Конкурентный транспорт ионов в цитоплазматическом канале доступа Na+,K+-АТФазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Ташкин, Всеволод Юрьевич

• Ташкин, Всеволод Юрьевич
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Ташкин, Всеволод Юрьевич

СОДЕРЖАНИЕ

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Выделение №+,К+АТФазы

1.2. Цикл Альберса-Поста

1.3.Неканонические режимы работы белка

1.4.Структура №+,К+-АТФазы

1.5.Различие структуры №+,К+-АТФазы в двух основных конформациях

1.6.Ингибиторы №+,К+-АТФазы

1.7.Сайты связывания ионов в белке

1.7.1.Гипотетическая последовательность связывания

1.8. Определение констант связывания К+ и Ка+ в цитоплазматических сайтах связывания Ка+,К+-АТФазы

1.9.Специфичность Ка+,К+-АТФазы к переносимым ионам

1.10.Влияние многовалентных ионов

1.11 .Электрогенность Ка+,К+-АТФазы. Диэлектрические коэффициенты

1.12.Модель электрогенного транспорта ионов Ка+,К+-АТФазой

1.13.Исследования на клетках. Нестационарный транспорт

1.14.Исследования на плоских бислойных мембранах. Метод адмиттанса

1.15.Влияние рН на активность №+,К+АТФазы

1.16 .Постановка задачи

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.Материалы

2.2 .Методы

2.2.1.Методы формирования БЛМ и регистрации токов Ыа+,К+-

АТФазы

2.2.2.Метод компенсации внутримембранного поля с помощью второй гармоники емкостного тока

3.РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 .Опыты с саяеё-АТР

3.2.Опыты с саеес!-Н+

3.2.1.Опыты на БЛМ без адсорбированных мембранных фрагментов

3.2.2.0пыты с Ка+,К+-АТФазой

3.2.2.1. Определение констант связывания Ыа и К" в

цитоплазматических сайтах Ыа+Х-АТФазы

3.2.2.2.Зависимость связывания Ыа+ в цитоплазматических сайтах от

концентрации

3.3 .Заключение

4.ВЫВОД Ы

5.СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИИ

5-IAF - 5-(иодоацетамидо)флюоресцеин

Caged-ATP - аденозин-5'-трифосфат, РЗ-(1-(2-нитрофенил)-этил) эфир Caged-Ef (MNPS) - 2-метокси-5-нитрофенилсульфат, натриевая соль DPhPC - дифитаноилфосфатидилхолин

EPPS - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинпропансульфоновая кислота MES - 2-(М-морфолино)этансульфоновая кислота NMG - N-Метил-О-глюкамин PCP - пентахлорфенол

RH-421 - р<[-(4-Сульфобутил1)-4-(4-(4-(дипентиламино)фенил) бутадиенил) пиридиний]

SDS - додецилсульфат, натриевая соль TRIS - трис(гидроксиметил)аминометан АДФ - аденозиндифосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота АЦП - аналого-цифровой преобразователь БЛМ - бислойная липидная мембрана ДК - диэлектрический коэффициент МФ - мембранный фрагмент УФ - ультрафиолетовый ЦАП - цифро-аналоговый преобразователь ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конкурентный транспорт ионов в цитоплазматическом канале доступа Na+,K+-АТФазы»

ВВЕДЕНИЕ

Na+,K+-AT<J>a3a - один из наиболее хорошо изученных белков семейства Р-АТФаз. Р-АТФазы осуществляют активный ионный транспорт через биологические мембраны. Они сопрягают гидролиз молекулы АТФ с ионным транспортом, за счет которого поддерживается трансмембранный градиент концентрации ионов натрия, калия, кальция и протонов, необходимый для протекания многих жизнеобеспечивающих процессов клетки. Эти белки обнаружены фактически во всех эукариотических, а также и в бактериальных организмах (Axeisen and Palmgren, 1998).

Белки этого семейства имеют достаточно консервативные аминокислотные последовательности, работают по принципиально одной и той же схеме. Механизм активного транспорта, осуществляемого и Ка+,К+-АТФазой, и другими АТФазами этого семейства, включает в себя серию превращений между различными конформационными состояниями, из которых основными являются три:

1. Ei - белок способен связать ионы с цитоплазматической стороны мембраны;

2. промежуточное - состояние окклюзии, когда ионы не могут обмениваться ни с цитоплазматической средой, ни с внеклеточной.

3. Е2 - белок способен связать ионы с внеклеточной стороны мембраны;

Особенностью Ка+,К+-АТФазы является наличие трех сайтов связывания

для ионов натрия с цитоплазматической стороны. В обмен на перенос этих трех ионов натрия из клетки, в цитоплазму переносятся два иона калия. Это и есть рабочий цикл №+,К+-АТФазы. В процессе функционирования этого белка возникает электрический ток, что позволяет изучать его «электрическими методами».

Изучению структуры и молекулярным аспектам работы этого белка посвящено колоссальное количество работ, которые включают следующие направления:

• разработка различных методов выделения и исследования белка;

• определение аминокислотной последовательности и генов, ее кодирующих;

• определение основных стадий рабочего цикла и ингибиторов, способных их селективно блокировать;

• определение структуры белка

Несмотря на интенсивные исследования, проводившиеся в течение нескольких десятков лет, все еще существует множество вопросов, связанных с механизмом его функционирования. Прежде всего, несмотря на то, что положение мест связывания ионов в белке установлено (они расположены в трансмембранной части белка примерно на 1/3 расстояния от цитоплазматической поверхности мембраны), структура каналов, соединяющих эти места с растворами с цитоплазматической и внеклеточной сторонами белка, неизвестны. Установление структуры белка позволило существенно приблизиться к пониманию механизма его функционирования, но структура представляет собой всего лишь статичную картину, а для выяснения детального механизма активного транспорта необходимы количественные измерения его кинетических и равновесных параметров, а также влияния на них внешних факторов. Наименее изученным в этой связи представляется канал, связывающий центры связывания с раствором с цитоплазматической стороны белка. Константы равновесия для связывания ионов с цитоплазматической стороны белка, измеренные с помощью различных экспериментальных подходов, сильно различаются, а соответствующие этим процессам константы скорости до последнего времени определить не удавалось. Большое внимание исследователей в последнее время привлекают неканонические режимы функционирования белка, когда оказывается, что в определенных условиях Ка+,К+-АТФаза оказывается способна переносить через мембрану не только ионы калия и натрия, но и протоны. Это может указывать на общность эволюционного пути Ка+,К+-АТФазы и других АТФаз этого семейства (например, Са2+-АТФазы или Н+,К+-АТФазы), у которых перенос протонов включен в их основную функцию.

Нарушения работы Ма+,К+-АТФазы ведут к множеству различных заболеваний. Так, различные мутации а-субъединицы белка вызывают гемиплегическую мигрень 2 типа, дистонию-паркинсонизм с острым началом, детскую гемиплегию и синдром Конна - тяжелые заболевания, проявляющиеся, в основном, в комплексе неврологических симптомов, и, в случае болезни Кона, серьезными нарушениями обмена веществ. Согласно последним данным, одним из эффектов этих мутаций является снижение в несколько раз сродства к натрию в третьем сайте, и, в случае синдрома Конна, снижение на 2-3 порядка сродства к ионам калия. Поэтому изучение связывания ионов в цитоплазматическом канале доступа может помочь прояснить детали этих болезней на молекулярном уровне.

Ответы на многие из этих вопросов могут быть получены с помощью электрических измерений. Перенос заряда, связанный с перемещением ионов (электрогенный транспорт) изучался как в стационарном, так и в нестационарном режиме. В последнем случае изучались отдельные электрогенные стадии активного транспорта в условиях, когда Ка+,К+-АТФаза не способна совершить полный цикл функционирования: самый распространенный способ достижения таких условий - удаление из среды ионов калия.

Исследования нестационарного электрогенного транспорта в очищенной от посторонних белков Ка+,К+-АТФазе можно проводить на модельной системе, в которой мембранные фрагменты (МФ), содержащие Ка+,К+-АТФазу, адсорбированы на поверхности бислойной липидной мембраны (БЛМ). Такая система позволяет исследовать электрогенный транспорт ионов при приложении переменного напряжения, вызванный либо быстрым освобождением АТФ из связанной формы, либо быстрым закислением среды. Согласно общепринятой гипотезе в цитоплазматическом канале доступа электрогенным является транспорт только третьего иона натрия, который связывается в III, высокоспецифичном для него, сайте. Неэлектрогенность связывания 2-х других ионов натрия так же, как и обоих ионов калия, остаются предметом дискуссий. В последние 10 лет получила распространение гипотеза, согласно которой электрический ток, вызванный транспортом первого и второго ионов натрия (и 2-

х ионов калия) «скрыт» противотоком протонов. В этом случае должна наблюдаться конкуренция между ионами натрия, калия и протонами за неспецифические сайты связывания белка, и быстрое закисление среды (т. е. скачок концентрации протонов) может использоваться не только для изучения связывания протонов, но также Иа+ и К+. Кроме того, согласно флуоресцентным данным, снижает сродство к в Е^конформации, поэтому представляет интерес изучить его влияние на связывание электрическими методами. Новизна исследования.

В работе впервые прямыми электрическими методами была исследована конкуренция между различными ионами в цитоплазматическом канале доступа №+,К+-АТФазы и получены константы связывания ионов натрия, калия и протонов в нем, а также влияние на них ионов магния. Использование метода измерения малых приращений адмиттанса, вызванных фотолизом caged-соединений, позволяет определить равновесные константы связывания вышеназванных ионов и кинетические константы вызванных этим связыванием процессов (перенос ионов между раствором и центрами связывания в белке, конформационные переходы) в диапазоне частот приложенного напряжения 11000 Гц. Ранее цитоплазматическое связывание ионов изучалось только косвенными методами - измерениями скоростей потоков ионов, окклюзии меченых ионов, скорости гидролиза АТФ белком и с использованием флуоресцентных зондов.

Цели и задачи исследования:

Целью работы было изучение возможности протонного транспорта №+,К+-АТФазой, а также связывания различных ионов в цитоплазматическом канале доступа. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

• Выяснить, происходит ли протонный транспорт в На+,К+-АТФазе.

• Выяснить, имеет ли место конкуренция между ионами натрия, калия и протонами за цитоплазматические сайты связывания.

• Определить параметры транспорта К+ и Н+ в цитоплазматическом канале доступа, а также влияние на них ионов магния.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Выделение Ыа+,К+-АТФазы

Эксперименты по изучению №+,К+-АТФазы проводятся либо на клетках, содержащих этот фермент в высокой концентрации (эритроциты, кардиомиоциты, ооциты, гигантский аксон кальмара), либо на модельных системах, используя предварительно выделенный и очищенный белок.

Выделение №+,К+-АТФазы основано на различных модификациях метода Йоргенсена. Сущность метода состоит в последовательном удалении всех мембранных белков, кроме №+,К+-АТФазы и части мембранных липидов. После дифференциального центрифугирования получается суспензия незамкнутых мембранных фрагментов, содержащих высокоактивный фермент в высокой концентрации (вплоть до 104 на квадратный микрометр) (рис. 1).

Рис. 1. Электронная микрофотография мембранного фрагмента, содержащего Ыа+,К+-АТФазу. Полоска - 100 нм. (Deguchi е1 а1., 1977).

Степень очистки превышает 90% от общей массы белка (Jorgensen, 1974). Мембранные фрагменты содержат примерно 0,8 мг фосфолипидов на 1 мг белка, и 0,2 мг холестерина (Buhler et al., 1991). Полученные таким образом препараты Na+,K+-AT<Da3bi широко применяются в структурных и функциональных исследованиях фермента.

1.2.Цикл Альберса-Поста

В физиологических условиях гидролиз одной молекулы АТР сопряжен с переносом трех ионов натрия во внеклеточную среду и двух ионов калия в цитоплазму. Поскольку транспорт катионов каждого типа идет против их электрохимических градиентов, он должен быть сопряжен с конформационной перестройкой белка, в ходе которой энергия переносимого иона повышается на величину, превышающую разность его свободных энергий в цитоплазме и во внеклеточной среде (Павлов, 1999). В одной из конформаций (Ej) в белке открыты сайты связывания для ионов, находящихся в цитоплазме, а в другой (Е2)- во внеклеточной среде. Такая модель была предложена Альберсом и Постом (Albers, 1967).

Известные на сегодняшний день физические модели работы белка берут за основу эту модель (рис. 2).

Помимо субстратов, для работы фермента требуется присутствие ионов магния, действующих как кофактор (Glynn, 1985). Магний образует с АТР комплекс, который служит субстратом в реакции фосфорилирования. В высоких концентрациях (десятки мМ) магний обладает ингибирующим действием. Весь транспортный цикл обратим при соответствующих условиях. При одновременном наличии АТФ, ионов натрия и магния в цитоплазме и калия во внешней среде Na+,K+-ATOa3a функционирует в стационарном режиме, совершая при оптимальных концентрациях субстратов 150 - 200 оборотов в секунду при физиологической температуре и около 20 оборотов - при комнатной.

«

H&gEjATP*

(Na3)ErP ч->P-E2(N*3)

3Na+<

J

3Na+

ATP

2K+

2K

Рис. 2. Цикл Альберса - Поста и схема переноса ионов через мембрану. Левая часть схемы отражает реакции, локализованные на цитоплазматической стороне мембраны, правая - на внеклеточной стороне. Общепринятыми символами Ei и Ег обозначен белок в разных конформациях.

1.3.Неканонические режимы работы белка

Ценная информация о механизме работы Na+,K+-AT<Da3bi может быть получена из экспериментов, в которых ионы натрия или калия отсутствуют в среде. В таких упрощенных условиях №+,К+-АТФаза способна осуществлять часть своих транспортных функций.

В отсутствие ионов калия и в присутствии ионов натрия как в цитоплазме, так и во внешней среде, белок осуществляет электронейтральный обмен ионов натрия в соотношении один к одному. Для поддержания этого режима

требуется одновременное присутствие АТФ и АДФ внутри клетки. Обмен сопровождается переносом меченого концевого фосфата между АТФ и АДФ, но не приводит к суммарному гидролизу АТФ. Предположительно обмен осуществляется по цепочке реакций:

3 Na+Uirr + Ej -ATP<->(3Na+)-Ej -P+ADP<-»P-E2+3 Na+BHeiu+ ADP Эта цепочка соответствует верхней части схемы Алберса-Поста. Здесь ионы натрия связываются с цитоплазматической стороны с высоким сродством 10 мМ), а с внешней - с низким 100 мМ) (Glynn, 1985).

В отсутствие ионов натрия и с внешней, и с цитоплазматической стороны мембраны наблюдается аналогичный калий-калиевый обмен. Сродство к калию имеет еще более выраженную асимметрию, на внешней стороне ~0,2 мМ, а на цитоплазматической ~ 1 ОмМ. Для такого режима работы необходимо присутствие неорганического фосфата и АТФ (Glynn, 1988). Необходимость присутствия фосфата означает, что перенос калия во внешнюю среду связан с обращением реакции его переноса в цитоплазму. Таким образом, калиевый обмен может быть представлен следующей схемой:

2 К+цит+ Ei + Р,^Е2-(2К+)+Р^Р-Е2(2К+)^Р-Е2+2К+внеш

В отсутствие во внешней среде ионов натрия и калия или других способных замещать их ионов (Rb+, Cs+, Li+ и т.д.), гидролиз АТФ сопровождается транспортом ионов натрия из цитоплазмы во внешнюю среду (Karlish and Kaplan, 1985) В этом случае АТФ-зависимый транспорт ионов натрия происходит так же, как и в физиологических условиях, сопровождаясь медленным спонтанным дефосфорилированием белка. Отношение числа переносимых ионов натрия к числу гидролизуемых молекул АТФ составляет три к одному. Перенос электронейтрален при рН=6,5, но становится все более электрогенным при повышении pH (Goldshleger et al., 1990). Наиболее вероятным представляется такое объяснение, что при низких значениях pH протоны служат заместителями ионов натрия, и неэлектрогенный "несопряженный перенос" ионов натрия на самом деле представляет собой их обмен на ионы водорода в соотношении три натрия к трем протонам.

Если в условиях несопряженного АТФ-зависимого транспорта ионов натрия во внешнюю среду добавить эти ионы в очень маленькой концентрации (~мМ), происходит ингибирование гидролиза АТФ и транспорта. Повышение внеклеточной концентрации ионов натрия приводит к возобновлению обоих процессов, однако при этом наблюдается поток ионов натрия в обоих направлениях (Cantley, 1981). В этих условиях ионы натрия могут замещать ионы калия с внешней стороны белка, и АТФ-зависимый натриевый обмен осуществляется по той же схеме, что и в стандартных условиях (т.е. по схеме

Альберса и Поста), но с заменой калия на натрий. Эксперименты с белком, реконструированным в липосомы, показывают, что АТФ-зависимый натриевый обмен является электрогенным. Однако стехиометрия натрий-натриевого обмена в указанных условиях несколько больше, чем три к двум. Одно из возможных объяснений состоит в том, что, как упоминалось выше, кроме ионов натрия, калий может замещаться протонами, тогда как способность протонов замещать ионы натрия значительно ниже.

Таким образом, помимо нормального обмена трех цитоплазматичеких ионов натрия на два внеклеточных иона калия, Na+,K+-ATOa3a способна осуществлять не сопровождающийся суммарным гидролизом АТФ калий-калиевый и натрий-натриевый обмен в соотношении один к одному, а также сопровождающийся суммарным гидролизом АТФ натрий-натриевый обмен, либо несопряженный транспорт ионов натрия из цитоплазмы во внеклеточную среду.

Помимо этого, обнаружена дополнительная реакция, в ходе которой наблюдается низкое сродство белка, пребывающего в состоянии Ег, к АТФ (Glynn, 1985) Такая реакция не является необходимой для завершения цикла -транспорта ионов калия в клетку, - однако она ускоряет конформационный переход. Кроме того, подбором соответствующих условий можно заставить Ыа+,К+-АТФазу работать в «обратном направлении», т.е. синтезировать АТФ (Garrahan and Glynn, 1967). В более поздней публикации (De Weer et al., 2001), показано существование электрического тока при обращении транспорта в обратном направлении.

В последних публикациях показана способность Na+, К4-АТФ аз ы в определенных условиях переносить и протоны, причем количество и механизм их переноса в настоящее время активно дискутируются (см «1.15.Влияние рН на активность Ка+,К+-АТФазы»),

1 А Структура Ыа+,К+-АТФазы

Функциональная единица фермента состоит из двух полипептидных цепей -аир, входящих в состав ферментного комплекса в эквимолярных количествах.

Позднее была обнаружена еще одна, у-субъединица (FXYD-белок), которая выполняет регуляторные функции (Berrebi-Bertran et al., 2001; Cornelius et al., 2001; Therien et al., 2001). Известно, что в в большинстве организмов Na+,K+-АТФаза существует в форме димеров (aß)2 или более высокомолекулярных комплексов. Однако, для ферментативной активности достаточно комплекса (aß) (Norby, 1987).

40 Ä

20 А 2 К+

Рис. 3. Структурная модель №т,К+-АТФазы.

Основной субъедипицей, осуществляющей гидролиз АТФ и транспорт, является а-субъединица, состоящая примерно из тысячи аминокислотных остатков и имеющая молекулярную массу порядка 112 кДа. Вторая, меньшая по размеру, - (3-субъединица представляет собой гликопротеин, содержащий около 300 аминокислотных и 50 углеводных остатков. Молекулярная масса р -субъединицы составляет 30 -40 кДа.

К настоящему времени получены структуры 1Ма+,К+-АТФазы с атомным разрешением как со связанными ионами рубидия (который заменяет калий) (МогШ й а1., 2007), калия (8Ыпос1а ег а1., 2009) и натрия (Капш е1 а1., 2013). Они показали, что а-субъединица №+,К+-АТФазы состоит из 10 трансмембранных а-

спиралей (М-домен) и нескольких петель между трансмембранными а-спиралями, которые с внеклеточной стороны невелики, а с цитоплазматической стороны образуют три больших домена (Ы - нуклеотид-связывающий, Р -фосфорилируемый и А-асШаиэг).

Трансмембранные участки белковых цепей богаты неполярными аминокислотными остатками. Большую роль в стабильности белка играют дисульфидные связи, образованные остатками цистеина, расположенными преимущественно в трансмембранной части молекулы, р-субъединица имеет 1 трансмембранную а-спираль и преимущественно экспонирована на внеклеточной стороне, выдаваясь во внеклеточную среду примерно на 40 А. РХУО-белок имеет 1 трансмембранную а-спираль и небольшую (выдающуюся на 15 А) внеклеточную часть. М-домен, в зависимости от конформации, содержит 2 сайта связывания ионов К+ или 3 сайта связывания ионов

1.5 .Различие структур Иа „К -АТФазы в двух основных конформациях

Для того, чтобы понять молекулярный механизм активного транспорта ионов, большое значение имеет детальное выяснение структурных перестроек белка в процессе его функционирования. С этой целью были предприняты значительные усилия для выяснения кристаллической структуры белка в разных состояниях. Наибольшие успехи были достигнуты при исследовании Са -АТФазы саркоплазматического ретикулума быстрых скелетных мышц (8Е11СА1а подтип), у которой в настоящее время известны структуры всех интермедиатов цикла функционирования (ТоуоБЫта, 2009). Для Ка+,К+-АТФазы были получены структуры Е! и Е2 конформаций, а также комплекса белка с оуабаином. Структуры Ка+,К+-АТФазы в конформациях Е! и Е2 приведены на рис. 5 и 6. Наибольшие различия между конформациями состоят в положении цитоплазматических доменов - № и Р- домены сомкнуты в конформации Е2 (благодаря АТР, «сшивающей» их по остаткам Аг§544 и А^685) и открыты в Еь а А-домен повернут примерно на 100° вокруг оси, нормальной к мембране.

Структура N3 ,К -АТФазы в конформации Е1 по сравнению с Е2 более вертикальна к плоскости мембраны, т. к. спираль М5 более выпрямлена. Подробнее различия в структуре М-до мена рассмотрены в следующей главе. Сшивка N и Р-доменов остается в состоянии фосфорилирования после гидролиза АТФ (в этом случае роль сшивающего агента играет фосфат) и исчезает после дефосфорилирования. Таким образом, структурные исследования позволили установить важную роль фосфорилирования белка в конформационных перестройках, необходимых для активного транспорта ионов.

Рис. 5. Структура Е]-конформации Na ,К ~АТФазы, ленточная диаграмма в двух перпендикулярных направлениях. Цвет изменяется постепенно от N-конца (голубой) до С-конпа (красный) у а- и [3-субъединиц. Пурпурные шарики связанные ионы натрия (три (I-III) в трансмембранной и один (С) - в цитоплазматической части белка). OLA - олигомицин. Сахара представлены ш аро -стержне в ы м и м од е л я ми.

Рис. 6. Структура Е2-конформации № ,К -АТФазы, ленточная диаграмма в двух перпендикулярных направлениях. Цвет изменяется постепенно от Ы-конца (голубой) до С-конца (красный) у а- и (3-субъединиц. Пурпурные шарики - связанные ионы калия (два (1-11) в трансмембранной и один (С) - в цитоплазматической части белка). Холестерин (СЬЯ), сахара и некоторые ключевые остатки представлены шаро-стержневыми моделями.

1.6. Ингибиторы Na+.K+-ATOa3bi

Все АТФазы Р-типа ингибируются ортованадатом, который связывается с гораздо большим сродством с сайтом фосфорилирования и блокирует его в Е2-конформации (Cantley et al., 1977; Robinson et al., 1981). Сродство ванадата к центру фосфорилирования сильно зависит от концентрации ионов магния- при 25 мМ Mg2+ - 40 нМ, тогда как при физиологической 0,6 мМ- заметно меньше 250 нМ.

Na+,K+-ATOa3a специфически ингибируется т. н. сердечными гликозидами, из которых наиболее изучен оуабаин. Он действует на фермент с внеклеточной стороны, блокируя его в Е2-конформации (Glynn, 1985). Оуабаин проникает глубоко в М-домен, занимая пространство от внеклеточной поверхности мембраны почти до сайтов связывания ионов. Известно 2 формы связывания этого ингибитора с №+,К+-АТФазой: с высокой аффинностью (с Е2-Р) и с низкой (с Е2*2К+). В работе (Ogawa et al., 2009) получена кристаллическая структура с атомным разрешением для низкоаффинной формы. Согласно ей, связывание происходит за счет гидрофобных взаимодействий и водородных связей преимущественно со спиралями М4 - Мб и внеклеточной петлей L7/8.

1.7.Сайты связывания ионов в белке

Положение мест связывания ионов можно увидеть на двух известных к настоящему времени структурах Na+,K+-АТФазы с атомным разрешением: для конформации Е2 со связанными ионами калия и для конформации Ei со связанными ионами натрия.

В Е2-конформации I сайт связывания калия расположен на расстоянии 1/4 толщины мембраны от её цитоплазматической поверхности, а II сайт - на расстоянии 1/3 толщины. Оба сайта разделяет всего 4.1 А, причем между ними нет ни одного атома кислорода (радиус К+ равен 1.35 А, так что ионы располагаются практически рядом). В образовании I сайта принимают участие 5 атомов кислорода - 3 боковых цепей (аминокислотных радикалов) - (Ser 782, Asn 783 - спираль М5 и Asp 811 - Мб), карбонил основной цепи (Thr 779 - М5) и 1

молекула воды. Сайт II образован 6 или 7 молекулами кислорода - 3 основной цепи (Val 329, Ala 330 и Val 332 -М4), и 3-4 боковых (Asn 783, Glu 786 - М5, Asp 811 - Мб и, возможно, Glu 334 - М4). Карбонилы Asp 811 и Asn 783 участвуют в координации обоих ионов К+. Валентность для К+ в I сайте составляет 1.06; во II-0.64. Для Na валентность I сайта равна 0.62, II сайта - 0.54, что объясняет меньшее сродство к Na+ в этой конформации.

Отличия конформации ион-связывающих центров №+,К+-АТФазы от SERCAla состоят в углах наклона М5 к М1 и поворота Мб (так что вместо Thr 814 к ионам экспонирован Asp 811) и в локальном (на несколько аминокислотных остатков) нарушении спиральной укладки М5 (за счет Рго785). Раскручивание М5 дает дополнительное место для связывания иона К+, большего, чем ион Са2+ (радиус которого 0.99 А), и экспонирует карбонил основной цепи Thr 779 к I сайту. В Са2+-АТФазе радикал Asn 768 (ему соответствует Asn 783 в Na+,K+-АТФазе) расположен слишком близко к сайтам связывания ионов, чтобы позволить связаться большему, чем Са , иону К . Предполагается, что именно раскручивание М5 ответственно за гораздо меньшую ионную селективность Na ,К -АТФазы по сравнению с кальциевой (которая связывает только

Са2+ и НГ).

Ионы проникают из растворов в центры связывания сквозь т.н. каналы доступа - структуры, напоминающие колодцы или ионные каналы, выход из которых в раствор с противоположной стороны мембраны закрыт. В Ег конформации закрыт выход во внеклеточную среду, в Е2- в цитоплазму. В Са2+-АТФазе, которая имеет высокую степень гомологии с а-субьединицей Na+,K+-АТФазы, доступ в цитоплазму закрывают «воротный» остаток Glu 309 и конец трансмембранной части М1, тогда как в люмен (соответствует внеклеточной среде №+,К+-АТФазы) - люменальная часть М4 (Toyoshima, 2009).

Рис. 7. Положение К -связывающих сайтов Иа+,К -АТФазы. Левый рисунок- вид с цитоплазматической стороны мембраны, правый - в плоскости нормали к

■у

мембране. Серые линии - пептидные цепи С а" -АТФазы (8ЕЯСА1а), выровненные по метал-координирующим аминокислотным остаткам. Фиолетовые шарики-ионы К , красные- молекулы воды, маленькие салатовые - ионы Са~ в С а" -АТФазе. Красные пунктирные линии — координация ионов К , зеленые пунктирные линии- водородные связи.

Все 3 № -связывающих сайта сильно сдвинуты к спиралям М4 и М5. в отличие от Са" -АТФазы, хотя геометрия координационных связей далека от идеальных 6 или 7. что проявляется в достаточно низком сродстве сайтов к ионам № (константы диссоциации порядка миллимолей). Первый сайт связывания иона натрия (в Е1- конформации) расположен близко к I сайту связывания иона К (в Е2- конформации), но глубже в пространстве между спиралями М4 и М5; Второй сайт примерно на 5 А ближе к цитоплазматической поверхности в связи с другим положением М4Е (ближней к внеклеточной среде части М4). Расстояние между сайтами I и II (3.2-3.6 А) существенно меньше, чем между I и II сайтами связывания (4.1 А). Это расстояние позволяет разместиться рядом двум ионам № (ионный радиус 0.95 А), но слишком мало для двух ионов К (радиус 1.33 А)

Рис. 8. Сравнение Na ,К -АТФазы в конформациях Е] со связанными ионами натрия, Е2 со связанными ионами калия и SERCAla . Наложение структур Na ,К -АТФазы в Ei*AlF4-*ADP*3Na (желтый цвет) с E2*MgF42~*2K (салатовый; а. e-g) и с SERCAla в E,*AlF4~*ADP*2Ca2 (оранжевый; Ь). а, b - структура всего белка. Вставка на рисунке а - трансмембранные катион-связывающие сайты Na .К -АТФазы в увеличенном масштабе, с, d - трансмембранная область Na „К -АТФазы (желтая) и SERCAla (оранжевая) в области катион-связывающих сайтов в увеличенном масштабе, вид параллельно плоскости мембраны, е - смещение трансмембранных спиралей, вид параллельно плоскости мембраны с цитоплазматической стороны, f - С-концевая область, g - область контакта МЗ и L6/7.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Ташкин, Всеволод Юрьевич, 2014 год

5. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Маркин B.C. и Чизмаджев Ю.А. Индуцированный ионный транспорт // 1974.

2. Павлов К.В. и Соколов В. С. Электрогенный транспорт ионов Na/K-АТРазой. // Биологические мембраны. 1999. Т.16. С. 604-638.

3. Соколов B.C. и Кузьмин В.Г. Измерение разности поверхностных потенциалов бислойных мембран по второй гармонике емкостного тока // Биофизика. 1980. Т. 25. С. 170-172.

4. Соколов B.C., Павлов К.В., Джанджугазян К.Н., и Бамберг Е. Изменение емкости и проводимости модельной мембраны при функционировании Na,K-АТФазы. //Биологические мембраны. 1992. Т. 9. С. 961-969.

5. Щербаков А.А., Чизмаджев Ю.А., Ленц А.А., и Соколов B.C. Импедансная спектроскопия транспорта ионов натрия в Na ,К ,АТР -азе. // Биологические мембраны 2005. Т. 22. С. 492-504.

6. Albers R.W. Biochemical aspects of active transport. // Annu. Rev. Biochem. 1967. V. 36. P. 727-756.

7. Apell H.-J. Structure-function relationship in P-type ATPases—a biophysical approach. // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003 V. 150. P. 1-35.

8. Apell H.-J., Haring V., Roudna M. Na,K-ATPase in artificial lipid vesicles: Comparison of Na/K and Na-only pumping mode. // Biochim. Biophys. Acta. 1990. V. 1023. P. 81-90.

9. Apell H.-J., Borlinghaus R., and Lauger P. Fast charge translocations associated with partial reactions of the Na,K-pump: II. Microscopic analysis of transient currents. // J. Membrane Biol. 1987. V. 97. P. 179-191.

10. Apell H.-J. and Diller A. Do H+ ions obscure electrogenic Na+ and K+ binding in the El state of the Na,K-ATPase? // FEBS Lett. 2002. V. 532. P. 198-202.

11. Apell H.-J. and Karlish S.J. Functional properties of Na,K-ATPase, and their structural implications, as detected with biophysical techniques. // J. Membrane Biol. 2001. V. 180. P. 1-9.

12. Apell H.-J. and Marcus M.M. (Na+ + K+)-ATPase in artificial lipid vesicles: influence of the concentration of mono- and divalent cations on the pumping rate. //Biochim. Biophys. Acta 1986. V. 862. P. 254-264.

13. Apell H.-J., Roudna M., Corrie J. E. ,Trentham D. R. Kinetics of the phosphorilation of Na,K-ATPase by inorganic phosphate detected by a fluorescence method. //Biochemistry. 1996. V. 35. P. 10922-10930.

14. Axelsen K. B. & Palmgren M. G. Evolution of substrate specificities in the P-type ATPase superfamily. // J. Mol. Evol. 1998. V. 46. P. 84-10.

15. Benz R. and Janko K. Voltage-induced capacitance relaxation of lipid bilayer membranes Effects of membrane composition. // Biochem. Biophys. Acta. 1976. V. 455 P. 721-738.

16. Berrebi-Bertran I., Robert P., Camelin J.C., Bril A. and Souchet M. The g-subunit of (Na+,K+)-ATPase: a representative example of human single transmembrane protein with a key regulatory role. // Cell. Mol. Biol. 2001. 1976. 47. P. 285-296.

17. Borlinghaus R., Apell H.-J., and Lauger P. Fast charge translocations associated with partial reactions of the Na,K-pump: I. Current and voltage transients after photochemical release of ATP. // J. Membrane Biol. 1987. V. 97. P.161-178.

18. Buhler R., Sturmer W., Apell H.-J. And Lueger P. Charge translocation by the Na,K-pump: I.Kinetic of local field changes studied by time-resolved fluorescence microscopy. //J. Membrane Biol. 1991. V. 121. P. 141-161.

19. Cantley L.C, Josephson L., Warner R., Yanagisava M., Lechene C., Guidotti G. Vanadate is a potent (Na,K)-ATPase inhibitor found in ATP derived from muscle. // J. Biol. Chem. 1977. V. 252. P. 7421-7423.

20. Cantley L.C. Structure and mechanism of the Na,K ATPase. // Curr. Top. Bioenerg. 1981. V. 11. P. 201-237.

21. Cornelius F., Mahmmoud Y.A., and Christensen H.R. Modulation of Na,K-ATPase by associated small transmembrane regulatory proteins and by lipids // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. V. 33. P. 415-423.

22. De Weer P., Gadsby D. C., Rakowski R. F. Voltage dependence of the apparent affinity for external Na+ of the backward-running sodium pump. // J. Gen. Physiol. 2001. V. 117(4). P. 315-328.

23. Deguchi N., Jorgensen P. L., Maunsbach A. B. Ultrastructure of the sodium pump. Comparison of thin sectioning, negative staining and freeze-fracture of purified membrane-bound (Na+,K+)-ATPase. // J. Cell Biology. 1977. V. 75. P. 619-634.

24. Dunham P. B., and Senyk O. Lithium efflux through the Na/K pump in human erythrocytes. //Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. V. 74. P. 3099.

25. Dunham P. B. and Hoffman J. F. Na and K transport in red blood cells. // In T. E. Andreoli, J. F. Hoffman and D. D. Fanestil (eds.), Physiology of membrane disorders. Plenum, NY. 1978. P. 255-272.

26. Fibich A., Janko K. and Apell H.-J. Kinetic of proton binding to the Sarcoplasmic Reticulum Ca-ATPase in the El state. // Biophys J. 2007. V. 93. P. 3092-3104.

27. Fendler K., Grell E., Haubs M. and Bamberg E. Pump currents generated by the Na+,K+-ATPase from kidney on black lipid membranes. // EMBO J. 1985. V. 4. P. 3079-3085.

28. Gache C., Rossi B., Leone F.A., Lazdunski M. Pseudosubstrates to analyze the reaction mechanism of the Na,K-ATPase. // In: Na.K-ATPase Structure and Kinetics. J.C. Skou and J.G. Nrnrby, editors. 1979. P. 301-314. Academic Press, London.

29. Gadsby D.C., Bezanilla F., Rakowski R.F., De W.P., and Holmgren M. The dynamic relationships between the three events that release individual Na ions from the Na/K-ATPase. // Nat. Commun. 2012. V. 3. P.669.

30. Garay R. P., Garrahan P. J. The interaction of sodium and potassium with sodium pump in red cells. // J. Phisiol. 1973. V. 231. P. 297-325.

31. Garrahan P. J. and Glynn I. M. The incorporation of inorganic phosphate into adenosine-triphosphate by reversal of the sodium-potassium pump. // J. Physiol. 1967. V. 192. P. 237-256.

32. Geissler D., Antonenko, Y. N., Schmidt R., Keller S., Krylova O. O., Wiesner B., Bendig J., Pohl P., and Hagen V. (Coumarin-4-yl)methyl esters as highly efficient, ultrafast phototriggers for protons and their application to acidifying membrane surfaces. //Angew.Chem.Int.Ed Engl. 2005. V. 44. №8. P. 1195-1198.

33. Glynn I. M. The Na+,K+-transporting adenosine triphosphatase. // In The Enzymes of Biological Membranes. A.N.Martonosi, editor. Plenum Press, New York. 1985b. P.35-114.

34. Glynn I. M. The coupling of enzymatic steps to the translocation of sodium and potassium. Skou, C., Norby, J. G., Mannsbach, A. B., and Esmann, M. 435-460. 1988. New York, Prog. Clyn Biol. Res. 268A. A.R. Liss. The Na,K pump, part A: molecular aspects.

35. Goldshlegger R., Karlish S.J.D., Rephaeli A. and Stein W.D. The Effect of Membrane-Potential on the Mammalian Sodium- Potassium Pump Reconstituted into Phospholipid-Vesicles // J. Physiol. London. 1987. V. 387. P. 331-355.

36. Goldshleger,R., Y.Shahak and S.J.D.Karlish. Electrogenic and electroneutral transport modes of renal Na/K ATPase reconstituted into proteoliposomes. // J. Membrane Biol. 1990. V. 113. P. 139-154.

37. Guardia E., Rey R. & Padry J. A. Na+-Na+ and CF-Cf ion pairs in water: mean force potentials by constrained molecular dynamics. // J. Chem. Phys. 1991. V. 95. P. 2823-2831.

38. Hegyvary C. and Jorgensen P. L. Conformational Changes of Renal Sodium Plus Potassium Iontransport Adenosine Triphosphatase Labeled with Fluorescein. // J. Biol. Chem. 1981. V. 256. №12. P. 6296-303.

39. Heyse S., Wuddel I., Apell H.-J., Sturmer W. Partial reactions of the Na,K-ATPase: determination of rate constants. // J. Gen. Physiol. 1994. V. 104. P. 197240.

40. Hilgemann D. W. Channel-Like Function of the Na,K Pump Probed at Microsecond Resolution in Giant Membrane Patches. // Science. 1994. V. 263. P. 1429-1432.

41. Hladky S.B. Ion transport and displacement currents with membrane - bound carriers: The theory for voltage - clamp currents, charge - pulse transients and admittance for symmetrical systems. // J. Membrane Biol. 1979. V. 49. P.213-237.

42. Holmgren M. and Rakowski R. Pre-Steady-State Transient Currents Mediated by the Na/K Pump in Internaly Perfused Xenopus Oocytes. // Biophys. J. 1994. V. 66. P.912-922.

43. Holmgren M., J.Wagg F.Bezanilla, R.F.Rakowski, P.De Weer, and D.C.Gadsby. Three distinct and sequential steps in the release of sodium ions. // Nature. 2000. V.403.P. 898-901.

44. Homareda H., Nozaki T., Matsui H. Interaction of sodium and potassium ions with Na+,K+-ATPase. Ill Cooperative effect of ATP and Na+ on complete release of K+ from E2K1. //J. Biochem. 1987. V. 101. P. 789-793.

45. Jorgenson P. L. Isolation of (Na++K>ATPase. // Meth. Enzymol. 1974. V. 32. P. 277-290.

46. Kanai R., Ogawa H., Wilsen B., Kornelius F. and Toyoshima C. // Nature 2013. V. 502. P. 201-206.

47. Karlish S. J. D., Yates D. W. and Glynn I. M. Conformational transitions between Na+-bound and K+-bound forms of (Na+ + K+)-ATPase, studied with formycin nucleotides. // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 525. P. 252-264.

48. Karlish S. J. D. Characterisation of conformational changes in (Na,K)ATPase labeled with fluorescein at the active site. // J. Bioenerg. Biomembr. 1980. V. 12. P. 111-136.

49. Karlish S. J. D. and Kaplan J. H. Pre-steady state kinetics of Na transport through the Na,K pump. Glynn, I. and Ellory, C. // Cambridge, Company of biologists. The sodium pump. 1985. P. 501-506.

50. Karlish S.J. D., Goldshlegger R. and Stein W. D. A 19-kDa terminal tryptic fragment of the a-chain of Na/K-ATPase is essential for occlusion and transport of cations. //Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1990. V. 87. P. 4566-4570.

51. Karlish S.J. Organization of the membrane domain of the Na/K-pump. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. V. 834. P. 30-44.

52. Lauger P. Electrogenic Ion Pumps. // Sinauer, Sunderland, MA. 1991.

53. Lu C.-C., Kabakov A., Markin V.S., Mager S., Frazier S., Frazier G.A., and Hilgemann D.W. Membrane Transport Mechanisms Probed by Capacitance Measurements with Megahertz Voltage Clamp. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1995. V. 92. №24. P. 11220-11224.

54. Matsui H, Hayashi Y, Homareda H, Kimimura M. Ouabain-sensitive 42K binding to Na+, K+-ATPase purified from canine kidney outer medulla.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977. V. 75. P. 373-380.

55. McConaghey P. D., and M. Maizels. Cation exchanges of lactose-treated human red cells. // J. Physiol. 1962. V. 162. P.485.

56. McLaughlin S. Electrostatic Potentials at Membrane-Solution Interfaces. // 1977. P. 71-144.

57. Morth J. P. et al. Crystal structure of the Sodium-potassium pump. // Nature. 2007. V. 450. P. 1043-1049.

58. Morth J. P. et al. The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. // Phil. Trans. R. Soc. B. 2009. V. 364. P.217-227.

59. Nakao M. and Gadsby D.C. Voltage Dependence of Na Translocation by the Na/K Pump. //Nature. 1986. V. 323. P.628-630.

60. Norby J.G. Na,K-ATPase - Structure and Kinetics - Comparison with Other IonTransport Systems. // Chemica Scripta 27B. 1987. P. 119-129.

61. Nyblom M., Poulsen H., Gourdon P., Reinhard L., Andersson M., Lindahl E., Fedosova N. and Nissen P.. Crystal structure of Na+, K(+)-ATPase in the Na(+)-bound state. // Science. 2013. V. 342. P. 123-127.

62. Or E., Goldshlegger R., Karlish S. J. D. An effect of voltage on binding of Na+ at the cytoplasmic surface of the Na+ K+ pump. // J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 2470-2477.

63. Ogawa H., Shinoda T., Cornelius F., and Toyoshima C. Crystal structure of sodium-potassium pump (Na+,K+,ATP-ase) with bound potassium and ouabain. // Proc. Nat. Acad, of Sei. USA 2009. V.106. P. 14085-14090.

64. Pedersen P. A., Nielsen J. M., Rasmussen J. H. & Jorgensen P. L. Contribution to T\\ K+, and Na+ binding of Asn776, Ser775, Thr774, Thr772, and Tyr771 in cytoplasmic part of fifth transmembrane segment in a-subunit of renal Na,K-ATPase. // Biochemistry. 1998. V. 37. P. 17818-17827.

65. Peluffo R.D. and Berlin J.R. Electrogenic K+ transport by the Na+,K+ pump in rat cardiac ventricular myocytes . // Journal Of Physiology London. 1997. V. 501. P. 33-40

66. Pintschovius J., Fendler K., Bamberg E. Charge translocation by the Na+/K+-ATPase investigated on solid-supported membranes: cytoplasmic cation binding and release. // Biophys. J. 1999. V. 76. P. 827-836.

67. Polvani C., Blostein R. 1988. Protons as substitutes for sodium and potassium in the sodium pump reaction. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 16757-63.

68. Post R.L., Toda G., Rogers F.N. Phosphorylation by inorganic phosphate of sodium plus potassium ion transport adenosine triphosphatase. // J. Biol. Chem. 1975. V. 250. P. 691-701

69. Rakowski R.F, Charge Movement by the Na/K Pump in Xenopus Oocytes. // J. Gen. Physiol. 1993. V.101. P. 117-144.

70. Rettinger J. Characterisation of Na+/K+-ATPase proton current in Na+- and K+-free extracellular solution. Indications for kinetic similarities between H+/K+-ATPase and Na+/K+-ATPase. // Biochem. Biophys. Acta. 1996. V. 1282. P. 207-215.

71. Robinson J. D. & Mercer R. W. Vanadate binding to the (Na+K)-ATPase. // Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 1981. V. 13. P. 205-218.

72. Rossi B., Gache C., Lazdunski M. Specifity and interaction of cationic sites of the axonal (Na+,K+)-activated adenosintriphsphatase. // Eur. J. Biochem. 1978. V. 85. P. 561 -570.

73. Sagar A., Rakowski R. F. Access channel model for the voltage-dependance of the forward-running Na+/K+-pump. // J. Gen. Physiol. 1993. V. 103. P. 869-894.

74. Sachs J. R. and L. G. Welt. The concentration dependence of active potassium transport in the human red blood cell. // J. Clin. Invest. 1967. V. 46. P. 65.

75. Shainskaya A., Schneeberger A., Apell H.-J., Karlish, S.J. Entrance port for Na+ and K+ ions on Na+,K+-ATPase in the cytoplasmic loop between transmembrane segments M6 and M7 of the alpha subunit. Proximity of the cytoplasmic segment of the beta subunit. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 2019-2028

76. Schak, V. R., Holm, R. and Vilsen, B. Inhibition of phosphorilation of Na+,K+-ATPase by mutations causing familial hemiplegic migraine. // J. Biol. Chem. 2012. V. 287. P. 2191-2202.

77. Schneeberger A., Apell H.-J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: I. Sodium binding is associated with a conformational rearrangement. // J. Membrane Biol. 1999. V. 168. P. 221-228.

78. Schneeberger A., Apell H.-J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-ATPase: II. Competition of various cations. // J. Membrane Biol 2001. V.179. P. 263-273.

79. Schwappach B., Sturmer W., Apell H.-J., Karlish S. J. D. Binding of sodium ions and cardiotonic steroids to native and selectively trypsinazed Na,K pump, detected by charge movements. // J Biol Chemistry. 1994. V. 269. P. 21620-21626.

80. Schulz S. & Apell H.-J. Investigation of ion binding to the cytoplasmic binding sites of the Na,K-pump. // Eur. Biophys. J. 1995. V. 23. P. 413^121.

81. Smejtek P. Hsu K., Perman W.H. Electrical conductivity in lipid bilayer membranes induced by pentachlorophenol. // Biophys. J. 1976. V. 16. P. 319-336.

82. Sokolov V.S., Ayuyan A. G. and Apell H.-J. Assignment of charge movements to electrogenic reaction steps ofNa,K-ATPase by analysis of salt effects on the kinetics of charge movements. //Eur. Biophys. J. 2001. V. 30. P. 515-527.

83. Sokolov V.S., Lenz A.A. and Apell H.-J. Negative changes of the membrane capacitance due to electrogenic Na transport by the Na,K-ATPase. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003. V. 986. P. 229-231.

84. Sokolov V.S., Stukolov S.M., Darmostuk A.S. and Apell H.-J. Influence of sodium concentration on changes of membrane capacitance associated with the electrogenic ion transport by the Na,K-ATPase. // Eur. Biophys. J. 1998. V. 27. P. 605-617.

85. Sokolov V.S. and Mirsky V.M. Electrostatic potentials of bilayer lipid membranes: basic research and analytical applications. // In: Ultrathin Electrochemical Chemo- and Biosensors: Technology and Performance, edited by Vladimir M. Mirsky, Heidelberg:Springer-Verlag. 2004. P. 255-291.

86. Sokolov V., Shcherbakov A., Lenz A., Chizmadzhev Yu. and Apell H.-J. Electrogenic Transport of Sodium Ions in Cytoplasmic and Extracellular Ion Access Channels of Na+,K+-ATPase Probed by Admittance Measurement Technique. //Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. 2008.V. 2. №2. P. 161-180.

87. Stankievic P. J., Tracey A. S., Crans D. C. Inhibition of phosphate- metabolizing enzymes by oxovanadium (V) complexes. // Met. Ions Biol. Syst. 1995. V. 31. P. 287-324.

88. Shinoda T., Ogawa H., Cornelius F. and Toyoshima C. Crystal structure of the sodium-potassium pump at 2.4A0 resolution. //Nature. 2009. V. 459. P. 446-450.

89. Therien A.G., Pu H.X., Karlish S.J. and Blostein R. Molecular and functional studies of the gamma subunit of the sodium pump // J. Bioenerg. Biomembr. 2001. V. 33. P. 407-414.

90. Toyoshima, C. and Nomura, H. Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium. //Nature. 2002. V.418. P. 605-611.

91. Toyoshima C. How Ca -ATPase pumps protons across the sarcoplasmatic reticulum membrane. // Bioch. Biophys. Acta. 2009. V. 1793. P. 941-946.

92. Toyoshima C., Iwasawa S., Ogawa H., Hirata A., Tsueda J. and Inesi G. Crystal structures of the calcium pump and sarcolipin in the Mg2+-bound El state. // Nature. 2013. V. 495. P. 260-264.

93. Vasilyev A., Khaterl K., Rakowski R. F. Effect of Extracellular pH on Presteady-State and Steady-State Current Mediated by the Na+/K+ Pump. // J. Membrane Biol. 2004. V. 198. P. 65-7.

94. Vedovato N. and Gadsby D. C. Route, mechanism, and implications of proton import during Na+/K+ exchange by native Na+/K+-ATPase pumps. // J. Gen. Physiol. 2014. V. 143. №4. P. 449-464.

95. Vilsen B. Mutant Glu78 l-»Ala of the rat kidney Na+,K+-ATPase displays low cation affinity and catalyzes ATP hydrolysis at a high rate in the absence of potassium ions. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 1455-1463.

96. Wuddel I., Apell H.-J. Electrogenicity of the sodium transport pathway in the Na, K-ATPase probed by charge-pulse experiments. // Biophys. J. 1995. V. 69. P. 909921.

11 !'i