Компьютерное конструирование трехмерной структуры цитохрома Р450 1А2 и поиск его потенциальных лигандов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Белкина, Наталья Валерьевна

• Белкина, Наталья Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Белкина, Наталья Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений

Введение

Цель работы

Основные задачи работы

Обзор Литературы

Цитохром Р450 1А2

Создание новых лекарственных средств

Методы молекулярного докинга

Создание лигандов de novo

Локирование целой молекулы

Ограничения прямых методов

Методы типа QSAR

Методы CoMFA и CoMSIA

Ограничения непрямых методов

Материалы и методы

Аппаратная база работы

Программная база работы

Информационные ресурсы, использованные в работе

Моделирование трехмерной структуры CYP1A2

Оценка качества построения модели CYP1A2

Программа ERRAT

Программа PR0CHEK

Создание библиотек конформеров

Оптимизация комплекса двух молекул

Оптимизация конформации лиганда при поиске в базах данных

Процедура локирования - программа ОоскЭеагсЬ

Создание ОБАИ модели с использованием метода СоМБ1А

Создание корреляционных уравнений методом нейронных сетей

Результаты и обсуждение

Моделирование трехмерной структуры СУР1А2

Оценка качества построения модели СУР1А2

Моделирование комплексов СУР1А2 с кофеином и

7-этоксирезоруфином

Предсказание констант диссоциации

Использование нейронных сетей

Создание ЗБ-ОЗАЛ+СоМЗЬА модели

Скрининг баз данных

Выводы

Список литературы

Приложение 1

СПИСОК СОКРАЩЕНИИ

3D-QSAR - 3-Dimensional QSAR.

CMC - Comprehensive Medical Chemistry.

CoMFA - Comparative Molecular Field Analysis.

CoMSIA - Comparative Molecular Similarity Indices Analysis.

CYP101 - цитохром P450 cam.

CYP102 - цитохром P450 Bm-3.

CYP107A1 - цитохром P450 Erif.

CYP108 - цитохром P450 Terp.

CYP1A2 - цитохром P450 1A2.

Kd - константа диссоциации белок-лигандного комплекса.

MelQx - 2-амино-З,8-диметилимидазо[4,5-f] хиноксалин.

PDB - Protein Data Bank.

PhIP - 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо [4,5-Ь]пиридин.

QSAR - Quantitative Structure-Activity Relationship.

QSMR - Quantitative Structure-Metabolism Relationship.

RMSD - среднеквадратичная разность расстояний между

тождественными атомами.

SCR - структурно-консервативный регион.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Компьютерное конструирование трехмерной структуры цитохрома Р450 1А2 и поиск его потенциальных лигандов»

ВВЕДЕНИЕ

Цитохромы Р450 являются гемсодержащими монооксигеназами ферментами, присущими почти всем живым существам и окисляющими как эндогенные, так и экзогенные низкомолекулярные органические соединения. К этому обширному надсемейству принадлежит и цитохром Р450 1А2 человека (СУР1А2), который участвует в метаболизме стероидов и, кроме того, способен окислять многие лекарственные соединения и другие ксенобиотики, иногда образуя при этом канцерогенные вещества. По этой причине ингибиторы СУР1А2 могут найти применение для профилактики онкологических заболеваний, причиной которых служит лекарственная терапия или контакт с вредными химикатами на производстве, в быту или вследствие проживания в экологически неблагополучных районах. Кроме того, окислительная модификация лекарственных соединений уменьшает их терапевтический эффект, и потому ингибирование СУР1А2 позволяет снизить обычно применяемые дозы.

В последние годы прямой поиск ингибиторов ферментов вытесняется вычислительным экспериментом, при котором взаимодействие реальных молекул лиганда и белка так или иначе симулируется с помощью их молекулярных моделей. Подобный подход позволяет в разумное время выявить потенциальные ингибиторы среди сотен тысяч доступных соединений, структуры которых объединены в электронные банки данных.

Необходимой предпосылкой при этом является знание трехмерной структуры участка связывания молекулы-лиганда на поверхности белка - обычно активного центра фермента. Расчетные методы, позволяющие оценить стерическую комплементарность лиганда участку связывания и энергию их взаимодействия, в конечном итоге приводят к гипотетическим структурам лиганд-белковых комплексов. Сведения о расположении лигандов в этих комплексах необходимы для вычисления значений константы диссоциации комплекса - параметра, отражающего эффективность лигандов в качестве конкурентных ингибиторов.

К сожалению, трехмерная структура цитохрома СУР1А2 человека, равно как и других мембранных цитохромов Р450, пока экспериментально не определена. Поэтому общей проблемой при поиске ингибиторов этих ферментов является возможность использования молекулярных моделей активного центра, основанных не на опытных данных (обычно - результатах рентгеноструктурного анализа), а на применении вычислительных методов. Применение расчетных молекулярных моделей активных центров цитохромов Р450 может значительно упростить и ускорить направленный поиск крайне необходимых лекарственных соединений. Эффективность такого подхода зависит от методологии как конструирования молекулярной модели фермента, так и последующего использования модели при поиске прочно связывающихся лигандов.

Построение трехмерной молекулярной модели белка с использованием его гомологии с другими белками, предсказание структуры комплексов белков с низкомолекулярными лигандами и корреляционный расчет констант диссоциации лиганд-белковых комплексов - все эти вычислительные методы интенсивно развиваются в последние годы, и их надежность постепенно увеличивается. Тем не менее, каждый из этих методов неизбежно сопряжен с ошибками, поскольку вынужденно основан на большом числе допущений и упрощений. С еще большей неопределенностью связан подход, развитый в данной работе, который основан на последовательном применении всех трех методов. Поэтому его применение, оправданное практической необходимостью, должно быть основано на тщательной экспериментальной проработке для каждого класса ферментов.

Выбор СУР1А2 в качестве объекта исследования обусловлен не только его биологической значимостью. Этот фермент по своей аминокислотной последовательности в значительной степени гомологичен бактериальным цитохромам с известной трехмерной структурой, что способствует надежности моделирования. С другой стороны, известны свойства комплексов СУР1А2 с различными соединениями, что позволяет оценить достоверность расчетной модели фермента и применить корреляционные методы для

предсказания констант диссоциации ранее неизвестных лиганд-белковых комплексов.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

На примере цитохрома СУР1А2 человека разработать и проверить методологию использования расчетной молекулярной модели белка для поиска возможных лигандов.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ РАБОТЫ

1. Построение трехмерной молекулярной модели СУР1А2, основанной на гомологии этого белка с бактериальными цитохромами Р450, структура которых определена рентгеноструктурным методом.

2. Моделирование структуры комплексов СУР1А2 с низкомолекулярными лигандами, для которых известны данные об эффективности их связывания с ферментом.

3. Разработка корреляционных уравнений на основе характеристик полученных комплексов для предсказания констант диссоциации комплексов СУР1А2 с ранее не исследованными лигандами.

4. Поиск новых эффективных лигандов СУР1А2 в банках данных низкомолекулярных соединений путем предсказания пространственного строения их комплексов с СУР1А2 и последующей оценки соответствующих констант диссоциации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Цитохром Р450 1А2

Цитохромы Р450 представляют собой суперсемейство гем содержащих монооксигеназ, которые обнаружены почти у всех видов живых существ. Ферменты, входящие в это суперсемейство, отвечают за окислительный метаболизм широкого спектра как экзогенных, так и эндогенных низкомолекулярных веществ [Арчаков, 1975] и являются ключевым звеном метаболизма многих лекарственных веществ. Осуществляемая цитохромами Р450 окислительная модификация некоторых экзогенных низкомолекулярных веществ иногда приводит к образованию их канцерогенных производных. Все вышесказанное определяет интерес к особенностям строения и функций различных представителей суперсемейства цитохромов Р450.

Аминокислотная последовательность различных цитохромов Р450 определена для многих видов эукариотических и прокариотических организмов [Nelson, 1996], однако трехмерная структура известна только для пяти бактериальных цитохромов Р450. Эти данные используются при моделировании трехмерных структур

эукариотических цитохромов Р450.

Одним из наиболее интересных представителей суперсемейства является цитохром Р4501А2 (CYP1A2), который является ключевым ферментом окислительного метаболизма многих лекарств и ответственен за окислительную активацию многих канцерогенов. В настоящее время выделены и хорошо изучены CYP1A2 крысы [Guengerich, 1982; Ryan, 1980; Fisher, 1981; Goldstein, 1982], кролика [Johnson, 1977; Haugen, 1975; Hashimoto, 1976] мыши [Negishi, 1979] и человека [Distlerath, 1985]. Аминокислотные последовательности CYP1A2 человека и CYP1A2 крысы идентичны на 75% [Jaiswal, 1987]. Следует отметить, что разработано большое число систем экспрессии CYP1A2 [Eugster, 1993; Sandhu, 1994]. Данный белок чаще всего выделяется в высокоспиновом состоянии. Для CYP1A2 характерны следующие специфические реакциями: О-деэтилирование 7-этоксирезоруфина [Glass, 1988; Burke, 1994], О-деэтилирование фенацетина [Pang, 1985; Jensen, 1995],

N-деметилирование кофеина [Tassaneeyakul, 1994; Notarianni, 1995] и N-гидроксилирование ряда гетероциклических аминов [Yamazoe, 1984; Boobis, 1994]. Рекомбинантный CYP1A2 человека и CYP1A2, выделенный из микросом печени крысы, имеют сходный спектр каталитической активности, хотя существуют и некоторые отличия. Скорость О-деэтилирования 7-метоксирезоруфина у крысы выше, чем у человека, и составляет 1,5 и 0,3 нмоль продукта в минуту на нмоль цитохрома Р450, соответственно. Скорость N-гидроксилирования 2-амино-З,8-диметилимидазо[4,5-f] хиноксалина (MelQx) выше у человека, чем у крысы - 3,0 и 0,5 нмоль продукта в минуту на нмоль цитохрома Р450, соответственно. С другой стороны, N-гидроксилирование, например, 2-амино-1-метил-6-фенилимидазо [4,5-Ь]пиридина (PhIP) оба цитохрома осуществляют с одинаковой скоростью - 4,0 нмоль продукта в минуту на нмоль цитохрома Р450. Канцерогенные соединения MelQx и PhIP образуются при кулинарной обработке мяса, причем N-гидроксилирование этих соединений, катализируемое CYP1A2, является основным путем метаболизма, приводящим к образованию мутагенных производных [Eaton, 1995; Gooderham, 1997].

Иммунохимические исследования показали, что содержание CYP1A2 в микросомах печени человека варьирует в среднем от 10 до 245 пмоль/мг белка, а в микросомах печени интактных крыс - от 4 до 35 пмоль/мг белка. Уровень содержания CYP1A2 меняется в зависимости от состояния, диеты и индивидуальных особенностей организма [Guengerich, 1997]. Индукция CYP1A2, т.е. значительное увеличение синтеза фермента, может быть обусловлена воздействием сигаретного дыма, употреблением определенных лекарственных средств, таких как оральные контрацептивы, барбитураты или некоторые анестетики, или проживанием в областях с загрязненной окружающей средой.

Характерными субстратами CYP1A2 являются полициклические, гетероциклические и/или галогенированные углеводороды. Субстратами CYP1A2 являются многие экзогенные канцерогены и лекарства, а также эндогенные стероиды. Ингибирование CYP1A2 обычно носит конкурентный характер. Очень часто такими конкурирующими между собой соединениями являются лекарства и

ксенобиотики, входящие в состав продуктов питания. Клиническое значение такого рода взаимодействия зависит от относительных концентраций лекарств, а также от индивидуальных особенностей пациента [Hansten, 1993]. Например, многие представители группы хинолонов и фторхинолонов, которые широко используются как антибактериальные средства, являются конкурентными и обратимыми ингибиторами CYP1A2. Одновременный прием ципрофлоксацина и теофиллина может привести к повышению концентрации теофиллина в крови [Gillum, 1993], а если совместно с ципрофлоксацином применяется и циметидин, тоже являющийся специфическим ингибитором CYP1A2, метаболизм теофиллина подавляется практически полностью [Davis, 1992].

Именно участие CYP1A2 в окислительном метаболизме некоторых лекарств иногда ослабляет терапевтический эффект лекарственных средств и/или приводит к проявлению многих побочных действий. Поэтому, вещества, способные ингибировать CYP1A2, могут быть полезны для профилактики онкологических заболеваний как при лекарственной терапии, так и при контакте с вредными химическими соединениями на производстве, в быту или при проживании в экологически неблагополучных районах.

4Учитывая вышесказанное, CYP1A2 представляется нам объектом, заслуживающим внимания исследователей. Особенно важны подходы, позволяющие прогнозировать структурные и функциональные особенности данного фермента и определять круг возможных лигандов CYP1A2. Определение таких потенциальных лигандов может служить основой как для выбора ингибиторов CYP1A2, так и для предсказания особенностей метаболизма известных или вновь созданных лекарственных средств.

Создание новых лекарственных средств

Взаимодействие лекарственных соединений с макромолекулами-мишенями, такими как белки и нуклеиновые кислоты, часто лежит в основе молекулярных механизмов действия лекарств. Образование комплексов типа лиганд-мишень характерно для действия биологически активных соединений, в том числе активаторов и ингибиторов различных ферментов. В таких комплексах молекулы-лиганды пространственно комплементарны участку связывания на поверхности белка и удерживаются на нем благодаря различным видам взаимодействия (кулоновские, вандерваальсовы, водородные связи и т.п.).

Один из подходов к созданию новых лекарственных препаратов включает поиск в компьютерных банках данных, содержащих описание сотен тысяч структур низкомолекулярных веществ, новых базовых структур, комплементарных функционально важным участкам белков. Такой поиск может осуществляться различными методами, которые можно разделить на два класса:

1) Прямой поиск - методы, основанные на знании структуры места связывания лиганда в макромолекуле-мишени. В их основе лежат методы компьютерной молекулярной графики и/или молекулярного докинга.

2) Непрямой поиск - методы, основанные на знании структур и свойств известных лигандов. Эта группа включает в себя методы ОБАК.: построение фармакофоров, поиск по общим элементам структуры, ЗБ-£)ЗАК с использованием СоМЕА.

Методы молекулярного докинга

Вычислительный эксперимент, позволяющий выявить

пространственное соответствие структур лиганда и белка, называется процедурой геометрического докинга. Однако пространственная комплементарность лиганда к рецепторному участку является необходимым, но далеко не всегда достаточным условием эффективного связывания. Поэтому геометрический докинг как средство поиска потенциальных лигандов среди десятков и сотен тысяч органических соединений должен сочетаться с оценкой энергии

взаимодействия лиганда с белком, а также с процедурами, позволяющими в определенных пределах максимизировать эту энергию. Такого рода компьютерное моделирование взаимодействия молекулы лекарства с его биологической мишенью позволяет выявить принципиально новое вещество, которое могло бы служить лигандом для макромолекулы-мишени с известной структурой. Новые лиганды могут быть созданы с помощью компьютерного моделирования de novo или обнаружены в существующих банках данных низкомолекулярных химических соединений [Арчаков, 1996] .

Создание лигандов de novo

Данная группа методов носит название фрагментарных и позволяет создать новое фармакологически активное соединение, оперируя библиотекой молекулярных фрагментов. Новые небольшие молекулы строятся внутри определенного места связывания, при этом критерием успешного присоединения дополнительных фрагментов служит увеличение числа благоприятных контактов молекул лиганда и мишени. Фрагментарные методы могут быть разделены на две основные подгруппы, которые можно определить как восходящие (build-up) методы и методы конструирования промежуточных элементов (bridging).

Восходящие методы характеризуются тем, что единственный фрагмент (или затравка) размещается в полости связывания и далее к нему шаг за шагом присоединяются другие группировки. Так работает, например, программа GROW, которая была разработана для проектирования пептидов, связывающихся с макромолекулой [Moon, 1991]. Это типичный восходящий метод, где аминокислотная затравка и следующие остатки добавляются итеративно. Конформации выбираются из предварительно созданной библиотеки

низкоэнергетических конформеров аминокислотных остатков. Существует и другой метод пептидного дизайна - GroupBuild [Singh, 1991], использующий библиотеку общих органических масок и полное описание нековалентных взаимодействий между лигандом и ферментом. Таким образом строится лиганд, который стерически и электростатически соответствует месту связывания [Rotstein, 1993а,b].

При использовании методов конструирования промежуточных элементов в месте связывания размещают ключевые функциональные группы, а затем предпринимают попытки соединить их в одну структуру. Одна из реализаций данного метода - программа LUDI [Böhm, 1992а, b]. Она соединяет в пространстве фрагменты, которые предварительно локируются в специфические области рецептора, например, доноры или акцепторы водородной связи, либо гидрофобные элементы. Место связывания может быть представлено как результат работы программы GRID [Goodford, 1985], которая позволяет картировать поверхность рецептора (участок места связывания и прилегающую к нему область пространства) с учетом физико-химических свойств. Фрагменты выбираются из заранее заданных библиотек, которые без труда могут быть сформированы пользователем. Размещенные фрагменты могут быть соединены с помощью линейных групп.

Докирование целой молекулы

Другая группа методов используется для поиска потенциальных лигандов в базах данных, содержащих структуры уже известных химических соединений. Для выполнения подобного поиска используют некоторую оценочную функцию, с помощью которой выявляют лиганды, структура которых наиболее комплементарна поверхности белка. Затем отбирают наилучшие результаты с помощью различных критериев оценки. Одной из самых ранних и наиболее широко применяемых программ для «стыковки» лиганда и мишени является программа DOCK [Kuntz, 1982; Schoichet, 1992]. Метод заключается в заполнении полости связывания в макромолекуле-мишени локально

комплементарными макромолекулярной поверхности сферами

[Connolly, 1983]. Далее в базе данных, содержащей трехмерные структуры химических соединений, выполняется поиск потенциальных лигандов, у которых межатомные расстояния соответствуют расстояниям между сферами слепка с места связывания. В исходном варианте этот алгоритм проверен только для стерической комплементарности. Последующие версии были ориентированы на усложнение различных функций оценки. В наиболее широко распространенной версии используются молекулярные поля сил [Meng, 1992], возможна химическая идентификация сфер [Schoichet, 1993],

а также может быть учтена гидратация [Meng, 1994]. В последние годы делаются попытки учесть гибкость молекул лигандов. Программа FLOG [Miller, 1994], развившаяся из DOCK, учитывает гибкость лигандов путем использования набора конформеров каждой молекулы, который хранится в базе данных. В конечном итоге отбирается конформер, комплекс которого получил наилучшую оценку.

В нашей лаборатории была разработана программа молекулярного докинга DockSearch [Ivanov, 1997; DockSearch 1998; Скворцов, 1998], позволяющая в итерационном режиме осуществлять последовательный докинг молекул из базы данных, содержащей структуры низкомолекулярных соединений, в активный центр мишени. В процессе докинга подвижна только молекула лиганда. Мишень и лиганд существуют в собственных декартовых системах координат, центры которых не совпадают. Лиганд имеет три вращательные и три поступательные степени свободы, отнесенные к его системе координат. Молекулы рассматриваются как наборы неводородных атомов, которые представлены сферами равного радиуса (1,4-1,6 Ä), центры которых совпадают с центрами атомов. Пространственное расположение атомов в молекуле отвечает выбранной конформации, которая не изменяется в ходе докинга. На поверхности каждой атомной сферы равномерно размещается заданное и равное число точек. Точка считается расположенной на поверхности молекулы, если пробная сфера (ее радиус обычно равен эффективному радиусу молекулы воды - 1,4 А) касается в ней данной атомной сферы и при этом не пересекается с другими атомными сферами. Процедура докинга заключается в последовательном выполнении следующих операций:

1. Ориентация лиганда фиксируется в пространстве заданием углов его поворота относительно осей подвижной системы координат.

2. Рассматривается набор векторов смещения центра координат лиганда относительно центра координат мишени. Каждый такой вектор получается совмещением двух поверхностных точек лиганда и мишени, для которых нормали к атомным сферам антиколлинеарны.

3. Исключаются вектора смещения, при которых пересекаются атомные сферы лиганда и мишени. Оставшиеся расположения лиганда и мишени рассматриваются как потенциальные комплексы этих молекул.

Для них вычисляется число поверхностных точек лиганда и мишени, которые в комплексе перестали быть поверхностными. Доля таких точек коррелирует со скрытой поверхностью комплекса (то есть с поверхностью, недоступной для молекул воды).

4. Углы поворота лиганда относительно осей подвижной системы координат изменяются, после чего осуществляется возврат к п. 2.

Таким образом, генерируется очень большой набор гипотез о строении комплексов, каждый из которых характеризуется величиной скрытой поверхности. Их число сокращается путем кластеризации по среднеквадратичному отклонению расстояний между атомами, таким образом, чтобы центру кластера отвечал комплекс с максимальной скрытой поверхностью.

Фактически эта программа работает как генератор гипотетических комплексов, оценка и отбор которых может быть осуществлен на последующих этапах с помощью различных критериев и дополнительных методов анализа.

Ограничения прямых методов

Существенным ограничением прямых методов поиска является необходимость знания трехмерной структуры макромолекулы-мишени, а лучше ее комплекса с известным лигандом. Обычно подобную информацию получают из компьютерного банка PDB (Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory) [Sussman, 1998]. Наиболее благоприятной ситуацией для осуществления подобного поиска является наличие нескольких комплексов и набор известных лигандов с экспериментально установленными биохимическими характеристиками их взаимодействия с мишенью. Такой характеристикой может быть, например, константа диссоциации комплекса (Kd). К сожалению такая идеальная стартовая ситуация бывает редко. Значительно чаще, в том числе и в случае с CYP1A2, данные о трехмерной структуре макромолекулы-мишени, так же как и о ее комплексах с известными лигандами, отсутствуют. Эта проблема может быть преодолена в ряде случаев путем создания трехмерной компьютерной модели макромолекулы-мишени и ее комплексов с известными лигандами. Подобное моделирование может быть выполнено на основе рентгеноструктурных данных о строении белков, гомологичных

макромолекуле-мишени [Bordo, 1993; Hilbert, 1993; Johnson, 1994; Srinivasan, 1993].

Методы типа QSAR

Классические методы QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship) представляют собой анализ взаимосвязи между биологической активностью и химической структурой вещества. Используемые для анализа взаимосвязи структура-активность методы различаются описанием химической структуры, представлением биологической активности и математическим [Kubinyi, 1995; Поройков, 1995; Kubinyi, 1997]. Методы QSAR широко применяются для оценки возможной фармакологической активности проектируемых структур. В настоящее время существует целая группа методов, основывающаяся на принципах QSAR, такие как QSMR (Quantitative Structure-Metabolism Relationship) - аналог QSAR для анализа взаимосвязи структуры вещества с его метаболизмом в организме (фармакокинетика, пути выведения, метаболиты и т.д.)[Cupid, 1999; Altomare, 1992]; 3D-QSAR (3-Dimensional QSAR) - при наличии информации о трехмерной структуре вещества в виде кристаллографических данных или трехмерной компьютерной модели в метод QSAR вводится взаимосвязь биологических свойств молекулы с расположением ее определенных заместителей в пространстве; CoMFA (Comparative Molecular Field Analysis) [Martin, 1996; Cramer, 1993]и CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis) [Klebe 1994; Klebe, 1998], осуществляющие картирование рецептора - определение формы места связывания в макромолекуле-мишени путем анализа набора гомологичных лигандов. Пространственное картирование места связывания лиганда и построение модели фармакофора [Loew, 1993; Sheridan, 1989; Tschinke, 1993] может позволить осуществить поиск соответствующих построенному фармакофору малых молекул в компьютерных банках данных. Весьма распространенным подходом является использование для построения 3D-QSAR моделей методов CoMFA и CoMSIA, которые более подробно будут описаны ниже.

Методы CoMFA и CoMSIA

Метод сравнительного анализа молекулярных полей (CoMFA), используемый в рамках 3D-QSAR, позволяет охарактеризовать важные стерические, электростатические, гидрофобные и др. участки вокруг молекул лиганда, которые определяют их взаимодействие с молекулой-мишенью.

При выполнении сравнительного анализа молекулярных полей молекула помещается в параллелепипед, который разбивается трехмерной решеткой. В узлы решетки помещаются тестируемые атомы (углерод - для определения стерических полей, протон - для определения электростатических полей, молекула воды - для определения гидрофобных областей и возможности образования водородных связей). Определяются величины энергий взаимодействия этих тестируемых атомов с молекулой, причем при расчете стерических полей используется потенциал Леннарда-Джонса, а при расчете электростатических - кулоновский потенциал. В результате получаются большие ряды данных, которые обрабатываются методом частичных наименьших квадратов.

Анализ методом частичных наименьших квадратов выполняют в две стадии. Первый этап - построение модели с выполнением процедуры скользящего контроля. Таким образом определяется, насколько адекватна модель и выявляется оптимальное число компонентов. Компоненты представляют собой линейные комбинации независимых переменных, использующихся в анализе. Затем выполняется окончательный анализ без скользящего контроля с тем количеством компонентов, которое было определено ранее. Процедура скользящего контроля осуществляется путем удаления одного или нескольких соединений из первоначального набора молекул, построения модели для такой уменьшенной выборки и предсказания по полученной модели свойств удаленных соединений. Такая процедура повторяется до тех пор, пока свойства всех соединений не будут предсказаны хотя бы один раз. Основа для оценки текущей модели -предсказанная ошибка суммы квадратов PRESS (Predictive Error Sum of Square), которая вычисляется по формуле:

PRESS = где:

PRESS - предсказанная ошибка суммы квадратов, Ургеа ~ предсказанное значение биологической активности для данного соединения,

Yobs ~ экспериментальное значение биологической активности для данного соединения.

Оптимальным числом компонентов является то, при котором стандартная ошибка скользящего контроля минимальна. Стандартная ошибка определяется как:

s - PRESS / (п-с, где:

s - стандартная ошибка,

PRESS - предсказанная ошибка суммы квадратов, п - число соединений, с - число компонентов.

В результате анализа получают сложное регрессионное уравнение. Анализ модели выполняют по картам распределения полей. О достоверности модели судят по тем же статистическим показателям, что и в классических методах QSAR [Cramer, 1988]. Такими показателями являются: R2 - квадрат множественного коэффициента корреляции, отражающий процент объяснения биологической активности данными дескрипторами; s - стандартная ошибка вычислений и F - критерий значимости [Аффифи, 1982].

CoMSIA (Comparative Molecular Similarity Indices Analysis) -сравнительный анализ индексов молекулярного сходства - новый метод для сравнения молекулярных структур. Как и CoMFA, данный анализ основан на гипотезе, что изменения биологической активности лиганда связаны с изменением его молекулярных свойств и выявляет наиболее характерные черты, важные для связывания лиганда с рецептором. В CoMSIA вычисляются пять типов областей: стерические, электростатические, гидрофобные, донорные и акцепторные.

Индексы сходства вычисляются в узлах решетки для предварительно совмещенных в пространстве молекул. Для описания энергии взаимодействия пробных атомов и атомов молекулы используется кривая нормального распределения. Форма кривой нормального распределения позволяет вычислять индексы сходства во

всех узлах решетки, как внутри, так и за пределами молекулярной поверхности.

Конечный результат QSAR анализа с использованием CoMFA или CoMSIA - карты распределения полей, показывающие благоприятные и неблагоприятные области для взаимодействия лиганда и рецептора. Использование кривой нормального распределения в методе CoMSIA приводит к получению менее фрагментированных поверхностей и построению более адекватных 3D-QSAR моделей [Klebe 1994; Klebe, 1998] .

Ограничения непрямых методов

Все методы данной группы являются по своей сути статистическими и опираются на уже существующие данные о взаимосвязи структуры лекарственного соединения с его биологической и фармакологической активностями. Они позволяют провести оценку возможной фармакологической активности проектируемых соединений или предсказывать возможную структуру нового вещества-гомолога с искомыми свойствами, исходя из имеющихся знаний о структуре веществ с той или иной фармакологической активностью. Но использование непрямых методов редко дает возможность обнаружить принципиально новый класс веществ с заданной активностью или предсказать принципиально новый тип биологической активности для уже известного химического соединения. Таким образом, наиболее оптимальным является совместное использование прямых и непрямых методов поиска новых лигандов макромолекул-мишеней.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Аппаратная база работы

Вычислительная часть работы выполнялась на компьютерах Silicon Graphics Indigo2 (R4400-150) и 0rigin200 (2xR10000-180) под управлением операционных систем IRIX 5.2 и 6.4 соответственно. Анализ полученных результатов выполнялся на персональных компьютерах Pentium под управлением операционной системы Windows 95.

Программная база работы

В ходе работы использовалось следующее программное обеспечение:

■ пакет молекулярного моделирования Sybyl [Sybyl 6.4, 1997] фирмы Tripos (модули Sybyl Base, Advanced Computation, Biopolymer, QSAR and Advanced CoMFA, DISCO, COMPOSER, CONCORD [Pearlman, 1987], UNITY и встроеный язык программирования SPL);

■ программа проверки белковых структур ERRAT [Colovos, 1993];

■ программа проверки стереохимии белковых структур PROCHECK [Morris, 1992; Laskowski, 1993];

■ программа геометрического локирования DockSearch [Скворцов, 1998];

■ программа для вычисления характеристик гидрофобных взаимодействий [Скворцов, 1998];

■ программа Fiesta для вычисления характеристик электростатических взаимодействий с использованием быстрого разложения Фурье [Sklenar, 1990];

■ программа для построения нейронных сетей Neural Network Constructor [Krepets, 1999].

Информационные ресурса, использованные в работе

Трехмерные координаты и аминокислотные последовательности четырех бактериальных Р4 50 были получены из базы данных PDB(Protein Data Bank, Brookhaven National Laboratory) [Sussman, 1998]:

1. Цитохром P450 cam (CYP101) - PDB-код 2CPP;

2. Цитохром P450 Bm-3 (CYP102) - PDB-код 2HPD;

3. Цитохром P450 Terp (CYP108) - PDB-код 1CPT;

4. Цитохром P450 Erif(CYP107A1) - PDB-код 10XA.

Аминокислотная последовательность CYP1A2 была получена из

банка SwissProt [Bairoch, 1997] - код Р05177.

Информация о 204 известных лигандах CYP1A2 (как о субстратах, так и об ингибиторах) была получена из базы данных низкомолекулярных соединений Metabolite компании MDL Information Systems [ISIS™/Base, 1998] и из различных литературных источников. Данные о 52 известных лигандах CYP1A2, которые были использованы для построения регрессионных уравнений, представлены в таблице 1.

Данные о моделях трехмерных структур [Pearlman, 1987] низкомолекулярных молекул для поиска новых лигандов брались из базы данных коммерчески доступных соединений фирмы Maybridge [Maybridge, 1996], базы данных CMC (Comprehensive Médical Chemistry) компании MDL Information Systems [ISIS™/Base, 1998] и базы ASINEX [ASINEX, 1998].

Таблица 1. Лиганды СУР1А2, для которых известны величины констант диссоциации (Ш) . Тип лиганда обозначен буквой Э для субстратов и буквой I для ингибиторов.

N Название Тип Kd (mkM) Ссылка

1 1 -метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин S 2246 Coleman, 1996

2 2-фенил-1 -пропанол S 1100 Shimizu, 1994

3 2-фенил-2-пропанол S 480000 Shimizu, 1994

4 2-этинилнафтален I 26 Foroozesh, 1997

5 4-(1-пропил) бифенил I 4,3 Foroozesh, 1997

6 4-(метилнитрозамино)-1 -(3-пиридил)-1 -бутанон s 380 Smith, 1996

7 5,7,4' -тригид роксифлавон (Апигенин) l 0,36 Pastrakuljic, 1997

8 7-гидроксиизофлавон I 15 Monostory, 1998

9 7-гидроксифлавон I 0,075 Zhai, 1998

10 7-метоксирезурфин s 0,52 Eugster, 1993

Таблица 1 (продолжение). Лиганды СУР1А2, для которых известны величины констант диссоциации (Кс1) . Тип лиганда обозначен буквой Б для субстратов и буквой I для ингибиторов._

N Название Тип Kd (мкМ) Ссылка

11 7-этокси-4-трифторметилкумарин S 6,8 Buters, 1993

12 7-этоксикумарин S 21 Yamazaki, 1996

13 7-этоксирезурфин S 0,37 Eugster, 1993

14 АЬЬоИ-66193 S 390 Machinist, 1995

15 Я(-)-циклогексилэтиламин S 1200 Krainev, 1993

16 И(+)-1 (1-нафтол) этипамин S 130 Krainev, 1993

17 Я(+)-1 (4-пиридил) этанол S 1100 Knainev, 1993

18 Я-варфарин S 1600 Zhang, 1995

19 [Ч-напроксен S 123 Miners, 1996

20 8(-)-1(1-нафтил) этиламин S 26 Krainev, 1993

21 8(-)-1 (4-пиридил) этанол S 6600 Krainev, 1993

22 3(+)-циклогексилэтиламин S 1000 Krainev, 1993

23 Б-напроксен S 143 Miners, 1996

24 Альфа-нафтофлавон I 0,013 von Moltke, 1996

25 Афлотоксин В1 S 41 Gallagher, 1996

26 Бета-нафтофлавон I 0,008 Takahashi, 1995

27 Бунитролол S 295 Ono, 1995

28 3,5,7- тригидроксифлавон (Галангин) I 0,008 Zhai, 1998

29 Дезметилсертралин I 9,5 von Moltke, 1996

30 Зилеутон (АВТ-077) S 340 Machinist, 1995

31 Иприфлавон I 15 Monostory, 1998

32 Кофеин S 260 Tassaneeyakul, 1994

33 Ломефлоксацин I 1230 Fuhr, 1990

34 Мексилетин S 15 Nakajima, 1998

35 Миртазапин I 159 Verhoeven, 1996

36 Нарингенин I 18 Fuhr, 1993

37 Нортриптилин S 54 Olesen, 1997

38 гОланзапин S 24,2 Ring, 1996

39 Парацетамол S 3430 Patten, 1993

40 Пароксетин I 5,5 von Moltke, 1996

41 Пипемидиевая кислота I 210 Fuhr, 1990

42 Рилузол S 30 Sanderink, 1997

43 Ропинирол S 46 Bloomer, 1997

44 Серотонин I 35 Agundez, 1998

45 Сертралин I 8,8 von Moltke, 1996

46 Теофиллин S 600 Zhang, 1995

47 Фенацетин S 46 Rodrigues, 1997

48 Флувоксамин I 0,24 von Moltke, 1996

49 Флуоксетин I 4,4 von Moltke, 1996

50 Фурафиллин I 4,4 von Moltke, 1996

51 Хлороксазон S 5,7 Ono, 1995

52 Эноксацин I 140 Fuhr, 1990

Моделирование трехмерной структуры CYP1A2

Моделирование трехмерной структуры CYP1A2 было выполнено средствами программы COMPOSER пакета Sybyl. Сравнительный анализ пространственных структур 4 бактериальных цитохромов Р450 и их аминокислотных последовательностей с CYP1A2 позволил определить структурно-консервативные регионы (SCR) в последовательности CYP1A2. Трехмерные координаты для SCR в модели CYP1A2 были взяты из соответствующих участков бактериальных цитохромов Р450. Для петель белковой цепи, которые не вошли в состав SCR, координаты подбирались из гомологичных участков различных белков из PDB или создавались de novo. Полученная структура CYP1A2 была оптимизирована с помощью процедуры минимизации энергии.

Минимизация энергии при моделировании молекулы CYP1A2 выполнялась методом Пауэла (Powell, ускоренный метод сопряженного градиента) [Powell, 1977], соответствующая процедура имеется в составе модуля Advanced Computation программного пакета Sybyl. Использовалось 500 шагов минимизации. Процедура останавливалась раньше, если градиент энергии был меньше 0,05 ккал/(моль-Â). Вычисление внутренней энергии молекулы при оптимизации структуры осуществлялось с использованием полуэмпирического поля сил фирмы Tripos, разработчика Sybyl, в которое входили следующие компоненты:

Е - Estr + Ebend + Еоор + Etors + Е vdw + Eele

I

где

Е^г ~ величина энергии деформации связей, Еьепс! - величина энергии угловых деформаций, Е00р ~ величина энергии деформации плоскости, Е^гэ - величина торсионной энергии,

Еиси* ~ величина энергии вандерваальсовых взаимодействий (потенциала Ленарда-Джонса),

Ее1е - величина энергии электростатических взаимодействий. Величины энергий рассчитывались следующим образом:

Энергия деформации связей - Ез1;г = — к?^-^?)2, где.

х=1 2

di - длина 1-й связи(А),

с1°1 - идеальная длина 1-й связи (А) ,

к^ - константа силы напряжения связи (ккал*моль-1 • А"2) .

Энергия угловых деформаций - ЕЬепа = ^ — к^^-б")2, где

2

9х - угол между двумя смежными связями в радианах, 6°1 - идеальная величина :1-го угла в радианах,

кд. - константа силы угловой деформации (ккал*моль -радиан )

1 2

Энергия деформации плоскости - Еоор = — к°орс!1 , где

1=1 2

(11 - расстояние между центром 1-го атома и плоскостью его заместителей(А),

к!°ор - константа силы деформации плоскости (ккал• моль-1-А'2) .

Торсионная энергия - ЕЬог = ^ — У™[И-Э^оэ (|п1|-со1) ], где

1=1 2

- торсионный барьер (ккал-моль_1) , Эх - принимает значение +1 при скрещенной конформации или

-1 при заслоненной конформации,

- периодичность, 0)1 - торсионный угол в радианах.

Энергия вандерваальсовых взаимодействий (потенциал Леннарда-Джонса)

1.0 2.0

Natoms __

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Белкина, Наталья Валерьевна

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ РАБОТЫ

1. Построена компьютерная модель трехмерной структуры цитохрома Р450 1А2 человека, достоверность которой подтверждается возможностью правильно предсказать региоспецифичность окисления известных субстратов этого фермента.

2. На основе прогнозирования пространственной структуры комплексов CYP1A2 с низкомолекулярными органическими соединениями разработаны два независимых уравнения для вычисления констант диссоциации таких комплексов (основанных на применении нейронных сетей и метода 3D-QSAR/CoMSIA). Оба этих подхода дают сходные результаты как для известных лигандов CYP1A2, так и для большого числа других соединений.

3. Использованные методы предсказания строения и свойств комплексов CYP1A2 позволили выявить 52 потенциальных лиганда этого фермента среди низкомолекулярных соединений, структуры которых приведены в ряде известных компьютерных банков данных (ASINEX, CMC, MayBridge).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Белкина, Наталья Валерьевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. Москва, «Наука» -1975.

2. Арчаков А.И. г Иванов А.С. Рациональное компьютерное конструирование новых лекарственных средств: обзор методов. // Вестник РАМН -1996, -вып.1 -стр.60-63.

3. Аффифи А.г Эйзен С. Статистический анализ. Подход с использованием ЭВМ. Москва, «Мир» -1982.

4. Поройков В.В. Компьютерное прогнозирование в разработке новых лекарственных средств. // дисс. докт. биол. наук -1995.

5. Скворцов B.C. Молекулярный докинг при исследовании белок-лигандных комплексов. // дисс. канд. биол. наук -1998.

6. Agundez J.A., Gallardo L.r Martinez С., Gervasini G. Benitez J. Modulaltion of CYP1A2 enzyme activity by indoleamines: inhibition by serotonin and tryptamine. // Pharmacogenetics -1998 -v.8(3) -p.251-258.

7. Agundez J.A.G., Luengo A., Benitez J. Caffeine demethylase activity in human and dark agouti rat liver microsomes. Comparison with Aminopyrine N-Demethylase Activity // Drug Metab. Dispos. -1992 -v.20(3) -p.343-352.

8. Allen F.H., Kennard 0. 3D Search and Research Using the Cambridge Structural Database. // Chemical Design Automation News -1993 -v.8(1) -p.131-137.

9. Altomare C. r Carrupt P.A., Gaillard P. r el Tayar N., Testa В., Carotti A. Quantitative structure-metabolism relationship analyses of MAO-mediated toxication of l-methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine and analogues. // Chem Res Toxicol -1992 -v. 5 (3) -p.366-375.

10. ASINEX, Association of Independent Experts, 6 Schukinskaya ul., Moscow 123182, Russia -1998.

11. Bairoch A., Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence database: its relevance to human molecular medical research. // J. Mol. Med. -1997 -v.75 -p.312-316.

12. Bloomer J.C., Clarke S.E., Chenery R.J. In vitro

identification of the P450 enzymes responsible for the

metabolism of ropinirole. // Drug Metab. Dispos. -1997 -v.25(7)

-p.840-844.

13. Bohm H.J. LUDI: rule-based automatic design of new substituents for enzyme inhibitor leads. // J. Comput. Aided Mol. Design -1992b -v.6 -p.593-606.

14. Bohm H.J. The computer program LUDI: a new method for the de novo design of enzyme inhibitors. // J. Comput. Aided Mol. Design -1992a -v.6 -p.61-78.

15. Boobis A.R., Lynch A.M., Murray S.f De La Torre R., Solans A., Farre M., Segura JGooderham N.J., Davies D.S. CYP1A2-catalyzed conversion of dietary heterocyclic amines to their proximate carcinogens is their major route of metabolism in humans. // Cancer. Res. -1994 -v.54 -p.89-95.

16. Bordo D. ENVIRON - a software package to compare protein three- dimensional structures with homologous sequences using local structural motifs. // CABIOS -1993 -v.9 -p.639-645.

17. Burke M.D., Thompson S., Weaver R.J., Wolf C.R., Mayer R.T. Cytochrome P450 specificities of alkoxyresorufin O-dealkylation in human and rat liver // Biochem. Pharmacol. -1994 -v.48(5) -p.923-936.

18. Buters J.T., Schiller C.D., Chou R.C. A highly sensitive tool for the assay of cytochrome P450 enzyme activity in rat, dog and man. Direct fluorescence monitoring of the deethylation of 7-ethoxy-4-trifluoromethylcoumarin. // Biochemical Pharmacology -1993 -v.46(9) -p.1577-1584.

19. Clark M., Cramer III R.D., Van Opdenbosch N. // Journal of Computational Chemistry -1989 -v.10 -p.982-1012.

20. Coleman T. , Ellis S.W., Martin I.J., Lennard M.S. , Tucker G.T. l-Methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) is N-demethylated by cytochromes P450 2D6, 1A2 and 3A4 — implications for susceptibility to Parkinson's disease. // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1996 -v.277(2) -p.685-690.

21. Colovos C., Yeates T.O. Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic interactions. // Protein. Sci. -1993 -v.2(9) -p.1511-1519.

22. Colovos C. , Yeates T.O. Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic interactions. // Protein. Sci. -1993 -v.2(9) -p.1511-9.

23. Connolly M.L. Analytical Molecular Surface Calculation. // J.

Appl. Cryst. -1983 -v.16 -p.548-558.

24. Cramer III R. D., Patterson D.E., Bunce J.D. Comparative molecular field analysis (CoMFA). 1. Effect of shape on binding of steroids to carrier proteins. // J. Am. Chem. Soc. -1988 -v.110 -p.5959-5967.

25. Cramer III S.A., DePriest D.E., Patterson P., Hecht The Developing Practice of Comparative Molecular Field Analysis // In: 3D QSAR in Drug Design: Theory, Methods and Applications, ESCOM, Leiden, -1993.

26. Cupid B.C. r Holmes E.f Wilson I.D., Lindon J.C., Nicholson J.K. Quantitative structure-metabolism relationships (QSMR) using computational chemistry: pattern recognition analysis and statistical prediction of phase II conjugation reactions of substituted benzoic acids in the rat. // Xenobiotica -1999 -v.29(1) -p.27-42.

27. Davis R.L., Quenzer R.W., Kelly H.W., Powell J.R. Effect of the addition of ciprofloxacin on theophylline pharmacokinetics in subjects inhibited by cimetidine. // Pharmacotherapy -1992 -v. 26 -p.11-13.

28. Degtyarenko K.N., Archakov A.I. Molecular evolution of P450 superfamily and P450-containing monooxygenase systems. // FEBS Lett. -1993 -v.332(1-2) -p.1-8.

29. Distlerath L.M., Reilly P.E., Martin M. V., Davis G.G., Wilkinson G.R., Guengerich F.P. Purification and characterization of the human liver cytochromes P-450 involved in debrisoquine 4-hydroxylation and phenacetin O-deethylation, two prototypes for genetic polymorphism in oxidative drug metabolism. // Biol. Chem. -1985 -v.260 (15) -p.9057-9067.

30. DockSearch -1998 (http://lmgdd.ibmh.msk.su/docksearch).

31. Eaton D.L., Gallagher E.P., Bammler T.K., Kunze K.L. Role of cytochrome P4501A2 in chemical carcinogenesis: implications for human variability in expression and enzyme activity. // Pharmacogenetics -1995 -v.5(5) -p.259-274.

32. Engh R.A., Huber R. Accurate bond and angle parameters for X-ray protein structure refinement. // Acta Cryst. -1991, -v.A47 -p.392-400.

33. Eugster E.P., Sengstag C. Saccharomyces cerevisiae: an

alternative source for human microsomal liver enzymes and its

use in drug interaction studies. // Toxicology -1993, -v.82 -

p.61-73.

34. Fine R.M., Wang H. , Shenkin P.S., Yarmush D.L., Levinthal C. Predicting antibody hypervariable loop conformations. II: Minimization and molecular dynamics studies of MCPC603 from many randomly generated loop conformations. // Proteins -1986 -v.1(4) -p.342-362.

35. Fisher G.J.r Fukushima H., Gaylor J.L. Isolation, purification, and properties of a unique form of cytochrome P-450 in microsomes of isosafrole-treated rats. // J. Biol. Chem. -1981 -v.256(9) -p.4388-4394.

36. Foroozesh M. , Primrose G., Guo Z., Bell L.C., Alworth W.L., Guengerich F.P. Aryl acetylenes as mechanism-based inhibitors of cytochrome P450-dependent monooxygenase enzymes. // Chem. Res. Toxicol. -1997 -v.lO(l) -p.91-102.

37. Fuhr \J.r Doehmer J., Battvla N., Woelfel C., Kudla C., Keita Y., Staib A.H. Biotransformation of caffeine and theophylline in mammalian cell lines genetically engineered for expression of single cytochrome P450 isoforms. // Biochem. Pharmacol. -1992 -v. 43 (2) -p.225-235.

38. Fuhr U. , Klittich K., Staib A.H. Inhibitory effect of grapefruit juice and its bitter principal, naringenin, on CYP1A2 dependent metabolism of caffeine in man. // Br. J. Clin. Pharmacol. -1993 -v.35(4) -p.431-436.

39. Fuhr U., Wolff T., Harder S., Schymanski P., Staib A.H. Quinolone inhibition of cytochrome P-450-dependent caffeine metabolism in human liver microsomes. // Drug Metab. Dispos. -1990 -v.18(6) -p.1005-1010.

40. Furuya H., Shimizu T., Hirano K. r Hatano M. , Fuj ii-Kuriyama Y., Raag R. , Poulos T.L. Site-directed mutageneses of rat liver cytochrome P-450d: catalytic activities toward benzphetamine and 7-ethoxycoumarin. // Biochemistry -1989 -v.28(17) -p.6848-6857.

41. Gallagher E.P., Kunze K.L., Stapleton P.L., Eaton D.L. The kinetics of aflatoxin Bl oxidation by human cDNA-expressed and human liver microsomal cytochromes P450 1A2 and 3A4. // Toxicol. Appl. Pharmacol. -1996 -v.141(2) -p.595-606.

42. Gi Hum J.G., Israel D.S., Polk R.E. Pharmacokinetic drug interactions with antimicrobial agents. // Clin. Pharmacokinetics -1993 -v.325 -p.450-482.

43. Glass S.J., van Liver R.B.L. Metabolism of 7-Ethoxyresorufin

by Phénobarbital of Aroclor 1254 Pretreated Mice // Drug Metab.

Dispos. -1988 -v.16(2) -p.333-337.

44. Goldstein J. A., Linko P., Luster M.I., Sundheimer D.W. Purification and characterization of a second form of hepatic cytochrome P-448 from rats treated with a pure polychlorinated biphenyl isomer. // J. Biol. Chem. -1982 -v.257(5) -p.2702-7.

45. Gooderham N.J., Murray S., Lynch A.M., Yadollahi-Farsani M., Zhao K., Rich K., Boobis A.R., Davies D.S. Assessing human risk to heterocyclic amines. // Mutat. Res. -1997 -v.376(1-2) -p.53-60

46. Goodford P.J. A computational procedure for determining energetically favorable binding sites on biologically important macromolecules. // J. Med. Chem. -1985 -v.28(7) -p.849-857.

47. Gotoh 0. Significant improvement in accuracy of multiple protein sequence alignments by iterative refinement as assessed by reference to structural alignments. // J. Mol. Biol. -1996 -v.264(4) -p.823-838.

48. Guengerich F.P. Comparsion of catalytic selectivity of cytochrome P450 subfamily enzymes from different species. // Chemico-Biological Interactions - 1997 -v.106 -p.161-182.

49. Guengerich F.P., Dannan G.A., Wright S.T., Martin M. V., Kaminsky L.S. Purification and characterization of microsomal cytochrome P-450s // Xenobiotica -1982 -v.12(11) -p.701-716.

50. Hansten P., Horn J. Drug interaction mechanisms and clinical characteristics in Drug Interactions and Updates. // Applied Therapeutics, Vancouver, Washington, -1993 -p.1-29.

51. Hashimoto C., Imai Y. Purification of a substrate complex of cytochrome P-450 from liver microsomes of 3-methylcholanthrene-treated rabbits. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1976

v. 68 (3) -p.821-827.

52. Haugen D.A., van der Hoeven T.A., Coon M.J. Purified liver microsomal cytochrome P-450. Separation and characterization of multiple forms. // J. Biol. Chem. -1975 -v.250(9) -p.3567-3570.

53. Heiden W., Moeckel G., Brickmann J. A new approach to the display of local lipophilicity/hydrophilicity mapped on molecular surfaces // J. Comp.-Aided Mol. Design -1993 -v. 7 -p.503-511.

54. Hilbert M., Bohm G.r Jaenicke R. Structural Relationships of

Homologous Proteins as a Fundamental Principle in Homology

Modeling. // Protein-Struct. Funct. Genet. -1993 -v.17 -p.138-

151.

55. Hiroya K. r Ishigooka M., Shimizu T., Hatano M. Role of Glu318 and Thr319 in the catalytic function of cytochrome P450d (P4501A2): effects of mutations on the methanol hydroxylation. // FASEB Journal -1992 -v.6(2) -p.749-451.

56. Hornik K., Stinchcombe M., White H. Multilayer feedforward networks are universal approximators. // Neural networks. -1989, v.2 (5) -p.359-366.

57. ISIS™/Base: Metabolite, Comprehensive Medical Chemistry, Molecular Design Limited Information Systems, Inc., 14600 Catalina Street, San Leandro, California, 94577, USA.

58. Ivanov A.S., Skvortsov V.S., Archakov A.I. Two applications of molecular docking: database searching for new inhibitors and simulation of intermolecular interactions of cytochromes P450 101, 2B4, 1A2 and b5. // The FASEB Journal -1997 -v.11(9) -A785.

59. Jaiswal A.K. r Nebert D.W., McBride O.W., Gonzalez F.J. Human P(3)450: cDNA and complete protein sequence, repetitive Alu sequences in the 3' nontranslated region, and localization of gene to chromosome 15. // J. Exp. Pathol. -1987 -v.3(1) -p.1-17.

60. Jensen K.G. , Poulsen H.E., Doehmer J., Loft S. Kinetics and Inhibition by Fluvoxamine of Phenacetin O-Deethylation in V7 9 Cells Expressing Human CYP1A2. // Pharmacol. Toxicol. (Copenhagen) -1995 -v.76(4) -p.286-288.

61. Johnson E.F., Muller-Eberhard U. Resolution of two forms of cytochrome P-450 from liver microsomes of rabbit treated with 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. // J. Biol. Chem. -1977 -v.252(9) -p.2839-2845.

62. Johnson M.S., Srinivasan N., Sowdhamini R., Blundell T.L. Knowledge-Based Protein Modeling. // Crit. Rev. Biochem. Molec. Biol. -1994 -v.29 -p.1-68.

63. Klebe G. Comparative Molecular Similarity Indices: CoMSIA. // In: 3D QSAR in Drug Design. Edit by Kubinyi H. et al. Kluwer Academic Publishers, Great Britain -1998 v.3 -p.87-104.

64. Klebe G., Abraham U., Mietzner T. Molecular Similarity Indices in a Comparative Analysis (CoMSIA) of Drug Molecules to Correlate and Predict their Biological Activity // J. Med. Chem. -1994 -v.37 -p.4130-4146.

65. Krainev A.G., Shimizu T., Ishigooka M., Hiroya K., Hatano M.

Chiral recognition at cytochrome P450 1A2 active site: effects of

mutations at the putative distal site on the bindings of asymmetrical

axial ligands. // Biochemistry -1993 -v.32 -p.1951-1957.

66. Krepets V.V., Shakin V.V. Weighing observations and changing metrics at constructing the models of linear regression and the neural networks. // Materials of XXIII International workshop on modelling of developing systems -1999 -p.45-48.

67. Kubinyi H. A general view on similarity and QRAS studies. // In: Computer-Assiated Lead Finding and Optimisation. Edit by van de Waterbeemd H., Testa B., Folkers G., Verlad Helvetica Chimia Acta, Basel -1997 -p.7-28.

68. Kubinyi H. Strategies and recent technologies in drug discovery. // Pharmazie -1995 -v.50(10) -p.647-662.

69. Kuntz I.D. Structure-Based Strategies for Drug Design and Discovery. // Science -1992 -v.257(5073) -p.1078-1082.

70. Kuntz I.D., Blaney J.M., Oatley S.J., Landridge R., Ferrin T.E A geometric approach to macromolecule-ligand interactions. // J. Mol. Biol. -1982 -v.161 -p.269-288.

71. Laskowski R.A., MacArthur M.W. , Moss D.S., Thornton J.M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. // J. Appl. Cryst. - 1993 -v.26 -p.283-291.

72. Lewis D.F., Lake B.G. Molecular modelling of CYP1A subfamily members based on an alignment with CYP102: rationalization of CYPlA substrate specificity in terms of active site amino acid residues.. // Xenobiotica -1996 -v.26 (7) -p.723-753.

73. Loew G.H., Villar H.O., Alkorta I. Strategies for Indirect Computer-Aided Drug Design. // Pharmaceut. Res. -1993 -v.10 -p.475-486.

74. Lozano J.J., Lopez-de-Brinas E., Centeno N.B., Guigo R., Sanz F. Three-dimensional modelling of human cytochrome P450 1A2 and its interaction with caffeine and MelQ. // J. Comput. Aided Mol. Design -1997 -v.11(4) -p.395-408.

75. Machinist J.M. , Mayer M.D., Shet M.S., Ferrero J.L., Rodrigues A.D. Identification of the human liver cytochrome P450 enzymes involved in the metabolism of zileuton (ABT-077) and its N-dehydroxylated metabolite, Abbott-66193. // Drug Metab. Dispos. -1995 -v.23(10) -p.1163-1174.

76. Martin Y.C., Kim K.-H., Liu C.T. Comparative Molecular Field Analysis: CoMFA. // In: Advances in Quant. Str.-Property Relationships, JAI Press -1996 -v.l, -p.1-52.

77. Maybridge catalog database. Ryan Scientific, Columbia, USA.

78. Mayuzumi H. , Sambongi C. , Hiroya K. , Shimizu T., Tateishi T., Hatano M. Effect of mutations of ionic amino acids of cytochrome P450 1A2 on catalytic activities toward 7-ethoxycoumarin and methanol. // Biochemistry -1993 -v.32(21) -p.5622-5628.

79. Meng E.C., Kuntz I.D., Abraham D.J., Kellog G.E. Evaluating docked complexes with the HINT exponential function and empirical atomic hydrophobicities. // J. Comput. Aided Mol. Design -1994 -v.8(3) -p.299-306.

80. Meng E.C., Shoichet B.K., Kuntz I.D. Automated Docking with Grid-Based Energy Evaluation. // J. Comp. Chem. -1992 -v.13(4) -p.505-524.

81. Miller M.D., Kearsley S.K., Underwood D.J., Sheridan R.P. // J. Comput.-Aided Mol. Design -1994 -v.8 -p.153-174.

82. Miners J.O., Coulter S., Tukey R.H., Veronese M.E., Birkett D.J. Cytochromes P450, 1A2, and 2C9 are responsible for the human hepatic O-demethylation of R- and S-naproxen. // Biochemical Pharmacology -1996 -v.51(8) -p.1003-1008.

83. Monostory K., Vereczkey I., Levai F., Szatmari I. Ipriflavone as an inhibitor of human cytochrome P450 enzymes. // Br. J. Pharmacol. -1998 -v.123(4) -p.605-610.

84. Moon J.B.f Howe J.W. Computer design of bioactive molecules: a method for receptor-based de novo ligand design. // Proteins -1991- v.11(4) -p.314-328.

85. Morris A.L., MacArthur M.W., Hutchinson E.G., Thornton J.M. Stereochemical quality of protein structure coordinates. // Proteins - 1992 -v.12 -p.345-364.

86. Nakajima M., Kobayashi K., Shimada N., Tokudome S., Yamamoto T. Kuroiwa Y. Involvement of CYP1A2 in mexiletine metabolism. // Br. J. Clin. Pharmacol. -1998 -v.46(1) -p.55-62.

87. Needleman S.B., Wunsch C.D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. // J. Mol. Biol. -1970 -v.48(3) -p.443-453.

88. Negishi M., Nebert D.W. Structural gene products of the Ah locus. Genetic and immunochemical evidence for two forms of mouse liver cytochrome P-450 induced by 3-methylcholanthrene. // J. Biol. Chem. -1979 -v.254(21) -p.11015-11023.

89. Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegeman J.J.r Feyereisen R., Waxman D.J., Waterman M.R., Gotoh 0., Coon M.J., Estabrook R.W., Gunsalus I.e., Nebert D.W. P450 superfamily:

update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature. // Pharmacogenetics -1996 -v.6(1) -p.1-42.

90. Neural Network Constructor -1999 (http://lmgdd.ibmh.msk.su/nnc).

91. Notarianni L.J., Oliver S.E., Dobrocky P., Bennett P.N., Silverman B.W. Caffeine as a metabolic probe: a comparison of the metabolic ratios used to assess CYP1A2 activity. // Br. J. Clin. Pharmacol. -1995 -v.39(1) -p.65-71.

92. Olesen O.V., Linnet K. Hydroxylation and demethylation of the tricyclic antidepressant nortriptyline by cDNA-expressed human cytochrome P-450 isozymes. // Drug Metab. Dispos. -1997 -v.25(6) -p.740-744.

93. Ono S., Hatanaka T., Hotta H., Tsutsui M., Satoh T. Gonzalez F.J. Chlorzoxazone is metabolized by human CYP1A2 as well as by human CYP2E1. // Pharmacogenetics -1995 -v.5(3) -p.143-150.

94. Ono S., Tsutsui M. r Gonzalez F.J., Satoh T., Masubuchi Y., Horie T., Suzuki T., Narimatsu S. Oxidative metabolism of bunitrolol by complementary DNA-expressed human cytochrome P450 isozymes in a human hepatoma cell line (Hep G2) using recombinant vaccinia virus. // Pharmacogenetics -1995 -v.5(2) -p.97-102.

95. Pang K.S., Kong P., Terrell J.A., Billings R.E. Metabolism of acetaminophen and phenacetin by isolated rat hepatocytes. A system in which the spatial organization inherent in the liver is disrupted. // Drug Metab. Dispos. - 1985 -v.13(1) -p.42-50.

96. Pastrakuljic A., Tang B.K., Roberts E.A., Kalow W. Distinction of CYP1A1 and CYP1A2 activity by selective inhibition using fluvoxamine and isosafrole. // Biochemical Pharmacology -1997 -v. 53 (4) -p.531-538.

97. Patten C.J., Thomas P.E., Guy R.L., Lee M., Gonzalez F.J. , Guengerich F.P., Yang C.S. Cytochrome P450 enzymes involved in acetaminophen activation by rat and human liver microsomes and their kinetics. // Chemical Research in Toxicology -1993 -v.6(4) -p.511-518.

98. Pearlman R.S. CONCORD: from Connectivity to 3D-Coordinates of Organic Compounds. // Chem.Design Auto News -1987 -v.8 -p.3-12.

99. Powell M.J.D. Restart Procedures for the Conjugate Gradient Method. // Mathematical Programming -1977 -v.12 -p.241-254.

100. Ring B.J., Catlow J., Lindsay T.J., Gillespie T., Roskos L.K., Cerimele B.J., Swanson S.P., Hamman M.A., Wrighton S.A.

Identification of the human cytochromes P450 responsible for the in vitro formation of the major oxidative metabolites of the antipsychotic agent olanzapine. // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1996 -v.276(2) -p.658-666.

101. Rodrigues A.D., Surber B.W., Yao Y., Wong S.L., Roberts E.M. [O-ethyl 14C]phenacetin O-deethylase activity in human liver microsomes. // Drug Metab. Dispos. -1997 -v.25(9) -p.1097-1100.

102. Rotstein S.H., Murcko M.A. GenStar - A Method for De-novo Drug Design. // J. Comput. Aided Molec. Design -1993 -v.7 -p.23-43.

103. Rotstein S.H.,. Murcko M.A. GroupBuild - A Fragment-Based Method for De-novo Drug Design. // J. Med. Chem. -1993 -v.36(12) -p.1700-1710.

104. Ryan D.E., Thomas P.E., Levin W. Hepatic microsomal cytochrome P-450 from rats treated with isosafrole. Purification and characterization of four enzymic forms. // J Biol Chem 1980 Aug 25 255:16 7941-55

105. Sanderink G.J., Bournique B., Stevens J., Retry M., Martinet M. Involvement of human CYP1A isoenzymes in the metabolism and drug interactions of riluzole in vitro. // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1997 -v.282(3) -p.1465-1472.

106. Sandhu P., Guo Z.r Baba T., Martin M. V., Tukey R.H., Guengerich F.P. Expression of modified human cytochrome P450 1A2 in Escherichia coli: stabilization, purification, spectral characterization, and catalytic activities of the enzyme. // Arch. Biochem. Biophys. -1994 -v.309(1) -p.168-177.

107. Schoichet B.K., Bodian D.L., Kuntz I.D. // J. Comp. Chem. -1992 -v.13 -p.380-397

108. Schoichet B.K., Kuntz I.D. Matching chemistry and shape in molecular docking. // Prot. Eng. -1993 -v.6(7) -p.723-732.

109. Sheridan R.P., Rusinko A., Nilakantan R., Venkataraghavan R. Searching for pharmacophores in large coordinate data bases and its use in drug design. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA -1989 -v.86 -p.8165-8169.

110. Shimizu T., Murakami Y., Hatano M. Glu318 and Thr319 mutations of cytochrome P450 1A2 remarkably enhance homolytic 0-0 cleavage of alkyl hydroperoxides. An optical absorption spectral study. // J. Biol. Chem. -1994 -v.269(18) -p.13296-13304.

111. Shimizu T., Sadeque A.J., Sadeque G.N., Hatano M., Fujii-Kuriyama Y. Ligand binding studies of engineered cytochrome P-

450d wild type, proximal mutants, and distal mutants. // Biochemistry -1991b -v.30(6) -p.1490-1496.

112. Shimizu T. , Tateishi T., Hatano M., Fujii-Kuriyama Y. Probing the role of lysines and arginines in the catalytic function of cytochrome P450d by site-directed mutagenesis. Interaction with NADPH-cytochrome P450 reductase. // J. Biol. Chem. -1991a -v.266(6) -p.3372-3375.

113. Singh J.r Saldanha J. Thronton A novel method for the modelling of peptide ligands to their receptors. // J.M. Protein Eng. -1991 -v.4(3) -p.251-261.

114. Sklenar H., Eisenhaber F., Poncin M., Lavery R. Theoretical Biochemistry and Molecular Biophysics. // Edit by D.L.Beveridge & R.Lavery, Adenine Press. -1990 -p.317-335.

115. Smith T.J., Guo Z., Gvengerich F.P., Yang C.S. Metabolism of 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) by human cytochrome P450 1A2 and its inhibition by phenethyl isothiocyanate. // Carcinogenesis -1996 -v.17(4) -p.809-813.

116. Srinivasan S., March C.J.r Sudarsanam S. An Automated Method for Modeling Proteins on Known Templates Using Distance Geometry. // Protein Sci. -1993 -v.2 -p.277-289.

117. Sussman J.L. , Lin D., Jiang J., Manning N.O., Prilusky J., Ritter 0., Abola E.E. Protein Data Bank (PDB): Database of Three-Dimensional Structural Information of Biological Macromolecules. // Acta Cryst. - 1998 -v.D54 -p.1078-1084.

118. Sybyl 6.4, Tripos Inc., 1699 South Hanley Road, St Louis, Missouri, 63144, USA.

119. Takahashi N., Miranda C.L., Henderson M.C., Buhler D.R., Williams D.E., Bailey G. Inhibition of in vitro aflatoxin Bl-DNA binding in rainbow trout by CYP1A inhibitors: alpha-naphthoflavone, beta-naphthoflavone and trout CYPlAl peptide antibody. // Comp. Biochem. Physiol. Part C Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. -1995 -v.110(3) -p.273-280.

120. Tassaneeyakul W.r Birkett D.J., McManus M.E., Tassaneeyakul W. , Veronese M.E., Andersson T., Tukey R.H., Miners J.O. Caffeine metabolism by human hepatic cytochromes P450: contributions of 1A2, 2E1 and 3A isoforms. // Biochemical Pharmacology -1994 -v.47(10) -p.1767-1776.

121. Topham C.M., Thomas POverington J.P., Johnson M.S., Eisenmenger F. , Blundell T.L. An assessment of COMPOSER: a rule-

based approach to modelling protein structure. // Biochem. Soc. Symp. -1990 -v.57 -p.1-9.

122. Tschinke V., Cohen N.C. The Newlead Program - A New Method for the Design of Candidate Structures from Pharmacophoric Hypotheses. // J. Med. Chem. -1993 -v.36 -p.3863-3870.

123. Tuck S.F., Hire K., Shimizu T., Hatano M., Ortiz de Montellano P.R. The cytochrome P450 1A2 active site: topology and perturbations caused by glutamic acid-318 and threonine-319 mutations.// Biochemistry -1993 -v.32(10) -p.2548-2553.

124. Verhoeven C.H.J., Vos R.M.E., Bogaardds J.J.P. Characterization and inhibition of human cytochrome P450 enzymes involved in the in vitro metabolism of mirtazapine. // Materials of XI International Symposium on Microsomes and Drug Oxidation, Los Angeles, USA, July 21-24 -1996 -P311.

125. Verlet J. Computer "experiments" on classical fluids: I. Thermodynamical properties of Lennard-Jones molecules. // Phys. Rev. -1967 -v.159 -p.98-103.

126. Viswanadhan V.N., Ghose A.K, Revankar G.R, Robins R.K. Atomic Physicochemical Parameters for Three Dimensional Structure Directed Quantitative Structure-Activity Relationships. 4. Additional Parameters for Hydrophobic and Dispersive Interactions and Their Application for an Automated Superposition of Certain Naturally Occurring Nucleoside Antibiotics. // J.Chem.Inf.Comput.Sci. -1989 -v.29 -p.163-172.

127. von Moltke L.L., Greenblatt D.J., Duan S.X., Schmider J Kudchadker L., Fogelman S.M.r Harmatz J.S., Shader R.I. Phenacetin O-deethylation by human liver microsomes in vitro: inhibition by chemical probes, SSRI antidepressants, nefazodone and venlafaxine. // Psychopharmacology (Berl) -1996 -v.128(4) -p.398-407.

128. Yamazaki H., Inoue K., Mimura M., Oda Y., Guengerich F.P., Shimada T. 7-Ethoxycoumarin O-deethylation catalyzed by cytochromes P4 50 1A2 and 2E1 in human liver microsomes.// Biochemical Pharmacology -1996 -v.51(3) -p.313-319.

129. Yamazoe Y., Shimada M., Maeda K., Kamataki T., Kato R. Specificity of four forms of cytochrome P-450 in the metabolic activation of several aromatic amines and benzo[a]pyrene. // Xenobiotica -1984 -v.14(7) -p.549-552.

130. Yanagita K., Sagami I., Daff S., Shimizu T. Marked enhancement in the reductive dehalogenation of hexachloroethane by a

Thr319Ala mutation of cytochrome P450 1A2. // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998 -v.249(3) -p.678-682.

131. Yanagita K., Sagami I., Shimizu T. Distal site and surface mutations of cytochrome P450 1A2 markedly enhance dehalogenation of chlorinated hydrocarbons. // Arch. Biochem. Biophys. -1997 -v.346(2) -p.269-276.

132. Zhai S. r Dai R., Wei X. , Friedman F.K., Vestal R.E. Comparative inhibition of human cythochromes P450 1A1 and 1A2 by flavonoids. 11 Drug Metab. Dispos. -1998 -v.26(10) -p.989-992.

133. Zhang Z., Fasco M.J., Huang Z.r Guengerich F.P., Kaminsky L.S. Human cytochromes P4501A1 and P4501A2: R-warfarin metabolism as a probe. // Drug Metab. Dispos. -1995 -v.23(12) -p.1339-1346.

134. Zhang Z.Y., Kaminsky L.S. Characterization of human cytochromes P450 involved in theophylline 8-hydroxylation. // Biochemical Pharmacology -1995 -v.50(2) -p.205-211.