Конструирование, биотехнологические характеристики и клинико-морфологическое обоснование терапевтической эффективности иммуномодулятора "Иммуно-Safe" тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Исаева, Анна Юрьевна

• Исаева, Анна Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Исаева, Анна Юрьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

Глава 1.Обзор литературы

1.1. Современные аспекты конструирования лекарственных средств

1.1.1. Конструирование лекарственных средств на основе корпускулярных носителей

1.1.2. Липосомы и препараты, сконструированные на их основе

1.1.3. Наночастицы и их использование в современной фармации

1.1.4. Наноносители на основе коллоидных неорганических систем

1.2. Цели и задачи иммунотерапии

1.2.1. Требования к иммунотропным веществам и их классификация

1.2.2. Обзор наиболее распространённых в РФ ветеринарных имму-нотропных веществ, их преимущества и недостатки

1.2.3. Преимущества предлагаемого иммуномодулятора «Иммуно-

8а£е»

Глава 2. Собственные исследования

2.1. Объекты и методы исследований

2.2. Результаты исследований и их обсуждение

2.2.1. Обоснование выбора компонентов и технологическая схема приготовления иммуномодулятора «Иммyнo-Safe»

2.2.1.1. Технология выделения комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока

2.2.2. Изучение влияния компонентов комплекса КБСМ на иммунную систему лабораторных животных

2.2.3. Конструирование иммуномодулятора «Иммуно-8а£е» на основе коллоидного селена с комплексом кислотоустойчивых белков сыворотки молока

2.2.4. Физико-химическая и биологическая характеристика иммуномодулятора «Иммyнo-Safe»

2.2.4.1. Изучение биодоступности иммуномодулятора «Имму-но-8а5е»

2.2.4.2. Изучение биодинамических параметров иммуномодулятора «Иммуно-БаГе»

2.2.5. Фармако-токсикологические свойства иммуномодулятора «Иммуно-8а£е»

2.2.5.1. Изучение аллергенной и местно-раздражающей реакции иммуномодулятора «Иммyнo-Safe»

2.2.5.2. Изучение острой токсичности иммуномодулятора «Иммyнo-Safe»

2.2.5.3. Изучение хронической токсичности иммуномодулятора «Иммyнo-Safe»

2.2.6. Клинико-морфологическое обоснование безопасности применения и терапевтической эффективности иммуномодулятора «Иммyнo-Safe»

2.2.6.1. Влияние иммуномодулятора «Иммуно-8а£е» на клеточный и неспецифический факторы иммунитета лабораторных животных

2.2.6.2. Влияние иммуномодулятора «Иммуно-8а£е» на гематологические и биохимические показатели у лабораторных животных

2.2.6.3. Терапевтическая эффективность иммуномодулятора «Иммуно-8а£е» при лечении некоторых гастроэнтерологических заболеваний собак

2.2.6.4. Влияние иммуномодулятора «Иммуно-8а£е» на состояние морфологических структур внутренних органов лабораторных животных

Заключение

Выводы

Практические предложения

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование, биотехнологические характеристики и клинико-морфологическое обоснование терапевтической эффективности иммуномодулятора "Иммуно-Safe"»

Введение

Актуальность темы. Биофармацевтическая промышленность является одной из важнейших отраслей биотехнологии, однако многие методы лечения и способы приготовления лекарственных форм значительно устарели и требуют существенной модернизации. К сожалению, большинство традиционных лекарственных форм имеют ряд существенных недостатков, таких как: ненаправленное действие лекарственного вещества, т.е. взаимодействие с нецелевыми биообъектами (что приводит к побочным эффектам), сложности в поддержании оптимальной терапевтической концентрации и как следствие - повышенный расход лекарственных веществ, недостаточная биосовместимость, нежелательные физиологические эффекты и др.

Соответственно, значительное количество традиционных лекарственных форм уже не отвечают современным жёстким требованиям, а их производство и применение в значительной степени тормозит развитие ветеринарной медицины, а также фармацевтической науки и индустрии.

Таким образом, одной из важнейших проблем в фармацевтической отрасли остается адресная доставка лекарственных веществ с целью повышения эффективности лечения и снижения себестоимости препаратов.

При этом необходимо решить две взаимосвязанные задачи - сначала адресно доставить препарат на носителе, а затем отделить препарат от носителя. Также сложность данных задач заключается в том, что, в ряде случаев, носители оказывают раздражающее действие на иммунную систему (все носители хорошо распознаются и захватываются иммунной системой при введении в организм, а выведение частиц из организма происходит в течение достаточно длительного времени. Миграция оставшихся структур в малых количествах по организму приводит к дестабилизации иммунной системы и, в дальнейшем, к аллергическим и аутоиммунным заболеваниям.

Поскольку в доступной нам литературе представлены несколько разрозненные, а зачастую и противоречивые представления о методах адресной доставки лекарственных веществ, то тематика данной работы является весьма актуальной.

Цель работы - поиск безопасного переносчика биологически активных веществ к органам мишеням и клеткам, сконструировать на его основе эффективный иммуномодулирующий препарат, и изучить его основные биологические, фармако-токсикологические, морфодинамические и терапевтические свойства.

Для достижения намеченной цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Разработать технологию синтеза коллоидного селена, используемого в качестве переносчика биологически активных веществ.

2. Разработать технологию приготовления и оптимизировать состав иммуномодулирующего лекарственного препарата «Иммуно-8а£е», созданного путём конъюгирования комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин) и коллоидного селена, используемого в качестве наноразмерного носителя.

3. Изучить основные биологические и фармако-токсикологические свойства препарата «Иммyнo-Safe», а так же на лабораторных моделях изучить его влияние на неспецифические факторы иммунитета.

4. Изучить морфодинамические параметры распределения препарата «Иммyнo-Safe» в органах и тканях животных при различных способах введения.

5. На основании клинических, гематологических, биохимических и морфологических исследований подтвердить безопасность применения и иммуностимулирующую эффективность препарата «Иммyнo-Safe».

Научная новизна.

Разработана технология синтеза коллоидного селена, используехмого в качестве наноразмерного носителя, изучены его физико-химические и биологические свойства. Отработана технология выделения комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин) и на лабораторных моделях изучено влияние полученной субстанции на неспецифические факторы иммунитета.

Сконструирован принципиально новый ветеринарный иммуномодулирую-щий лекарственный препарат «Иммуно-8а£е», созданный на основе наноразмер-ных частиц коллоидного селена, используемых в качестве наноплатформы для адресной доставки биологически активных веществ к иммунокомпетентным органам. Экспериментально подтверждена доставка во внутриклеточное пространство биологически активных веществ, конъюгированных на наноносителе.

Установлены основные фармако-токсикологические свойства иммуномоду-лирующего препарата «Иммyнo-Safe», подтверждённые патоморфологическими и морфо-биохимическими исследованиями. При этом установлено отсутствие токсических, аллергизирующих и местно-раздражающих свойств. Изучены основные морфодинамические параметры распределения препарата в органах при различных способах введения. РЬучено влияние препарата на биохимические и гематологические показатели, а также на морфофункциональное состояние внутренних органов животных.

Практическая значимость.

Разработан эффективный и безопасный способ доставки биологически активных веществ во внутриклеточное пространство.

Производству предложена технология синтеза коллоидного селена. На лабораторных моделях изучено влияние коллоидного селена и комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (КБСМ) на неспецифические факторы иммунитета.

Ветеринарной медицине предложен новый иммуномодулирующий лекарственный препарат «Иммуно-БаГе», созданный на основе наноразмерного носителя. На производство и применение препарата разработан проект нормативной документации (технические условия и инструкция по применению). Установлены основные фармако - токсикологические свойства и морфодинамические характеристики препарата «Иммyнo-Safe». Клинически и морфологически обоснована безопасность применения сконструированного препарата «Иммуно-ЗаАе».

По материалам диссертационной работы опубликованы методические рекомендации «Конструирование новых лекарственных препаратов на основе коллоидного селена, используемого в качестве наноразмерного носителя» (в соавторстве с A.A. Волковым, A.C. Староверовым) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников (2012 г.). Материалы исследований используются в учебном процессе и научной работе ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ФГБОУ ВПО «Донской ГАУ», УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» (Республика Беларусь).

Работа выполнена на кафедре терапия, акушерство и фармакология ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской работы: «Проведение исследований механизма взаимодействия нанокомпозиций на основе коллоидных металлов и полимерных производных с иммунной и метаболической системой животных» (№ гос. регистрации 01201280016, научный руководитель темы, заведующий лабораторией д.б.н. Староверов С. А.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основе коллоидного селена, используемого в качестве наноразмерного носителя и биологически активного вещества (комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока) сконструирован иммуномодулирующий препарат «Иммуно-Safe». Разработаны технологические параметры его изготовления.

2. Разработанный иммуномодулирующий препарат «Иммуно-Safe» не обладает местно-раздражающим, кумулятивным и токсическим действием.

3. При изучении биодинамических параметров распределения иммуномоду-лятора «Иммуно-Safe» в органах животных, выявлено явление тропизма препарата к иммунокомпетентным органам, что подтверждает возможность его применения в качестве иммуномодулирующего средства.

4. Клинические, гематологические, биохимические и морфологические исследования свидетельствуют о безопасности применения и терапевтической эффективности иммуномодулятора «Иммуно-8аГе».

Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на: Международной научно - практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, обмен опытом и перспективы развития» (Саратов, 2012), Международной научно-практической конференции «Новые и возвращающиеся болезни животных заразной и незаразной этиологии» (Витебск, 2012), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии» посвящённой 100-летию «СГАУ им. Н.И. Вавилова» (Саратов, 2013).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа изложена на 136 страницах компьютерного текста, содержит 38 таблиц, иллюстрирована 52 рисунками и диаграммами. Список литературы включает в себя 169 источников.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Исаева, Анна Юрьевна

120 Выводы

1. Разработана технология синтеза позволяющая создавать коллоидный раствор, содержащий частицы селена размером от 60 до 100 нм, несущих на своей поверхности кислотоустойчивые белки сыворотки молока.

2. Установлено, что полученная субстанция комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин) оказывает стимулирующее действие на неспецифические факторы иммунитета, что выражается в повышении активности фагоцитоза и усилении митохондриального дыхания перитонеальных макрофагов.

3. Доказано свойство коллоидных частиц селена проникать во внутриклеточное пространство и свободно переносить конъюгированные на их поверхности биологически активные вещества.

4. Установлено, что препарат «Иммуно-БаГе» обладает тропизмом к имму-нокомпетентным органам, в частности к селезенке, что указывает на лимфоген-ный путь распространения препарата по организму.

5. Определён класс опасности препарата «Иммуно-БаЯе»: IV класс опасности - малоопасные вещества (ГОСТ 12.1.007-76).

6. Изучено стимулирующее влияние на клеточный и неспецифический факторы иммунитета животных препарата «Иммуно-За!^».

7. Повышение пролиферативной активности клеток селезенки крысы указывает на возможность использования наночастиц коллоидного селена в качестве носителя для конструирования вакцинных препаратов.

Практические предложения

1. Коллоидный селен, выполняющий функцию наноразмерного носителя, является перспективным материалом для разработки новых лекарственных средств, а так же для наномодификации уже имеющихся лекарственных препаратов.

2. Учитывая тропизм к иммунокомпетентным органам, представляется возможным создание при помощи наноразмерного неорганического селена химических вакцин.

3. Результаты исследований, изложенные в диссертации, рекомендуются для использования в учебном процессе на ветеринарных, зооинженерных и биологических факультетах, при написании учебных пособий и монографий, а также при про-ведении научно-исследовательских работ по изучению биологически активных веществ и их влияния на организм животных. Результаты исследований могут быть включены в программу повышения квалификации зооветеринарных специалистов.

Заключение

Биотехнология относится к числу трех основных приоритетных направлений развития современной мировой экономики. Развитие сельскохозяйственной биотехнологии отмечено в числе основных трендов развития биотехнологии в Комплексной программе развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года, утвержденной 24 апреля 2012 года № 1853п-П8.

Мировой рынок фармацевтической нанопродукции формируется очень быстрыми темпами. Мировой объем продаж лекарств с модифицированной (адресной) системой доставки в настоящее время составляет 20% от общего объема рынка общепринятых фармацевтических препаратов. Вступление России в ВТО неизбежно приведет к развитию данного сегмента рынка и активизации исследований в этом направлении.

Одним из приоритетных направлений в современной биологии (в т.ч. биофармакологии), в гуманной и ветеринарной медицине является разработка эффективных и безопасных переносчиков, обеспечивающих адресную внутриклеточную доставку лекарственных веществ и биологически активных молекул (пептиды, белки, ДНК, и т.д.). Сущность перспективных технологий данного проекта представляет собой разработку эффективного средства доставки лекарственных веществ и антигенов во внутреннее пространство клеток и поражённых тканей при использовании нанометровых структур на основе коллоидных металлов и мицелл. Неорганические наночастицы показывают низкую токсичность и перспективны как средства управляемой доставки к органам-мишеням. Коллоидные частицы имеют некоторое преимущество перед другими наночастицами, благодаря своему мелкому размеру, большой свободной поверхности, низкой токсичности, клеточной пенетрабельности и возможности поверхностной модификации.

В качестве данной наноплатформы, нами предлагается использовать неорганические частицы, на основе коллоидного селена. Использование этого природного метаболита в качестве носителя для активных веществ и антигенов представляет инновационный подход в решении описанных выше проблем.

Коллоидный селен, как платформа для доставки биоактивных молекул, имеет определенное преимущество перед другими носителями, связанное с тем, что элемент является частью метаболической цепочки организма и, за счет чего, способен усваиваться во внутриклеточном пространстве. Тем самым решается вопрос нежелательных последствий, связанных с «утилизацией» организмом самого наноносителя. Таким образом, коллоидный селен в наноразмерном состоянии является перспективным материалом для приготовления эффективных фармакологических препаратов, позволяющих произвести адресную доставку лекарственного вещества непосредственно в клетки опухоли, поскольку обладает универсальными свойствами, подходящими для данной задачи.

Наноплатформа с активным веществом попадает из места инъекции к клеткам-мишеням лимфогенным и гематогенным путем. По своей структуре частица представляет собой многослойную конструкцию, которая постепенно биодегра-дирует во внутриклеточном пространстве мишени и высвобождает активные вещества.

В качестве биологически активного компонента нами использовались различные вещества, но особый эффект был получен при конъюгировании комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока.

Выделение комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока проводили по следующей технологии: из сыворотки коровьего молока проводят извлечение белка путем осаждения его сернокислым аммонием (70% насыщения). Осадок, содержащий белки, растворяли дистиллированной водой до получения белковой взвеси, которую подвергают диализу при помощи диализных мембран с диаметром пор 12000 - 14000 Да с целью удаления веществ с молекулярной массой менее 12000 Да. По окончании диализа получают водный раствор, содержащий смесь трех белков: лактоферин - 75000 - 80000 Да, лактоальбумин - 18000 Да, лактоглобулин - 67000 Да.

Для освобождения молекул комплекса КБСМ от железа проводили диализ белкового препарата, содержащего смесь трех белков (лактоферин, лактоальбумин, лактоглобулин) в ацетатном буфере рН 4,0. Затем для нейтрализации рН раствор диализуют в 0,89 % растворе NaCl (физиологический раствор). Определение концентрации общего белка проводится Биуретовым методом. Концентрацию общего белка доводят физиологическим раствором до 10 г/л.

После получения субстанции кислотоустойчивых белков сыворотки молока нами проводился синтез наноплатформы на основе коллоидного селена.

Нами было изучено влияние комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (КБСМ) на иммунную систему лабораторных животных. Для этого использовали тест с нитротетразолевым синим на перитонеальных клетках белых нелинейных крыс. Было установлено, что КБСМ заметно стимулируют клеточную систему иммунитета, что выражается в усилении митохондриального дыхания перитонеальных макрофагов. Кроме того, зависимость усиления клеточного дыхания от концентрации КБСМ показывает, что эффект КБСМ стремится к предельному уровню. Повышение уровня восстановления нитротетразолия перитонеаль-ными клетками в присутствии КБСМ позволяет судить о росте активности фагоцитоза.

Так же нами были получены результаты по усилению бактерицидной активности перитонеальных клеток мыши в присутствии КБСМ. Меньшая выживаемость клеток стафилококка в культуре перитонеальных клеток в присутствии комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока, очевидно, является результатом усиления фагоцитоза. Сравнение контроля, где отсутствовали какие-либо бактерицидные или бактериостатические агенты, и культур «КБСМ + S. aureus» показывает, что в данной концентрации и при данных условиях инкубации КБСМ не оказывает выраженного бактериостатического эффекта в отношении стафилококка. Однако при совместном присутствии КБСМ и перитонеальных клеток мыши выживаемость стафилококка заметно падает, о чеАм свидетельствует сравнение культур «ГЖМ+З. aureus +КБСМ», «ПКМ+5'. aureus» между собой и с контрольной культурой, падение выживаемости стафилококка в первом из образцов обусловлено, очевидно, усилением фагоцитоза. Уменьшение числа выживающих стафилококков (рост активности фагоцитоза) более заметно при низких и средних исходных плотностях посева.

Таким образом, КБСМ повышает активность фагоцитоза, что позволяет предполагать его стимулирующее влияние на формирование гуморального иммунитета.

Для подтверждения полученных данных нами была проведена иммунизация мышей антигенами сальмонелл совместно с КБСМ и определен титр агглютинирующих AT в сыворотках иммунизированных мышей. Наиболее высокий титр AT обнаружен в сыворотке мышей, иммунизированных смесью сальмонелл и КБСМ. У мышей, иммунизированных только биомассой, и мышей, иммунизированных биомассой через день после инъекции КБСМ, титры AT одинаковы и существенно ниже, чем у животных, получавших КБСМ и антиген одновременно. В сыворотке не иммунизированных животных также обнаруживаются AT, агглютинирующие антигены сальмонелл. Иммунизация биомассой сальмонелл совместно с КБСМ происходит эффективнее, при этом предварительная, за день до иммунизации инъекция КБСМ, не сказывается на уровне AT в сыворотке по сравнению с контролем. Приведённые выше данные свидетельствуют о том, что КБСМ при внутрибрюшинной иммунизации стимулирует фагоцитоз корпускулярного антигена, способствуя тем самым более полной и эффективной его презентации иммунной системе макроорганизма.

Подтвердив положительное влияние комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока на иммунную систему лабораторных животных, мы приступили к следующему этапу наших исследований, а именно к конструированию имму-номодулятора «Иммуно-Safe» на основе корпускулярного носителя (коллоидного селена) и комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока.

Коллоидный селен синтезировался нами по следующей технологии: в флакон объемом 20 мл внесли 0,5 мл 1М солянокислого гидразина, добавили 2 мл miliQ воды. В полученном растворе ресуспензировали 20 мг белка (в данном случае нами использовался КБСМ), после чего добавляли 0,125 мл 1 М селенита натрия и доводили объем раствора до 5 мл. Через несколько минут, когда раствор окрасился в оранжевый цвет, довели pH смеси до 7,2 1М гидроксидом натрия. Провели диализ раствора против miliQ воды, в течение 96 часов, с подменой воды каждые 24 часа.

Нами была изучена физико-химическая характеристика иммуномодулятора «Иммуно-Safe». Было установлено значение pH - 7,2 единицы, это соответствует физическим параметрам инъекционных растворов для парентерального введения. Для определения равномерности и однородности распределения компонентов иммуностимулирующей композиции определяли спектр в диапазонах длин волн от 200 до 1000 нм, с шагом 1 нм. Было установлено, что полученный раствор имеет достаточно однородную среду поглощения света в диапазоне от 200 до 650 нм. Размер частиц коллоидного селена определяли при помощи электронного микроскопа LIBRA 120 (Carl Zeiss, Германия). Было установлено, что описанный выше синтез позволяет создать коллоидный раствор, содержащий частицы селена от 60 до 100 нм.

Параллельно была повторно проведена электронная микроскопия полученного нами наноразмерного носителя (наноплатформы). Исследования проводили на электронном микроскопе LIBRA 120 (Carl Zeiss, Германия) с приставкой для элементного анализа (спектрометр с омега фильтром) с возможностью записи спектра энергетических потерь электронов для идентификации селена. Благодаря данному исследованию было подтверждено наличие в составе наноплатформы селена.

Предварительное изучение биодоступности разработанного нами иммуномодулятора «Иммуно-Safe» с биологическими объектами проводили на клетках линии HeLa. Было подтверждено проникновение нанокомплекса (селен + КБСМ) через клеточную мембрану. Параллельно проводили изучение биологической активности иммуномодулятора «Иммуно-Safe». Исследования проводились на клеточной линии SPEV-2. Было установлено, что при культивировании клеток в присутствии иммуномодулятора «Иммуно-Safe», приводит к повышению дыхательной активности в 4 раза. Что может говорить о способности препарата активировать окислительные процессы клеточного метаболизма.

Изучение иммунотоксичности препарата «Иммyнo-Safe» проводили на клеточной линии НеЬа. Нами были получены следующие результаты: концентрация селена 10 мкг/мл не только не вызывает угнетения роста клеток, но и отмечается стимуляция клеточного дыхания на 28%. В дальнейшем, проведя титрование селена, от концентрации 10 мкг/мл до 1 мкг/мл, было установлено, что 2,5 мкг/мл является минимальной концентрацией, вызывающей стимулирование дыхания клеток линии НеЬа (до 30%).

Отметив стимуляцию клеточного дыхания у клеток линии НеЬа, мы в дальнейшем провели исследования по изучению влияния коллоидного селена на стимуляцию пролиферативной активности лимфоидных клеток. Проведя данные исследования, мы отметили, что препарат «Иммуно-8а£е» вызывал стимуляцию пролиферативной активности клеток на 91%, селенит натрия на 9%, а фитоге-магглютинин на 26% по сравнению с контролем. Анализируя полученные выше данные, хочется отметить, что препарат «Иммyнo-Safe», обладая повышенной пролиферативной активностью, может рассматриваться в перспективе как хорошее иммуномодулирующее средство.

Подтвердив биологическую активность иммуномодулятора «Иммуно-БаАе», было изучено его распределение в органах лабораторных животных. Для этого КБСМ, входящий в состав препарата «Иммуно-8а£е» метился красителем ФИТЦ (флуоресцинизоцианат). Были установлены следующие биодинамические характеристики препарата «Иммуно-8а£е».

При оральном введении препарата «Иммуно-БаГе», меченного ФИТЦ, через 2 и 6 часов препарат в крови отсутствовал, а через 24 часа после введения отмечается зеленое свечение флуоресцинизоцианата в межклеточном пространстве, которое свидетельствует о наличии комплекса коллоидного селена с КБСМ в крови.

При внутрибрюшинном введении препарата появление в крови отмечается через 2 часа и сохраняется до 6 часов.

При внутримышечном введении препарат «Иммуно-8а£е», меченного ФИТЦ, также как и при внутрибрюшинном, отмечается свечение через 2 и 6 часов внутри и по периферии структурных образований. Через 24 часа наблюдается полное выведение препарата из крови.

В костном мозге при оральном введении препарата «Иммуно-8аГе», меченного ФИТЦ, отмечается довольно интенсивная флюоресценция через б часов после введения, а через 24 часа препарат практически полностью утилизируется из костного мозга.

При внутрибрюшинном введении препарата флюоресценция в косном мозге отмечается уже через 2 часа после введения и сохраняется до 6 часов.

Аналогичная ситуация просматривается в костном мозге и при внутримышечном введении препарата «Иммyнo-Safe». Через 24 часа флюоресценция полностью отсутствует.

В печени, при оральном введении препарата, отмечается довольно интенсивное свечение внутри структурных образований через 6 часов. А через 24 часа флюоресценция полностью исчезает.

При внутрибрюшинном введении препарат поступает в печень также через 6 часов и локализуется внутри структурных образований. Вместе с этим, при внутримышечном введении, препарат также поступает в паренхиму печени через 6 часов, но остается в ней в течение 24 часов с момента введения, локализуясь внутри структурных образований, имеющих оболочку.

При оральном введении препарата, в почечной ткани он регистрировался через 24 часа после введения, о чем свидетельствует довольно интенсивная флюоресценция в мазке отпечатке паренхимы почки мыши. При внутрибрюшинном введении препарата, флюоресценция в почечной ткани отмечается уже через 2 часа и исчезает через 6. Аналогичные процессы происходят и при внутримышечном введении препарата: через 2 часа наблюдается флюоресценция в мазке отпечатке паренхимы почки мыши, которая исчезает через 6 часов.

При оральном введении препарата флюоресценция в селезёнке появляется через 2 часа и сохраняется в течение 24 часов. Свечение имеет строго очерченные границы и форму, что дает основание предполагать локализацию коллоидного селена внутри клеточных структур. Аналогичные данные получились при внутрибрюшинном введении препарата. Вместе с этим при внутримышечном введении флюоресценция исчезла через 24 часа.

При исследовании фармако-токсикологических свойств иммуномодулятора «Иммуно-8а£е» нами была изучена аллергенная и местно-раздражающая реакция, в частности: методом кожной пробы, методом внутрикожной пробы и методом глазной пробы.

При исследовании методом кожной пробы было установлено, что после нанесения препарата на кожу кроликов, на месте нанесения эритемы и отёчности не образовалось. Зуда и беспокойства у животного не отмечено. Спустя 30, 60 минут, 24, 48 часов никаких отклонений от нормы на месте нанесения препарата не выявлено.

При исследовании аллергенной и местно-раздражающей реакции методом внутрикожной пробы было установлено, что на месте введения препарата «Имму-нo-Safe» объёмом 0,1 мл, никаких изменений не выявлено (отёков, эритем, зуда).

Метод глазной пробы позволил установить следующее - в момент введения в конъюнктивальный мешок препарата «Иммуно-8а£е» объёмом 0,3 мл наблюдалось незначительное слезотечение и умеренная гиперемия конъюнктивы, но спустя 5 минут данные симптомы исчезали. В последующем никаких воспалительных процессов конъюнктивы, роговицы не выявлено.

По итогам изучения аллергенной и местно-раздражающей реакции можно сделать заключение, что препарат «Иммyнo-Safe» не обладает местно-раздражающим действием.

При изучении острой токсичности иммуномодулятора «Иммyнo-Safe» сформированы 4 группы лабораторных животных - белых нелинейных мышей по 6 голов в каждой. Концентрация введения препарата «Иммуно-8а£е» составила 0,5; 1; 2,5 и 5 мл. Способ введения - внутрибрюшинно. При наблюдении за животными в течение 7 суток было отмечено, что препарат не вызвал гибели ни одного животного. На основании чего можно сделать заключение, что препарат «Иммуно-8а£е» при внутрибрюшинном введении не обладает токсическим действием.

Изучение хронической токсичности иммуномодулятора «Иммуно-Safe» проводили на 18 белых нелинейных мышах - самцах с исходной массой 20-25 г. Все животные были разделены на 3 группы, по 6 животных в каждой. Животным 1 опытной группы внутримышечно ежедневно в течение 1 месяца вводили препарат в дозе 500 мг/кг по действующему веществу или 0,8 мл/кг (концентрация действующего вещества в препарате составляла 10 мг/мл); 2-ой группы — 250 мг/кг по действующему веществу или 0,4 мл/кг (концентрация действующего вещества в препарате составляла 5 мг/мл). Животным контрольной группы, при тех же условиях содержания и кормления, вводили равный объем раствора вспомогательных веществ, входящих в состав препарата без активного вещества из расчета 0,8 мл/кг препарата без действующего вещества.

В течение всего опыта вели наблюдение за состоянием и поведением животных, динамикой роста массы тела, регулярно проводили исследования по оценке функционального состояния печени, почек и изучали влияние препарата на гематологические показатели. Результаты исследований показали, что в течение опыта внешних признаков интоксикации у животных не отмечалось. Признаков токсикоза и гибели животных, не наблюдали, что дает основание говорить об отсутствии у препарата в указанных дозах эффекта кумуляции по токсическому признаку. Кроме того, препарат благоприятно сказывался на приросте живой массы у исследуемых животных, о чем свидетельствует положительная динамика результатов взвешивания животных.

С целью оценки функционального состояния печени и функциональной активности почек определяли ряд биохимических показателей. По итогам работы было установлено, что при длительном введении препарата «Иммуно-Safe» не выявлено статистически значимых отличий биохимических показателей крови лабораторных животных у опытных и контрольных групп. Эти данные свидетельствуют об отсутствии нарушений в функциональном состоянии почек и печени.

Так же в ходе работы было изучено влияние препарата «Иммуно-Safe» на периферическую кровь, которое оценивали по морфологическому составу клеток и уровню гемоглобина. Как показали наши результаты, длительное введение иммуномодулятора «Иммуно-БаГе» не вызывало достоверных отличий гематологических показателей в сравнении с контролем.

При патоморфологическом исследовании внутренних органов мышей, получавших препарат «Иммyнo-Safe», каких-либо патологических изменений не отмечали.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Исаева, Анна Юрьевна, 2013 год

Список литературы

1. Автаидилов В.В., Ларченко Н.Т., Нефедова Е.А. Морфологичнская диагностика хронических гастритов (по данным морфометрии гастробиоптатов). Архив патологии. 1982. №9. С. 19-24.

2. Альберт А. Избирательная токсичность. - М.: Медицина, 1989. Т. 2.

400 с.

3. Биохимическая оценка эффективности липосомальных форм фенотерола при бронхопневмонии у крыс / А.Г. Корякова, Н.В. Кулакова, С.С. Кобелев [и др.] //Хим.-Фарм. Журн. 2000. Т. 34. С. 3-5.

4. Катцунг Б.Г. Базисная и клиническая фармакология. - М., -СПб.: Бином-Невский Диалект, 1998. Т. 1. 611 с.

5. Климов В.В., Кологривова E.H., Черевенко H.A. и др. Иммунная система и основные формы иммунопатологии, - Ростов-на-Дону; Феникс, 2006. 224 с.

6. Краснопольский Ю.М., Гольбец И.И., Сенников Г.А. Молекулярно-биологические проблемы создания лекарственных средств и изучение механизмов их действия // Хим.-Фарм. Журн. 1981. № 7. С. 13-23.

7. Лабинская А. С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. Изд. 4-е, перераб. и доп. - М., «Медицина», 1978. 394 с.

8. Лефковитс И.С., Пернис Б.А. Методы исследований в иммунологии. -М.: «Мир». 1981.486 с.

9. Липосомальная форма диамидина: снижение токсичности / Б.А. Тимофеева, И.М. Болотин, Л.П. Степанова [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. 1991. Т. 36. С.34-36.

10. Липосомы и другие наночастицы как средства доставки лекарственных веществ / А.П. Каплун, Ле Банг Шон, Ю.М. Краснопольский [и др.] // Вопросы медицинской химии. 1999. № 1. С. 1-11.

11. Ломакин. М.С Иммунобиологический надзор / МЛ. Ломакин. - М.: Медицина, 1990. 256 с.

12. Лопатин П.В., Сафонов В.П., Литвинова Т.П. Использование неводных растворителей для приготовления инъекционных растворов // Хим.-Фарм. Журн. 1972. № 11. С. 36-47.

13. Лоуренс Д.Р., Беннетт П.Н. Клиническая фармакология. - М.: Медицина, 1993. Т. 1. 638 с.

14. Лоуренс Д.Р., Беннетт П.Н., Браун М.Дж. Клиническая фармакология. - М.: Медицина, 2002. 680 с.

15. Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. 123 с.

16. Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная аналитика / под ред

B.В. Меньшикова. -М.: Лабинформ. РАМЛД, 1999. Т.2. 352 с.

17. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. С. 72 -90.

18. Методические указания по применению унифицированных и биохимических методов исследования крови, мочи и молока в ветеринарных лабораториях. —М., 2004. 123 с.

19. Пастер Е.У., Овод В.В., Позур В.К., Вихоть Н.Е. Иммунология: Практикум. - Киев: Вища. шк., 1989. 304 с.

20. Петров И.В., Васильева П.П., Куршаков Т.С. [и др.] Стандартизированные методы обследования иммунной системы человека (определение розеткообразующих клеток, иммуноглобулинов, гетерофильных антител и фагоцитоза): Метод, рекомендации. - М.: 1984. 14 с.

21. Получение и некоторые свойства липосомного препарата 2,4-ди(1-метил-3-гидроксибутил)дейтеропорфирина-1Х / A.B. Решетников, И.В.Жигальцев,

C.Н. Коломейчук. [и др.] //Биоорг. хим., 1999. Т. 25. С. 782-790.

22. Русанов А.И. Мицеллообразование в растворах поверхностно активных веществ. - Санкт-Петербург: Химия, 1992. 280 с.

23. Соколов В.Д., Андреева Н.Л., Мухина З.Н. и др. Клиническая фармакология и фармакотерапия, - СПб., 1998. 122 с.

24. Сохин. A.A. Иммунотерапия инфекционных заболеваний /A.A. Сохин

// Прикладная иммунология. - К: Здоровье, 1984. С.213-232.

25. Торчилин В.П., Клибанов A.J1. Липосомы как средства направленного транспорта лекарств//Российский химический журнал. 1987. Т. 32. С. 502-514.

26. Федоров Ю.Н. Иммунодефициты домашних животных / Ю.Н. Федоров, О.А. Верховский - М., 1996. 95 с.

27. Фримель Г.А. Иммунологические методы. - М.: «Медицина». 1987.

472 с.

28. Хрестова Н.Л., Апуховская Л.И., Гурин Н.М. Изучение биологической активности витамина D3 в липосомах//Хим.-Фарм. Журн. 1990. № 1. С. 52-55.

29. Швец В.И., Краснопольский Ю.М. Липиды в лекарственных препаратах//Хим.-Фарм. Журн. 1987. № 1. С. 17-25.

30. Шляхов Э.Н. Стимуляция поствакцинального процесса на примере иммунизации против сибирской язвы /Э. Н. Шляхов, В. Ф. Кику. - Кишинев: Штиинца, 1984. 197 с.

31. Эффективность липосомальных форм цитостатиков / А.Л. Дранов, А.С. Дудниченко, PI.A. Мезин [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1996. № 1. С. 85-89.

32. A combination of poloxamers increases gene expression of plasmid DNA in skeletal muscle / P. Lemieux, N. Guerin, G. Paradis [et al.] // Gene Therapy. 2000. V. 7.P. 986-991.

33. A new formulation for blood substitutes / C. Cecutti, A. Novelli, I. Rico [et al.]//Sci. Technol. 1990. V. 11. P. 115-123.

34. A nowel reactive polimeric micelle with aldehyde groups on its surface / C. Scholz, M. Lijima, K.A. Kataoka [et al.] // Macromol. 1995. V. 53. P. 283-318.

35. A nowel reactive polimeric micelle with aldehyde groups on its surface / C. Scholz, M. Lijima, K.A. Kataoka [et al.] //Macromol. 1995. V. 53. P. 283-318.

36. Aboofazeli R., Lawrence M.J. Investigations into the formation and characterization of phospholipid microemulsions. I. Pseudo-ternary phase diagrams of systems containing water - lecithin - alcohol - isopropyl miristate // Int. J. Pharm. 1993. V. 93. P. 161-175.

37. Agatonovic-Kustrin S., Glass B.D., Wisch M.H. Strategy for the development of a thermodynamically stable oral microemulsion // Curr. Drug Discov. Technol. 2004. V. l.P. 165-171.

38. Ahuja A. Mucoadhesive Drug Delivery Systems, Khar K.R., Ali J. // Drug Develop. Ind. Pharm. 1997. V. 23. P. 489-515.

39. Allen T.M., Hausen C.B. Pharmacokinetics of stealth conventional liposomes: effect of dose //Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1068. P. 133-141.

40. Almgren M. Mixed micelles and other structures in the solubilization of bi-layer lipid membranes by surfactants // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1508. P. 146163.

41. Bernas T., Dobrucki J.W. The role of plasma membrane in bioreduction of two tetrazolium salts, MTT, and CTC // Arch. Biochem. Biophys. 2000. V. 380. P. 108116.

42. Biodegradable nanoparticle mediated antigen delivery to human cord blood derived dendritic cells for induction of primary T cell responses / M. Diwan, P. Elamanchili, H. Lane [et al.] // J. Drug Target. 2003. V. 11. P. 495-507.

43. Block copolymer - based formulation of doxorubicin. From cell screen to clinical trials / V.Y. Alakhov, E. Klinskii, S. Li [et al.] // Coll. Surf. B. 1999. V. 16. P. 113-134.

44. Block copolymer micelles: preparation, characterization and application in drug delivery / G. Gaucher, M. H. Dufresne, V.P. Sant [et al.] // J. Contr. Rel. 2005. V. 109. P. 169-188.

45. Bym S.R., Pfeiffer R.R., Stowell J.G. Solid-state chemistry of drugs. -West Lafayette: SSCI, 1999. 574 p.

46. Campbell R.B., Balasubramanian S.V., Straubinger R.M. Phospholipid-cationic lipid interactions: influences on membrane and vesicle properties // BBA-Biomembranes. 2001. V. 1512. P. 27-39.

47. Carrion C., Domingo J.C., de Madariaga M.A. Preparation of long-circulating immunoliposomes using PEG-cholesterol conjugates: effect of the spacer arm between PEG and cholesterol on liposomal characteristics // Chem. Phys. Lipids.

2001. V. 113. P. 97-110.

48. Catherine M. Goodman, Catherine D. McCusker, Tuna Yilmaz Toxicity of Gold Nanoparticles Functionalized with Cationic and Anionic Side Chains // Bioconju-gate Chem. 2004. №15. P. 897-900.

49. Cationic microparticles are an effective delivery system for immune stimulatory CpG DNA / M. Singh, G. Ott, J. Kazzaz [et al.] // Pharm. Res. 2001. V. 18. P. 1476-1479.

50. Cellular uptake of liposomes targeted to intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) on bronchial cells / E. Mastrobattista, G. Storm, L. van Bloois [et al.] // BBA-Biomembranes. 1999. V. 1419. P. 353-363.

51. Chandran S., Roy A., Mishra B. Recent trends in drugs delivery systems: liposomal drug delivery system - preparation and characterization // Indian J. Exp. Biol. 1997. V. 35. P. 801-809.

52. Colloidal gold: a novel nanoparticle vector for tumor directed drug delivery / G.F. Paciotti, L. Myer, D. Weinreich [et al.] // Deliv. 2004. №11. P. 169-183.

53. Cremophor EL mediated alteration of paclitaxel distribution in human blood: Clinical pharmacokinetic implications / A. Sparreboom, L. van Zuylen, E. Brouwer [et al.] // Cancer. Res. 1999. V. 59. P. 1454-1457.

54. Cremophor EL: the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation / H. Gelderblom, J. Verweij, K. Nooter [et al.] // Eur. J. Cancer. 2001. V. 37. P. 1590-1598.

55. Croubels S., De Baere S., De Backer P. Practical approach for the stability testing of veterinary drugs in solutions and in biological matrices during storage // Anal. Chim. Acta. 2003. V. 483. P. 419-427.

56. Current status and potential application of ISCOMs in veterinary medicine / B. Morein, K.-F. Hu, I. Abusugra // Adv. Drug Deliv. Rev. 2004. V. 56. P. 1367-1382.

57. Devika Chithrani B., Arezou A. Ghazani, Warren C. W. Chan determining the size and shape dependence of gold nanoparticle uptake into mammalian cells // Nano Letters. 2006. V.6. №.4. P.662-668.

58. Dionysius D.A., Grieve P.A., Milne J.M. Forms of lactoferrin: their and-

bacterial effect on enterotoxigenic Escherichia coli // J. Dairy Sei. 1993. V. 76. P. 25972606.

59. Dionysius D.A., Milne J.M. Antibacterial peptides of bovine lactoferrin: purification and characterization//J. Dairy. Sei. 1997. V. 80. P. 667-674.

60. Douglas S.J., Davis S.S., Ilium L. Nanoparticles in drug delivery // Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 1987. V. 3. P. 233-261.

61. Duncan R. The dawning era of polymer therapeutics // Nat. Rev. Drug Dis-cov. 2003. V. 2. P. 347-360.

62. Duncan R., Kopecek J. Soluble synthetic polymers as potential drug carriers //Adv. Polim. Sei. 1984. V. 57. P. 51-101.

63. Effects of Pluronic blok copolymers on drug absorption in caco-2 cell monolayers / E.V. Batrakova, H.Y. Han, V.Y. Alakhov [et ah] // Pharm. Res. 1998. V. 15. P. 850-855.

64. Enhanced anti-inflammatory activity of a liposomal intercellular adhesion 'molecule-1 antisense oligodeoxynucleotide in an acute model of contact hypersensitivity / S.K. Klimuk, S.C. Semple, P.N. Nahirney [et al.] // J. Pharm. Exp. Ther. 2000. V. 292. P. 480-488.

65. Enhanced tumor accumulation and anticancer activity of cisplatin-loaded polymeric micelles / S. Okazaki, N. Nishiyama, Y. Rato [et al.] // J. Contr. Rel. 2003. V. 91. P. 233-236.

66. Evaluation of crystallinity and drug release stability of directly compressed theophylline hydrophilic matrix tablets stored under varied moisture conditions / C.M. Adeyeye, J. Rowley, D. Madu [et al.] // Int. J. Pharm. 1995. V. 116. P. 65-75.

67. Fleming M.S., Mandal T.K., Walt D.R. Nanosphere-microsphere assembly: Methods for core-shell materials preparation // Chem. Mater. 2001. V. 13. P. 22102216.

68. Formation of theophylline monohydrate during the pelletisation of micro-crystalline cellulose - anhydrous theophylline blends / J. Herman, J.P. Remon, N. Vis-avarungroj [et al.] //Int. J. Pharm. 1988. V. 42. P. 15-18.

69. Free radical scavenging efficiency of nano-Se in vitro / Bo Huang, Jinsong

Zhang, Jingwu Hou [et al.] // Free Radical Biology & Medicine. 2003. Vol.35. №. 7. P. 805-813.

70. Fubini B., Gasco M.R., Gallarate M. Microcalorimetric study of microe-mulsions as potential drug delivery systems. II. Evalution of enthalpy in the presence of drugs // Int. J. Pharm. 1989. V. 50. P. 213-217.

71. Functionalized gold nanoparticles for drag delivery / Han Gang, Ghosh Partha, Vincent M. Rotello // Nanomedicine. 2007.V.2. JVbl.P.l 13-123.

72. Fundamental relationships between the cjmposition of Pluronic block copolymers and their hypersesitization effects in MDR cancer cells / E.V. Batrakova, S. Li, A. Venne [et al.] // Pharm. Res. 1999. V. 16. P. 1373-1379.

73. Gabelle F., Koros W.J., Shechter R.S. Solubilization of aromatic solutes in block copolymers // Macromolecules. 1995. V. 28. P. 4883-4892.

74. Gagne J.-F., Desormeaux A., Perron S. Targeted delivery of indinavir to HIV-1 primary reservoirs with immunoliposomes // Biochim. Biophis. Acta. 2002. V. 1558. P. 198-210.

75. Ghosh P. Gold nanoparticles in delivery applications // Adv. Drug Deliv. Rev. 2008. doi:10.1016. addr.2008.03.016.

76. Gregoriadis G. Engineering liposomes for drug delivery: progress and problems //Trends in Biotechnol, 1995. V 13. P. 527-537.

77. Grob P.J. Immunostimulantien und Infectienskrankheiten /P.J. Grob, A. Fontana // Ther. Umschr. 1982.V.32. №.9. P 668-674.

78. Haensler J., Verdelet C., Sanchez V. Intradermal DNA immunization by using jet-injector in mice and monkey // Vaccine. 1999. V. 26. P. 628-638.

79. Hancock B.C., Zografi G.Characteristics and significance of amorphous state in pharmaceutical systems // J. Pharm. Sei. 1997. V. 86. P. 1-12.

80. Hawley A.E., Ilium L., Davis S.S. Lymph node localization of biodegradable nanospheres surface modified with poloxamer and poloxamine block co-polymers :

i

// FEBS Lett. 1997. V. 400. P. 319-323. 1

81. Hawley A.E., Ilium L., Davis S.S. Preparation of biodegradable, surface engineered PLGA nanospheres with enhanced lymphatic drainage and lymph node up- j

take // Pharm. Res. 1997. V. 14. P. 657-661.

82. Hemolytic and antifungal activity of liposome-entrapped amphotericin B prepared by the precipitation method / J.C. Kim, E.O. Lee, J.Y. Kim [et al.] // Pharm. Dev. Technol. 1997. V. 2. P. 275-284.

83. Henry C.M. Special delivery // ACSJ. 2000. V. 78. P. 49-65.

84. High pressure phase transitions in organic solids I: a —> ß transition in re-sorcinol / S.M. Sharma, V. Vijayakumar, S.K. Sikka [et al.] // Pramana. 1985. V. 25. P. 75-79.

85. Hodgson J. ADMET - turning chemicals into drugs // Nat. Biotech. 2001. V. 19. P. 722-726.

86. Holmgren J., Svennerholm A.M., Ähren C. Nonimmunoglobulin fraction of human milk inhibits bacterial adhesion (hemagglutination) and enterotoxin binding of Escherichia coli and Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1981. V. 33. P. 136-141.

87. Hypersensitizing effect of Pluronic on cytotoxic activity, transport, and subcellular distribution of doxorubicin in multi drug-resistant cells / A. Venne, R. Man-deville, A.V. Kabanov [et al.] // Cancer Res. 1996. V. 56. P. 3626-3629.

88. Iden D.L., Allen T.M. In vitro and in vivo comparison of immunolipo-somes made by conventional coupling techniques with those made by a new postinsertion approach//Biochim. Biohpys. Acta. 2001. V. 1513. P. 207-216.

89. Immune response with biodegradable nanosheres and alum: studies in rabbits using staphylococcal enterotoxin B-toxoid / M.P. Desai, J.M. Hilfinger, G.L. Amidon [et al.] //J. Microencapsulation. 2000. V. 17. P. 215-225.

90. Immune responses to orally administered PLGA microparticles: influence of oil vehicles and surfactive agents / I. Gutierro, R.M. Hernandez, M. Igartua [et al.] // J. Microencapsulation. 2003. V. 20. P. 525-536.

91. Immunostimulatory activity of lactotransfemn and maturation of CD4-CD8- murine thymocytes / M. Zimecki, J. Mazurier, M. Machnicki // Immunol. Lett. 1991. V. 30. P. 119-124.

92. Induction of mucosal and systemic immune responses by immunization with ovalbumin entrapped in poly(lactide-co-glycolide) microparticles / K.J. Maloy,

A.M. Donachie, D.R. O'Hagan [et al.] // Immunology. 1994. V. 81. P. 661-667.

93. Induction of potent immune responses by cationic microparticles with adsorbed human immunodeficiency virus DNA vaccines / D. O'Hagan, M. Singh, M. Ugozzoli [et al.] // J. Virol. 2001. V. 75. P. 9037-9043.

94. Influence of Cremophor EL on the quantification of paclitaxel in plasma using high-performance liquid chromatography with solid-phase extraction as sample pretreatment / M.T. Huizing, H. Rosing, F.P. Koopmans [et al.] // J. Chromatogr. B. 1998. V. 709. P. 161-165.

95. Influence of surface hydrophilicity of liposomes on their interaction with plasma protein and clearance from the circulation: studies with poly(ethylene glycol)-coated vesicles / J. Senior, C. Delgado, D. Fisher [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1062. P. 77-82.

96. Inorganic nanoparticles as carriers for efficient cellular delivery / Zhi Ping Xua, Qing Hua Zeng, Gao Qing Lua [et al.] // Chemical Engineering Science. 2006. V. 61. P. 1027- 1040.

97. Interaction of Cremophor-EL with human plasma / M. Kongshaug, L.S. Cheng, J. Moan [et al.] // Int. J. Biochem. 1991. V. 23. P. 473-478.

98. Interaction of nanoparticle-bound ampicillin with the leucocytes of peripheral blood / A.Yu. Sherstov, G.Ya. Kivman, A.Ye. Vassiliev [et al.] // Abstr. Ill Conf. Pharm.Sci. Clin. Pharmacol. 1996. 26 p.

99. International Union of Pharmacology. XIII. Classification of Histamine Receptors / S.J. Hill, C.R. Ganellin, H. Timmerman [et al.] // Pharm. Rev. 1997. V. 49. P. 253-278.

100. Israelachvili J.N. Intermolecular and surface forces. - London: Academic Press, 1991.480 p.

101. Issues and challenges in developing long-acting veterinary antibiotic formulations / Y. Sun, D.W. Scruggs, Y. Peng [et al.] // Adv. Drug Deliv. Rev. 2004. V. 56. P. 1481-1496.

102. Jiunn L.H., Anthony L.H.Y. Role of pharmacokinetics and metabolism in drug discovery and development // Pharm. Rev. 1997. V.49. P. 403-449.

103. Kabanov A.V., Batrakova E.Y., Alakhov V.Y. Pluronic block copolymers for overcoming drug resistance in cancer // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2002. V. 54. P. 759779.

104. Kabanov A.V., Batrakova E.V., Alakhov V.Yu. Pluronic block copolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery // J. Contr. Rel. 2002. V. 82. P. 189-212.

105. Kakizawa Y., Kataoka K. Block copolymer micelles for delivery of genes and related compounds // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54. P. 203-222.

106. Kataoka K., Harada A., Nagasaki Y. Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological and biological significance // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2001. V. 47. P. 113-131.

107. Kataoka K., Kabanov A. Polymeric Micelles in Biology and Pharmaceutics. - Amsterdam: Elsevier, 1999. 342 p.

108. Kreuter J. Colloidal Drug Delivery Systems. - New York: Marcel Dekker, 1994. 370 p.

109. Kreuter J. Factors influencing the body distribution of polyacrylic nanopar-ticles. - Amsterdam: Elseiver, 1985. P. 51-68.

110. Kreuter J., Speiser P.P. New adjuvants on a polymethylmethacrylate base // Infect. Immun. 1976. V. 13. P. 204-210.

111. Kunii D., Levenspiel O. Fluidization Engineering. - Oxford: Butterworth Heinemann, 1991. 491 p.

112. Kwon G.S., Kataoka K. Block copolymer micelles as long-circulating drug vehicles // Adv. Drug. Deliv. Rev. 1995. V. 16. P. 295-309.

113. Kwon G.S., Okano T. Polymeric micelles as new drug carriers // Adv. Drug. Deliv. Rev. 1996. V. 21. P. 107-116.

114. Lambert G. Polyalkylanoacrylate nanospheres and nanocapsules for the delivery of antisense oligonucleotides // J. Disp. Sci. Technol. 2003. V. 24. P. 439-452.

115. Langer R. Drug delivery and targeting // Nature. 1998. V. 392. - P. 5-10.

116. Lavasanifar A., Samuel J., Kwon G.S. Poly(ethylene oxide)-block -poly(L-amino acid) micelles for drug delivery // Adv. Drug. Deliv. Rev. 2002. V. 54. P. 169-190.

117. Lee J.H., Lee H.B., Andrade J.D. Blood compatibility of polyethylene oxide surfaces III Prog. Polym. Sci. 1995. V. 20. P. 1043-1079.

118. Liposomes as carrier for production of sugar specific antibodies: preparation of antigalactosyl antiserum / P.K. Das, P. Ghosh, B.K. Bahchawat [et al.] // Immunol. Commun. 1982. Y. 1. P. 17-18.

119. Mancini G. // Immunochemistry. 1965. V. 2. №3. P. 235-254.

120. Martinek K., Yatsimirskii A.K., Levashov A.V. The kinetic theory and the mechanisms of micellar effects on chemical reactions // In: Micellization, Solubilization and Micro emulsions / Ed.: Mittal K.L. - New York: Plenum Press, 1977. P. 489-505.

121. Melik-Nubarov N.S., Kozlov M.Yu. Evaluation of partition coefficients of low molecular weight solutes between water and micelles of block copolymer of ethylene oxide based on dialysis kinetics and fluorescence spectroscopy // Colloid Polym. Sci. 1998. V. 276. P. 381-387.

122. Menger F.M., Portnoy C.E. Chemistry of reactions proceeding inside molecular aggregates // J. Am. Chem. Soc. 1967. V. 89. P. 4698-4703.

123. Meyer Th., Bohler J., Frahm A.W. Determination of cremophor EL in plasma after sample preparation with solid phase extraction and plasma protein precipitation//J. Pharm. Biomed. Anal. 2001. V. 24. P. 495-506.

124. Micellar structure of an ethylene oxide-propylene oxide block copolymer: A small-angle neutron scattering study / N.J. Jain, V.K. Aswal, P.S. Goyal [et al.] // J. Phys. Chem. B. 1998. V. 102. P. 8452-8458.

125. Moghimi S.M., Hunter A.C., Murray J.C. Long circulating and target -specific nanopartticles: theory to practice//Pharmacol. Rev. 2001. V. 53. P. 283-318.

126. Muller R.H., Heinemmann S. Emulsions for intravenous administration. I. Emulsions for nutrition and drug delivery // Pharm. Ind. 1993. V. 55. P. 853-856.

127. Muller R.H., Mader K., Gohla S. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery - a review of the state of the art // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2000. V. 50. P. 161-177.

128. Nagarajan R., Barry M., Ruckenstein E. Unusual selectivity in solubilization by block copolymer micelles // Langmuir. 1986. V. 2. P. 210-215.

129. Naidu A.S. Lactoferrin: Natural, Multifunctional, Antimicrobial. - Boca Raton, FL: CRC Press, 2000. 86 p.

130. Nanocapsules: lipid-coated aggregates of cisplatin with high cytotoxicity / K.N.J. Burger, R.W.H.M. Staffhorst, H.C. de Vijlder [et al.] // Nat. Med. 2002. V. 8. P. 81-84.

131. Niskanene M. Explaining the dissolution properties of theophylline pellets by their microstructure // Pharm. Technol. Int. 1992. V. 9. P. 20-28.

132. Novel injectable pH and temperature sensitive block copolymer hydrogel / W.S.Shim, J.S. Yoo, Y.H. Bae [et al.] // Biomacromolecules. 2005. V. 6. P. 2930-2934.

133. Novel pH sensitive block copolimer micelles for solvent free drug loading / W.S. Shim, S.W. Kim, E.-K. Choi [et al.] // Macromol. Biosci. 2006. V. 6. P. 179-286.

134. O'Hagan D. Synthetic peptides entrapped in microparticles can elicit cytotoxic T cell activity / D.F. Nixon, C. Hioe, P.D. Chen [et al.] // Vaccine. 1996. V. 14. P. 1523-1530.

135. Okada H., Toguchi H. Biodegradable microsheres in drug delivery // Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 1995. V. 12. P. 1-99.

136. Optimal structural requirements for Pluronic blok copolymers in modifying p-glicoprotein drug efflux activity in bovine brain endothelial cells / E.V. Batrakova, V.Y. Alakhov, D.W. Miller [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2003. V. 304. P. 845854.

137. Optimizing liposomes for delivery of chemoterapevtic agents to solid tumors / D. Drummond, O. Meyer, K. Hong [et al.] // Pharmacol. Rev. 1999. V. 51. P. 691-744.

138. Oral gene delivery with chitosan-DNA nanoparticles generates immunologic protection in murine model of peanut allergy / K. Roy, H.-Q. Mao, S.-K. Huang [et al.] // Nat. med. 1999. V. 5. P. 387-391.

139. Otsuka M., Ohtani M., Kaneniwa N. Effect of humidity on solid-state isomerization of various kinds of lactose during grinding // J. Pharm. Pharmacol. 1992. V. 45. P. 2-5.

140. Paciotti G.F., Kingston D.G.I., Tamarkin L. Colloidal gold nanoparticles: a

novelnanoparticle platform for developing multifunctional tumor-targeted drug delivery vectors // Drug Dev. Res. 2006. №67. P. 47-54.

141. Pattarino F., Carlotti M.E., Gasco M.R. Topical delivery systems for aze-laic acid: Effect of the suspended drug in microemulsion // Pharmazie. 1994. V. 49. P. 72-73.

142. Pertechnetate release from a water/oil microemulsion and an aqueous solution after subcutaneous injection in rab / M. Bello, D. Colangelo, M.R. Gasco [et al.] // J. Pharm. Pharmacol. 1994. V. 46. P. 508-510.

143. Pharmaceutical development of (investigational) anticancer agents for parenteral use: A review / J.D. Jonkman-de Vries, K.P. Flora, A. Bult [et al.] // Drug Dev Ind. Pharm. 1996. V. 22. P .475-494.

144. Pharmaceutical solids: a strategic approach to regulatory considerations / S.R. Byrn, R.R. Pfeiffer, M. Ganey [et al.] // Pharm. Res. 1995. V. 12. P. 945-954.

145. Plasmid DNA encoding human carcinoembryonic antigen (CEA) adsorbed onto cationic microparticles induces protective immunity against colon cancer in CEA-tronsgenic mice / Y. Luo, D. O'Hagan, H. Zhou [et al.] // Vaccine. 2003. V. 21. P. 1938-1947.

146. Pluronic block copolymers: novel functional molecules for gene therapy / A.V. Kabanov, P. Lemieux, S. Vinogradov [et al.] // Adv. Drug Deliv. Rev. 2002. V. 54. P. 223-233.

147. Pluronic p85 enhances the delivery of digoxin to the brain: in vitro and in vivo studies / E.V. Batrakova, D.W. Miller, S. Li [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. V. 296. P. 551-557.

148. Pluronic p85 increases permeability of a broad spectrum of drugs in polarized bbmec and caco-2 monolayers / E.V. Batrakova, S. Li, A. Venne [et al.] // Pharm. Res. 1999. V. 16. P. 1366-1372.

149. Polyvalent Oligonucleotide Gold Nanoparticle Conjugates as Delivery Vehicles for Platinum(IV) / Warheads Shanta Dhar, Weston L. Daniel, David A. Giljohann [et al.] //J. AM. CHEM. SOC. 2009. №. 131. P. 14652-14653.

150. Preparation and evaluation of the in vitro drug release properties and mil-

coadhesion of novel microspheres of hyaluronic acid and chitosan / S.T. Lim, G.P. Martin, D.J. Berry [et al.] // J. Contr. Rel. 2000. V. 66. P. 281-292.

151. Putney S.D., Burke P.A. Improving protein therapeutics with sustained-release formulations // Nat. Biotechnol. 1998. V. 16. P. 153-157.

152. Rangel-Yagui C.O., Pessoa A. Jr., Tavares L.C. Micellar solubilization of drugs // J. Pharm. Pharm. Sci. 2005. V. 8. P. 147-163.

153. Results of a cancer research campaign phase I dose escalation trial of SP1049C in patients with advanced cancer / M. Ranson, D. Ferry, D. Kerr [et al.] // 5th Int. Symp. Polym. Ther. 2002. p. 15.

154. Solid-state NMR and IR for the analysis of pharmaceutical solids: polymorphs of fosinopril sodium / H.G. Brittain, K.R. Moms, D.E. Bugay [et al.] //J. Pharm. Biomed. Anal. 1993. V. 11. P. 1063-1069.

155. Speiser P.P. Nanoparticles and liposomes: a state of the art // Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol. 1991. V 13. P. 337-342.

156. Stabilization of pluronik p-105 micelles with an interpenetrating network of N,N,-diethylaccrylamide / J.D. Pruitt, G. Husseini, N. Rapoport [et al.] // Macromol.. 2000. V. 33. P. 9306-9309.

157. Surface engineered nanospheres with enhanced drainage into lymphatic drainage and lymph node uptake by macrophages of the regional lymph nodes / S.M. Moghimi, A.E. Hawley, N.M. Christy [et al.] // FEBS Lett. 1994. V. 344. P. 225-230.

158. Sustained-release injectables formed in situ and their potential use for veterinary products / M. Christian, U. Isele, P. Van Hoogevest [et al.] // J. Contr. Rel. 2002. V. 85. P. 1-15.

159. The mechanism of liposome accumulation in infarction / T.N. Palmer, V.J. Caride, M.A. Caldecourt [et al.] //Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 797. P. 363-368.

160. Theoretical approaches to physical transformation of active pharmaceutical ingredients during manufacturing processes / K.R. Morris, U.J. Griesser, C.J. Eckhardt [et al.] // Adv. Drug Deliv. Rev. 2001. V. 48. P. 91-114.

161. Thews G., Mutschler M., Vaupel P. Anatome, Physiologie, Pathophisiolo-gie des Menschen. - Stuttgart: Wissenchaftliche Verlagsgesellschaft, 1980. 981 p.

162. Titrimetric determination of Cremophor EL in aqueous solutions and biofluids / M. Kunkel, T. Meyer, J. Bohler [et al.] // J. Pharm. Biomed. Anal. 1999. V. 21. P. 911-922.

163. Torchilin V.P. How do polymers prolong circulation time of liposomes? // J. Liposome Res. 1996. V 6. P. 99-116.

164. Torchilin V.P. Trubetskoy V.S. Which polymers can make nanoparticulate drug carriers long-circulating? // Adv. Drug. Deliv. Rev. 1995. V. 16. P. 141-155.

165. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review / H. Maeda, J. Wu, T. Sawa [et al.] // J. Contr. Rel. 2000. V. 65. P. 271-284.

166. Van Zuylen L., Verweij J., Sparreboom A. Role of formulation vehicles in taxane pharmacology // Inv. New. Drug. 2001. V. 19. P. 125-141.

167. Vesicle reconstitution from lipid-detergent mixed micelles / M. Ollivon, S. Lesieur, C. Grabielle-Madelmont [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1508. P. 34-50.

168. Yokoyama M. Block copolymers as drug carriers // CRC Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst. 1992. V. 9. P. 213-248.

169. Zhang X., Jackson J.K., Burt H.M. Determination of surfactant critical micelle concentration by a novel fluorescence depolarization technique // J. Biochem. Biophys. Meth. 1996. V. 31. P. 145-150.