Конструирование аптамеров белков методами компьютерного моделирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.09, кандидат наук Щербинин, Дмитрий Сергеевич

• Щербинин, Дмитрий Сергеевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Щербинин, Дмитрий Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Аптамеры

1.1.1 Структура и применение аптамеров

1.1.2 Поиск и синтез аптамеров

1.2 Тромбин

1.2.1 Общая сведения

1.2.2 Аптамеры к тромбину

1.3 Цитохромы

1.3.1 Функции цитохромов

1.3.2 Суперсемейство цитохромов Р450

1.33 Цитохром Р450 51А1

1.4 Методы молекулярного моделирования

1.4.1 Метод молекулярной динамики

1.4.2 Докинг. Исследование белок-лигандных взаимодействий

1.4.3 Виртуальный скрининг

1.4.4 Использование компьютерных методов для поиска аффинных

аптамеров

2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты

2.2 Компьютерные методы

2.2.1 Докинг

2.2.2 Молекулярная динамика

2.2.3 Расчет энергий связывания

2.3 Экспериментальные методы

2.3.1 Синтез аптамеров

2.3.2 Экспериментальная проверка сконструированных аптамеров

3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Анализ структур комплексов белок-аптамер и разработка стратегии

компьютерного конструирования аптамеров

3.2 Исследование взаимодействия (анти)тромбинового аптамера с тромбином и претромбином-2

3.2.1 Поиск возможных сайтов взаимодействия тромбина с аптамерами

методами молекулярного докинга

3.2.2 Исследование взаимодействия ТВ А с тромбином и претромбином-2

методами молекулярной динамики

3.3 Компьютерное конструирование аптамеров к цитохрому Р450 51А1

3.3.1 Поиск сайта связывания аптамеров и конструирование "узнающего "

фрагмента аптамера

3.3.2 Поиск конформации стабилизирующего участка аптамера

3.3.3 Экспериментальное тестирование

4 ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

а.о.

ЯМР

СУР

CYP51A1

MD

NMA

РСА

PDB

3D-QSAR

RMSD

RMSF

SELEX

ТВА

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

аминокислотный остаток Ядерно-магнитный резонанс Цитохром Р450 Цитохром Р450 51А1

Molecular Dynamics (Молекулярная динамика) Normal mode analysis (Метод нормальных мод) Primary component analysis (Метод главных компонент) Protein Data Bank

3D Quantitative structure-activity relationship Root-mean-square deviation (среднеквадратичные отклонения) Root mean square fluctuation (среднеквадратичные флуктуации) Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment Thrombin-binding aptamer (Тромбин-связывающий аптамер)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование аптамеров белков методами компьютерного моделирования»

ВВЕДЕНИЕ

Аптамеры представляют собой небольшие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, способные связываться с белками с высокой аффинностью и специфичностью [Mayer G., 2009]. В большинстве случаев они состоят из 15-30 нуклеотидов и имеют стабильную пространственную структуру [Gatto В., 2009], обеспечивающую селективность связывания с конкретными белками. *

В настоящее время исследованию и поиску аптамеров уделяется значительное внимание. Их рассматривают в качестве перспективной замены моноклональных антител [Jayasena S.D., 1999]. В отличие от последних, синтез аптамеров занимает значительно меньше времени и требует меньших материальных затрат. В структуру аптамеров легче вносить замены для удобства их дальнейшего использования [Ferreira C.S., 2007]. Кроме того, аптамеры обладают дополнительными технологическими преимуществами, в частности, они менее чувствительны к условиям их хранения. Поэтому их рассматривают как новые аффинные и селективные реагенты, которые могут быть использованы в аффинной хроматографии, в биосенсорных системах, в диагностических платформах, в том числе и в ELISA. Кроме того, в том числе и из-за низкой иммуногенности, аптамеры рассматриваются как терапевтические агенты. В частности, в настоящее время аптамер для фактора роста эндотелия сосудов (Pegaptanib) уже внедрен в клиническую практику для лечения макулодистрофии.

Для поиска аптамеров в настоящее время применяются лишь экспериментальные методы. Основным из них является метод SELEX [Tuerk С., 1990; Syed М.А., 2010], который основан на повторяющейся десятки раз процедуре удлинения, полимеризации и отбора олигонуклеотидов из начальной библиотеки нуклеотидов со случайной последовательностью. В результате создание нового аптамера является трудно предсказуемой задачей с высоким уровнем случайности.

Одним из возможных подходов по ускорению поиска и создания новых аптамеров является применение методов компьютерного моделирования. Эти методы могут быть использованы как на предварительном этапе исследования при оптимизации состава начальной библиотеки олигонуклеотидов для дальнейшего поиска, снизив тем самым неопределенность и случайность экспериментального поиска, так и при проведении полного цикла конструирования аптамеров.

( Несмотря на эффективность применения компьютерных методов для поиска и оптимизации низкомолекулярных лигандов, для поиска и разработки de novo более сложных по структуре молекул аптамеров они практически не использовались. Применение компьютерных методов молекулярного моделирования в основном ограничивалось исследованиями уже известных пар белок-аптамер [Lin Р.Н., 2012]. Примером является исследование взаимодействий между тромбином и его известным 15-членным аптамером (ТВА, thrombin-binding aptamer) при внесении изменений в структуру олигонуклеотида [Pagano В., 2007].

Для поиска РНК аптамеров к низкомолекулярным соединениям был разработан подход, имитирующий метод SELEX in silico. Было показано, что он позволяет получать правдоподобные результаты, но требует значительных временных затрат и больших вычислительных мощностей [Chushak Y., 2009].

Поэтому целью работы было разработать подход рационального компьютерного конструирования аптамеров к белкам-мишеням и апробировать его на примере цитохрома Р450 51А1.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие Задачи:

1. Отработать методику исследования белок-аптамерных комплексов с использованием компьютерных подходов на примере тромбина и его 15-членного аптамера.

2. Разработать подход по рациональному направленному конструированию аптамеров in silico.

3. Применить предложенный подход для конструирования аптамеров к цитохрому Р450 51 Al и провести их экспериментальную проверку.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Аптамеры

1.1.1 Структура и применение аптамеров

Аптамеры представляют собой короткие РНК или ДНК (одноцепочечные) олигонуклеотиды со стабильной трехмерной структурой, способные связываться с мишенью с высокой афинностью и селективностью. В качестве мишеней для них могут выступать как отдельные ионы (Zn2+) и небольшие органические соединения (например, дисахариды), так и большие молекулы белков или даже целые клетки [Ciesiolka J., 1995; Phillips J.А, 2008]. Способность связываться с мишенью аптамеров определяется как их нуклеотидным составом, так и трехмерной структурой, которая может иметь различные мотивы (участки), такие как: шпильки, квадроплексы, тетра-петли, псевдоузлы и т.д. Некоторые примеры таких структур приведены на рисунке 1

Аптамеры имеют стабильную пространственную организацию, но считается, что она может подстраиваться под сайт связывания при взаимодействии с белками-мишенями. Взаимодействие между аптамером и мишенью может осуществляться за счет электростатических взаимодействий заряженных групп, стерической комплементарно сти взаимодействующих молекул, стэккинг-взаимодействия между ароматическими группами нуклеотидов и аминокислот и за счет образования водородных связей [Hermann Т., 2000]. Аптамеры связываются с мишенями с высокой специфичностью, и изменение в их структуре или точечная мутация в сайте связывания белка-мишени может приводить к значительному изменению аффинности взаимодействия.

А

Т

I

CL

Т

I

п

С-Х-----

г/

т-

G А А

А А G

А

С U

G G

U

5'-GGGUUG UGGCAC U

З'-СССААС ACCGUG С G G

В

U U

5-GGCACGAG-GU А

3'- С С GUG CUС С A G

U С

A G Cf*A А—* 3'

А С G

G А

GC G А A G G С А Т

С GGGT Gaa А А

А G

Т С А А Т G

Т А

G А

Т С С

т

А

Рис. 1. Примеры пространственной организации аптамеров. А - Анти-тромбиновый аптамер, имеющий в составе G-квадроплекс; Б - выпячивание и петля АМФ-связывающего РНК аптамера; В - шпилька тобрамицинового РНК аптамера; Г - аптамер, образованный смыканием трех спиралей (Three-way junction); Д - РНК аптамер витамина В12 образующий псевдоузел. [Baldrich Е. Chapter 17. Aptamers: Versatile Tools for Reagentless Aptasensing. In: Recognition Receptors in Biosensors, M. Zourob (ed.), Springer Science Business Media, LLC 2010, 675-772].

В настоящее время аптамеры рассматриваются в качестве наиболее перспективной замены моноклональных антител, поскольку они практически лишены всех их основных недостатков. Кроме того, аптамеры обладают рядом характеристик, выгодно их отличающих от конкурирующих классов соединений и расширяющих сферу их применения. Среди них можно выделить:

1. Высокая стабильность. Известно, что белковые молекулы очень чувствительны к внешним изменениям и могут легко денатурировать, теряя свою активность. Тогда как аптамеры намного менее зависимы от внешних условий и способны полностью восстанавливать свою структуру и свойства даже после нескольких циклов денатурации-ренатурации [Mascini М., 2008]. Это значительно упрощает их длительное хранение, транспортировку и применение.

2. Простота синтеза и возможность модификации. Разработка и производство моноклональных антител является длительным и дорогим процессом, требующим большого количества лабораторного оборудования и квалифицированного персонала. Помимо этого, коммерческое производство антител для клинического применения связанно с работой с большим количеством клеточного материала [Birch, J.R., 2006]. При этом в процессе производства антител обязательными являются постоянные иммунологические исследования каждой партии белковых молекул. В основе производства аптамеров лежит легко воспроизводящийся химический синтез, что позволяет в больших количествах и с высокой чистотой получать необходимые олигонуклеотиды. Подобный подход позволяет максимально снизить стоимость производства аптамеров по сравнению с синтезом антител. Кроме того, в процессе синтеза в структуру аптамеров могут быть внесены любые модификации, повышающие эффективность, улучшающие стабильность олигонуклеотидов и расширяющие область их применения, например, в качестве сигнальных молекул путем присоединения меток [Ferreira C.S., 2007].

3. Низкая иммуногенность. В отличие от антител, в большинстве случаев аптамеры, состоящие из нуклеотидов, не распознаются иммунной системой как чужеродные объекты, и, соответственно, не вызывают иммунный ответ [Eyetech Study Group, 2002].

4. Разнообразность мишеней. Специфические антитела в большинстве случаев создаются и применяются только для соединений, вызывающих сильный иммунный ответ. Для остальных разработка антител сильно затруднена. Для аптамеров подобных ограничений нет. Специфичные аптамеры могут быть синтезированы как к сложным макромолекулам, так и к малым молекулам (в том числе и токсичным соединениям) и даже к ионам [Jayasena S.D., 1999].

1.1.2 Поиск и синтез аптамеров

В настоящее время основным методом направленного поиска аффинных аптамеров является метод SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment). Данный метод основан на многократном in vitro отборе олигонуклеотидов из

12 15

комбинаторной библиотеки, состоящей из последовательностей. Метод SELEX

состоит из трех многократно повторяющихся последовательных этапов (Рис. 2) [Syed М.А., 2010].

Начальная библиотека

1. Генерация Библиотеки

Мишень

10_15 N |з. Амплификация »v циклов )

Промывка

/>Oty ЭЛ1

f^is

2. Связывание /разделение

Рис. 2. Стандартная схема поиска аптамеров по методу SELEX [Keefe A.D., Cload S.T. SELEX with modified nucleotides. //Curr Opin Chem Biol. 2008, 12(4), 448-56].

На первом этапе происходит синтез библиотеки одноцепочечных олигонуклеотидов со случайными последовательностями длиной в 30-40 нуклеотидов, фланкированные

сайтом связывания праймера. На втором этапе библиотека синтезированных олигонуклеотидов инкубируется с закрепленными на носителе молекулами мишени. После этого происходит отделение связавшихся с мишенью олигонуклеотидов. На этом этапе могут применяться различные методы проверки связывания и отделения неаффинных олигонуклеотидов. Третий этап заключается в увеличении количества молекул, способных связываться с мишенью. С использованием метода ПЦР происходит амплификация отобранных олигонуклеотидов. После этого амплифицированная библиотека отобранных олигонуклеотидов используется для дальнейшей рандомизации на первом этапе метода SELEX. Таким образом, на каждом этапе поиска выбираются аптамеры, лучше всего связывающиеся с мишенью, после чего эти последовательности случайно модифицируются для повышения аффинности.

Для более эффективного отбора аффинных к мишени олигонуклеотидов метод SELEX может дополняться различными современными подходами: аффинная хроматография, капиллярный электрофорез, поверхностный плазмонный резонанс и многие другие [Song К.М., 2011; Mendonsa S.D., 2005].

Кроме применения стандартных нуклеотидов, библиотеки SELEX можно пополнять и модифицированными основаниями, например, с дополнительными флуоресцентными метками [Stojanovic M.N., 2000; Elowe N.H., 2006].

Основным недостатком метода SELEX является присутствие фактора случайности при построении исследуемой библиотеки олигонуклеотидов. Соответственно, далеко не каждый проект по поиску аптамеров к выбранной мишени является успешным. Появились представления, что не для всех белков возможно создание специфичного аптамера.

Тем не менее, к настоящему времени найдено уже большое количество аптамеров к

разнообразным мишеням, отличающихся по длине, нуклеотидным последовательностям

1

й аффинностью к этим мишеням. Данные о многих аптамерах собраны в различных базах данных, в том числе специализированных, например, The Ellington Lab Aptamer Database (http://aptamer.icmb.utexas.edu/). Одним из наиболее изученных аптамеров для белка является антитромбиновый аптамер ТВ А, созданный в 1992 году методом SELEX [Bock L.C., 1992].

i

и •

1.2 Тромбин

1.2.1 Строение, функции тромбина. Активация протромбина

Альфа-тромбин играет ключевую роль в таких процессах, как гемостаз, тромбоз, и дифференцировка клеток [Weitz J.I., 2002; Vergnolle N., 2002; BarShavit R., 1991;]. Этот фермент катализирует превращение фибриногена в фибрин, активацию факторов V, VIII, XI и XIII, а также участвует в активации тромбоцитов [Sambrano G.R., 2001; Bode W., 1992; Siller-Matula J.M., 2011]. Тромбин является сериновой протеазой и имеет общую, характерную для данного класса ферментов, пространственную укладку. Зрелый альфа-тромбин состоит из короткой (легкой) A-цепи и каталитической (тяжелой) Б-цепи [Bode W., 1997].

В аминокислотной последовательности белка выделяют "каталитическую триаду", состоящую из His57, Aspl02 и Serl95, обеспечивающую функционирование фермента. Данные аминокислотные остатки располагаются на нижней части "каньона" каталитического кармана [Bode W., 1997]. В отличие от других сериновых протеаз коагуаляционной системы, каталитическая активность тромбина дополнительно регулируется несколькими участками связывания регуляторов на поверхности белка и петлями, определяющими специфичность взаимодействия фермента с субстратами и ингибиторами [Bode W., 1992; Bode W., 1997].

Два распознающих участка, называемые экзосайтами, являются ключевыми: первый, фибриноген-распознающий сайт, также называемый анион-связывающий экзосайт-1, образован петлей Arg67-Ile82 тяжелой цепи, и второй, гепарин-связывающий сайт (анион-связывающий экзосайт-2), локализованный на С-конце тяжелой цепи альфа-тромбина [Tsiang M., 1995].

Пространственное строение тромбина представлено на рисунке 3. Видно, что оба экзосайта находятся на противоположных сторонах белковой глобулы в удалении от активного центра. Тем не менее, было показано, что они непосредственно участвуют в

n

распознавании и специфическом связывании тромбином ряда макромолекулярных субстратов, ингибиторов и модуляторов. Эти сайты обогащены положительно заряженными остатками (Arg и Lys), которые обеспечивают электростатическое связывание с анионными лигандами и отрицательно заряженными остатками [Bode W., 1992].

Экзосайт-2

Каталитический центр

Петля - 184

Петля - 60

Экзосайт-1

Рис. 3. Трехмерная структура тромбина с основными функциональными областями.

Помимо регулирования активного центра экзосайты тромбина аллостерически связаны и между собой [РеЦ-ега N.8., 2009]. Это обеспечивает регуляцию активности тромбина при помощи лигандов, специфически связывающимися с одним из анион-связывающих сайтов. Предполагается, что эта связь осуществляется через Ыа-связывающий сайт [РеЦ-ега N.8., 2009].

Изначально тромбин синтезируется в виде предшественника - протромбина, состоящего из ОЬА-домена, двух фрагментов активационных пептидов (Ф1 и Ф2) и двух цепей тромбина (легкой и тяжелой). Превращение протромбина в тромбин происходит в

результате последовательного отщепления фрагментов 1 и 2 от каталитического домена и разрыва связи внутри каталитического домена (Arg363-Ile364) с образованием легкой и тяжелой цепи тромбина [Carter I.S.R., 2010]. В зависимости от наличия кофакторов в среде [Carlisle T.L., 1990], расщепление цепи протромбина может происходить двумя путями (Рис. 4).

Активация протромбина и его превращение в "зрелый" тромбин протромбиназным комплексом (фактор Ха, фактор Va, фосфолипиды, Са2+), начинается с расщепления связи Arg363-Ile364 и приводит к образованию промежуточного продукта -миезотромбина, связанного с протромбиновыми фрагментами [Krishnaswamy S., 1987; Mann K.G., 1987]. В дальнейшем происходит последовательное отщепление Ф1 и Ф2. Сначала разрывается связь Serl98- Argl99 при этом отщепляется фрагмент 1, после этого происходит расщепление связи Arg327-Thr328 и высвобождение "зрелого" тромбина [Downing M.R., 1975]. Зрелая, активная форма альфа-тромбина, таким образом, состоит из остатков протромбина с Thr328 до Arg363, что соответствует легкой цепи, и остатков с Ile364 по His622, образующих тяжелую цепь фермента.

Протромбин П

/> Ф1 Ф2 А ь ч

^Т* \ Претромбин-1

г^п m

Ф1 Ф2 А | Б

J [if

Ф2 А

Ф2 ГП

Ф2 А Б А Б

Миезотромбин без Ф1 \ ^^ / Претромбин-2

/

А Б

Альфа - Тромбин

Рис. 4. Пути превращения протромбина в альфа-тромбин.

Существует и второй путь активации протромбина и превращения его в альфа-тромбин, который осуществляется в присутствии фактора Ха, Са2+ и фосфолипидов. Превращение по данному пути начинается с разрыва связи Serl98-Argl99, что приводит к образованию промежуточного продукта - претромбина-1 и протромбинового фрагмента Ф1 (Ala44-Serl98). На следующем этапе происходит отщепление протромбинового фрагмента Ф2 за счет разрыва связи Arg327-Thr328. На этом же этапе образуется наиболее близкий предшественник активного альфа-тромбина - претромбин-2, состоящий из единой полипептидной цепи (включающий легкую и тяжелую цепи) зрелого тромбина. Далее, превращение неактивного претромбина-2 в тромбин заключается в разрыве связи между остатками легкой и тяжелой цепи. Таким образом, наиболее близким предшественником тромбина является претромбин-2, отличающийся только наличием связи Arg363-Ile364.

В процессе "созревания" тромбина, в зависимости от пути активации протромбина, анион-связывающие сайты могут быть как доступны для лигандов, так и закрыты. Недоступность экзосайтов связана с наличием дополнительных фрагментов Ф1 и Ф2, которые постепенно отщепляются в ходе "созревания" тромбина [Downing M.R., 1975]. При этом экзосайт-2 в процессе активации становится доступен лишь в претромбине-2 и зрелом тромбине, поскольку он закрывается активационным фрагментом 2. На рисунке 5 представлена пространственная структура цепей тромбина и Ф2. Видно, что фрагмент 2 не закрывает первый экзосайт тромбина, но находится в области второго экзосайта.

I

Рис. 5. Структура части протромбина, состоящей из цепи тромбина (молекулярная поверхность покрашена в светло-серый цвет) и фрагмента 1 (оранжевый). Красным на поверхности тромбина отмечен экзосайт-1.

Было высказано предположение, что экзосайты в предшественниках тромбина находятся в неактивной конформации, названные проэкзосайтами. Но это переходное состояние остается мало изученным. В работе [Kretz С.А., 2006.] была исследована способность предшественников тромбина связываться с аффинными к зрелому альфа-тромбину лигандами. Претромбин-2, в котором анион-связывающие сайты доступны для лигандов и отличающийся от зрелого тромбина лишь наличием связи между остатками легкой и тяжелой цепи (Arg363-Ile364), связывает широко известные 15-членные аптамеры в два раза хуже. Однако в чем заключается эта неактивная конформация не известно.

1.2.2 Аптамеры к тромбину

В 1992 году Бок и коллеги исследовали выборку из 1013 синтетических олиго-нуклеотидов и обнаружили ингибитор тромбина, связывающийся с ним с высокой

аффинностью и селективностью [Воск Ь.С, 1992]. Найденный методом 8ЕЬЕХ аптамер, тромбин-связывающий аптамер ТВ А, состоит из 15 нуклеотидов и имеет последовательность 5'-ООТТООТОТООТТОО-3\ Трехмерная структура ТВ А была решена методом ЯМР-спектроскопии (Рис. 6) [ЗсЬикге, 1994]. В пространственной конформации этого олигонуклеотида выделяют характерный для всех известных анти-тромбиновых аптамеров О-квадроплекс, состоящий из двух, расположенных друг над другом, О-квартетов. На схеме видно, что аптамер состоит из двух О-квартетов, образованных гуанидинами, соединенными двумя ТТ- и одной ТОТ-петлей. Стабильность внутри О-квартетов обеспечивается неканоническими хугстиновскими взаимодействиями [ОаЦо В., 2009], а в квадроплексе они фиксируются я-стэккинговыми взаимодействиями между параллельно расположенными ароматическими кольцами гуанинов.

Рис. 6. Пространственная структура 15-членного антитромбинового аптамера ТВА.

При исследовании пространственной организации 15-ти членного антитромбинового аптамера были выявлены две возможные зеркальные конформации: Chair-, Basket-конформеры (конформации кресло и корзина) (Рис. 7). Было показано, что пространственная структура этого аптамера становится более устойчивой, когда между гуаниновыми квартетами располагается ион К+ [Reshetnikov R.V., 2011], причем, для образования структуры Chair ион К+ обязателен [Reshetnikov R.V., 2011].

Рис. 7. Возможные пространственные укладки аптамеров (Chair, Basket)

Кроме пространственной структуры самого аптамера методами рентгенно-структурного анализа были получены трехмерные структур аптамер-тромбинового комплекса. Было обнаружено, что в кристалле аптамер связывается не только с фибриноген-распознающим экзосайтом, но и с гепарин-связывающим. В кристалле связывание тромбина с аптамером происходило в соотношении 2:1, при этом аптамер зажат между двумя молекулами тромбина и контактирует сразу с обоими экзосайтами белка (Рис. 8).

В банке данных трехмерных структур PDB имеются пространственные конформации комплексов тромбина с двумя возможными конформерами аптамера: 1HUT и 1НАО [Padmanabhan К., 1993; Padmanabhan К., 1996.]. В первой структуре

Basket

Chair

(1НиТ) аптамер связывается с фибриноген-распознающим сайтом при помощи ТОГ-петли, во втором (1НАО) взаимодействие осуществляется благодаря двум ТТ-петлям.

Рис. 8. Взаимодействие 15-членного аптамера с двумя молекулами тромбина в кристалле (PDBid-lHAO).

С момента открытия были предприняты неоднократные попытки создания улучшенных вариантов этого аптамера. В большинстве случаев они представляют собой его немного измененные, удлиненные версии. Так, в 1997 был найден 29-членный аптамер 60-18 [Tasset D.M., 1997] (Рис. 9), также имеющий в своей структуре характерный G-квадроплекс. В отличие от 15-членного аптамера, данный олигонуклеотид взаимодействует только с гепарин-связывающим сайтом (экзосайтом-2) тромбина [Tasset D.M., 1997].

Рис. 9. Схематичное изображение пространственной укладки 15- членного аптамера (А) и 29-членного (Б) [Zhou G., Huang X., Qu Y. The binding effect of aptamers on thrombin. //Biochem. En. J. 2010, 52, 117-122].

Увеличение аффинности и селективности аптамеров может достигаться созданием гетеродимерных конструкций олигонуклеотидов и введением химических модификаций, обеспечивающих образование дополнительных связей, в том числе и ковалентных. Так, для тромбина были успешно синтезированы конструкции, состоящие из двух известных аптамеров: TCAGTCCGTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT и

ATGTCTACTGGTTGGTGTGGTTGGGTAG, соединенные политимидиновым линкером. Второй олигонуклеотид представлял собой немного удлиненный ТВА, и оба они имеют в своей пространственной структуре характерный G-квадроплекс. Было отмечено, что гетеродимерные конструкции обладают большей аффинностью по сравнению с отдельными аптамерами [Рахметова С.Ю., 2010А]. Результаты исследования по поиску оптимальной длины линкера указывали на то, что в такой гетеродимерной конструкции взаимодействие осуществляется сразу с обоими экзосайтами тромбина, при этом молекула белка зажата между двумя связанными аптамерами. Также были проведены исследования по замене тимидина на BrdU и IdU. Было показано, что оба варианта фотоаптамера обладали лучшей аффинностью по

сравнению с нормальными вариантами, а использование фотоаптамера в гетеродимерной конструкции позволило значительно увеличить связывание с тромбином [Рахметова С.Ю., 201 ОБ].

Помимо ТВА в банке РВВ имеются структуры комплексов тромбина еще двух антитромбиновых аптамеров: ДНК- и РНК-аптамерами (417У и ЗЕШ2). 417У содержит комплекс тромбина с 27-членным ДНК аптамером (Рис. 10А). Этот аптамер взаимодействует только со вторым экзосайтом, и в своей структуре имеет два О-квартета, аналогичные ТВА. В записи 3002 представлен комплекс тромбина с 26-членным РНК-аптамером (Рис. 10Б). Как и 27-членный ДНК аптамер, он также взаимодействует со вторым экзосайтом.

Рис. 10. Комплексы тромбина с 27-нуклеотидным ДНК (417У) (А) и РНК аптамером (3002) на втором экзосайте (Б). Для наглядности на рисунках слева изображен ТВА, расположенный на первом экзосайте.

1.3 Цитохромы

1.3.1 Функции цитохромов

Цитохромы являются сложными железосодержащими белками, небелковая группа которых представлена гемом. Впервые они были описаны в 1886 году Мак-Манном под названием гистогематины, но роль их в клетках была выяснена лишь в 1925 году. Данные белки широко распространены в растительных, в животных клетках и микроорганизмах [Ленинджер А., 1976]. Цитохромы являются мембраносвязанными белками, локализуются в митохондриях, ЭПР, хлоропластах и хроматофорах и играют ключевую роль в окислительных процессах клетки, таких как: клеточное дыхание, фотосинтез, микросомальное окисление и др. Перенос электрона при этом в белке происходит благодаря изменению валентности атома железа, входящего в состав гема [Вив Ш., 2002].

Атом Бе, входящий в состав гемов цитохромов и подвергающийся окислению и восстановлению, координирован четырьмя связями с атомами азота порфириновых колец и двумя - с лигандами, принадлежащими полипептидным цепям (остатки гистидина, цистеина). Или, как в случае цитохрома Р450 (СУР), молекулой воды (в свободном состоянии) или субстрата.

1.3.2 Супер семейство цитохромов Р450

Цитохромы Р450 являются широко изучаемым суперсемейством, относящимся к цитохромам класса Ь, для которого настоящее время известно 11500 индивидуальных белков, выполняющих в организме различные функции. С одной стороны, цитохромы Р450 участвуют как в метаболизме эндогенных субстратов (таких как липиды, витамины, гормоны), с другой же, представители этого суперсемейства участвуют в окислении экзогенных соединений (ксенобиотики, лекарства). Считается, что до 75% лекарств метаболизируется с участием этих ферментов.

Основная функция цитохромов Р450 заключается в проведении монооксигеназной реакции - присоединения одного атома кислорода к органическому субстрату и окисления второго атома кислорода до Н20 (Схема). На рисунке 11 представлены

основные стадии каталитического цикла цитохрома Р450, приводящего к гидроксилированию субстрата (Я-Н).

ЯН + 2е+ 02 + 2Н+ -> ЯОН + Н20

Схема №1. ЯН - субстрат, ЯОН - продукт окисления. Электроны для этой реакции берутся из ЫАБ(Р)Н и доставляются из одного или нескольких редокс- партнеров.

Рис. 11. Каталитический цикл цитохрома Р450.

На первом этапе связывание субстрата приводит к смещению дистальной молекулы воды. Это вызывает сдвиг спинового равновесного состояния гемового железа с низко спинового (Б = 1/2) к высоко спиновому (Б = 5/2), что повышает положительный потенциал железа и способствует переносу электрона от редокс-партнера для перевода железа гема в двухвалентное состояние. Двухвалентное железо в дальнейшем связывает кислород с образованием первого промежуточного состояния. Перенос второго

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Щербинин, Дмитрий Сергеевич, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ленинджер А., Биохимия. Молекулярные основы структуры и функций клетки, пер. с англ., М., 1976.

- - 2. Рахметова С.Ю., Радько С.П., Гнеденко О.В., Бодоев Н.В., Иванов A.C., Арчаков А.И. Гетеродимерные фотоаптамерные конструкции как новый подход к повышению эффективности формирования фотосшивок с белком-мишенью // Биомедицинская химия. 201 OA., 56, 1, 72-81.

3. Рахметова С.Ю., Радько С.П., Гнеденко О.В., Бодоев Н.В., Иванов A.C., Арчаков А.И. Сравнительный термодинамический анализ взаимодействия тромбина с антитромбиновыми аптамерами и их гетеродимерной конструкцией // Биомедицинская химия. 2010Б., 56, 3, 404-411.

4. Ahmad K.M., Oh S.S., Kim S., McClellen F.M., Yi Xiao, Soh H.T. Probing the Limits of Aptamer Affinity with a Microfluidic SELEX Platform. // PLoS One. 2011,6(11) 27051.

\

5. Ahuja S, Jahr N, Im SC, Vivekanandan S, Popovych N, Le Clair SV, Huang R, Soong R, Xu J, Yamamoto K, Nanga RP, Bridges A, Waskell L, Ramamoorthy A. A Model of the Membrane-bound Cytochrome b5-Cytochrome P450 Complex from NMR and Mutagenesis Data. // J Biol Chem. 2013, 26;288(30), :22080-95.

6. Anderson P.J., Nesset A., Bock P.E. Effects of activation peptide bond cleavage and fragment 2 interactions on the pathway of exosite I expression during activation of human prethrombin 1 to thrombin. // J. Biol. Chem. 2003, 278(45), 44482-8.

7. Bakan A., Bahar I. The intrinsic dynamics of enzymes plays a dominant role in determining the structural changes induced upon inhibitor binding. //Proc. Natl. Acad.

'. Sei. USA. 2009, 106(34), 14349-54.

8. BarShavit R., Sabbah V., Lampugnani M.G., An Arg- Gly-Asp sequence within thrombin promotes endothelial cell adhesion. // J. Cell Biol., 1991, 112, 335-344.

9. Birch J.R.; Racher A.J. Antibody production. // Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58, 671-685.

10. Bock L.C., Griffin L.C., Latham J.A., Vermaas E.H., Toole J.J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. // Nature. 1992, 6;355(6360), 564-6.

11. Bode W., Brandstetter H., Mather T., Stubbs M.T. Comparative analysis of haemostatic proteinases: Structural aspects of thrombin, factor Xa, factor IXa and protein C. // Thromb. Haemost. 1997, 78, 501-511.

12. Bode W., Turk D., Karshikov A. The refined 1.9-Ä X-ray crystal structure of D-Phe-Pro-Arg chloromethylketone- inhibited human a-thrombin: Structure, analysis, overall structure, electrostatic properties, detaild active-site ge- ometry, and structure-function relationship. //Protein Sei. 1992, 1, 426-471.

13. Brody E.N., Gold L. SOMAmers as therapeutic and diagnostic agents. // J Biotechnol, 74,5-13.

14. Carlisle T.L., Bock P.E., Jackson C.M.. Kinetic intermediates in prothrombin activation. Bovine prethrombin 1 conversion to thrombin by factor X. // J Biol Chem. 1990, 15;265(35), 22044-55.

15. Carter IS, Vanden Hoek AL, Pryzdial EL, Macgillivray RT.Thrombin a-chain: activation remnant or allosteric effector? // Thrombosis. 2010, 2010, 416167.

16. Case D.A., Cheatham T., Darden T., Gohlke H., Luo R., Merz K.M. Jr, Onufriev A., Simmerling C., Wang B., Woods,R. The AMBER biomolecular simulation programs. // J. Computat. Chem. 2005, 26, 1668-1688.

17. Chushak Y., Stone M.O. In silico selection of RNA aptamers. // Nucleic Acids Research, 2009, 37, 12, 87.

18. Ciesiolka J, Gorski J, Yarns M. Selection of an RNA domain that binds Zn2+. // RNA. 1995, 1(5), 538-50.

19. Das R., Baker. D. Automated de novo prediction of native-like RNA tertiary structures. // Proc. Natl Acad. Sei. USA. 2007, 104, 14664-14669.

20. Di Cera E., Guinto E.R., Vindigni A., The Na+ binding site of thrombin. // J. Biol. Chem.

1995,270, 22089-22092.

21. Downing M.R., Butkowski R.J., Clark M.M., Mann K.G. Human prothrombin activation. //JBiolChem. 1975, 10;250(23), 8897-906

22. Ellington A.D., Szostak J.W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. //Nature. 1990, 346(6287), 818-22.

23. Elowe N.H., Nutiu R., Allali-Hassani A., Cechetto J.D., Hughes D.W., Li Y., Brown E.D. Small-molecule screening made simple for a difficult target with a signaling nucleic acid aptamer that reports on deaminase activity. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006, 45, 5648-5652.

24. Estrada DF, Laurence JS, Scott EE. Substrate-modulated cytochrome P450 17A1 and cytochrome b5 interactions revealed by NMR. // J Biol Chem. 2013, 288(23), 17008-18.

25. Eyetech Study Group. Preclinical and phase 1A clinical evaluation of an anti-VEGF pegylated aptamer (EYE001) for the treatment of exudative age-related macular degeneration. // Retina. 2002, 22, 143-152.

26. Ferreira C.S., Missailidis S. Aptamer-based therapeutics and their potential in radiopharmaceutical design. // Braz. Arch. Biol. Technol. 2007, 50, 63-76.

27. Fischer, R.T., Trzaskos, J.M., Magolda, R.L., Ko, S.S., Brosz, C.S., Larsen, B. Lanosterol 14 alpha-methyl demethylase. Isolation and char- acterization of the third metabolically generated oxidative demethyla- tion intermediate. // J. Biol. Chem. 1991, 266, 61246132.

28. Gatto B., Palumbo M., Sissi C. Nucleic acid aptamers based on the G-quadruplex structure: therapeutic and diagnostic potential. // Curr. Med. Chem. 2009, 16(10), 124865.

29. Gotoh, O. Substrate recognition sites in cytochrome P450 family 2 (CYP2) proteins inferred from comparative analyses of amino acid and coding nucleotide sequences. // J. Biol. Chem. 1992, 267, 83-90.

30. Guengerich, F.P. Comparisons of catalytic selectivity of cytochrome P450 subfamily

enzymes from different species. // Chem. Biol. Interact. 1997, 106, 161-182.

31. Hayward S., de Groot B.L. Normal modes and essential dynamics. // Methods Mol. Biol. 2008, 443, 89-106.

32. Hermann T, Patel DJ. Adaptive recognition by nucleic acid aptamers. //Science. 2000, 4;287(5454), 820-5.

33. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: visual molecular dynamics. // J Mol Graph. 1996, 14(1), 33-8, 27-8.

34. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature. // Nomenclature of tetrapyrroles, Recommendations. Eur. J. Biochem. 1986.

35. Jayasena S.D. Aptamers: An emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics. // Clin. Chem. 1999,45, 1628-1650.

36. Kollman P.A., Massova I., Reyes C., Kuhn B., Huo S., Chong L., Lee M., Lee T., Duan Y., Wang W., Donini O., Cieplak P., Srinivasan J., Case Calculating structures and free energies of complex molecules: combining molecular mechanics and continuum models.//Acc Chem Res. 2000, 33(12), 889-97.

37. Kretz C.A., Stafford A.R., Fredenburgh J.C., Weitz J.I. HD1, a thrombin-directed aptamer, binds exosite 1 on prothrombin with high affinity and inhibits its activation by prothrombinase. //J. Biol. Chem. 2006, 281(49), 37477-85.

38. Krishnaswany S., Church W.R., Nesheim M.E., Mann K.G. Activation of human prothrombin by human prothrombinase: Influence of factor Va on the reaction mechanism. // J. Biol. Chem. 1987, 262, 3291-3299.

39. Leach A. Molecular Modelling: Principles and Applications. // Pearson Education EMA, 2001,353.

40. Lepesheva, G.I., and Waterman, M.R. Sterol 14alpha-demethylase cytochrome P450 (CYP51), a P450 in all biological kingdoms. // Biochim. Biophys. Acta, 2007, 3, 467477.

41. Lill M. Virtual screening in drug design. // Methods Mol Biol. 2013, 993, 1-12.

42. Lin P.H., Tsai C.W., Wu J.W., Ruaan R.C., Chen W.Y. Molecular dynamics simulation of the induced-fit binding process of DNA aptamer and L-argininamide. // Biotechnol J. 2012, 7(11), 1367-75.

43. Long S.B., Long M.B., White R.R., Sullenger B.A. Crystal structure of an RNA aptamer bound to thrombin // Rna 2008, 14, 2504-2512

44. Mann K.G. The assembly of blood clotting complexes on membranes. // Trends Biochem. Sci. 1987, 12, 229-233.

45. Mascini M. Aptamers and their applications. // Anal. Bioanal. Chem. 2008, 390, 987988.

46. Massova I., Kollman P.A. Combined molecular mechanical and continuum solvent approach (MM-PBSA/GBSA) to predict ligand binding // Perspectives in Drug Discovery and Design 2000, 18, 113-135.

47. Mayer G. The Chemical Biology of Aptamers // Angewandte Chemie Int. 2009, 48(45), 2672-2689.

48. Mendonsa S.D.; Bowser M.T. In vitro selection of aptamers with affinity for neuropeptide Y using capillary electrophoresis. // J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 93829383.

49. Munro A.W., Girvan H.M., McLean K.J. Cytochrome P450~redox partner fusion enzymes. // Biochimica et biophysica acta. 2007. 1770, 3, 345-59.

50. Negishi, M., Iwasaki, M., Juvonen, R.O., Sueyoshi, T., Darden, T.A., Pedersen, L.G. Structural flexibility and functional versatility of cytochrome P450 and rapid evolution. // Mutat. Res. 1996, 350, 43- 50.

51. Freeman W.H. 2002. Section 18.3. The Respiratory Chain Consists of Four Complexes: Three Proton Pumps and a Physical Link to the Citric Acid Cycle. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemistry. 5th edition, New York, 2002.

5 2. Nomenclature of electron-transfer proteins //1991. T. 611. C. 599-611.

53. Padmanabhan K., Padmanabhan K.P., Ferrara J.D., Sadler J.E., Tulinsky A. The structure of alpha-thrombin inhibited by a 15-mer single-stranded DNA aptamer. // J Biol Chem. 1993, 25;268(24), 17651-4.

54. Padmanabhan K., Tulinsky A. An ambiguous structure of a DNA 15-mer thrombin complex.// Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1996, l;52(Pt 2), 272-82.

55. Padmanabhan K., Tulinsky A. An ambiguous structure of a DNA 15-mer thrombin complex // Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1996, 52(Pt 2), 272-82.

56. Pagano B., Martino L., Randazzo A., Giancola C. Stability and binding properties of a modified thrombin binding aptamer. // Biophys J. 2008, 94(2), 562-9.

57. Petrera N.S., Stafford A.R., Leslie B.A., Kretz C.A., Fredenburgh J.C., Weitz J.I. Long range communication between exosites 1 and 2 modulates thrombin function. // J Biol. Chem. 2009, 18;284(38), 25620-9.

58. Phillips JA, Lopez-Colon D, Zhu Z, Xu Y, Tan W. Applications of aptamers in cancer cell biology. // Anal Chim Acta. 2008, 28;621(2), 101-8.

59. Pikuleva I.A. Cytochrome P450s and cholesterol homeostasis. // Pharmacol Ther. 2006, 112(3), 761-73.

60. Podust, L.M., von Kries, J.P., Eddine, A.N., Kim, Y., Yermalitskaya, L.V., Kuehne, R., Ouellet, H., Warrier, T., Altekoster, M., Lee, J.S., Rademann, J., Oschkinat, H., Kaufmann, S.H., and Waterman, M.R. Small-molecule scaffolds for CYP51 inhibitors identified by high-throughput screening and defined by X-ray crystallography. //

' Antimicrob. Agents Chemother., 2007, 11, 3915-3923.

61. Reshetnikov R.V., Sponer J., Rassokhina O.I., Kopylov A.M., Tsvetkov P.O., Makarov A.A., Golovin A.V. Cation binding to 15-TBA quadruplex DNA is a multiple-pathway cation-dependent process. //Nucleic Acids Res. 2011 39(22), 9789-802.

62. Sambrano G.R., Weiss E.J., Zheng Y.W., Huang W., Coughlin S.R. Role of thrombin signalling in platelets in haemostasis and thrombosis. // Nature. 2001, 413, 74-78.

63. Sanbonmatsu K.Y., Blanchard S.C., Whitford P.C. Biophysical approaches to translational control of gene expression // Biophysics for the Life Sciences Volume 1, 2013, pp 51-68 Molecular Dynamics Simulations of the Ribosome.

64. Schultze, P., Macaya, R.F., Feigon. Three-dimensional solution structure of the thrombin-binding DNA aptamer d(GGTTGGTGTGGTTGG). // J. Journal: (1994) J.Mol.Biol. 235: 1532-1547.

65. Siller-Matula J.M., Schwameis M., Blann A., Mannhalter C., Jilma B. Thrombin as a multi-functional enzyme. Focus on in vitro and in vivo effects. // Thromb Haemost. 2011, 106(6), 1020-33.

66. Song K.M.; Cho M.; Jo H.; Min K.; Jeon S.H.; Kim T.; Han M.S.; Ku J.K.; Ban C. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer. // Anal. Biochem. 2011,415, 175-181.

67. Spyrakis F., BidonChanal A., Barril X., Luque F.J. Protein flexibility and ligand recognition: challenges for molecular modeling. // Curr. Top. Med. Chem. 2011, 11(2), 192-210.

68. Stojanovic M.N.; de Prada P.; Landry D.W. Fluorescent sensors based on aptamer self-assembly. //J.Am. Chem. Soc. 2000, 122, 11547-11548.

69. Stromstedt M., Waterman M.R., Haugen T.B., Tasken K., Parvinen M., Rozman D. Elevated expression of lanosterol 14alpha-demethylase (CYP51) and the synthesis of oocyte meiosis-activating sterols in postmeiotic germ cells of male rats. // Endocrinology

'•>■■ 1998,5,2314-2321.

70. Strushkevich, N., Usanov, S.A., and Park, H.W. Structural basis of human CYP51 inhibition by antifungal azoles. // J. Mol. Biol., 2010, 4, 1067-1078.

71. Stulov S.V., Mankevich O.V, Novikov R.A., Tkachev Y.V., Timofeev V.P., Dugin N.O., Pozdnev V.F., Fedyushkina I.V., Scherbinin D.S., Veselovsky A.V., Misharin A,Yu. Synthesis and molecular modeling of (40R)- and (40S)- 40-substituted 20-{[(E)-androst-5-en-17-ylidene]-methyl}oxazolines // Steroids, 2013, 78, 5, 521-527.

72. Syed M.A.; Pervaiz S. Advances in aptamers. // Oligonucleotides 2010, 20, 215-224.

73. Tasset D.M., Kubik M.F., Steiner W. Oligonucleotide inhibitors of human thrombin that bind distinct epitopes. // J Mol Biol. 1997, 10;272(5), 688-98.

74. Teilum K., Olsen J.G., Kragelund B.B. Protein stability, flexibility and function. // Biochim. Biophys. Acta. 2011, 1814(8), 969-76.

75. Timkovich, R., Cork, M. S., Gennis, R. B., Johnson, P. Y. (1985) J. Am. Chem. SOC. 107,6069-6075.

76. Tsiang M., Jain A.K., Dunn K.E., Rojas M.E., Leung L.L., Gibbs C.S. Functional mapping of the surface residues of human thrombin. // J. Biol. Chem. 1995, 270(28), 16854-63.

77. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase // Science. 1990, 249(4968), 505-10.

78. Vergnolle N., Derian C.K., D'Andrea M.R., Steinhoff M., Andrade-Gordon P. Characterization of thrombin- induced leukocyte rolling and adherence: A potential proinflammatory role for proteinase-activated receptor-4. // J. Immunol. 2002, 169, 1467-1473.

79. Vijayalakshmi J., Padmanabhan K.P., Mann K.G., Tulinsky A. The isomorphous structures of prethrombin2, hirugen-, and PPACK-thrombin: changes accompanying

' ' activation and exosite binding to thrombin. // Protein Sci. 1994, 3(12), 2254-71.

80. Weitz J.I., Buller H.R.. Direct thrombin inhibitors in acute coronary syndromes: Present and future. // Circulation. 2002, 105, 1004-1011.

81. Wu Q., Picard V., Aiach M., Sadler J.E. Activation-induced exposure of the thrombin anion-binding exosite. Interactions of recombinant mutant prothrombins with thrombomodulin and a thrombin exosite-specific antibody. // J. Biol. Chem. 1994, 269(5), 3725-30.

82. Yuriev E., Ramsland P.A. Latest developments in molecular docking: 2010-2011 in review. // J Mol Recognit. 2013, 26(5), 215-39.

Zharkova M.S., Sobolev B.N., Oparina N.Yu., Veselovsky A.V., Archakov A. I. Prediction of amino acid residues participated in substrate recognition by cytochrome P450 subfamilies with broad substrate specificity. // J.Mol.Recogn. 2013, 26(1), 86-91.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит научного руководителя д.б.н. Веселовского Александра Владимировича за постоянную помощь в работе, ценные советы и поддержку на протяжении всех этапов исследования.

Также автор выражает благодарность коллективу лаборатории медицинской геномики ФГБУ «ИБМХ» РАМН и отдельно - кандидату биологических наук Радько Сергею Павловичу за помощь в синтезе олигонуклеотидов; сотрудникам лаборатории межмолекулярных взаимодействий ФГБУ «ИБМХ» РАМН и лично ее заведующему - д.б.н, профессору Иванову Алексею Сергеевичу за помощь в экспериментальном тестировании аффинности и селективности сконструированных аптамеров;

заведующему лаборатории параллельных вычислений и информационных технологий ФГБУ «ИБМХ» РАМН, к.х.н., Скворцову Владлену Станиславовичу за помощь и ценные консультации в области компьютерного моделирования.

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки (соглашение №8274)