Комплементарно адресованное алкилирование нуклеиновых кислот в клетках асцитной карциномы КРЕБС-2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Райт, Антонина Сергеевна

• Райт, Антонина Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Райт, Антонина Сергеевна

Введение.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Комплементарно адресованная модификация, перспективы биологических приложений подхода

1.2. Конструкции и основные свойства реагентов для комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот . ю

1.2Л. Реакционноспособные терминальные производные олиго- и полинуклеотидов

1.2.2. Полимодифицирующие реагенты.

1.3. Комплементарно адресованное алкилирование 2',3'-0- [4-(и-2-хлорэтил-и-метиламино)бен-зилиден]олигонуклеотидами.

1.3.1. Комплементация 2',з'-0-[4-(ш-2-хлорэтил-и-метиламино)бензилиден]олигонуклеотидов

1.3.2. Механизмы алкилирования в комплементарных комплексах

1.4. Влияние олигонуклеотидов на биохимические и биологические процессы в культурах живых клеток.

Глава 2. Результаты и обсуждение результатов

2.1. Обоснование методов анализа и фракционирования биополимеров клеток асцитной карциномы Кребс-2.

- 3

2.2. Сорбция бензилиденовых производных олиго-нуклеотидов клетками асцитной карциномы Кребс

2.3. Алкилирование биополимеров в клетках асцитной карциномы Кребс-2 -производными нонатимидилилуридина.

2.4. Анализ специфичности внутриклеточного ал-килирования нуклеиновых кислот.

2.5. Химическая направленность внутриклеточного алкилирования нуклеиновых кислот

2.6. Сохранность адреса реагентов, ковалентно связанных комплементарными нуклеиновыми кислотами в клетках асцитной карциномы Кребс-2.

2.7. Кинетика и механизм внутриклеточного алкилирования

2.8. Жизнеспособность клеток асцитной карциномы Кребс-2, экспонированных с реагентами

Глава 3. Экспериментальная часть.

3.1. Вспомогательные материалы и методики

3.2. Реагенты и их оксианалоги.

3.3. Культура клеток.

3.4. Выделение ядер.юо

3.5. Исследования сорбции реагентов и их окси-аналогов .Ю

3.6. Исследование алкилирования биополимеров в клетках .Ю

3.7. Выделение суммарной РНК клеток.104'

3.8. Выделение ДНК клеток.

3.9. Выделение poiy(А)-трактов мРНК.Ю

ЗЛО. Микроколоночная гель-хроматография poly (А) мРНК.

3.11. Идентификация алкилированных в клетках оснований нуклеиновых кислот

3.12. Определение цитотоксичности реагентов и их оксианалогов .Ю

Выводы.

Цитированная литература.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АКК - асцитная карцинома Кребс-2. БДГГ - 6-бром-5,5-диметоксигексаногидразид. ДФХФ - хиорангидрид дифенилфосфорной кислоты. ТФП - w,N,N'-три-хлор этил )-N1 -(п.-формш1фенил)-пропиленди-амин-1,3. ochrci - 4-(и-2-хлорэ тил-и-ме тиламино)бензальдегид. сшсн-реагенты - 2', 3' -0- [4- (N-2-хлорэтил-н-метиламино) бен-зилиден]олиго- и полинуклеотиды.

I - (C6H5UH)2pcL[Tp(Et)]4rUCHRCl.

II - d[Tp(Et)]grUCHRCl.

III - d(Tp)grUCHRCl.

IV - [32P]-pd(Tp)9rUCHRCl.

V - d(ТСССAAAC)rACHRC1. ciRCH2NH-peareHTH - 4-(к-2-хлорэтил-н-метиламино)бензйл-5'фосфамиды олигонуклеотидов. Mscoci - хлорангидрид мезитиленкарбоновой кислоты. Ph3P/(PyS)2 - эквимольная смесь трифенилфосфина и 2,2'-дипиридилдисулъфида. 3RCyt - 3-[2-(и-метил-и-4-формилфениламино)этил]цитозин. RAde, RGua, RCyd - аналогичные 3RCyt алкиларилъные производные аденина, гуанина и цитидин--2'(з')-фосфата.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплементарно адресованное алкилирование нуклеиновых кислот в клетках асцитной карциномы КРЕБС-2»

Актуальность проблемы. Поиск и разработка подходов селективного воздействия на структуры и функций нуклеиновых кислот живых клеток и многоклеточных организмов принадлежит к важнейшим задачам молекулярной биологии. В основу подхода, развиваемого в настоящей работе, положен принцип комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот.

Комплементарно адресованная модификация представляет разновидность аффинной модификации биополимеров в приложении к нуклеиновым кислотам и характеризуется использованием реагентов, специфичность которых программируется комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени олиго- и полинуклеотидами, а реакционноспособность - присоединенными функциональными группами обычно алкилирущего типа.

Специфичность и эффективность комплементарно адресованной модификации, неоднократно демонстрировавшиеся в бесклеточных системах, служат необходимым основанием для исследований возможностей этого способа воздействия на нуклеиновые кислоты в живых клетках.

Цель работы. Основная цель состояла в получении доказательств комплементарно адресованного характера внутриклеточной модификации нуклеиновых кислот алкилирувдими терминальными производными олигонуклеотидов, внесенными в культураль-ную среду.

Научная новизна. Впервые осуществлена внутриклеточная комплементарно адресованная модификация нуклеиновых кислот.

Обнаружены зависимости процессов сорбции реагентов клетками и внутриклеточного алкилирования от суммарного заряда и размера олигонуклеотидных фрагментов реагентов. Показано, что специфичность в отношении нуклеиновых кислот выше у неионных реагентов. Отмечено, что внутриклеточное алкилирование протекает со скоростями, существенно превосходящими допустимую механизмом s^i в бесклеточных системах.

Практическая ценность. Результаты исследований утвервдают перспективность применения комплементарно адресованных реагентов в целях направленного воздействия на нуклеиновые кислоты в живых клетках и создают основания для расширения фронта и интенсификации работ в этом направлении. Ближайшим выходом таких работ может стать выяснение функциональной значимости отдельных участков нуклеиновых кислот посредством их блокирования в клетках комплементарно адресованными реагентами.

Объем работы. Диссертация состоит из введения,3-х глав, выводов и списка цитированной литературы. В главе I представлены сведения о конструкциях и свойствах реагентов, применяемых и предназначенных для комплементарно адресованной модификации; освещена специфика комплементарно адресованного алкилирования в простых системах in vitro с применением однотипных использованным в работе реагентов; обсуждены исследования биохимических и биологических эффектов олигонуклео-тидов и их аналогов на живые клетки в культуре. Глава 2 представляет собственные исследования и их обсуящение. Экспериментальная часть описана в главе 3. Вся работа изложена на 136 страницах машинописного текста, включая 19 таблиц и 7 рисунков. Список литературы содержит 157 названий.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Райт, Антонина Сергеевна

Основные результаты выполненного in vitro исследования взаимодействия клеток асцитной карциномы Кребс-2 и алкилиру-нлцих реагентов - 2*,з'-о-[4-(и-2-хлорэтил-и-метиламино)бен-зилиден] овых производных нонатимидилилуридина,d(Тр)grUCHRCi, этилированного нонатимидилилуридина,d[тр(Et)] grUCHRCi, и (c6H5NH)2pd[Tp(Et)]4rU0HRCi состоят в следующем.

1. Установлено, что реагенты, как с этилированными, так и неэтилированными олигонуклеотидными фрагментами, сорбируются клетками асцитной карциномы. Кинетика сорбции зависит от температуры, суммарного заряда и размера реагентов. Количества сорбируемых реагентов прямфропорциональны концентрации (по крайней мере, до 10 мкМ) реагентов в среде. В клетках реагенты концентрируются; кратность концентрирования выше для этилированных реагентов и снижается с увеличением олиго-нуклеотидного фрагмента.

2. Получены прямые доказательства проникания реагентов из среды в клетки и их ядра: до 58$ сорбированных реагентов расходуется в клетках на алкилирование тестированных полимеров - нуклеиновые кислоты и белки. Преимущественному алкили-рованию подвержены нуклеиновые кислоты. Реагент d[Tp(Et)J rUCHRCi более специфичен к нуклеиновым кислотам, чем d(Tp)grUCHRCl.

3. По совокупности проанализированных параметров - химической направленности модификации, степени модификации, ее зависимости от температуры и структуры олигонуклеотидного фрагмента реагентов - сделано заключение о комплементарно адресованном характере внутриклеточного алкилирования нуклеиновых кислот.

4. Обнаружено, что внутриклеточное алкилирование нуклеиновых кислот и белков протекает со скоростями, существенно превосходящими допустимую механизмом sHi в бесклеточных системах.

5. Показано, что основным объектом комплементарно адресованного внутриклеточного алкилирования реагентами на основе олиготимидилилуридина являются ро1у(а)-тракты ро1у(а)+-мРНК: при относительном содержании менее 1% на долю трактов приходится более трети ковалентно связанного всей фракцией нуклеиновых кислот реагента. Степень модификации poly(а)-трактов и набор алкилированных в них остатков аденина соответствует наблюденным в модельных бесклеточных системах in vitro.

6. Показано, что комплементарно адресованное алкилирование в клетках асцитной карциномы Кребс-2 осуществлено без заметного нарушения целостности клеточных мембран, жизнеспособности клеток.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Райт, Антонина Сергеевна, 1984 год

1. Belikova А. М., Zarytova V.F., Grineva N.1. Synthesis of ribonucleosides and diribonucleoside phosphates containing 2-chloroethylamine and nitrogen mustard residues. -Tetrahedron Lett., 1967, No. 37, p. 3557-3562.

2. Гринева Н.И., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Алкилирувдие производные компонент нуклеиновых кислот. II. Синтез ури-дилил-(з' — б')-2',з'-о-4-(и-2-хлорэтил-и- метиламино)-бензилиден.уридина. Изв. СО АН СССР, сер. хим. наук, 1968, № 12, вып. 5, с. II8-I24.

3. Гринева Н.И. Алкилирувдие производные компонентов нукле-новых кислот. Комплементарно адресованная модификация нуклеиновых кислот.: Автореф. дис. на соискание ученой степени докт. хим. наук. Москва, 1975, 52 с.

4. Гринева Н.И. Химическое алкилирование в специфичных комплексах как метод исследования структуры и функций нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов. Биохимия, 1977, т. 42, вып. 2, с. 370-374.

5. Гринева Н.И. Комплементарно адресованная фрагментация ДНК и аспекты ее применения в генетической инженерии. -Вестн. АМН СССР, 1981, В 2, с. 83-94.

6. Гринева Н.И. Комплементарно адресованное алкилирование и фрагментация нуклеиновых кислот. В кн.: Афинная модификация биополимеров./Под ред. Д.Г. Кнорре. Новосибирск: Наука, 1983, с. 187-212.

7. Салганик Р.И., Дианов Г.Л., Курбатов В.А., Шишкин В.А.,

8. Галль А.А. Направленное воздействие на геном бактериофага Т7 с помощью транс1фипта области ранних генов, несущего множественные алкилирующие группы. Докл. АН СССР, 1978, т. 239, № I, с. 217-219.

9. Афинная модификация биополимеров/Под ред. Д. Г. Кнорре -Новосибиоск: Наука, 1983, с. 214-215.

10. Кнорре Д.Г., Власов В.В. Олигонуклеотиды и их производные как биологически активные вещества. Вестн. АН СССР, 1984, J& 12, с. 74-81.

11. Automated chemical and enzyme gene synthesis/Lang A., Ronnfeldt E., Kunst A. eds. Darmstadt: Depart. Biochem. Techn. HighBeool, 1982.

12. Hillen W., Klein R.D., Wells R.D. Preparations of milligram amounts of 21 deoxyribonucleic acid restriction fragments. Biochemistry, 1981, v. 20, No. 13, p. 37483756.

13. Власов В.В., Казаков С.А. Конструирование афинных реагентов. В кн.: Афинная модификация полимеров./Под ред. Д.Г. Кнорре - Новосибирск: Наука, 1983, с. 7-56.

14. Summerton J. Intracellular inactivation of specific nucleotide sequences: a general approach to the treatmentof viral diseases and virally-mediated cancers. J. the-or. Biol., 1979, v. 78, No. 1, p. 77-99.

15. Гринева Н.И., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Алкилирущиепроизводные компонент нуклеиновых кислот.vii. Метиловый эфир 2', 3' -О— 4-(ы-2-хлорэтил-и-метиламино) бензшщден. -уридин-5'-фосфата. Ж. общ. химии, 1970, т. 40, вып. I, с. 215-222.

16. Гринева Н.И., Карпова Г.Г. 2* ,3*-0- р-(хлорэтилметила-мино)бензилиден. тРНК адресующий реагент с алкилирую-щей группировкой на акцепторном стебле тРНК. - Изв. АН ССОР, сер. хим. наук, 1972, № 5, с. I2I9-I220.

17. Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Кузнецова Л.М», Чимитова

18. Райт В.К., Карпова Г.Г., Гринева Н.И. Конформация 2',з'--о-4-(и-2-хлорэтил-и-метиламино)бензилиден.олигоцити-дилатов и свойства.их комплексов с полиинозиновой кислотой. Биоорган, химия, 1977, т. 3, J6 I, с. 31-38.

19. Готтих М.Б., Ивановская М.Г., Вейко В.П., Шабарова З.А. Синтез аффинных реагентов на основе гепта- и октадезок-сирибонуклеотидов, комплементарных участку РНК бактериофага MS2. Биоорган, химия, 1981, т. 7, Jfc 9, с. 13101317.

20. Цилевич Т.Л., Краевский А.А., Готтих Б.П. Методы химического синтеза аминокислотных и пептидных эфиров нук-леозидов, нуклеотидов и олигонуклеотидов. Успехи химии, 1972, т. 41, вып. 10, с. 1766-1787.

21. Гринева Н.И., Ломакина Т.С. Алкилирующие производныекомпонентов нуклеиновых кислот, xiv. Синтез б'-фосфами-дов олигонуклеотидов, производных 4-(ш-2-хлорэтил-1Т-ме-тиламино)бензиламина. Ж. общ. химии, 1972, т. 42, вып. 7, с. 1630-1634.

22. Гринева Н.И., Ломакина Т.О. Алкилирующие производные компонентов нуклеиновых кислот, xvi. 5'-3-и-2-хлорэтил-и-метиламино)пропил. фосфамиды нуклеозидов и олигонуклеотидов. Ж. общ. химии, 1973, т. 43, вып. II, с. 25512555.

23. Гимаутдинова О.И., Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Ломакина Т.С., Шелпакова Е.Л. Получение 4-(яг-2-хлорэтил-и-метил-амино)бензил-5,-фосфамдцов рибоолигоаденилатов и их взаимодействие с рРНК и ДНК E.coii . Биоорган, химия, 1978, т. 4, Ш 7, с. 917-926.

24. Ивановская М.Г., Поздняков П.И., Зельцер И.Э., Соколова Н.И., Шбарова З.А., Прокофьев М.А. Реагенты для модификации белков и нуклеиновых кислот. Синтез глиоксаль- и бромацилсодержащих амидов динуклеотида. Докл. АН СССР, 1977, т. 236, В 4, с. 1022-1024.

25. Мишенина Г.Ф., Самуков В.В., Щубина Т.Н. Селективная модификация монозамещенных фосфатных групп в 5*-моно- и полифосфатах нуклеозидов и олигонуклеотидов. Биоорган, химия, 1979, т. 5, № 6, с. 886-893.

26. Бадашкеева А.Д., Зарытова В.Ф., Урманов И.Х., Щубина Т.Н.

27. Получение производных динуклеотидов по концевому б'-фосфату при помощи арилсульфонилхлоридов. Изв. СО АН СССР, сер. хим. наук, 1976, № 2, вып. I, с. 124-129.

28. Зарытова В.Ф., Райт В.К., Черникова Т.С. Действие активирующих реагентов на межнуклеотидные связи в полирибонук-леотиде. Биоорган, химия, 1977, т. 3, № 12, с. 16261632.

29. Друца В.Л., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г., Лебедев В.А., Соколова Н.И., Шабарова З.А. Реакции межнуклеотидного фосфата с хлорангидридом мезитиленкарбоновой кислоты. -Докл. АН СССР, 1977, т. 233, & 4, с. 595-597.

30. Будкер В.Г., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г., Кобец Н.Д., Ря-занкина О.И. Синтез б'-трифосфатов олигонуклеотидов. -Биоорган, химия, 1977, т. 3, № 5, с. 618-625.

31. Michelson A.M. Synthesis of nucleotide anhydrides by anion exchange. Biochim. et biophys. acta, 1964, v. 91, No. 1, p. 1-13.

32. Drutsa V.L., Zarytova V.P., Knorre D.G., Lebedev A.V., Sokolova N.I., Shabarova Z.A. Investigation of activation of phosphates groups in mono- and olygonucleotides with mesitoyl chloride. Nucleic Acids Res., v. 5, No. 1,p. 185-193, 1978.

33. Oshevski S.I. Enzymatic transfer of ATP S thiophosphateonto the 5 -hydroxyl of an olygonucleotide as a route to reactive olygonucleotide derivatives. FEBS Lett., 1982, v. 143, No. 1, p. 119-123.

34. Ошевский С.И., Галль А.А., Шишкин Г.В. Получение аффинного рагента с управляемой алкилирующей функцией алкилиро-ванием б'-тиофосфата олигонуклеотида. Биоорган, химия,1983, т. 9, Ш 9, с. 1265-1269.

35. Ошевский С.И., Грачев М.А., Мустаев А.А. Способ получения аффинных реагентов с управляемой алкилирующей функцией -производных олигонуклеотидов по 5*-фосфатному остатку. -Биоорган, химия, 1983, т. 9, & 7, с. 958-965.

36. Кнорре Д.Г., Чимитова Т.А. Изотермы химической модификации биополимеров для аффинных реагентов, образующих активные промежуточные частицы. Молек. биология, 1978, т. 12, вып. 4, с. 814-821.

37. Энгельгард X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. М.: Мир, 1980, 245 с.

38. Brookes Р., Laweley P.D. The reaction of mono- and difun-ctional alkylating agents with nucleic acids. Biochem. J., 1961, v. 80, No. 3, p. 496-503.

39. Дианов Г.Л., Овчинникова Л.П., Воронина Е.Н., Кокоза Е.Б., Салганик Р.И. Получение направленных мутаций у фага Т7 с помощью полиалкилирующих РНК, комплементарныхизбранным генам. Докл. АН СССР, 1979, т. 248, № 2, с. 465-468.

40. Дианов Г.Л., Мазин А.В., Зайцев Б.Н., Вавилин В.й., Сал-ганик Р.И. Направленная модификация ранней области ДНК бактериофага Т7 путем алкилирования в R-петле, образованной модифицированным транскриптом. Молек. биология, 1980, т. 14, вып. 2, с. 261-264.

41. Thomas М., mite R.L., Davis R.W. Hybridization of RNA to double-stranded DNA: formation of R-loops. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976, v. 73, No. 7, p. 2294-2298.

42. Воронина E.H., Кокоза Е.Б., Дианов ГЛ., Салганик Р.И. Получение направленных мутаций у фага Т7 путем трансфек-ции Escherichia coli с помощью локально алкилированной Т7 ДНК. Генетика, 1980, т. 16, № 9, с. 1527-1534.

43. Гринева Н.И., Мызина С.Д. Кинетические характеристики алкилирования ДНК хлорэтиламинами и элиминации алкилиро-ванных оснований из ДНК. Молек. биология, 1975, т. 9, вып. 4, с. 502-508.

44. Мазин А.В., Дианов Г.Л., Салганик Р.И. Использование ал- 122 килирующих производных ДНК для направленного воздействия на геном. Молек. биология, 1981, т. 15, вып. I, с.252-256.

45. Summerton J. Sequence-specific crosslinking agents for nucleic acids: design and functional group testing. -J. theor. Biol., 1979, v. 78, Ho. 1, p. 61-75.

46. Власов В.В., Казаков С.А. Комплементарно адресованная модификация poiy(i) Щ1С-гидрокеодиамминоroiaтиновыми производными олигоцитидилатов. Биоорган, химия, 1982, т. 8, гё 4, с. 499-506.

47. Власов В.В., Казаков С.А. Взаимодействие бифункциональных двухядерных соединений платины с imp и poiy(i). -Биоорган, химия, 1983, т. 9, Л 4, с. 530-538.

48. Srivastova R.C., Frochlich J., Eichorn G.L. The effect of platinum binding on the structure of DNA and its function in RNA synthesis. Biochlmie, 1978, v. 60, No. 9, p. 879-891.

49. Hoeshele J.D., Johnson N.P., Rahn R.O., Brown D.H. Com1 Q^mparative distribution of JPt-labeled dichlorodiamino-platinum* (XI), DDP, in the rat with emphasis on localisation in DNA. Biochimie, 1978, v. 60, No. 9, p. 10541055.

50. Filipski J., Kohn K.w., Prather R., Bonner w.m. Thiourea reverses crosslinks and restores biological activity in- 123

51. DNA treated with dichlorodiammine platinum (II). Science, 1979, v. 204, No. 4389, p. 181-183.

52. Roberts J.J., Pascoe J.M. Cross-linking of complementary strands of DNA in mammalian cell by antitumor platinum compounds. Nature, 1972, v. 235, No. 5336, p. 283284.

53. Pascoe J.M., Roberts J.J. Interaction between mammalian cell DNA and inorganic platinum compounds I. DNA inter-strand cross-linking and cytotoxic properties of platinum (II) compounds.-J. Biochem. Pharmacol., 1974, v. 23, No. 11, p. 1345-1357.

54. Власов B.B., Казаков С.А., Мисовец В.Г. Синтез двуядер-ных соединений Pt(li) с n,n' ,н-тетракис(2-^аминоэтил)--1,6-гексаметилендиамином. Докл. АН СССР, т. 266, J6 4, с. 866-870, 1982.

55. Sarkar А.К. Schulman L.H. Attachment of cross-linking reagents to tRNA for protein affinity labeling studies. In: Methods in Enzymology, 1979, v. 59, p. 156-165.

56. Ивановская М.Г., Шабарова З.А., Прокофьев М.А. Новый метод введения химически активных групп в олигодезоксири-бонуклеотиды о помощью бисульфит-катализируемого переа-минирования цитозина. Докл. АН СССР, 1979, т. 249, $ I, с. I09-II3.

57. Reiser A., Willets P.W., Perry G.C., Williams V. , Marlley R. Photolysis of aromatic azides. Trans. Paraday Soc., 1968, v. 64, No. 12, p. 3265-3275.

58. Reiser A., Wagner H.M. Photochemistry of the azido group./Patai S., Ed., London: Interscience publishers, 1971, p. 441-501.

59. Bayley H., Knowles J.К. Photoaffinity labelling. In: Methods Enzymol., 1977, v. 46, p. 69-114.

60. Pellegrini M., Oen H., Cantor C.R. Covalent attachment of a peptidyl-transfer RNA analog to the 50S subunit of Escherichia coli ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1972, v. 69, No. 4, p. 837-841.

61. Breitmeyer J.B., Noller H.T. Affinity labeling of specific regions of 23S RNA by reaction of N-bromoacetyl-phenylalanyl-transfer RNA with Escherichia coli ribosomes. J.Mol. Biol., 1976, v. 101, No. 3, p. 297-306.

62. Мецлер Д. Биохимия. M.: Мир, 1980, т. I, с. 136-142.

63. Beattie K.L., Wiegand R.C., Radding C.M. Uptake of gomo-logous single-stranded fragments by superhelical DNA. II. Characterisation of the reaction. J. Mol. Biol., 1977, v. 116, No. 4, p. 783-803.

64. Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Мызина С.Д., Чемасова А.Н. Комплементарно адресованное алкилирование ДНК производными гексааденилата. Биоорган, химия, 1975, т.1, J£ 12, с. I707-I7I4.

65. Гринева Н.И., Зарытова В.Ф., Кабашева Г.Н.,Кнорре Д.Г., Козоровицкий А.Я. О конформации 2*,3*-0-бензилиденовыхпроизводных олигонуклеотидов. Докл. АН СССР, 1971, т.198, ik 3, с. 582-584.- 125

66. Гринева Н.И., Карпова Г.Г., Шамовский Г.Г. Комплементация пентааденилиладенозина и алкилирукяцих производных олигоаденилиладенозинов с рибосомальной РНК. Молек. биология, 1974, т. 8, вып. 3, с. 358-371.

67. Зарытова В.Ф. t Карпова Г.Г., Пичко Н.П.Шешегова Е.А. Получение алкилирущих производных этиловых эфиров олигонуклеотидов и их взаимодействие с poiy(A). Биоорган, химия, 1981, т. 7, № 4, с. 534-541.

68. Бенимецкая Л.З., Герасимова Л.М., Карпова Г.Г., Гринева Н.И. Влияние на 5*-комплементарно адресованную модификацию параметров комплексообразования алкилирующих производных олигоаденилатов с ДНК. Биоорган, химия, 1980, т. 6, гё 12, с. I79I-I80I.

69. Grineva N.I., Karpova G.G. Complementarily addressed modification of rRNA with p-(chloroethylmethylamino)-benzylidene hexanucleotides. FEBS Lett., 1973» v. 32, No. 2, p. 352-355.

70. Гринева Н.И., Карпова Г.Г. Комплементарно адресованное алкилирование рибосомальной РНК алкилирувдими производными олигонуклеотидов. Молек. биология, 1974, т. 8, вып. 6, с. 832-844.

71. Бенимецкая Л.З., Герасимова Л.М., Гринева Н.И., Карпова Г.Г. Комплементарно адресованное алкилирование и фрагментация ДНК фага Т7 вблизи олиготимидиловых последовательностей. Молек. биология, 1978, т. 12, вып. 5, с. 988-1000.

72. Власов В.В., Гринева Н.И., Зарытова В.Ф., Кнорре Д.Г. Эффективность ацеталей 4-(ы-2-хлорэтил-и-метиламино)-бензальдегида, производных олигонуклеотидов, при алки-лировании транспортной РНК. Молек. биология, 1970, т. 4, вып. 2, с. 201-204.

73. Карпова Г.Г., Пичко Н.П., Чимитова Т.А., Гринева Н.И. Комплементарно адресованное алкилирование рибосомных РНК Escherichia coli в комплексах особой конформации. -Молек. биология, 1979, т. 13, вып. 2, с. I0I2-I020.

74. Власов В.В., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Пичко Н.П., Райт А.С. Быстрая модификация биополимеров алкилирувди-ми производными олиготимидилатов в клетках асцитной карциномы Кребса. Докл. АН СССР, т.274, $ 4, с. 965-968, 1984.

75. Горн В.В., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Кутявин Й.В., Пичко Н.П. Аномальная скорость комплементарно-адресованного алкилирования в прочных комплементарных комплексах. Докл. АН СССР, 1983, т. 270, J& 3, с. 613-615.

76. Miller P.S., Braiterman l.t., t'so P.O.P. Effects of trinucleotide ethyl phosphotriester, Gmp(Et)Gmp(Et)U on mammalian cells in culture. Biochemistry, 1977, v. 16, No. 9, P- 1988-1996.

77. Miller P.s., McParland k.b., Jayaraman k., t'so P.O.P. Biochemical and biological effects of nonionic nucleic acid methylphosphonates. Biochemistry, 1981, v. 20, No. 7,-p. 1874-1880.

78. Jayaraman k., McParland k., Miller P., t'so P.o.p. Selective inhibition of Escherichia coli protein synthesis and growth by nonionic oligonucleotides complementary to the 3'end of 16S rRNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, v. 78, No. 3, p. 1537-1541.

79. Zamecnic P.O., Stephenson M.L. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, No. 1, p. 280-284.

80. Stephenson M.L., Zamecnik P.O. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxynucleotide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, No. 1, p. 285-288.

81. Miller P.S., Pang K.N., Kondo N.S., t'so P.O.P. Synthesis and properties of adenine and thymine nucleoside al-kyl phosphotriesters, the neutral analogs of dinucleosi-de monophosphates. J. Amer. Chem. Soc., 1971, v. 93, No. 24, p. 6657-6665.

82. DeBoer g., Miller p.s., t'so p.o.p. Hydrogen-bonded complexes of adenine and thymine nucleoside alkyl phosphotriesters in deuterochloroform. Biochemistry, 1973, v. 12, No. 4, p. 720-726.

83. Kan L.S., Barrett J.C., Miller P.S., t'so P.O.P. Proton magnetic resonance studies of the conformational changes of dideoxynucleoside ethyl phosphotriesters. Bio-polymers, 1973, v. 12, No. 10, p. 2225-2240.

84. Miller P.S., Barrett j.c., t'so P.o.P. Synthesis of oli-godeoxyribonucleotide ethyl phosphotriesters and their specific complex formation with transfer ribonucleic acid. Biochemistry, 1974, v. 13, No. 24, p. 4887-4896.

85. Miller P.S., Yano J., Yano E., Carroll C., Jayaraman K., ,»

86. T so P.O.P. Nonionic nucleic acid analogues. Synthesis and characterisation of dideoxyribonucleoside methyl-phosphonates. Biochemistry, 1979, v. 18, No. 23, p. 5134-5143.- 129

87. Barrett J.С., Miller P.S., T'so P.O.P. Inhibitory effect of complex formation with oligodeoxyribonucleotide ethyl phosphotriesters on transfer ribonucleic acid aminoacylation. Biochemistry, 1974, v. 13, No. 24,p. 4897-4906.

88. Shine J., Dalgarno L. Determinant of cistron specificity in bacterial ribosomes. Nature (London), 1975, v. 254, No. 5495, p. 34-38.

89. Schwartz D.E. , Zamecnik P.C., Y/eith H.L. Rous sarcoma virus genome is terminally redundant: the 3'sequence. -Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, No. 3, p. 994998.

90. Пэгано Д. Титрование инфекционной ДНК. В кн.: Методы вирусологии и молекулярной биологии. М.: Мир, 1972, с. 146-158.

91. Hovanessian A.G., Wood J., Meurs E., Montagnier L. Increased nuclease activity in cell treated with pppA2'--p5,A2*p5,A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979, v. 76, No. 7, p. 3261-3265.

92. Липосомы в биологических системах./Под ред. Г. Грего-риадиса, А. Аллисона. М.: Медицина, 1983, с. 136138.

93. Castellot J.J., Miller J.M.R., Pardee A.B. Animal cells reversibly permeable to small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, v. 75, No. 1, p. 351-355.

94. Стефанович Л.Е., Линде С.A., Карпова Г.Г., Гринева Н.И., Магарилл С.А. Использование липосом для введения алки-лируадих производных олигонуклеотидов в клетки млекопитающих. Биохимия, 1979, т. 44, вып. 7, с. 1289

95. Зарытова В.Ф., Иванова Е.М., Карпова Г.Г., Кнорре Д.Г., Пичко Н.П., Райт А.С., Стефанович I.E. Комплементарно адресованное алкилирование ро1у(А)-фрагментов мРНК в клетках асцитной карциномы Кребса. Биоорган, химия, 1981, т. 7, № 10, с. I5I2-I522.

96. Власов В.В., Гринева Н.И., Кнорре Д.Г. Алкилирувдие производные компонент нуклеиновых кислот. VI. Ионизация 4-(к-2-хлорэтил-я-метиламино)-бензальдегида и его ацеталей. Изв. СО АН СССР, сер. хим. наук, 1969, В 2, вып. I, с. 104-109.

97. Трудолюбова М.Г. Количественное определение РНК и ДНК в субклеточных фракциях клеток животных. В кн.: Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977, с. 313316.

98. Бенимецкая Л.З., Карпова Г.Г., Гринева Н.И. Алкилиро-ванные основания, образующиеся при 5*-комплементарно-адресованной модификации ДНК и кинетика их элиминирования в условиях алкилирования. Биоорган, химия, 1978, т. 4, гё 10, с. I372-I38I.

99. НО. Абакумова О.Ю. Метод фракционирования меченых клеточных макромолекул с помощью миллипоровых фильтров. В кн.: Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977, с.338.343.

100. Panasci L.C., Green D.C., Lee P., Schein P.S. A phenol technique for extraction of alkylated DNA, RNA and protein from a single tissue sample. Analyt. Biochem., 1977, v. 83, No. 2, p. 678-688.

101. Caldwell I.e., Henderson J.F. Isolation of nucleotides, nucleic acids, and protein from single tissue samples by a phenol technique. Analyt. Biochem., 1970, v. 34, No. 2, p. 303-311.

102. Lee S.Y., Mendecki J., Brawerman G. A polynucleotide segment rich in adenylic acid in the rapidly labeled polyribosomal RNA component of mouse sarcoma 180 ascites cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1971, v. 68, No. 6, p. 1331-1335.

103. Георгиев Г.П. Методы определения, выделения и фракционирования нуклеиновых кислот. В кн.: Химия и биохимия нуклеиновых кислот. Л.: Медицина, 1968, с. 96-98, II2-II4.

104. Georgiev G.P., Ryskov А.P., Coutelle С., Mantieva V.L., Avakyan E.R. On the structure of transcriptional unit in mammalian cells. Biochim. et biophys. acta, 1972,v. 259, No. 2, p. 259-283.

105. Любимова E.B., Подобед O.B. Метод выделения и очистки содержащей поли(А) мРНК из клеток млекопитающих. В кн.: Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977, с. 316-321.

106. Илвдуганова Н.А., Блинова Н.Н., Мертвецов Н.П. Выделение матричной РНК из полирибосом печени крыс путем аффинной хроматографии на поли(У)-сефарозе 4В. Изв. СО АН СССР, сер. хим. наук, 1977, 15, вып. 3, с. 72-80.

107. Materials, equipment and systems for chromatography, electrophoresis, immunochemistry and membrane filtration. Price list C. Bio-Rad Laboratories, 1977, p. 47-51.

108. Edmonds M., Caramela M.G. The isolation and characterization of adenosine monophosphate-rich polynucleotides synthesized by Ehrlich ascites cells. J. Biol. Chem., 1969, v. 244, No. 5, p. 1314-1324.

109. Drews J. , Brawerman G. Alterations in the nature of ribonucleic acid synthesized in rat liver during regeneration and after Cortisol administration. J. Biol. Chem., 1967, v. 242, No. 5, p. 801-808.

110. Адаме P. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир, 1983, с. 56-57.

111. Juliano R., Mayhew Е. Interaction of polynucleotides- 133 with cultured mammalian cells. Exptl. cell res., 1972, v. 73, No. 1, p. 3-12.

112. Hovanessian A.G., Wood J.N. Anticellular and antiviral effects of ppp(2'p5'A)n. Virology, 1980, v. 101, No. 1, p. 81-90.

113. Baglioni C., Alessandro S., Nilsen T.W., Hartog A.J., Crea R., Boom J.H. Analogs of (2'-5') oligo(A). Endo-nuclease activation and inhibition of protein synthesis in intact cells. J. Biol. Chem., 1981, v. 256, No. 7, p. 3253-3257.

114. Graham T.L., Van der Eb A.J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 1973, v. 52, No. 2, p. 456-467.

115. Бенимецкая Л.З., Карпова Г.Г., Гринева Н.И. Алкилиро-ванные основания, образующиеся при 5'-комплементарно адресованной модификации ДНК и кинетика их элиминирования в условиях алкилирования. Биоорган, химия, 1978, т. 4, В 10, с. I372-I38I.

116. Kinniburgh A.J., Martin Т.Е. Oligo(A) and oligo(A)-ad-jacent sequences present in nuclear ribonucleoprotein complexes and mRNA. Biochem. Biophys. Res. Communs., 1976, v. 73, No. 3, p. 718-726.

117. Шапот B.C. Биохимические аспекты опухолевого роста. -М.: Медицина, 1975, с. 257-264.

118. Шапот B.C. Ингибиторы нуклеаз как средство для изучения их биологической роли. В кн.: vin Международный противораковый конгресс. Труды, т. 2. Вопросы биохимии рака и канцерогенеза. М. - I., 1963, с. 240-244.

119. Buneva V.N., Dobrikova E.Yu., Knorre D.G., Pacha I.O.,- 134

120. Chimitova Т.A. Affinity labeling of yeast hexokinase with benzylamide derivatives of adenosine mono- and triphosphates bearing an alkylating group. PEBS lett., 1981, v. 135, No. 1, p. 159-163.

121. Бунева B.H., Кудряшова H.B., Небрат I. Т., Ромащенко

122. А.Г., Чимитова Т. A., Юшкова Л.Ф. Дискриминация ДНК-по-лимераз Escherichia coli алкилирущим Ъ-амидом dTTP. Докл. АН СССР, 1982, т. 268, № I, с. 243-246.

123. Пол Д. Культура клеток и тканей. М.: Медгиз, 1963, с. 265-268.136. Ссылка 135 , с. 312-314.

124. Кумарев В.П., Райт А.С., Райт В.К., Салганик Р.И. Иммобилизация белков и ферментов на альдегидосилохроме. -Биоорган, химия, 1976, т. 2, JS 5, с. 700-705.

125. Райт А.С., Райт В.К., Салганик Р.И. Свойства иммобилизованной на альдегидосилохроме полинуклеотидфосфорила-зы. Биоорган, химия, 1976, т. 2, №5, с. 706-712.

126. Шабалин Ю.А., Циоменко А.Б., Вагабов В.М., Кулаев И.С.ор

127. Препаративный микробиологический метод синтеза Р-нуклеозидтрифосфатов из 5'-мононуклеотидов. Прикл. биохимия и микробиол., 1976, т. 12, вып. 3, с. 378-382.

128. Магарилл С.А., Василенко С.К., Райт В.К. Особенности гидролиза синтетических полирибонуклеотидов эндорибо-нуклеазой из яда кобры Naja oxiana. Биохимия, 1981, т. 46, вып. 3, с. 408-413.

129. Y/eissbach А., Poonian М. Nucleic acids attached to solid matrices. In: Methods in Enzymol., 1974, v. 34, part B, p. 468.

130. Pharmacia Pine Chemicals. Affinity chromatography.

131. Principles and methods. Orebro? Igungforetagen АБ, 1971, p. 15.

132. Гордон A., Форд P. Спутник химика. M.: Мир, 1976, с. 437-446.

133. Draper o.j., Pollard A.L. The purification of phenol for paper partition chromatography. Science, 1949, v. 109, No. 2835, p. 448-449.

134. Гребенгак В.Д., Мазо А.А. Обессоливание воды ионитами. -M.: Химия, 1980, с. 76.146. Ссылка 124 , с. 44-51.

135. Richardson С.С. Phosphorilation of nucleic acid by an enzyme from T4 bacteriophage-infected Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1965, v. 54, No. 1, p. 158-162.

136. Угарова Т.Ю. Бесклеточная белоксинтезиругощая система из клеток асцитной карциномы Кребс-2. В кн.: Современные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977, с. 358-368.151. Ссылка 135 , с. 3I0-3II.

137. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Parr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Polin phenol reagent. -J. Biol. Chem., 1951, v. 193, No. 1, p. 265-275.

138. Власов В.В., Грачев М.А., Комарова Н.И., Кузьмин С.В., Мензорова Н.И. Ионообменная хроматография и спектральный анализ олигонуклеотидов в микромасштабе. Молек. биол., 1972, т. 6, вып. 6, с. 809-816.

139. Зайдель А.Н. Элементарные оценки ошибок измерения. -Л.: Наука, 1968, 97 с.