Конформационная динамика урацил-ДНК-гликозилаз человека SMUG1 и MBD4 в процессе взаимодействия с ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Яковлев Данила Алексеевич

• Яковлев Данила Алексеевич
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Яковлев Данила Алексеевич

Список сокращений

Введение

1 Обзор литературы: особенности структуры и субстратной специфичности урацил-ДНК-гликозилаз

1.1 Эксцизионная репарация оснований

1.2 Механизмы каталитической активности ДНК-гликозилаз

1.3 Изучение кинетики конформационных перестроек в ДНК-гликозилазах методом «остановленного потока»

1.4 Урацил и продукты дезаминирования цитозина

1.5 Урацил-ДНК-гликозилаза человека UNG2

1.6 Тимин-ДНК-гликозилаза человека (TDG)

1.7 ^ецифичная к одноцепочечной ДНК монофункциональная урацил-ДНК-гликозилаза 1 (SMUG1)

1.8 Метил-CpG-связывающий фермент 4 (MBD4)

2 Материалы и методы

2.1 Реактивы

2.2 Олигонуклуотиды и субстраты

2.3 Препараты ферментов

2.4 Изучение кинетики накопления продукта реакции

2.5 Изучение конформационной динамики взаимодействия ДНК-гликозилаз с ДНК

2.6 Анализ кинетических кривых и установление механизма конформационных переходов

3 Результаты и их обсуждение

3.1 Кинетический механизм узнавания повреждения урацил-ДНК-гликозилазой человека SMUG1

3.2 Конформационная динамика взаимодействия SMUG1 с аналогом продукта

3.3 Конформационная динамика взаимодействия SMUG1 с ДНК-субстратом

3.4 Общий механизм удаления повреждения ферментом SMUG1

3.5 Метил-CpG-связывающий фермент 4 MBD4

3.6 Конформационная динамика взаимодействия MBD4cat с аналогом продукта

3.7 Конформационная динамика взаимодействия MBD4cat с ДНК-субстратами

3.8 Общий механизм удаления повреждения ферментом MBD4cat

4 Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

5mC 5-метилцитозин;

5caC 5-карбоксицитозин;

5fC 5-формилцитозин;

5fC2'F 2'-фторо-5-формил-дезоксицитидин;

5fU 5-формилурацил;

5FU 5-фтороурацил;

5hmU 5-гидроксиметилурацил;

5OHC 5-гидроксицитозин;

5OHU 5-гидроксиурацил;

MPG Алкиладенин-ДНК-гликозилаза человека;

AID Цитидин-деаминаза, индуцируемая активацией;

ALK Структурное семейство ДНК-гликозилаз, отвечающих за удаление ал-килированных азотистых оснований;

AlkA 3-метиладенин-ДНК-гликозилаза E. coli;

AP Апуриновый/апиримидиновый сайт;

APEX1 AP-эндонуклеаза 1 человека;

APOBEC Аполипопротеин B-мРНК-редактирующий комплекс ферментов;

BER Base Excision Repair - эксцизионная репарация оснований;

BHQ1 Тушитель флуоресценции (Black hole quencher 1);

EndoIII Эндонуклеаза III E. coli;

EndoV Эндонуклеаза V E. coli;

FAM 6-(карбоксамидо)флуоресцеинфосфорамидит;

H2TH Структурное суперсемейство ДНК-гликозилаз, содержащих мотив «спираль-два поворота-спираль»;

HhH Структурное суперсемейство ДНК-гликозилаз, содержащих мотив «спираль-шпилька-спираль»;

MBD4 Метил-CpG-связывающий фермент 4 человека;

MUTYH Аденин-ДНК-гликозилаза человека;

NEIL1-3 ДНК-гликозилазы человека, гомологичные эндонуклеазе VIII из E. coli;

NTHL1 Эндонуклеаза III человека;

OGG1 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза 1 человека;

PCNA Proliferating Cell Nuclear Antigen;

RMSD Root Mean Square Deviation - среднеквадратичное отклонение позиций атомов;

RPA Репликативный белок A;

SMUG1 Специфичная к одноцепочечной ДНК монофункциональная урацил-ДНК-гликозилаза 1 человека;

TDG Тимин-ДНК-гликозилаза человека;

TET Tet-Eleven Transferases - семейство 5-метилцитозиндиоксигеназ;

Tg 5,6-дигидрокси-5,6-дигидро-тимин;

U2'F 2'-фторо-дезоксиуридин;

Udg Урацил-ДНК-гликозилаза E. coli;

sC 3,N 4-этеноцитозин.

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конформационная динамика урацил-ДНК-гликозилаз человека SMUG1 и MBD4 в процессе взаимодействия с ДНК»

Актуальность работы

ДНК в клетке на протяжении жизни организма подвергается разрушающим воздействиям: как химическому (эндо- и экзогенному) [1-5], так и физическому (УФ и ионизирующее излучение) [2,6], в результате которых в молекуле могут появляться повреждения. Важную роль в сохранности первичной структуры молекулы ДНК играет система репарации [7]. Нарушение процессов репарации, а также возникновение ошибок в ходе репликации, приводит к появлению мутаций, которые закрепляются в следующих поколениях клеток.

По размеру повреждения можно разделить на крупные (разрывы цепи, сшивки, объемные аддукты) и небольшие, которые, как правило, представляют собой модифицированные азотистые основания. В соответствии с разными типами повреждений выделяют несколько путей репарации ДНК [8].

Ошибочно вставленные во время репликации ДНК основания, нарушающие уотсон-криковские взаимодействия, удаляются по пути мисматч-репарации; большие ковалентные модификации ДНК, фотосшивки, затрагивающие несколько оснований в одной цепи и другие объемные повреждения удаляются по пути эксцизионной репарации нуклеотидов. Разрывы цепи ДНК подвергаются репарации по нескольким путям: одноцепочечные разрывы по пути репарации одноцепочечных разрывов, а двуцепочечные - по путям гомологичной рекомбинации или негомологичного соединения концов [7,8].

По пути эксцизионной репарации оснований из ДНК удаляется большинство необъемных повреждений азотистых оснований и апурин-апиримидиновые сайты (АР-сайты) [9]. Ключевыми ферментами в этом пути являются ДНК-гликозилазы, которые обнаруживают поврежденные нуклеотиды. В клетках человека экспрессируется 11 ДНК-гликозилаз, принадлежащих к четырем различным структурным суперсемействам.

Из 11 ДНК-гликозилаз четыре узнают и удаляют производные урацила: UNG2, TDG, SMUG1 и MBD4. Первые три отностятся к разным семействам суперсемейства UDG, последний - к суперсемейству НКН. Несмотря на пересекающуюся субстратную специфичность, биологическая роль у этих ферментов разная: помимо общей репарации ДНК UNG2 и SMUG1 участвуют в процессе соматической гипермутации, необходимом для формирования иммунитета, а MBD4 и TDG удаляют интермедиаты пути активного деметилирова-ния ДНК и преимущественно действуют в CpG-динуклеотидных доменах генома.

Несмотря на большой интерес к исследованию механизмов и выяснению природы высокой специфичности ферментов репарации и, в том числе, ДНК-гликозилаз, подробно исследован механизм конформационных переходов только для белка UNG2, про остальные белки известно значительно меньше, а у белка SMUG1 человека даже не разрешена кристаллическая структура. Непонятным остается вопрос, каким образом они осуществляют поиск и узнавание поврежденных оснований в ДНК. Поэтому актуальными являются исследования механизмов, обеспечивающих высокую селективность ферментов репарации к своим субстратам.

Цель работы - установление кинетических механизмов конформационных переходов в молекулах фермента и ДНК в процессах, катализируемых урацил-ДНК-гликозилазами человека MBD4 и SMUG1, и выявление общих закономерностей процессов образования каталитически активных комплексов ферментами, принадлежащими к разным структурным семействам. Для выполнения поставленной цели были решены следующие задачи:

Для выполнения поставленной цели были решены следующие задачи:

• Изучить конформационную динамику ферментов MBD4 и SMUG1 (дикого типа и мутантных форм F98W, Н239А и К243А) и ДНК в процессе их взаимодействия методом «остановленного потока» с регистрацией изменений интенсивности флуоресценции остатков триптофана в белке, а также флуоресцентных и FRET-меток, введенных в ДНК.

• С помощью методов моделирования по гомологии и молекулярной динамики получить структуры комплексов SMUG1 дикого типа и мутантных форм (F98W, Н239А, R243A), с ДНК и установить роль данных аминокислотных остатков в процессах специфического узнавания повреждения и катализа.

• Используя последовательное усложнение ДНК-субстратов и увеличение их длины изучить влияние длины ДНК-дуплекса на кинетику связывания MBD4 с ДНК и удаления повреждения.

• На основании совокупности теоретических и экспериментальных данных предложить кинетический механизм конформационных превращений в процессе взаимодействия ферментов MBD4 и SMUG1 с поврежденной ДНК.

Положения, выносимые на защиту

1. Образование каталитически компетентных комплексов ферментов человека SMUG1 и MBD4 сопровождается согласованными последовательными конформационными перестройками белка и ДНК-субстрата.

2. Аминокислотные остатки Phe98 и His239 фермента SMUG1 играют важную роль в катализе и субстратной специфичности фермента. Аминокислотный остаток А^243 не является каталитически значимым, но играет важную роль в субстратной специфичности фермента.

3. Изменение длины ДНК-субстрата фермента MBD4 влияет только на скорость поиска повреждения, но не на скорость дальнейших конформационных перестроек фермент-субстратного комплекса.

4. ДНК-гликозилазы SMUG1 и MBD4, принадлежащие к разным структурным семействам, имеют схожий механизм узнавания поврежденного основания, включающий излом ДНК-дуплекса, выворачивание поврежденного нуклеотида и встраивание аминокислотных остатков активного центра в ДНК.

Научная новизна и практическая значимость работы

В представленной работе методом остановленного потока в режиме реального времени изучена конформационная динамика взаимодействия ферментов SMUG1 и MBD4 с ДНК-субстратами. Показано, что конформационные изменения происходят как с молекулами белков, так и ДНК-субстратов. Методом моделирования по гомологии с последующей оптимизацией методом молекулярной динамики получены структуры комплексов ферментов человека SMUG1 и MBD4 с ДНК.

Сопоставление данных о конформационной динамике ферментов и ДНК со структурами комплексов позволило установить роль отдельных аминокислотных остатков SMUG1 в процессе узнавания повреждения и гидролиза #-гликозидной связи, изучить влияние длины субстрата на кинетику взаимодействия MBD4 с ДНК и предложить детальные механизмы взаимодействия SMUG1 и MBD4 с ДНК.

Личный вклад автора

Все описанные в работе результаты получены автором самостоятельно, либо при его непосредственном участии. Автор активно участвовал в анализе полученных результатов и написании статей.

Публикации и апробация работы

По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи, индексируемые в базах Web of Science и Scopus.

Результаты диссертации были представлены на российских и международных конференциях: VII Всероссийский симпозиум «Белки и пептиды» (Новосибирск, 2015); «Химическая биология 2016» (Новосибирск, 2016); «42nd FEBS Congress» (Иерусалим, Израиль, 2017); VIII симпозиум «Белки и пептиды» (Москва, 2017); «43rd FEBS Congress» (Прага, Чехия, 2018); IX симпозиум «Белки и пептиды» (Сочи, 2019).

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, их обсуждения, заключения и списка литературы. Работа изложена на 114 страницах, содержит 64 рисунка, 11 таблиц и 9 схем. Библиография включает 181 литературный источник.

1 Обзор литературы: особенности структуры и субстратной специфичности урацил-ДНК-гликозилаз

1.1 Эксцизионная репарация оснований

Небольшие поврежденные основания в ДНК, такие, как урацил, 3-метиладенин или 8-оксогуанин, обычно удаляются по пути эксцизионной репарации оснований (BER) [9,10]. Общий механизм эксцизионной репарации оснований показан на рис. 1.

Рисунок 1. Общая схема эксцизионной репарации оснований [9].

Хотя у пути BER есть несколько вариантов (короткозаплаточный и длиннозаплаточный), каждый из них сводится к набору общих элементов и, как правило, включает следующие пять шагов [9]:

1. Узнавание и удаление ошибочного или поврежденного азотистого основания путем гидролиза #-гликозидной связи, катализируемое ДНК-гликозилазой, с образованием АР-сайта.

2. Гидролиз фосфодиэфирной связи с 5'-стороны от АР-сайта АР-эндонуклеазой или разрыв сахарофосфатного остова по механизму в-элиминирования бифункциональными ДНК-гликозилазами.

3. Удаление 3'-концевого заместителя с образованием 3'-ОН группы в разрыве ДНК АРЕХ1.

4. Включение корректного нуклеотида ДНК-полимеразой в или полимеразами 5 и 8 в комплексе с белком PCNA.

5. В случае длиннозаплаточного варианта - удаление вытесненного одноцепочечного фрагмента флэп-эндонуклеазой FEN1.

6. Восстановление целостности цепи ДНК-лигазой КЮ3 или КЮ1 с образованием фосфодиэфирной связи.

ДНК-гликозилазы играют роль инициирующих ферментов в пути BER: они отвечают за поиск и узнавание поврежденного основания и запускают каскад дальнейших ферментативных реакций.

1.2 Механизмы каталитической активности ДНК-гликозилаз

Все ДНК-гликозилазы разделяются на две группы на основании их каталитического механизма и отсутствия или наличия АР-лиазной активности: моно- и бифункциональные, соответственно [11].

При гидролизе #-гликозидной связи монофункциональными ДНК-гликозилазами за-действуется молекула воды. Она выступает в качестве нуклеофила, атакующего С1'-атом остатка 2'-дезоксирибозы (рис. 2А) [12-16]. В результате гидролиза #-гликозидной связи образуется АР-сайт, который узнается АР-эндонуклеазой и репарируется по пути эксцизи-онной репарации оснований.

В случае бифункциональных ДНК-гликозилаз нуклеофилом выступает аминогруппа одной из аминокислот, находящихся в активном центре (рис. 2Б), которая при

взаимодействии с ДНК образует основание Шиффа [12,15]. Этот класс ДНК-гликозилаз катализирует не только удаление основания путем гидролиза #-гликозидной связи, но и дальнейшее образование одноцепочечного разрыва с блокирующим 3 '-концом (АР-лиазная реакция) [9].

Рисунок 2: Примеры активных центров моно- и бифункциональных ДНК-глико-зилаз, демонстрирующие общий характер механизма катализа ферментами каждой группы [12].

A. Монофункциональная ДНК-гликозилаза AlkA (E. coli) связывает молекулу воды, которая атакует электронодефицитный атом C1' остатка 2'-дезокси-рибозы. B. Бифункциональная ДНК-гликозилаза Endo III (E. coli) в качестве нук-леофила содержит аминогруппу лизина.

По типу химических модификаций небольшиие повреждения ДНК делятся на 3 группы: продукты дезаминирования [1,3,17,18], алкилирования [1,19,20] и окисления [1,21-23] оснований. В клетках человека работает 11 ДНК-гликозилаз, которые можно разделить на три группы с пересекающейся субстратной специфичностью (таблица 1, рис. 3): удаляющие продукты дезаминирования цитозина и его производных (UNG2, TDG, SMUG1 и MBD4), удаляющие окисленные основания (MUTYH, OGG1, NTHL1, NEIL1-3) и фермент MPG, удаляющий, преимущественно, продукты алкилирования пуринов.

А. Монофункциональная ДНК-гликозилаза AlkA

Б. Бифункциональная ДНК-гликозилаза Endolll

Тип повреждения Сокращение Полное название АР-лиазная активность Субстратная специфичность (основные субстраты*)

Урацил и его производные, тимин (напротив гуанина) UNG2 Урацил-ДНК -гликозилаза и (в одноцепочечной ДНК, и^, и:А) [24], 5FU [25]

TDG Тимин-ДНК-гликозилаза — Т^, ГС^, саС^ [26,27]

SMUG1 Специфичная к одноцепочечной ДНК монофункциональная ура-цил-ДНК-гликозилаза и^, 5hmU [28,29]

MBD4 Метил-CpG-связывающий фермент 4 и:а T:G, 5FU:G [30]

Алкилированные основания, гипоксан-тин MPG Алкиладенин-ДНК-гликозилаза 3тА, 7тА, 3mG, 7mG, еА, 6тА, Нх [3133]

Окисленные основания MUTYH Аденин-ДНК-гликозилаза — A:G, A:8oxoG [34,35]

OGG1 8-оксогуанин-гликозилаза 1 Есть (р) 8oxoG:C, faPyG [36-38]

NTHL1 Гомолог эндонуклеазы III 1 Есть (р) Cg, DHU, 5ohU, 5ohC [39]

Nei endonuclease VШ-like 1 Есть (р, 5) Tg, 5ohU, 5ohC, faPyA/G, мочевина в двуцепочечной ДНК [40-42]

NEIL2 Nei endonuclease VШ-like 2 Есть (р, 5) Tg, 5ohU, 5ohC в ЬиЬЬ1е-структурах и D-петлях [40-42].

NEIL3 Nei endonuclease VШ-like 3 Есть (р) Sp, Gh [43-45]

*Наиболее частые и эффективно удаляемые повреждения.

Рисунок 3. Структуры поврежденных оснований - основных субстратов ДНК-гликозилаз человека. 5XU: X=H - U, урацил; X=F - 5FU, 5-фтороурацил; X=HO -CH2 - 5hmU, 5-гидроксметилурацил; X=HO - 5ohU, 5-гидроксиурацил; 5XC: X=HO - 5ohC, 5-гидроксицитозин; X=H(C=O) - 5fC, 5-формилурацил; X=HOOC - 5caC, 5-карбоксицитозин; DHU, дигидроуридин; Tg, тимин гликоль; Cg, цитозин гликоль; sC, 3,^-этеноцитозин; Sp, спироиминодигидан-тоин; Gh, гуанидиногидантоин; FapyG, 2,6-диамино-4-гидрокси-5-формамидопиримидин, FapyA, 2,4-диамино-5-формамидопиримидин; 8oxoG, 7,8-дигидро-8-оксогуанин; 6mA, N6-метиладенин; Hx, гипоксантин; sA, 1,^-этеноаденин; 7mA, 7-метиладенин; 3mA, 3-метиладенин; 7mG, 7-метилгуанин; 3mG, 3-метилгуанин.

1.2.1 Механизмы поиска поврежденного нуклеотида ДНК-гликозилазами

Показано, что разные ДНК-связывающие белки имеют свои особенности взаимодействия с ДНК, которые тесно связаны с их функцией. Например, транскрипционные факторы прочно связывают определенную последовательность [46-48], а белок PCNA, участвующий в пути BER, связывается с ДНК вне зависимости от контекста [49].

В отличие от многих ДНК-связывающих белков, ДНК-гликозилазы должны быстро проверять каждое основание в геноме в процессе обнаружения повреждений. Это требование, обусловленное эволюционной необходимостью постоянного сканирования генома, устанавливает жесткие ограничения на термодинамические и кинетические характеристики взаимодействия данных ферментов с ДНК, которые отличаются от типичных для связывающих ДНК белков [50-53].

Если гликозилаза слишком прочно связывается с неповрежденной ДНК, то она проводит слишком много времени на неспецифических участках; если же связывание слишком слабое или гликозилаза движется слишком быстро, то она не успевает обнаружить специфическое повреждение ДНК. Такие противоречивые требования к ферментом можно назвать парадоксом «скорость - специфичность» [54,55].

Теоретические расчеты [56] показывают, что существует три основных режима динамического поиска в зависимости от значений кинетических параметров: констант ассоциации и диссоциации фермента с ДНК (коп, и скорости одномерной диффузии фермента по ДНК (и). Режим движения фермента во многом определяется параметром X - средним расстоянием, на которое молекула белка проходит по ДНК в течение каждого цикла поиска.

Если молекула фермента обладает сильным сродством к неспецифической ДНК, то есть, koff имеет небольшую величину; то X будет больше длины цепи (Ц), и цикл поиска специфичного сайта будет только один (рис. 4В). В этом случае среднее время поиска пропорционально L2, так как связанный с ДНК белок движется в режиме одномерного случайного блуждания. Из-за избыточности случайного блуждания поиск, как правило, медленный из-за того, что многие сайты посещаются неоднократно.

и оГ

X X

га со о а.

| юЧ

го *

и

о; х ш о. со

10° ^

А Б / В

Режим Режим Случайные

«прыжков» «скольжения» блуждания

(30) (ЗР + Ю) (Ю)

Л

10"3 10"1 101 103 ю5 ю7

Область сканирования Л, п. о.

Рисунок 4. Зависимость скорости поиска специфичного сайта в ДНК от кинетических параметров связывания.

L = 1000 п. о., и = 105 с-1, коп = Ю5 М-1 с-1, специфический сайт на расстоянии Ь/2 от начала цепи, ко^варьировали для изменения величины X [56].

В противоположном предельном случае, при слабом сродстве фермента к ДНК (большая кс$, X < 1) он может связываться с ДНК, но не может диффундировать вдоль нее, так как ДНК-белковый комплекс быстро диссоциирует (рис. 4А). Белок в среднем совершает L поисковых циклов. Этот динамический режим называется режимом «прыжков». Поиск в этом режиме, как правило, быстрый при условии, что константа скорости ассоциации коп высокая.

Наиболее интересное поведение - режим «скольжения» - наблюдается для промежуточных параметров взаимодействия (рис. 4Б). В этом случае эффективная длина сканирования X больше единицы, но меньше длины исследуемого участка ДНК L. В этом режиме система может достичь наиболее оптимального динамического поведения с наименьшим временем поиска. Это облегчение поиска достигается благодаря эффекту увеличения эффективного размера целевого участка ДНК: он увеличивается от одного основания до характерной длины одномерной диффузии.

Это один из основных механизмов облегченной диффузии белков во время поиска мишени, но другие процессы, такие как межсегментный перенос, также могут внести существенный вклад в облегченную диффузию [57].

Таким образом, для ДНК-гликозилаз парадокс «скорость - специфичность» разрешается тем, что диффузия ферментов вдоль ДНК происходит в режиме «скольжения», близком к оптимальному, который является комбинацией процессов диссоциации-связывания и одномерного случайного блуждания вдоль цепи ДНК [55,58,59].

Частая диссоциация с ДНК и связывание с ней в другом месте позволяет ферментам искать повреждения на обеих цепях молекулы и обходить участки, занятые другими белками (например, РНК-полимеразой) [60,61]. Как только фермент связывается с новым сегментом ДНК, он движется вдоль цепи в режиме одномерного случайного блуждания [55,59] пока не встретит препятствие или не произойдет спонтанная диссоциация комплекса.

1.2.2 Общие особенности структуры ДНК-гликозилаз

Кристаллографические исследования показали, что ДНК-гликозилазы делятся на шесть структурных суперсемейств (рис. 5) [15].

Среди 11 ДНК-гликозилаз человека представлены белки, относящиеся только к 4 суперсемействам :

• HhH MBD4, МШГН, OGG1, Шт1;

• шта

• AAG МР^

• UDG иШ2, TDG, SMUG1.

EndoV UDG HhH

H2TH AAG ALK

Рисунок 5. Структурные суперсемейства ДНК-гликозилаз [15]. Типичными кристаллическими структурами из каждого представленного класса являются: EndoV. ДНК-гликозилаза пиримидиновых димеров фага T4 EndoV (PDB ID 1VAS).

UDG. Урацил-ДНК-гликозилаза человека UNG2 (PDB ID 1EMH). Helix-hairpin-Helix (HhH). 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза человека OGG1 (PDB ID 1YQK).

Helix-two Turn-Helix (H2TH). 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза Bacillus stearother-mophilus MutM (PDB ID 1L1T).

AAG. Алкиладенин-ДНК-гликозилаза человекаMPG (PDB ID 1EWN). ALK. Алкилпурин-ДНК-гликозилаза Bacillus cereus AlkD (PDB ID 3JXZ). Изображения отдельных фрагментов белков, окрашены в соответствии со вторичной структурой, бордовым цветом выделены мотивы HhH и H2TH.

Несмотря на различные архитектуры, эти белки, за исключением семейства ALK [62], используют механизм выворачивания оснований для эффективного узнавания и связывания субстратов. На рисунке 6 представлены известные в настоящее время структуры ДНК-гли-козилаз человека в комплексе с ДНК. Видно, что все эти ферменты в составе комплекса с поврежденной ДНК индуцируют изгиб ДНК-дуплекса и выворачивают поврежденный нук-леотид в активный центр.

Д Е

Рисунок 6. Структуры ДНК-гликозилаз человека в комплексе с ДНК. Суперсемейство ШН: А, MBD4 (PDB Ю 4DK9), Б, OGG1 К). Суперсемейство Н2ТН: В, ШК1 (51Щ. Суперсемейство AAG: Г, MPG (1Е^. Суперсемейство UDG: Д, UNG2 (1ЕМН), Е, TDG (5T2W). Ход главных цепей белков (синие) и ДНК (серые) показан схематично лентами, вывернутое основание изображено в виде красной шаростержневой модели.

Несмотря на то, что ДНК-гликозилазы принадлежат к разным структурным суперсемействам, у всех них есть общие особенности строения активного центра и областей связывания с ДНК [58,63-66]. Для ряда этих ферментов показано, что они связывают свое специфичное поврежденное основание через последовательность конформационных перестроек (рис. 7) [58]. Процесс связывания начинается с образования одного или нескольких ранних комплексов распознавания (1С), в которых происходит узнавание поврежденного основания. В случае поврежденного основания образуется «вывернутый» комплекс (ЕС), конфор-мация ДНК в котором оптимальна для дальнейшей реакции гидролиза #-гликозидной связи [58].

Рисунок 7. Расширенные координаты реакции процесса распознавания неповрежденных и поврежденных оснований ферментами Udg, МиМ ^воЬасШт stearothermophilus) и OGG1 (человек).

В процессе неспецифического связывания отрицательно заряженная ДНК связывается с ДНК-гликозилазами через сеть солевых мостиков и водородных связей на участке поверхности, который обычно имеет общий положительный заряд. Сильные взаимодействия с фосфатными группами ДНК, в основном, ограничиваются участком от 3 до 10 нуклеотидов на сканируемой цепи. При этом в экспериментах с модифицированной незаряженной ДНК (метилфосфонатная модификация) показано [51], что отрицательный заряд на ДНК необходим только для связывания фермента с ДНК, но дальнейшее движение может происходить и по незаряженной молекуле.

Обнаружение повреждения ДНК-гликозилазами сопровождается взаимодействием с каждым основанием. При этом ДНК-гликозилазы используют стратегию предварительного отбора повреждений. Например, было предложено, что гликозилазы Fpg [67,68], Nei [69] и Nth [70] E. coli, NEIL1 [71], OGG1 и UNG2 [72] человека предварительно «проверяют» субстраты путем образования контактов между основанием и консервативными остатками, расположенными в непосредственной близости от активного центра. Это позволяет идентифицировать потенциальные субстраты без полного выворачивания каждого основания в карман активного центра (рис. 7, IC).

Исследования ряда ДНК-гликозилаз, таких как UNG2 [73], OGG1 [72,74], MPG [75] и TDG [76] показали, что ДНК-гликозилаза подвергается конформационным изменениям при связывании с ДНК, переходя из формы, слабо взаимодействующей с ДНК неспецифическим образом, в форму, оптимальную для узнавания повреждения (рис. 8) [58].

Все ДНК-гликозилазы, изученные до настоящего времени, индуцируют изгиб и нарушение уотсон-криковских взаимодействий между основаниями ДНК-дуплекса в области поврежденного нуклеотида. При этом угол изгиба ДНК обычно изменяется между 40° и 55° для разных ДНК-гликозилаз (рис. 7). Такие конформационные изменения облегчают выворачивание поврежденного нуклеотида из ДНК, который, вращаясь вокруг своих фосфоди-эфирных связей, перемещается в активный центр [58,66].

Рисунок 8. Механизм удаления основания монофункциональными и бифункциональными гликозилазами [77].

А. поиск повреждения. Б. Первичное связывание. В. Активированный комплекс с вывернутым основанием в активном центре. Г, Д. Катализ и диссоциация с продуктом.

Выворачивание основания - энергетически невыгодный процесс [68,72,78], поскольку приводит к неоптимальной конформации сахарофосфатного остова и нарушает Уотсон-Криковские и стэкинг-взаимодействия в ДНК-дуплексе. Следовательно, конформация ДНК с вывернутым основанием и изгибом вдоль оси дуплекса должна удерживаться за счет энергетически выгодного взаимодействия с белком.

Стабильность комплекса фермент-ДНК обеспечивается двумя основными структурными единицами, общими для всех ДНК-гликозилаз: «карманом», который узнает и

удерживает вывернутое основание, и аминокислотыми остатками, формирующими «выступ», который занимает пространство внутри спирали ДНК, образовавшееся после выворачивания основания (рис. 9) [15].

Рисунок 9. Схематичное изображение комплекса ДНК-гликозилазы с ДНК-дуплексом, содержащим повреждение.

А. Поврежденное основание (голубое) вывернуто и находится в кармане активного центра.

Б. Аминокислотные остатки белка занимают образованную при выворачивании полость.

1.3 Изучение кинетики конформационных перестроек в ДНК-гли-козилазах методом «остановленного потока»

Во время ферментативного процесса происходит связывание фермента с субстратом и другими необходимыми для реакции молекулами, например кофакторами или кофермен-тами. На данный момент считается, что формирование специфических контактов между участниками реакции, необходимое для протекания ферментативного процесса, сопровождается последовательными взаимными конформационными перестройками взаимодействующих молекул. Это явление описывается моделью индуцированного соответствия Ко-шланда [79].

Для подробного изучения ферментативного процесса и сопровождающих его конфор-мационных перестроек недостаточно только информации, полученной из статичных кристаллических структур. Несомненно, структуры несвязанного фермента и его комплекса с продуктом, лигандом или субстратом (в случае каталитически неактивных форм фермента) дают понимание основных взаимодействий фермента и субстрата и наиболее стабильных конформаций участников ферментативного процесса. Но статические структуры не позволяют изучить конформационные процессы, происходящие при переходах между теми формами, которые удалось закристаллизовать.

Для изучения фермент-субстратных взаимодействий часто применяют флуоресцентную спектроскопию [80-83]. В молекулах белка собственной флуоресценцией обладают боковые группы аминокислотных остатков триптофана и тирозина, причем основной вклад во флуоресценцию белка вносят остатки триптофана [80]. Важной особенностью флуоресценции триптофана является ее чувствительность к окружению - в гидрофобном ядре длина волны испускания остатка меньше, чем при его контакте с полярной средой [84]. Это явление позволяет судить о конформационных перестройках в молекуле белка. Однако следует учитывать, что в случае, когда в белке больше одного остатка триптофана, изменения флуоресценции белка лишь отражают динамику конформационных перестроек, но не позволяют судить о том, что именно изменилось в структуре молекулы.

В отличие от белков, молекулы нуклеиновых кислот не обладают собственной флуоресценцией. Для наблюдения их конформационных изменений приходится вводить в состав молекулы либо синтетические флуоресцентные аналоги азотистых оснований, например, 2-аминопурин (аРи) [85], или FRET-пару [86]. 2-аминопурин образует пару с тимином и менее стабильную - с цитозином [87,88]. Это основание удобно использовать для наблюдения

за изменениями в ДНК, так как интенсивность его флуоресценции снижается при образовании с ним стекинговых взаимодействий [89]. Такой эффект позволяет изучать процессы выворачивания соседних азотистых оснований и разрушения взаимодействий с ними.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Яковлев Данила Алексеевич, 2021 год

Список литературы

1. Lindahl T. Instability and decay of the primary structure of DNA //nature. - 1993. - T. 362.

- №. 6422. - C. 709-715.

2. Cadet J., Wagner J. R. DNA base damage by reactive oxygen species, oxidizing agents, and UV radiation //Cold Spring Harbor perspectives in biology. - 2013. - T. 5. - №. 2. -C.a012559.

3. Lewis C. A. et al. Cytosine deamination and the precipitous decline of spontaneous mutation during Earth's history //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2016. - T. 113.

- №. 29. - C. 8194-8199.

4. Rebhandl S. et al. AID/APOBEC deaminases and cancer //Oncoscience. - 2015. - T. 2. -№. 4. - C. 320.

5. Soll J. M., Sobol R. W., Mosammaparast N. Regulation of DNA alkylation damage repair: lessons and therapeutic opportunities //Trends in biochemical sciences. - 2017. - T. 42. -№. 3. - C. 206-218.

6. Nakano T. et al. Induction of DNA-protein cross-links by ionizing radiation and their elimination from the genome //Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2015. - T. 771. - C. 45-50.

7. Waters R. Maintaining genome integrity: Meeting on Responses to DNA Damage //EMBO reports. - 2006. - T. 7. - №. 4. - C. 377-381.

8. Chatterjee N., Walker G. C. Mechanisms of DNA damage, repair, and mutagenesis //Environmental and molecular mutagenesis. - 2017. - T. 58. - №. 5. - C. 235-263.

9. Kim Y. J., M Wilson III D. Overview of base excision repair biochemistry //Current molecular pharmacology. - 2012. - T. 5. - №. 1. - C. 3-13.

10. Wallace S. S. Base excision repair: a critical player in many games //DNA repair. - 2014. -T. 19. - C. 14-26.

11. Krokan H., Standal R., Slupphaug G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA //Biochemical Journal. - 1997. - T. 325. - №. 1. - C. 1-16.

12. Labahn J. et al. Structural basis for the excision repair of alkylation-damaged DNA //Cell. -1996. - T. 86. - №. 2. - C. 321-329.

13. Hashimoto H., Zhang X., Cheng X. Excision of thymine and 5-hydroxymethyluracil by the MBD4 DNA glycosylase domain: structural basis and implications for active DNA demeth-ylation //Nucleic acids research. - 2012. - T. 40. - №. 17. - C. 8276-8284.

14. Hashimoto H. et al. Excision of 5-hydroxymethyluracil and 5-carboxylcytosine by the thy-mine DNA glycosylase domain: its structural basis and implications for active DNA demeth-ylation //Nucleic acids research. - 2012. - T. 40. - №. 20. - C. 10203-10214.

15. Brooks S. C. et al. Recent advances in the structural mechanisms of DNA glycosylases //Bi-ochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. - 2013. - T. 1834. - №. 1. -C. 247-271.

16. Coey C. T. et al. Structural basis of damage recognition by thymine DNA glycosylase: Key roles for N-terminal residues //Nucleic acids research. - 2016. - T. 44. - №. 21. -C. 10248-10258.

17. Alseth I., Dalhus B., Bj0ras M. Inosine in DNA and RNA //Current opinion in genetics & development. - 2014. - T. 26. - C. 116-123.

18. McDaniel Y. Z. et al. Deamination hotspots among APOBEC3 family members are defined by both target site sequence context and ssDNA secondary structure //Nucleic acids research. - 2020. - T. 48. - №. 3. - C. 1353-1371.

19. Lawley P. D., Brookes P. The action of alkylating agents on deoxyribonucleic acid in relation to biological effects of the alkylating agents //Experimental cell research. - 1963. -T. 9. - C. 512-520.

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

Xiao W., Samson L. In vivo evidence for endogenous DNA alkylation damage as a source of spontaneous mutation in eukaryotic cells //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1993. - T. 90. - №. 6. - C. 2117-2121.

Klaunig J. E., Kamendulis L. M. The role of oxidative stress in carcinogenesis //Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2004. - T. 44. - C. 239-267.

Valko M. et al. Free radicals, metals and antioxidants in oxidative stress-induced cancer //Chemico-biological interactions. - 2006. - T. 160. - №. 1. - C. 1-40. van Loon B., Markkanen E., Hübscher U. Oxygen as a friend and enemy: How to combat the mutational potential of 8-oxo-guanine //DNA repair. - 2010. - T. 9. - №. 6. -C. 604-616.

Slupphaug G. et al. Properties of a recombinant human uracil-DNA glycosylase from the UNG gene and evidence that UNG encodes the major uracil-DNA glycosylase //Biochemistry. - 1995. - T. 34. - №. 1. - C. 128-138.

Mauro D. J. et al. Mechanisms of Excision of 5-Fluorouracil by the Uracil DNA Glycosylase in Normal Human Cells //Molecular Pharmacology. - 1993. - T. 43. - C. 854-854. Xu X., Watt D. S., Liu C. Multifaceted roles for thymine DNA glycosylase in embryonic development and human carcinogenesis //Acta biochimica et biophysica Sinica. - 2016. -T. 48. - №. 1. - C. 82-89.

Hashimoto H. Structural and mutation studies of two DNA demethylation related glycosyl-ases: MBD4 and TDG //Biophysics. - 2014. - T. 10. - C. 63-68.

Wibley J. E. A. et al. Structure and specificity of the vertebrate anti-mutator uracil-DNA glycosylase SMUG1 //Molecular cell. - 2003. - T. 11. - №. 6. - C. 1647-1659. Kavli B. et al. hUNG2 is the major repair enzyme for removal of uracil from U: A matches, U: G mismatches, and U in single-stranded DNA, with hSMUG1 as a broad specificity backup //Journal of Biological Chemistry. - 2002. - T. 277. - №. 42. - C. 39926-39936. Sjolund A. B., Senejani A. G., Sweasy J. B. MBD4 and TDG: multifaceted DNA glycosyl-ases with ever expanding biological roles //Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2013. - T. 743. - C. 12-25.

O'Connor T. R., Laval J. Human cDNA expressing a functional DNA glycosylase excising 3-methyladenine and 7-methylguanine //Biochemical and biophysical research communications. - 1991. - T. 176. - №. 3. - C. 1170-1177.

Saparbaev M., Kleibl K., Laval J. Escherichia coil, Saccharomyces cerevisiae, rat and human 3-methyladenine DNA glycosylases repair 1, N 6-ethenoadenine when present in DNA //Nucleic Acids Research. - 1995. - T. 23. - №. 18. - C. 3750-3755.

Roy R., Kennel S. J., Mitra S. Distinct substrate preference of human and mouse N-methylpurine-DNA glycosylases //Carcinogenesis. - 1996. - T. 17. - №. 10. - C. 2177-2182. Takao M. et al. Differential subcellular localization of human MutY homolog (hMYH) and the functional activity of adenine: 8-oxoguanine DNA glycosylase //Nucleic Acids Research. - 1999. - T. 27. - №. 18. - C. 3638-3644.

Ohtsubo T. et al. Identification of human MutY homolog (hMYH) as a repair enzyme for 2-hydroxyadenine in DNA and detection of multiple forms of hMYH located in nuclei and mitochondria //Nucleic acids research. - 2000. - T. 28. - №. 6. - C. 1355-1364. Rosenquist T. A., Zharkov D. O., Grollman A. P. Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1997. - T. 94. - №. 14. - C. 7429-7434.

Radicella J. P. et al. Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae //Proceedings of the National Academy of Sciences. -1997. - T. 94. - №. 15. - C. 8010-8015.

Dherin C. et al. Excision of oxidatively damaged DNA bases by the human a-hOgg1 protein and the polymorphic a-hOgg1 (Ser326Cys) protein which is frequently found in human populations //Nucleic acids research. - 1999. - T. 27. - №. 20. - C. 4001-4007.

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

Ikeda S. et al. Purification and Characterization of Human NTH1, a Homolog ofEscherichia coli Endonuclease III direct identification of Lys-212 as the active nucleophilic residue // Journal of Biological Chemistry. - 1998. - T. 273. - №. 34. - C. 21585-21593. Dou H., Mitra S., Hazra T. K. Repair of oxidized bases in DNA bubble structures by human DNA glycosylases NEIL1 and NEIL2 //Journal of Biological Chemistry. - 2003. - T. 278. -№. 50. - C. 49679-49684.

Hazra T. K. et al. Identification and characterization of a human DNA glycosylase for repair of modified bases in oxidatively damaged DNA //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. - T. 99. - №. 6. - C. 3523-3528.

Makasheva K. A., Endutkin A. V., Zharkov D. O. Requirements for DNA bubble structure for efficient cleavage by helix-two-turn-helix DNA glycosylases //Mutagenesis. - 2020. -T. 35. - №. 1. - C. 119-128.

Takao M. et al. Human Nei-like protein NEIL3 has AP lyase activity specific for single-stranded DNA and confers oxidative stress resistance in Escherichia coli mutant //Genes to Cells. - 2009. - T. 14. - №. 2. - C. 261-270.

Krokeide S. Z. et al. Human NEIL3 is mainly a monofunctional DNA glycosylase removing spiroimindiohydantoin and guanidinohydantoin //DNA repair. - 2013. - T. 12. - №. 12. -C. 1159-1164.

Liu M., Doublie S., Wallace S. S. Neil3, the final frontier for the DNA glycosylases that recognize oxidative damage //Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2013. - T. 743. - C. 4-11.

Kovari D. T. et al. Tethered particle motion: an easy technique for probing DNA topology and interactions with transcription factors //Single Molecule Analysis. - Humana Press, New York, NY, 2018. - C. 317-340.

Dror I., Rohs R., Mandel-Gutfreund Y. How motif environment influences transcription factor search dynamics: Finding a needle in a haystack //BioEssays. - 2016. - T. 38. - №. 7. -C. 605-612.

Schmidt H. G. et al. An integrated model of transcription factor diffusion shows the importance of intersegmental transfer and quaternary protein structure for target site finding //PloS one. - 2014. - T. 9. - №. 10. - C. e108575.

De March M. et al. Structural basis of human PCNA sliding on DNA //Nature communications. - 2017. - T. 8. - №. 1. - C. 1-7.

Dunn A. R. et al. Single Qdot-labeled glycosylase molecules use a wedge amino acid to probe for lesions while scanning along DNA //Nucleic acids research. - 2011. - T. 39. - №. 17. - C. 7487-7498.

Schonhoft J. D., Kosowicz J. G., Stivers J. T. DNA translocation by human uracil DNA glycosylase: role of DNA phosphate charge //Biochemistry. - 2013. - T. 52. - №. 15. -C. 2526-2535.

Nelson S. R. et al. Two glycosylase families diffusively scan DNA using a wedge residue to probe for and identify oxidatively damaged bases //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - T. 111. - №. 20. - C. E2091-E2099.

Hedglin M., Zhang Y., O'Brien P. J. Probing the DNA structural requirements for facilitated diffusion //Biochemistry. - 2015. - T. 54. - №. 2. - C. 557-566.

Mirny L. et al. How a protein searches for its site on DNA: the mechanism of facilitated diffusion //Journal of Physics A: Mathematical and Theoretical. - 2009. - T. 42. - №. 43. -C.434013.

Slutsky M., Mirny L. A. Kinetics of protein-DNA interaction: facilitated target location in sequence-dependent potential //Biophysical journal. - 2004. - T. 87. - №. 6. - C. 4021-4035. Shvets A. A., Kochugaeva M. P., Kolomeisky A. B. Mechanisms of protein search for targets on DNA: theoretical insights //Molecules. - 2018. - T. 23. - №. 9. - C. 2106.

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

71

72

73

74

75

Halford S. E., Marko J. F. How do site-specific DNA-binding proteins find their targets? //Nucleic acids research. - 2004. - Т. 32. - №. 10. - С. 3040-3052.

Friedman J. I., Stivers J. T. Detection of damaged DNA bases by DNA glycosylase enzymes //Biochemistry. - 2010. - Т. 49. - №. 24. - С. 4957-4967.

Berg O. G., Winter R. B., Von Hippel P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory //Biochemistry. - 1981. - Т. 20. - №. 24. -С. 6929-6948.

Gowers D. M., Wilson G. G., Halford S. E. Measurement of the contributions of 1D and 3D pathways to the translocation of a protein along DNA //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2005. - Т. 102. - №. 44. - С. 15883-15888.

Hedglin M., O'Brien P. J. Hopping enables a DNA repair glycosylase to search both strands and bypass a bound protein //ACS chemical biology. - 2010. - Т. 5. - №. 4. - С. 427-436. Rubinson E. H., Eichman B. F. Nucleic acid recognition by tandem helical repeats //Current opinion in structural biology. - 2012. - Т. 22. - №. 1. - С. 101-109. Metz A. H., Hollis T., Eichman B. F. DNA damage recognition and repair by 3-methylade-nine DNA glycosylase I (TAG) //The EMBO journal. - 2007. - Т. 26. - №. 9. -С. 2411-2420.

David S. S., O'Shea V. L., Kundu S. Base-excision repair of oxidative DNA damage //Nature. - 2007. - Т. 447. - №. 7147. - С. 941-950.

Zharkov D. O., Mechetin G. V., Nevinsky G. A. Uracil-DNA glycosylase: Structural, ther-modynamic and kinetic aspects of lesion search and recognition //Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2010. - Т. 685. - №. 1-2. -С. 11-20.

Dalhus B. et al. DNA base repair-recognition and initiation of catalysis //FEMS microbiology reviews. - 2009. - Т. 33. - №. 6. - С. 1044-1078.

Koval V. V. et al. Real-time studies of conformational dynamics of the repair enzyme E. coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase and its DNA complexes during catalytic cycle //Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. - 2010. -Т. 685. - №. 1-2. - С. 3-10.

Kuznetsov N. A. et al. Active destabilization of base pairs by a DNA glycosylase wedge initiates damage recognition //Nucleic acids research. - 2015. - Т. 43. - №. 1. - С. 272-281. Kladova O. A., Kuznetsov N. A., Fedorova O. S. Thermodynamics of the DNA repair process by endonuclease VIII //Acta Naturae (англоязычная версия). - 2019. - Т. 11. - №. 1 (40). - С. 29-37.

Kuznetsov N. A. et al. Conformational dynamics of DNA repair by Escherichia coli endonuclease III //Journal of Biological Chemistry. - 2015. - Т. 290. - №. 23. - С. 14338-14349. Kladova O. A. et al. Conformational dynamics of damage processing by human DNA Glycosylase NEIL1 //Journal of molecular biology. - 2019. - Т. 431. - №. 6. - С. 1098-1112. Banerjee A. et al. Structure of a repair enzyme interrogating undamaged DNA elucidates recognition of damaged DNA //nature. - 2005. - Т. 434. - №. 7033. - С. 612-618. Friedman J. I., Majumdar A., Stivers J. T. Nontarget DNA binding shapes the dynamic landscape for enzymatic recognition of DNA damage //Nucleic acids research. - 2009. - Т. 37. -№. 11. - С. 3493-3500.

Bruner S. D., Norman D. P. G., Verdine G. L. Structural basis for recognition and repair of the endogenous mutagen 8-oxoguanine in DNA //nature. - 2000. - Т. 403. - №. 6772. -С. 859-866.

Wolfe A. E., O'Brien P. J. Kinetic mechanism for the flipping and excision of 1, N 6-ethen-oadenine by human alkyladenine DNA glycosylase //Biochemistry. - 2009. - Т. 48. -№. 48. - С. 11357-11369.

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94

Buechner C. N. et al. Lesion search and recognition by thymine DNA glycosylase revealed by single molecule imaging //Nucleic acids research. - 2015. - T. 43. - №. 5. -C. 2716-2729.

Jacobs A. L., Schär P. DNA glycosylases: in DNA repair and beyond //Chromosoma. -2012. - T. 121. - №. 1. - C. 1-20.

Banavali N. K., MacKerell Jr A. D. Free energy and structural pathways of base flipping in a DNA GCGC containing sequence //Journal of molecular biology. - 2002. - T. 319. - №. 1. - C. 141-160.

Koshland Jr D. E. Application of a theory of enzyme specificity to protein synthesis //Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1958. -T. 44. - №. 2. - C. 98.

Liyanage M. R. et al. Fluorescence spectroscopy of peptides //Therapeutic Peptides. - Humana Press, Totowa, NJ, 2014. - C. 237-246.

Ross J. A., Jameson D. M. Time-resolved methods in biophysics. 8. Frequency domain flu-orometry: applications to intrinsic protein fluorescence //Photochemical & Photobiological Sciences. - 2008. - T. 7. - №. 11. - C. 1301-1312.

Ghisaidoobe A. B. T., Chung S. J. Intrinsic tryptophan fluorescence in the detection and analysis of proteins: a focus on Förster resonance energy transfer techniques //International journal of molecular sciences. - 2014. - T. 15. - №. 12. - C. 22518-22538. Carpenter M. L., Oliver A. W., Kneale G. G. Analysis of DNA-protein interactions by intrinsic fluorescence //DNA-Protein Interactions. - Humana Press, 2001. - C. 491-502. van Stokkum I. H. M., Laptenok S. P. Quantitative Fluorescence Spectral Analysis of Protein Denaturation //Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. - 2014. - C. 43-51. Dunlap C. A., Tsai M. D. Use of 2-aminopurine and tryptophan fluorescence as probes in kinetic analyses of DNA polymerase ß //Biochemistry. - 2002. - T. 41. - №. 37. -C. 11226-11235.

Didenko V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications //Biotechniques. - 2001. - T. 31. - №. 5. - C. 1106-1121. Sowers L. C. et al. Base pairing and mutagenesis: observation of a protonated base pair between 2-aminopurine and cytosine in an oligonucleotide by proton NMR //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1986. - T. 83. - №. 15. - C. 5434-5438. Sowers L. C., Boulard Y., Fazakerley G. V. Multiple structures for the 2-aminopurine- cy-tosine mispair //Biochemistry. - 2000. - T. 39. - №. 25. - C. 7613-7620. Jean J. M., Hall K. B. 2-Aminopurine fluorescence quenching and lifetimes: role of base stacking //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - T. 98. - №. 1. -C. 37-41.

Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler //Annual review of biochemistry. - 1978. - T. 47. - №. 1. - C. 819-846.

Chance B. Rapid and sensitive spectrophotometry. I. The accelerated and stopped-flow methods for the measurement of the reaction kinetics and spectra of unstable compounds in the visible region of the spectrum //Review of Scientific Instruments. - 1951. - T. 22. -№. 8. - C. 619-627.

Fedorova O. S. et al. Conformational dynamics and pre-steady-state kinetics of DNA glycosylases //Biochemistry (Moscow). - 2010. - T. 75. - №. 10. - C. 1225-1239. Bujalowski W. Thermodynamic and kinetic methods of analyses of protein- nucleic acid interactions. From Simpler to More Complex Systems //Chemical reviews. - 2006. -T. 106. - №. 2. - C. 556-606.

Wong I. et al. Presteady-state Analysis of a Single Catalytic Turnover byEscherichia coli Uracil-DNA Glycosylase Reveals a "Pinch-Pull-Push" Mechanism //Journal of Biological Chemistry. - 2002. - T. 277. - №. 22. - C. 19424-19432.

95. Koval V. V. et al. Pre-steady-state kinetics shows differences in processing of various DNA lesions by Escherichia coli formamidopyrimidine-DNA glycosylase //Nucleic acids research. - 2004. - T. 32. - №. 3. - C. 926-935.

96. Lari S. U. et al. Quantitative determination of uracil residues in Escherichia coli DNA: Contribution of ung, dug, and dut genes to uracil avoidance //DNA repair. - 2006. - T. 5. -№. 12. - C. 1407-1420.

97. Jaszczur M. et al. AID and Apobec3G haphazard deamination and mutational diversity //Cellular and molecular life sciences. - 2013. - T. 70. - №. 17. - C. 3089-3108.

98. Ladner R. D. The role of dUTPase and uracil-DNA repair in cancer chemotherapy //Current Protein and Peptide Science. - 2001. - T. 2. - №. 4. - C. 361-370.

99. Kavli B. et al. Uracil in DNA—general mutagen, but normal intermediate in acquired immunity //DNA repair. - 2007. - T. 6. - №. 4. - C. 505-516.

100. Krokan H. E., Drabl0s F., Slupphaug G. Uracil in DNA-occurrence, consequences and repair //Oncogene. - 2002. - T. 21. - №. 58. - C. 8935-8948.

101. Visnes T. et al. Uracil in DNA and its processing by different DNA glycosylases //Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. - 2009. - T. 364. -№. 1517. - C. 563-568.

102. Dawson N. L. et al. CATH: an expanded resource to predict protein function through structure and sequence //Nucleic acids research. - 2017. - T. 45. - №. D1. - C. D289-D295.

103. Kass S. U., Landsberger N., Wolffe A. P. DNA methylation directs a time-dependent repression of transcription initiation //Current biology. - 1997. - T. 7. - №. 3. - C. 157-165.

104. Siegfried Z., Cedar H. DNA methylation: a molecular lock //Current Biology. - 1997. -T. 7. - №. 5. - C. R305-R307.

105. Li E., Bestor T. H., Jaenisch R. Targeted mutation of the DNA methyltransferase gene results in embryonic lethality //Cell. - 1992. - T. 69. - №. 6. - C. 915-926.

106. Feinberg A. P., Tycko B. The history of cancer epigenetics //Nature Reviews Cancer. -2004. - T. 4. - №. 2. - C. 143-153.

107. Zhu J. K. Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases //Annual review of genetics. - 2009. - T. 43. - C. 143-166.

108. Dalton S. R., Bellacosa A. DNA demethylation by TDG //Epigenomics. - 2012. - T. 4. -№. 4. - C. 459-467.

109. Oswald J. et al. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote //Current biology. - 2000. - T. 10. - №. 8. - C. 475-478.

110. Mayer W. et al. Demethylation of the zygotic paternal genome //Nature. - 2000. - T. 403. -№. 6769. - C. 501-502.

111. Surani M. A., Hayashi K., Hajkova P. Genetic and epigenetic regulators of pluripotency //Cell. - 2007. - T. 128. - №. 4. - C. 747-762.

112. Niehrs C. Active DNA demethylation and DNA repair //Differentiation. - 2009. - T. 77. -№. 1. - C. 1-11.

113. Bochtler M., Kolano A., Xu G. L. DNA demethylation pathways: Additional players and regulators //Bioessays. - 2017. - T. 39. - №. 1. - C. 1-13.

114. Seisenberger S. et al. Reprogramming DNA methylation in the mammalian life cycle: building and breaking epigenetic barriers //Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. - 2013. - T. 368. - №. 1609. - C. 20110330.

115. Otterlei M. et al. Post-replicative base excision repair in replication foci //The EMBO journal. - 1999. - T. 18. - №. 13. - C. 3834-3844.

116. Weiser B. P. et al. N-terminal domain of human uracil DNA glycosylase (hUNG2) promotes targeting to uracil sites adjacent to ssDNA-dsDNA junctions //Nucleic acids research. -2018. - T. 46. - №. 14. - C. 7169-7178.

117. Hagen L. et al. Cell cycle-specific UNG2 phosphorylations regulate protein turnover, activity and association with RPA //The EMBO journal. - 2008. - T. 27. - №. 1. - C. 51-61.

118. Schormann N., Ricciardi R., Chattopadhyay D. Uracil-DNA glycosylases—Structural and functional perspectives on an essential family of DNA repair enzymes //Protein science. -2014. - T. 23. - №. 12. - C. 1667-1685.

119. Parikh S. S. et al. Base excision repair initiation revealed by crystal structures and binding kinetics of human uracil-DNA glycosylase with DNA //The EMBO journal. - 1998. -T. 17. - №. 17. - C. 5214-5226.

120. Werner R. M. et al. Stressing-Out DNA? The Contribution of Serine- Phosphodiester Interactions in Catalysis by Uracil DNA Glycosylase //Biochemistry. - 2000. - T. 39. - №. 41. -C. 12585-12594.

121. Drohat A. C., Stivers J. T. NMR evidence for an unusually low N1 p K a for uracil bound to uracil DNA glycosylase: implications for catalysis //Journal of the American Chemical Society. - 2000. - T. 122. - №. 8. - C. 1840-1841.

122. Das R. et al. Ground State Destabilization in Uracil DNA Glycosylase: Let's Not Forget "Tautomeric Strain" in Substrates //Journal of the American Chemical Society. - 2019. -T. 141. - №. 35. - C. 13739-13743.

123. Werner R. M., Stivers J. T. Kinetic isotope effect studies of the reaction catalyzed by uracil DNA glycosylase: Evidence for an oxocarbenium ion- uracil anion intermediate //Biochemistry. - 2000. - T. 39. - №. 46. - C. 14054-14064.

124. Jiang Y. L. et al. Probing the limits of electrostatic catalysis by uracil DNA glycosylase using transition state mimicry and mutagenesis //Journal of Biological Chemistry. - 2002. -T. 277. - №. 18. - C. 15385-15392.

125. Parker J. B., Stivers J. T. Uracil DNA glycosylase: revisiting substrate-assisted catalysis by DNA phosphate anions //Biochemistry. - 2008. - T. 47. - №. 33. - C. 8614-8622.

126. Parikh S. S. et al. Uracil-DNA glycosylase-DNA substrate and product structures: confor-mational strain promotes catalytic efficiency by coupled stereoelectronic effects //Proceed-ings of the National Academy of Sciences. - 2000. - T. 97. - №. 10. - C. 5083-5088.

127. Stivers J. T., Pankiewicz K. W., Watanabe K. A. Kinetic mechanism of damage site recognition and uracil flipping by Escherichia coli uracil DNA glycosylase //Biochemistry. -1999. - T. 38. - №. 3. - C. 952-963.

128. Jiang Y. L., Stivers J. T. Mutational analysis of the base-flipping mechanism of uracil DNA glycosylase //Biochemistry. - 2002. - T. 41. - №. 37. - C. 11236-11247.

129. Cravens S. L., Hobson M., Stivers J. T. Electrostatic properties of complexes along a DNA glycosylase damage search pathway //Biochemistry. - 2014. - T. 53. - №. 48. -C. 7680-7692.

130. Morgan M. T., Bennett M. T., Drohat A. C. Excision of 5-Halogenated Uracils by Human Thymine DNA Glycosylase robust activity for DNA contexts other than CpG //Journal of Biological Chemistry. - 2007. - T. 282. - №. 38. - C. 27578-27586.

131. Maiti A. et al. Crystal structure of human thymine DNA glycosylase bound to DNA elucidates sequence-specific mismatch recognition //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2008. - T. 105. - №. 26. - C. 8890-8895.

132. Pidugu L. S. et al. Structural basis for excision of 5-formylcytosine by thymine DNA glycosylase //Biochemistry. - 2016. - T. 55. - №. 45. - C. 6205-6208.

133. Baba D. et al. Crystal structure of SUMO-3-modified thymine-DNA glycosylase //Journal of molecular biology. - 2006. - T. 359. - №. 1. - C. 137-147.

134. Manvilla B. A. et al. Crystal structure of human methyl-binding domain IV glycosylase bound to abasic DNA //Journal of molecular biology. - 2012. - T. 420. - №. 3. -C. 164-175.

135. Hashimoto H., Zhang X., Cheng X. Activity and crystal structure of human thymine DNA glycosylase mutant N140A with 5-carboxylcytosine DNA at low pH //DNA repair. - 2013. -T. 12. - №. 7. - C. 535-540.

136. Da L. T., Yu J. Base-flipping dynamics from an intrahelical to an extrahelical state exerted by thymine DNA glycosylase during DNA repair process //Nucleic acids research. - 2018. -T. 46. - №. 11. - C. 5410-5425.

137. Pettersen H. S. et al. Uracil-DNA glycosylases SMUG1 and UNG2 coordinate the initial steps of base excision repair by distinct mechanisms //Nucleic acids research. - 2007. -T. 35. - №. 12. - C. 3879-3892.

138. An Q. et al. C^ T mutagenesis and y-radiation sensitivity due to deficiency in the Smug1 and Ung DNA glycosylases //The EMBO journal. - 2005. - T. 24. - №. 12. - C. 2205-2213.

139. Kemmerich K. et al. Germline ablation of SMUG1 DNA glycosylase causes loss of 5-hy-droxymethyluracil-and UNG-backup uracil-excision activities and increases cancer predisposition of Ung-/- Msh2-/- mice //Nucleic acids research. - 2012. - T. 40. - №. 13. -C. 6016-6025.

140. Dingler F. A. et al. Uracil excision by endogenous SMUG 1 glycosylase promotes efficient I g class switching and impacts on A: T substitutions during somatic mutation //European journal of immunology. - 2014. - T. 44. - №. 7. - C. 1925-1935.

141. Di Noia J. M., Rada C., Neuberger M. S. SMUG1 is able to excise uracil from immunoglobulin genes: insight into mutation versus repair //The EMBO journal. - 2006. - T. 25. -№. 3. - C. 585-595.

142. Kroustallaki P. et al. SMUG1 promotes telomere maintenance through telomerase RNA processing //Cell reports. - 2019. - T. 28. - №. 7. - C. 1690-1702. e10.

143. Lirussi L., Nilsen H. Telomere maintenance: regulating hTERC fate through RNA modifications //Molecular & cellular oncology. - 2019. - T. 6. - №. 6. - C. e1670489.

144. Matsubara M. et al. Mutational analysis of the damage-recognition and catalytic mechanism of human SMUG1 DNA glycosylase //Nucleic acids research. - 2004. - T. 32. - №. 17. -C. 5291-5302.

145. Turner D. P. et al. The DNA N-glycosylase MED1 exhibits preference for halogenated py-rimidines and is involved in the cytotoxicity of 5-iododeoxyuridine //Cancer research. - 2006. - T. 66. - №. 15. - C. 7686-7693.

146. Petronzelli F. et al. Investigation of the substrate spectrum of the human mismatch-specific DNA N-glycosylase MED1 (MBD4): Fundamental role of the catalytic domain //Journal of cellular physiology. - 2000. - T. 185. - №. 3. - C. 473-480.

147. Morera S. et al. Biochemical and structural characterization of the glycosylase domain of MBD4 bound to thymine and 5-hydroxymethyuracil-containing DNA //Nucleic acids research. - 2012. - T. 40. - №. 19. - C. 9917-9926.

148. Hill P. W. S., Amouroux R., Hajkova P. DNA demethylation, Tet proteins and 5-hy-droxymethylcytosine in epigenetic reprogramming: an emerging complex story //Ge-nomics. - 2014. - T. 104. - №. 5. - C. 324-333.

149. Rai K. et al. DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and gadd45 //Cell. - 2008. - T. 135. - №. 7. - C. 1201-1212.

150. Millar C. B. et al. Enhanced CpG mutability and tumorigenesis in MBD4-deficient mice //Science. - 2002. - T. 297. - №. 5580. - C. 403-405.

151. Wong E. et al. Mbd4 inactivation increases C^ T transition mutations and promotes gastrointestinal tumor formation //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. -T. 99. - №. 23. - C. 14937-14942.

152. Sansom O. J. et al. MBD4 deficiency reduces the apoptotic response to DNA-damaging agents in the murine small intestine //Oncogene. - 2003. - T. 22. - №. 46. - C. 7130-7136.

153. Cortellino S. et al. The base excision repair enzyme MED1 mediates DNA damage response to antitumor drugs and is associated with mismatch repair system integrity //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2003. - T. 100. - №. 25. - C. 15071-15076.

154. Screaton R. A. et al. Fas-associated death domain protein interacts with methyl-CpG binding domain protein 4: a potential link between genome surveillance and apoptosis //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2003. - Т. 100. - №. 9. - С. 5211-5216.

155. Walavalkar N. M. et al. Solution structure and intramolecular exchange of methyl-cytosine binding domain protein 4 (MBD4) on DNA suggests a mechanism to scan for mCpG/TpG mismatches //Nucleic acids research. - 2014. - Т. 42. - №. 17. - С. 11218-11232.

156. Woods R. D. et al. Structure and stereochemistry of the base excision repair glycosylase MutY reveal a mechanism similar to retaining glycosidases //Nucleic acids research. -2016. - Т. 44. - №. 2. - С. 801-810.

157. McCann J. A. B., Berti P. J. Transition-state analysis of the DNA repair enzyme MutY //Journal of the American Chemical Society. - 2008. - Т. 130. - №. 17. - С. 5789-5797.

158. Lee S., Verdine G. L. Atomic substitution reveals the structural basis for substrate adenine recognition and removal by adenine DNA glycosylase //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2009. - Т. 106. - №. 44. - С. 18497-18502.

159. Zechel D. L., Withers S. G. Glycosidase mechanisms: anatomy of a finely tuned catalyst //Accounts of chemical research. - 2000. - Т. 33. - №. 1. - С. 11-18.

160. Vocadlo D. J. et al. Catalysis by hen egg-white lysozyme proceeds via a covalent intermediate //Nature. - 2001. - Т. 412. - №. 6849. - С. 835-838.

161. Norman D. P. G., Bruner S. D., Verdine G. L. Coupling of substrate recognition and catalysis by a human base-excision DNA repair protein //Journal of the American Chemical Society. -2001. - Т. 123. - №. 2. - С. 359-360.

162. Lundblad R., Macdonald F. Handbook of biochemistry and molecular biology (5th edition). /CRC Press 2010. - 1017 С.

163. Kibbe W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator //Nucleic acids research. - 2007. - Т. 35. - №. suppl_2. - С. W43-W46.

164. Harlow E., Lane D. Bradford assay //CSH protocols. - 2006. - Т. 2006. - №. 6. -С. 1121-1132.

165. Ester M. et al. A density-based algorithm for discovering clusters in large spatial databases with noise //Kdd. - 1996. - Т. 96. - №. 34. - С. 226-231.

166. Maaten L., Hinton G. Visualizing data using t-SNE //Journal of machine learning research. -2008. - Т. 9. - №. Nov. - С. 2579-2605.

167. Волькенштейн М.В. Физика ферментов. /М.: Наука 1967. - С. 199.

168. Pettersen E. F. et al. UCSF Chimera—a visualization system for exploratory research and analysis //Journal of computational chemistry. - 2004. - Т. 25. - №. 13. - С. 1605-1612.

169. Shapovalov M. V., Dunbrack Jr R. L. A smoothed backbone-dependent rotamer library for proteins derived from adaptive kernel density estimates and regressions //Structure. - 2011. - Т. 19. - №. 6. - С. 844-858.

170. Cornell W. D. et al. A second generation force field for the simulation of proteins, nucleic acids, and organic molecules //Journal of the American Chemical Society. - 1995. - Т. 117. -№. 19. - С. 5179-5197.

171. Popov A. V., Vorob'ev Y. N. GUI-BioPASED: A program for molecular dynamics simulations of biopolymers with a graphical user interface //Molecular biology. - 2010. - Т. 44. -№. 4. - С. 648-654.

172. Ward Jr J. H. Hierarchical grouping to optimize an objective function //Journal of the American statistical association. - 1963. - Т. 58. - №. 301. - С. 236-244.

173. Henikoff S., Henikoff J. G. Amino acid substitution matrices from protein blocks //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1992. - Т. 89. - №. 22. - С. 10915-10919.

174. Baker N. A. et al. Electrostatics of nanosystems: application to microtubules and the ribo-some //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2001. - Т. 98. - №. 18. -С. 10037-10041.

175. Mi R. et al. Insights from xanthine and uracil DNA glycosylase activities of bacterial and human SMUG1: switching SMUG1 to UDG //Journal of molecular biology. - 2009. -T. 385. - №. 3. - C. 761-778.

176. Rachofsky E. L., Osman R., Ross J. B. A. Probing structure and dynamics of DNA with 2-aminopurine: effects of local environment on fluorescence //Biochemistry. - 2001. - T. 40. -№. 4. - C. 946-956.

177. Kuznetsova A. A. et al. Pre-steady-state kinetic analysis of damage recognition by human single-strand selective monofunctional uracil-DNA glycosylase SMUG1 //Molecular BioSystems. - 2017. - T. 13. - №. 12. - C. 2638-2649.

178. Mechetin G. V., Zharkov D. O. Mechanism of translocation of uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli between distributed lesions //Biochemical and biophysical research communications. - 2011. - T. 414. - №. 2. - C. 425-430.

179. Rowland M. M. et al. Microscopic mechanism of DNA damage searching by hOGG1 //Nucleic acids research. - 2014. - T. 42. - №. 14. - C. 9295-9303.

180. Blainey P. C. et al. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA //Proceedings of the National Academy of Sciences. -2006. - T. 103. - №. 15. - C. 5752-5757.

181. Kuznetsova A. A. et al. Step-by-step mechanism of DNA damage recognition by human 8-oxoguanine DNA glycosylase //Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. -2014. - T. 1840. - №. 1. - C. 387-395.