом использовании. М.: Наука, 1987.-471 с.

17. Вайнштейн Э.Ф. Деление гомологического ряда химических соединений на низкомолекулярные, олигомерные и полимерные // Росс. Хим. Журн. 2001. - T. XLV. - С. 79-87.

18. Георгиевский В.П. Технология и стандартизация лекарств. -Харьков: Рирег, 1996. 783 с.

19. Головкина Л.П., Березкина C.B. Противопаразитарная мазь «Авермектиновая» // Патент РФ 2124895. 1999.

20. Дейл М.М., Формен Дж.К. Руководство по иммунофармакологии. М.: Медицина, 1998. - 332 с.

21. Демидов Н.В. Антигельминтики в ветеринарии. М.: Колос, 1982. - С. 349-350.

22. Диденко П.П. Лекарственные формы антигельминтиков // Тр. ВИГИС. 1996. - Т. 32. - С. 37-48.

23. Дранов А.Л., Дудниченко A.C., Мезин И.А., Мензелеев Р.Ф., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Эффективность липосомальных форм цитостатиков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1996. - № 1. - С. 8589.

24. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Коллоидное золото в твердофазных методах анализа // Биохимия. 1997. - Т. 62. - С. 411-418.

25. Дыкман Л.А., Богатырев В.А. Наночастицы золота: получение, функционализация, использование в биохимии и иммунохимии // Успехи химии. 2007. - Т. 76. - С. 199-213.

26. Дыкман Л.А., Богатырев В.А., Щёголев С.Ю., Хлебцов Н.Г. Золотые наночастицы: синтез, свойства, биомедицинское применение. М: Наука, 2008. - 319 с.

27. Дыкман Л.А., Сумарока М.В., Староверов С.А., Зайцева И.С., Богатырев В.А. Иммуногенные свойства коллоидного золота // Известия АН, Сер. биол. 2004. - Т. 31. - С. 86-91.

28. Захарова Л.Я., Миргородская Ф.Б., Жильцова Е.П. Катализ реакций нуклеофильного замещения в супрамолекулярных системах // Изв. Акад. Наук Сер. Хим. 2004. - № 7. - С. 13311347.

29. Йегера Л. Клиническая иммунология и аллергология. М.: Медицина, 1990. - 528 с.

30. Каплун А.П., Ле Банг Шон, Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Липосомы и другие наночастицы как средства доставки лекарственных веществ // Вопросы медицинской химии. 1999. - № 1.-С. 1-11.

31. Карпищенко А.И. Медицинские лабораторные технологии. -Санкт Петербург: Интермедика, 2002. 600 с.

32. Катцунг Б.Г. Базисная и клиническая фармакология. Т. 1. -М.,-СПб.: Бином-Невский Диалект, 1998. - 611 с.

33. Кирш Ю.Э. Поли-Ы-винилпирролидон и другие поли-№-виниламиды. М.: Наука. 1998, - 252 с.

34. Корякова А.Г., Кулакова Н.В.Добелев С.С., Невзорова В.А., Гельцер Б.И., Лукьянова П.А. Биохимическая оценка эффективности липосомальных форм фенотерола прибронхопневмонии у крыс // Хим.-Фарм. Журн. 2000. - Т. 34. -С.3-5.

35. Котрикадзе Н.Г., Ломсадзе Б.А., Царидзе М.А. Регуляция каталитических свойств ферментов в «обращенных мицеллах» // Биофизика. 1999. - Т. 44. - С. 231-235.

36. Коэн А.Р. Свое, чужое и аутоиммунитет // В мире науки. 1988. -№ 6. - С. 14-23.

37. Краснопольский Ю.М., Гольбец И.И., Сенников Г.А. Молекулярно-биологические проблемы создания лекарственных средств и изучение механизмов их действия // Хим.-Фарм. Журн. 1981. -№ 7. - С. 13-23.

38. Кузник Б.И., Максимова О.Г. Общая гематология. Ростов-на-Дону: Феникс, 2007. - 575 с.

39. Левашов A.B., Клячко Н.Л. Мицеллярная энзимология: методы и техника // Изв. Акад. Наук. Сер. Хим. 2001. - № 10. - С. 16381651.

40. Лефковитс И., Пернис Б. Методы исследований в иммунологии. М.: Мир, 1981.-486 с.

41. Лисуков И. А. Иммунокомпрометированный пациент (нозокомиальные инфекции в гематологической практике). -Новосибирск: Наука, 2005. 180 с.

42. Логинова Н.В., Полозов Г.И. Ведение в фармацевтическую химию. -Минск: БГУ, 2003. 250 с.

43. Лопатин П.В., Сафонов В.П., Литвинова Т.П. Использование неводных растворителей для приготовления инъекционных растворов // Хим.-Фарм. Журн. 1972. - № 11. - С. 36-47.

44. Лоуренс Д.Р., Беннетт П.Н., Браун М.Дж. Клиническаяфармакология. М.: Медицина, 2002. - 680 с.47.