Конформационные превращения фермент-субстратных комплексов в процессах, катализируемых 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами из E. coli и человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Кузнецов, Никита Александрович

• Кузнецов, Никита Александрович
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Кузнецов, Никита Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Кинетические исследования механизмов ферментативных реакций в 9 предстационарных условиях

1.1. ДНК- и РНК-полимеразы

1.1.1. ДНК-полимераза I Escherichia coli (фрагмент Кленова)

1.1.2. РНК-полимераза бактериофага Т

1.1.3. ДНК-полимеразы бактериофагов RB69 и Т

1.1.4. ДНК-пол имераза /?

1.2. ДНК-лигаза бактериофага Т

1.3. ДНК-метилтрансферазы

1.3.1. ДНК-метилтрансфераза Dam бактериофага Т

1.3.2. ДНК-метилтрансфераза EcoRI

1.4. ДНК-гликозилазы

1.4.1. Урацил-ДНК-гликозилаза

1.4.2. Аденин-ДНК-гликозилаза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конформационные превращения фермент-субстратных комплексов в процессах, катализируемых 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами из E. coli и человека»

Клеточная ДНК постоянно подвергается воздействию экзогенных и эндогенных агентов, которые являются причиной различных модификаций в геноме. Эти повреждения ДНК обладают цитотоксическим либо мутагенным эффектом и, как следствие, вызывают гибель или перерождение клеток. В ходе эволюции образовалась специализированная система защиты клетки от повреждений - система репарации ДНК. Системы репарации присутствуют во всех живых организмах от бактерий до человека и являются высоко консервативными [1-3]. Ферменты репарации ДНК играют важную роль в обеспечении функций ДНК и жизни клетки. С каждым днем увеличивается число примеров, иллюстрирующих важность репарации ДНК в предотвращении различных заболеваний [4-8]. Поэтому изучение этих ферментов в последнее время вызывает особый интерес. Знания о механизмах и особенностях действия ферментов репарации могут приблизить человечество к решению проблем раннего старения и лечения болезней, связанных с высоким уровнем генерации мутаций в геноме.

Многие поврежденные основания лишь незначительно отличаются по структуре от нормальных оснований и практически не нарушают строения двойной спирали ДНК. Тем не менее, ферменты репарации находят повреждения среди миллионов ^модифицированных оснований. Одним из часто встречающихся повреждений азотистых оснований ДНК является 8-оксогуанин. Остаток 8-оксогуанина отличается от немодифицированного гуанина только двумя дополнительными атомами: атомом кислорода при С-8 и атомом водорода при N-7. Данное повреждение удаляется из ДНК 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазами. Эти ферменты обладают двумя типами каталитической активности: N-гликозилазной и АР-лиазной. Несмотря на большой интерес к выяснению природы высокой специфичности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз, многие аспекты этой проблемы до сих пор оставались неизученными. В качестве одной из гипотез, объясняющих высокую специфичность данных ферментов к 8-оксогуанину, было предположение о том, что ферменты претерпевают ряд конформациопных изменений, которые способствуют образованию специфических взаимодействий с ДНК-субстратом. Такие изменения структуры фермента и ДНК-субстрата могут, в принципе, протекать как через последовательность стадий с образованием множества промежуточных состояний фермент-субстратного комплекса, так и через «согласованный» механизм с одновременным перемещением в пространстве отдельных групп и атомов фермента и субстрата для достижения каталитически компетентного состояния [9,10].

К началу выполнения настоящей работы была известна лишь структура формамидопиримидин-ДНК-гликозилазы (Fpg) из Thermus thermopholus в свободном состоянии [11] и отсутствовали данные о том, какие изменения претерпевают 8-оксогуапин-ДНК-гликозилазы при образовании фермент-субстратных комплексов. Не было также данных об изменениях конформаций ферментов в ходе протекания каталитических стадий. Кинетические исследования процессов репарации ДНК, были проведены преимущественно в стационарных условиях, не позволяющих регистрировать быстропротекающие стадии узнавания ферментами специфических сайтов в цепи ДНК. Кроме того, анализ данных проводился на основе классической двухстадийной кинетической схемы Михаэлиса-Ментен [12-14], не учитывающей возможности образования множества промежуточных фермент-субстратных комплексов.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы установить роль конформационной динамики ферментов и ДНК-субстратов в протекании ферментативных реакций с участием 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз из Е. coli (Fpg) и человека (hOggl) и изучить предстационарную кинетику этих процессов. Задачи настоящего исследования состояли в следующем:

• методом «остановленной струи» с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции остатков Тгр в ферментах и 2-аминопурина в ДНК обнаружить конформационные переходы в молекулах ферментов и ДНК-субстратов;

• при протекаиии процессов в условиях «одного оборота фермента» изучить детальные кинетические механизмы;

• с использованием постадийного усложнения структуры ДНК-субстрата определить молекулярную природу отдельных стадий;

• выяснить природу стадий, обеспечивающих высокую специфичность узнавания ферментами поврежденного участка в молекуле ДНК. Конформационные переходы в ходе каталитических циклов регистрировались по изменению интенсивности флуоресценции остатков триптофана (Тгр) в ферментах и вводимых в ДНК остатков 2-аминопурина (2-аРи) в условиях «одного оборота фермента» [15, 16]. Поскольку узнавание субстратов и их превращение протекало в миллисекунд ном и секундном диапазонах, то в работе использовали метод остановленной струи («stopped-flow»). Для выяснения механизма узнавания поврежденного основания в ДНК был использован способ постадийного усложнения структуры ДНК-субстратов. Переход от неспецифического лиганда (наиболее простые взаимодействия) к специфическим субстратам (полный цикл ферментативных реакций), содержащим остаток 8-оксогуанина или образующийся из него в ходе ферментативной реакции в качестве интермедиата апурин/апиримидиновый сайт, позволил установить последовательность конформационных переходов в реагирующих молекулах и понять их природу. Чтобы выяснить, на какой из стадий ферментативного процесса происходит отбор специфического субстрата, то есть, как происходит узнавание поврежденного участка среди множества неповрежденных нуклеотидов, в работе исследовано поведение мутантной формы фермента Fpg F110W, содержащей замену остатка Phe-110, принимающего участие в узнавании субстрата, на флуоресцирующий остаток Тф. Кроме того, были исследованы субстраты, содержащие напротив остатка 8-оксогуанина в соседней цепи некомплементарные нуклеотиды A, G и Т.

Полученные в работе данные о кииетическом механизме и динамике конформационных превращений ферментов Fpg и hOggl при взаимодействии с ДНК-субстратами были подтверждены данными рентгеноструктурного аиализа и ЯМР-спектроскопии [17-19], появившимися в ходе выполнения исследования в последние годы. Сопоставление конформационных изменений ферментов и ДНК-субстратов с данными о структурах свободных ферментов, их комплексов с субстратами и интермедиатами позволило построить молекулярпо-кинетические модели процессов взаимодействия ферментов Fpg и hOggl с ДНК-субстратами. Полученные модели позволили связать конформационные переходы взаимодействующих молекул с элементарными актами ферментативных процессов. Предложены детальные кинетические модели взаимодействия ферментов и ДНК-субстратов и определены константы скорости отдельных стадий, входящих в эти модели. Установлены стадии ферментативных процессов, которые вносят наибольший вклад в обеспечение специфичности ферментов к ДНК-субстратам. Для фермента hOggl подтверждено и кинетически охарактеризовано участие продукта первой каталитической стадии (свободного основания oxoG) в качестве кофактора на последующей стадии - реакции p-элимипирования - приводящей к разрыву рибозофосфатного остова.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Кинстичсские исследования механизмов ферментативных реакций в предетационарных условиях

Способность белков и ДНК существовать в различных конформациях - это уникальная особенность макромолекул. Ферментативные процессы с их участием сопровождаются конформационными перестройками [20]. Стадии связывания субстратов и каталитические стадии приводят к превращению субстратов в продукты и сопровождаются изменениями конформаций фермент-субстратных комплексов. То есть, существует прямая связь между конформациопной динамикой и функциональной активностью ферментов [21-24].

Тем не менее, в настоящее время динамика конформационных изменений ферментов и ее связь с каталитическими функциями остается слабо изученной областью [25-27]. Действительно, понимание механизмов ферментативных реакций в основном базируется на статических структурных данных, получаемых из рентгеноструктурного анализа и ЯМР-спектроскопии, а также на данных стационарной ферментативной кинетики и анализа строения интермедиатов и продуктов превращения субстратов [28-30]. Несомненно, эти данные вносят большой вклад в понимание природы ферментативного катализа. Однако, основываясь лишь на перечисленных методах, невозможно построить детальную молекулярно-кинетическую модель ферментативного процесса.

Изучение ферментативных реакций в стационарных условиях приводит к потере значительной части информации о механизме процесса и промежуточных формах фермента [31, 32]. Параметры стационарной кинетики А^кат и км являются сложными функциями констант скорости всех индивидуальных реакций, протекающих в ходе ферментативного процесса [33]. В Таблице 1 приведены примеры нескольких механизмов реакции и представлены зависимости kK3J и Км от констант скорости отдельных стадий. Видно, что усложнение механизма реакции приводит к значительному усложнению выражений для ккп и Км, что, в свою очередь, не позволяет определить константы скорости индивидуальных стадий.

К кг E + ES-»-Е + Р ккат ~ кг v к2 + кл Км к, к | kj Е + S -j—Е S ЕР-- Е + Р *. к2 к ~ ^ кат к2 + к2 + къ кгкъ + кАк2 + клкъ м Цк2 + к2 + *3)

ЕР-»- Е + Р кл к.2 к3 1 — к2ктк^ кат (к2 + к2)(кА + къ) + к2къ + кгк4 к^к2(к^ К}) к^к^) + к2к^к4 м К ((к2 + к2)(кА + кг) + к2к3 + к3к4)

Детальные кинетические исследования должны включать определение всех кинетических параметров реакции взаимодействия фермента и субстрата. Прямое определение констант скорости элементарных стадий реакции может вытекать из анализа предстационарпой кинетики реакции.

Общий случай реакции превращения субстрата в продукт с участием произвольного числа п промежуточных комплексов может быть описан Схемой 1.

Схема 1 кх к2 къ кп кп+] К\ Кг Кг К где Е - фермент, S - субстрат, (E*S)n - различные фермент-субстратные комплексы, Р - продукт реакции, здесь и далее k/k.j - константы скорости, характеризующие i-тую стадию реакции.

Кинетику этого процесса описывает система дифференциальных уравнений (1)-(6). Решение этой системы уравнений позволяет получить зависимость концентрации участников реакции от времени и начальных концентраций взаимодействующих веществ. Константы скорости элементарных стадий реакции находят с помощью методов линейной или нелинейной регрессии.

В том случае, когда прямое решение системы уравнений невозможно, применяют методы численного интегрирования дифференциальных уравнений [34]. d[ES], *,[S][E] + A:.2[ES]2 - (*, + ЛДО], (1) d[ES]| i+i)[ES](i+D - (K + ^,+i)[ES]i (2) d[ES]

4)

E0 = [E]+ IflES]. n

S0 = [S] + [P] + Z[ES]i

1Г-Л»[ES]» (6)

При избытке одного из реагентов данную систему уравнений можно проинтегрировать. Например, в случае So » Ео, можно считать концентрацию субстрата постоянной и заменить бимолекулярный нелинейный член &i[E][S] на псевдомономолекулярный &i[E][S]o, линейно зависящий только от одной переменной концентрации. При этом получается система n +1 линейных дифференциальных уравнений, которая легко решается стандартным способом путем нахождения корней характеристического уравнения степени п, собственные значения которого позволяют рассчитать значения всех констант скорости [34]. Поскольку процесс протекает в условиях множественного оборота фермента, то после протекания реакции в предстационарном режиме по истечении времени t » т (т - характеристическое время самой медленной стадии), реакция переходит в стационарный режим.

В условиях одного оборота фермента (Ео > So) необходимо решать систему дифференциальных уравнений (1)-(6) без дополнительных упрощений, то есть численно. Однако в этом случае удается зарегистрировать все фермент-субстратные комплексы и интермедиаты реакции и охарактеризовать все стадии ферментативного процесса.

Таким образом, методы предстационарной кинетики позволяют детально проанализировать механизм ферментативной реакции. Хотя этот подход более сложен технически и при его использовании требуется трудоемкий математический анализ кинетических кривых, изучение ферментативных реакций в предстационарных условиях позволяет в значительной степени углубить знания о механизмах действия ферментов [35,36].

При изучении биологических объектов используются такие методы предстационарной кинетики, как метод прерывания реакции («quench-flow») и метод остановленной струи («stopped-flow»), которые могут быть использованы для большого круга ферментов и позволяют минимизировать объемы и количество реагирующих веществ. В основе обоих методов лежит быстрое, в течение < 1 мс, смешивание взаимодействующих веществ и остановка потока реакционной смеси. Прерывание реакции в методе «quench-flow» происходит либо при быстром замораживании/нагревании реакционной смеси, либо при смешивании с веществами, блокирующими протекание реакции. Анализ состава реакционной смеси на различных временах от начала реакции в интервале времени порядка 1-1000 мс дает возможность построить кинетические зависимости для интермедиатов и конечных продуктов. В методе остановленной струи изменение концентрации веществ в ходе химической реакции регистрируется, как правило, оптическими методами, например, по изменению оптического поглощения или интенсивности флуоресценции раствора.

Хорошо известно, что триптофан (Тгр) является наиболее интенсивно флуоресцирующей аминокислотой [15], и примерно 90% всей флуоресценции белков обычно обусловлено его присутствием. Максимумы испускания флуоресценции белков зависят от локального окружения остатков Тгр в молекуле полипептида. Например, сдвиг в коротковолновую область интерпретируют, как результат экранирования триптофановых остатков от водной фазы. В то же время процесс денатурации приводит к длинноволновому сдвигу в спектре испускания флуоресценции и, приблизительно, к одной и той же величине максимума в спектре испускания всех белков. Свойства Тгр позволяют использовать его как высокочувствительный флуоресцентный маркер конформационных изменений в молекулах белков [37-39]. Однако необходимо иметь в виду, что большинство белков содержит несколько остатков Тгр, находящихся в различном окружении, поэтому спектральные свойства каждого из них могут различаться.

Флуоресцентные свойства макромолекул часто не позволяют получать из эксперимента желаемую информацию. В таком случае используют флуорофоры, которые хотя и являются посторонними по отношению к исследуемой системе, но имеют лучшие спектральные свойства. Например, при исследовании ферментативных реакций с участием нуклеиновых кислот используют аналоги нуклеотидов, которые флуоресцируют и при этом сохраняют способность к образованию водородных связей с ^модифицированными нуклеотидами. Конформационные переходы в молекуле ДНК, как правило, регистрируют по изменению интенсивности флуоресценции 2-аминопурина (2-аРи). Остаток 2-аРи является одним из самых привлекательных флуоресцирующих аналогов азотистых оснований. В паре 2-аРи/Т происходит образование двух водородных связей, как и в случае с аденином, в то же время в паре 2-аРи/С возможно образование как одной, так и двух водородных связей [40, 41]. Таким образом, встраивание остатка 2-аРи напротив оснований С и Т приводит к минимальным нарушениям структуры ДНК. Известно, что интенсивность флуоресценции 2-аРи очень сильно зависит от внешнего окружения. Например, при наличии стэкинг-взаимодействия между соседними основаниями, а также при образовании двухспиральных структур ДНК происходит резкое уменьшение интенсивности флуоресценции остатков 2-аРи [42]. Чувствительность характеристик флуоресценции 2-аРи к конформационным изменениям, происходящим в двойной спирали ДНК, способствует использованию именно этого маркера при исследовании взаимодействий ферментов с ДНК. 2-Аминопурин применяли для изучения кинетических характеристик различных ферментов, взаимодействующих с ДНК, например фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I [43], ДНК-полимеразы Р и X [37, 44], РНК-полимеразы бактериофага Т7 [45], ДНК-полимеразы бактериофагов Т4 и RB69 [46, 47], ДНК-метилтрансфераз [48], ДНК-гликозилаз [39] и других ферментов.

В настоящем обзоре рассмотрены результаты кинетических исследований ферментов, взаимодействующих с нуклеиновыми кислотами в предстационарных условиях. Выбор конкретных ферментов, вошедших в обзор литературы, основывался на нескольких факторах: (1) это ферменты, взаимодействующие с нуклеиновыми кислотами; (2) для этих ферментов или их ближайших гомологов известны кристаллические структуры в свободном состоянии и/или в комплексе с субстратом. Несмотря на огромное количество работ посвященных ферментам, взаимодействующим с ДНК, наличие перечисленных ограничений приводит к конечному числу рассматриваемых примеров. В обзоре представлены некоторые ДНК- и РНК-полимеразы, рассмотрены также представители ДНК-лигаз, ДНКметилтрансфераз и ДНК-гликозилаз. Особое внимание направлено па связь структуры взаимодействующих молекул и конформационных изменений с кинетическим механизмом реакции и на выяснение роли отдельных элементарных стадий в протекании ферментативного процесса.

Способность удваивать геном является необходимым условием жизни всех организмов. Считается, что самые первые ферменты обладали полимеразной активностью. Основной задачей полимераз является безошибочное копирование полной последовательности генома с целью сохранить всю закодированную в нем информацию. Полимеразы передвигаются вдоль ДНК и одновременно осуществляют синтез дочерней цепи. Эти ферменты могут иметь различные размеры, клеточные функции, точность синтеза и чувствительность к аналогам нуклеотидов. Однако их объединяет общая особенность - реакция переноса нуклеотида на З'-конец праймера, в которой участвуют двухвалентные ионы металла и несколько групп консервативных аминокислотных остатков (Рис. 1).

Сравнение аминокислотной последовательности [49], а также анализ кристаллических структур ДНК-полимераз [50] позволяет разделить их на пять семейств. В настоящее время известны кристаллические структуры представителей четырех семейств. Наиболее изученным из них является семейство ДНК-полимеразы I (pol I) или А-семейство, которое включает фрагменты Клепова ДНК-полимеразы I Escherichia coli и Bacillus stearothermophilus, ДНК-полимеразу I Thermus aquaticus и РНК- и ДНК-полимеразы фага Т7 [51-53]. Второе семейство ДНК-зависимых ДНК

1.1. ДНК- и РНК-полимсразы

Рис. 1. Общая структура активного центра полимераз. Номера аминокислотных остатков соответствуют ДНК-полимеразе I Escherichia coli.

Здесь и далее рисунки представлены в том виде, в каком они приведены в оригинальных работах. полимераз называется pol а или В-семейство. Все эукариотические репликационные ДНК-полимеразы и полимеразы фагов Т4 и RB69 принадлежат этому семейству [54, 55]. Обратные транскриптазы, РНК-зависимые РНК-полимеразы и теломеразы имеют ряд общих структурных элементов и объединены в единое семейство RT. В то же время, структура ДНК-полимеразы р не имеет структурного подобия ни с одним из выше перечисленных семейств [56]. На основании сравнения аминокислотной последовательности бактериальные ДНК-полимеразы III также выделены в отдельное семейство [49].

Анализ известных кристаллических структур ДНК-полимераз выявил общие элементы архитектуры этих ферментов независимо от их принадлежности к разным семействам [57]. Общую форму ДНК-полимераз сравнивают со строением правой руки и выделяют такие элементы как большой палец (thumb), ладонь (palm) и пальцы (fingers). Главная функция домена «palm» - это каталитическая реакция полимеризации, домен «fingers» участвует в связывании нуклеозид-трифосфата (dNTP) и одноцепочечного участка ДНК в месте образования новой комплементарной пары. Домен «thumb» участвует в связывании ДНК и продвижении фермента после очередного акта катализа вдоль ДНК. Среди всех ДНК-полимераз «ра1т»-домен наиболее консервативен, в то время как «fingers»- и «ШитЬ»-домены различны во всех четырех семействах, для которых установлены кристаллические структуры (Рис. 2) [58]. Структура домена «palm» всех известных полимераз состоит из 4-6 ^-складчатых слоев и двух а-спиралей. Пространственное расположение этих элементов имеет одинаковые особенности для всех семейств за исключением семейства полимеразы р. Домен «thumb» состоит в основном из а-спиралей, однако структурные особенности этого домена значительно отличаются в различных семействах. Наибольшие различия в последовательностях аминокислот и структуре полимераз относятся к домену «fingers». Вторичная структура этого домена в трех из четырех семейств, для которых установлена кристаллическая структура, представлена а-спиралями различной длины и пространственной укладки относительно друг друга (Рис 2А, В, Г). Однако в случае семейства RT «fingers»-домен состоит как из антипараллельных Р-складчатых слоев, так и а-спиралей (Рис. 2Б). комплексов ДНК-пол и мераз из разных семейств: (А) семейство pal I, (Б) семейство RT, (В) семейство pol а, (Г) семейство pol р [57].

Рис. 2. Кристаллические структуры двойных

Несмотря на структурные различия, описанные выше, все полимеразы имеют общие особенности синтеза ДНК, заключающиеся в однотипном связывании ДНК, нуклеозид-трифосфатов и ионов металла, необходимых для катализа (Рис. I). Кроме того, все полимеразы имеют общее строение активного центра и изгибают молекулу ДНК примерно на 90 Сравнение структуры двойных (фермент*ДНК) и тройных комплексов (фермент-ДНК'сПМТР) показало, что полимеразы претерпевают значительные структурные изменения при связывании н у клеозид-три фосфата [52, 54, 59-61]. Такие конформационные изменения могут отвечать за специфичность/ошибочность полимеразы в процессе синтеза ДНК. Однако недавние исследования показали, что возможным фактором ошибочности некоторых ДНК-полимераз является химическая стадия процесса |62,63].

Исследования конформационных изменений ДНК-полимераз и их субстратов в процессе их взаимодействия и катализа дают возможность ответить на многие вопросы, связанные с ферментативной специфичностью и активностью этих ферментов. I fa основе кристаллических структур Д1 IK-полимераз и их комплексов, а также кинетических исследований, проведенных методами быстрой кинетики, были соотнесены конформационные изменения с различными стадиями ферментативного акта и установлена молекулярная модель полимеризационного цикла [37,43, 46].

Ниже более подробно рассмотрены структурно-динамические аспекты функционирования различных полимераз,

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кузнецов, Никита Александрович

выводы

1. Впервые по регистрации флуоресценции остатков Тгр в белках и 2-аРи в ДНК методом остановленной струи исследована предстационарная кинетика ферментативных реакций с участием 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg из Е. coli и hOggl человека. Установлено, что в ходе каталитического цикла происходят множественные конформационные изменения обоих ферментов и ДНК-субстратов. Такие изменения приводят к взаимной адаптации структур взаимодействующих молекул, формированию каталитически-активных состояний ферментов и способствуют превращению субстрата в продукт.

2. Предложены кинетические схемы взаимодействия ферментов Fpg и hOggl с ДНК-субстратами и определены константы скорости и равновесия для всех стадий, входящих в эти схемы.

3. С использованием подхода, основанного на последовательном усложнении строения ДНК-субстрата, определена молекулярная природа конформационных изменений молекул ферментов и ДНК-субстратов, происходящих в процессе их взаимодействия.

4. Установлено, что дискриминация ферментом Fpg различных типов повреждений ДНК (8-оксогуанин и 5,6-дигидроурацил) происходят на второй и третьей стадиях процесса узнавания субстрата; дискриминация ферментами Fpg и hOggl различных азотистых оснований, расположенных в комплементарной цепи напротив повреждения, происходит на второй стадии связывания субстратов.

5. Показано, что скорость превращения АР- и охоО-субстратов ферментом hOggl в присутствии 8-бромгуанина увеличивается в 8 и 2 раза, соответственно. Полученные данные подтверждают, что 8-оксогуанип, образующийся при взаимодействии hOggl с oxoG-субстратом в ходе первой каталитической стадии - гидролизе N-гликозидной связи, выполняет роль кофактора второй каталитической стадии - реакции р-элиминирования.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа является первым комплексным кинетическим исследованием механизма действия 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg Е. coli и hOggl человека. Ферменты Fpg и hOggl принадлежат разным структурным классам ДНК-гликозилаз, однако выполняют одинаковые клеточные функции, удаляя из ДНК окисленные азотистые основания. В настоящее время установлена структура этих ферментов и химический механизм их действия. Известно, что взаимодействие ферментов с ДНК-субстратами приводит к копформационным изменениям как в молекуле белка, так и в молекуле субстрата. Считается, что такие изменения структур взаимодействующих молекул приводят к образованию специфических невалентных контактов (водородные связи, стэкипг и др.), в результате этого реализуется высокоэффективное узнавание и связывание поврежденных участков ДНК.

Впервые исследована динамика конформационных превращений в молекулах ферментов и ДНК-субстратов, что имеет фундаментальное значение для исследования процесса взаимодействия этих ферментов с ДНК. Поскольку изменение структуры взаимодействующих молекул происходят в миллисекундном диапазоне времени, в работе использовали метод остановленной струи. Для наблюдения за конформационными изменениями ферментов и ДНК регистрировали интенсивность флуоресценции Тгр и 2-аРи, соответственно. В работе использовали метод усложнения структуры ДНК-субстратов, который позволил выделить конформационные изменения, характеризующие определенные взаимодействия между ферментом и субстратом. Использование мутантной формы Fpg F110W дало возможность установить конформационные изменения фермента, связанные с движением этого аминокислотного остатка. Для определения специфичности ферментов использовали ДНК-субстраты, содержащие различные типы поврежденных оснований, а также различные азотистые основания напротив повреждения. Кроме того, в работе были определены кинетические характеристики процесса взаимодействия hOggl с ДНК-субстратами в присутствии BrG.

Взаимодействие ферментов Fpg и hOggl с ДНК, не содержащей модифицированных оснований, приводило к образованию неспецифических комплексов. В обоих случаях при образовании этих комплексов происходит «разрыхление» ДНК. Однако процессы, вызывающие это «разрыхление» имеют разную природу. В случае с Fpg этот процесс, по-видимому, связан с интеркаляцией аминокислотного остатка Phe-110, в то же время в комплексе с hOggl возможно выворачивание ^модифицированного основания в «предкаталитический» центр фермента. Кинетические исследования обоих ферментов свидетельствуют о том, что скорость образования неспецифического комплекса фермент*ДНК близка к диффузионно-контролируемому пределу.

Взаимодействие ферментов с F-лигандом приводит к формированию каталитически-активного комплекса. Этот процесс был зарегистрирован по интенсивности флуоресценции Тгр для Fpg. Несмотря на то, что hOggl содержит 10 остатков Тгр (Fpg содержит 5 Тгр) при его взаимодействии с F-лигандом интенсивность флуоресценции Тгр изменялась незначительно. Однако проведенные эксперименты позволили зарегистрировать процесс встраивания аминокислотных остатков ферментов в полость F-лиганда.

При взаимодействии ферментов с АР-субстратом, кроме стадий связывания аналогичных F-лиганду, были зарегистрированы химические стадии ферментативного процесса и диссоциация комплекса фермент»продукт. Эти исследования кинетики конформационных изменений при взаимодействии ферментов с G- и F-лигандами и АР-субстратом послужили основой для анализа наиболее сложного процесса взаимодействия с oxoG-субстратом.

При взаимодействии ферментов с oxoG-субстратом было показано, что для фермента Fpg можно зарегистрировать пять стадий образования каталитически-активного комплекса. Первичное неспецифическое связывание приводит к формированию «столкновителыюго комплекса» с ДНК, в котором происходит узнавание специфического сайта и образование второго комплекса. Именно вторая стадия ответственна за узнавание. Основываясь на рентгеноструктурных данных можно предположить, что на этой стадии происходят конформационные изменения в области Phe-110. Эти изменения играют ключевую роль в процессе распознавания поврежденного участка ДНК и имеют важное значение при узнавании типа повреждения. Эксперименты с мутантом F110W позволяют заключить, что остаток Arg-108, расположенный недалеко от Phe-110, также участвует в этой стадии процесса и взаимодействует с основанием, расположенным напротив повреждения. Эти две аминокислоты осуществляют дискриминацию различных ДНК-субстратов. В том случае, когда в сайте связывания фермента находится специфический субстрат, происходит третья стадия процесса - выворачивание поврежденного основания. Эта стадия приводит к формированию полости в дуплексе ДНК.

Четвертая стадия характеризует процесс встраивания аминокислотных остатков Phe-110, Met-73 и Arg-108 в образовавшуюся в ДНК полость. После этого, на пятой стадии, происходит подстройка конформации активного центра фермента и осуществление каталитических стадий процесса.

В то же время, для фермента hOggl было зарегистрировано три стадии связывания oxoG-субстрата. Образование неспецифического комплекса приводит к «разрыхлению» двойной спирали субстрата и быстрому выворачиванию поврежденного основания в активный центр фермента. Вторая и третья стадии процесса связывания субстрата отражают последовательное встраивание аминокислот (по данным рентгеноструктурного анализа Asn-149, Tyr-203, Arg-154 и Arg-204) в полость дуплекса. Показано, что дискриминация субстратов по основанию, расположенному напротив повреждения, происходит на второй стадии процесса. В то же время третья стадия приводит к формированию каталитически-активного комплекса.

Для обоих ферментов показано, что после образования каталитически-активного комплекса последовательно происходят химические стадии ферментативного процесса. При этом, в соответствии с литературными данными было показано, что скорость-лимитирующей стадией для Fpg является N-гликозилазная реакция, а для hOggl - реакция P-элиминирования. Завершает ферментативный цикл равновесная стадия диссоциации комплекса фермент'продукт.

Таким образом, в результате работы установлена последовательность элементарных актов взаимодействия 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаз Fpg Е. coli и hOggl человека с ДНК-субстратами и изучена конформационная динамика ферментов и ДНК. Предложены кинетические схемы, позволяющие описать наблюдаемые изменения флуоресценции Тгр и 2-аРи, и определены константы скорости стадий, входящих в эти схемы. Кроме того, в прямых экспериментах по разделению продуктов реакции электрофорезом в ПААГ определены константы скорости химических стадий и показано, что они хорошо согласуются с величинами этих констант, полученных методом остановленной струи. По результатам флуоресцентного титрования определены константы диссоциации комплексов фермент'продукт. Полученные в работе данные указывают на то, что механизм ферментативного процесса в случае обоих ферментов соответствует модели индуцированного соответствия Кошланда.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Кузнецов, Никита Александрович, 2007 год

1. Friedberg Е.С., Walker G.C., Siede W. DNA repair and mutagenesis. ASM Press. Washington. DC. 1995.

2. Gros L„ Saparbaev M.K., Laval J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 2002. V. 21. P. 8905-8925.

3. AravindL., Walker D.R., Koonin E.V. Conserved domains in DNA repair proteins and evolution of repair systems. Nucleic Acids Res. 1999. V. 27. P. 1223-1242.

4. Cooke M.S., Evans M.D., Dizdaroglu M., Lunec J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. FASEB J. 2003. V. 17. P. 1195-1214.

5. Evans M.D., Dizdaroglu M., Cooke M.S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutat. Res. 2004. V. 567. P. 1-61.

6. Gupta P.K., Sirover M.A. Regulation of DNA repair in serum-stimulated xeroderma pigmentosum cells. J. Cell. Biol. 1984. V. 99. P. 1275-1281.

7. Lu. R., Nash H.M., Verdine G.L. A mammalian DNA repair enzyme that excises oxidatively damaged guanines maps to a locus frequently lost in lung cancer. Curr. Biol. 1997. V. 7. P. 397-407.

8. Audebert M., Charbonnier J.B., Boiteux S„ Radicella J.P. Mitochondrial targeting of human 8-oxoguanine DNA glycosylase hOGGl is impaired by a somatic mutation found in kidney cancer. DNA Repair. 2002. V. 1. P. 497-505.

9. Benkovic S.J., Hammes-Schiffer S. A perspective on enzyme catalysis. Science. 2003. V. 301. P. 1196-1202.

10. Bruice T.C. A view at the millennium: the efficiency of enzymatic catalysis. Acc. Chem. Res. 2002. V. 35. P. 139-148.

11. Tchou J., Bodepudi V., Shibutani S., Antoshechkin I., Miller J., Grollman A.P., Johnson F. Substrate specificity of Fpg protein recognition and cleavage of oxidatevely damaged DNA. J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 15318-15324.

12. Rosenquist T.A., Zharkov D.O., Grollman A.P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 7429-7434.

13. Zharkov D.O., Rosenquisti Т.A., Gerchman S.E., Grollman A.P. Substrate specificity and reaction mechanism of murine 8-oxoguanine-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 28607-28617.

14. Лакович Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М.: Мир. 1986. С. 2228 и 345-365.

15. Royer С.A. Probing protein folding and conformational transitions with fluorescence. Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 1769-1784.

16. DavidS.S. DNA search and rescue. Nature. 2005. V. 434. P. 569-570.

17. Amara P., Serre L„ Castaing В., Thomas A. Insights into the DNA repair process by the formamidopyrimidine-DNA glycosylase investigated by molecular dynamics. Protein Sci. 2004. V. 13. P. 2009-2021.

18. Hammes G.G. Multiple conformational changes in enzyme catalysis. Biochemistry. 2002. V.41.P. 8221-8228.

19. Boehr D.D., Dyson H.J., Wright P.E. An NMR perspective on enzyme dynamics. Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 3055-3079.

20. Olsson M.H.M., Parson W.W., Warshel A. Dynamical contributions to enzyme catalysis: critical test of a popular hypothesis. Chem. Rev. 2006. V. 106. P. 17371756.

21. Giraldo J., Roche D., Rovira X., Serra J. The catalytic power of enzymes: conformational selection or transition state stabilization? FEBS Lett. 2006. V. 580. P. 2170-2177.

22. Aganval P.К Role of protein dynamics in reaction rate enhancement by enzymes. J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 15248-15256.

23. Eisenmesser E.Z., Millet O., Labeikovsky W., Korzhnev D.M., Wolf-Watz M„ Bosco D.A., Skalicky J.J., Kay L.E., Kern D. Intrinsic dynamics of an enzyme underlies catalysis. Nature. 2005. V. 438. P. 117-121.

24. Eisenmesser E.Z., Bosco D.A., Akke M., Kern D. Enzyme dynamics during catalysis. Science. 2002. V. 295. P. 1520-1523.273031,32,33,34,35.