Комплексная технология биологически активной добавки к пище "Тинростим" и препарата холинэстеразы из ганглиев кальмаров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.07, кандидат технических наук Михеев, Евгений Валерьевич

• Михеев, Евгений Валерьевич
• кандидат технических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат технических наук Михеев, Евгений Валерьевич

Введение.

1. Обзор литературы

1.1. Строение и свойства цитомединов

1.2. Характеристика Б АД «Тинростим».

1.3. Биологическая роль, строение и свойства холинэстераз.

1.4. Холинэстеразы гидробионтов

1.5. Методы выделения и очистки холинэстераз

1.5.1. Солюбилизация ХЭ с помощью детергентов

1.5.2. Солюбилизация с помощью ферментов

1.5.3. Солюбилизация органическими растворителями

2. Материалы и методы

3. Результаты и обсуждение

3.1. Характеристика сырья ганглиев головоногих моллюсков.

3.2. Модификация метода получения Б АД «Тинростим».

3.3. Технологические характеристики ганглиев кальмаров как сырья для получения препарата ХЭ

3.3.1. Определение рациональных сроков хранения сырья.

3.3.2. Определение рациональных параметров экстракции ХЭ

3.4. Методы солюбилизации и очистки фермента.

3.4.1. Определение параметров обезжиривания сырья органическими растворителями

3.4.2. Очистка ХЭ методом фракционирования сульфатом аммония

3.4.2.1. Характеристика процесса получения препаратов ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров методом фракционирования сульфатом аммония

3.4.2.2. Характеристика препаратов ХЭ кальмаров, полученных методом фракционирования сульфатом аммония.

3.4.3. Солюбилизация ХЭ нервной ткани кальмаров тритоном Х

3.4.3.1. Определение параметров обработки сырья детергентом тритон

3.4.3.1. Определение параметров обработки сырья детергентом тритон

3.4.3.2. Характеристика препарата ХЭ полученного с использованием тритона Х

3.4.4. Исследования влияния ферментов на процесс выделения ХЭ ганглиев кальмаров.

3.4.5. Характеристика препаратов ХЭ, полученных с использованием ферментов.

3.5. Комплексная технология получения фермента холинэстеразы и БАД «Тинростим»

3.5.1. Характеристика процесса

3.5.2. Характеристика препаратов ХЭ и БАД «Тинростим», полученных комплексным методом

3.6. Обсуждение.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексная технология биологически активной добавки к пище "Тинростим" и препарата холинэстеразы из ганглиев кальмаров»

Актуальность работы. Вопросам переработки головоногих моллюсков на пищевые цели посвящено много работ (Леванидов, Захарова, 1968; Кизеветтер, 1973; Купина и др., 2001; Швидкая, Блинов, 2008). Среди головоногих моллюсков особое промысловое значение имеют кальмары. Мышечные ткани кальмаров составляют до 52 % и около 32 % массы кальмара приходится на отходы - печень, пищеварительную систему, гонады и ганглии. Известны технологии переработки внутренних органов кальмаров для получения лечебно-профилактических жиров как БАД к пище (Новгородцева и др., 2007), щелочных и кислых фосфатаз из гонад (Касьяненко и др., 1980; Розенгарт и др., 1993), БАД «Артротин» из хрящевой ткани (Клычкова, 2004; Пат. РФ № 2250047), БАД «Тинростим» из ганглиев (Эпштейн и др., 1997). Зрительные ганглии кальмара составляют около 3 % массы тела животного. Процесс их ручной заготовки трудоемок и затратен. Известная технология получения БАД «Тинростим» (ТИ 36-278-05) из ганглиев кальмаров многостадийна, требует больших затрат ацетона, что предъявляет особые требования к организации производства. Использование современных технологических приемов и аппаратов позволяет существенно уменьшить количество используемых органических растворителей.

Исследование ферментов как биологических катализаторов представляет собой одно из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии и биохимии. В течение многих лет разрабатываются различные аспекты взаимосвязи структуры и активности, а также направления их практического применения в биотехнологии продуктов питания и БАД (Пивненко и др., 1997; Неклюдов и др., 2000; Калиниченко и др., 2008). Однако проблема выделения и очистки ферментов не теряет своей актуальности, так как развитие современных биотехнологических приемов позволяет упростить и удешевить многоступенчатую и высокозатратную процедуру выделения ферментов. Все это предъявляет, определенные требования к разработке технологических приемов» выделения ферментов, масштабированию процессов, изучению специфических свойств ферментов.

Исследования последних лет убедительно показали наличие высокой холи-нэстеразной активности в нервной ткани у различных видов гидробионтов (Козловская и др., 1990; Jebali et al., 2006; Podolska, Napierska, 2006). Интерес к холинэстеразам (ХЭ) объясняется той ролью, которую играет фермент нервной ткани в быстропротекающих процессах синаптической передачи. Известно использование ХЭ как биохимического реактива при оценке эффективности инсектицидов «и высокотоксичных фосфорорганических соединений (ФОС), а также лекарственных средств (Садыков и др., 1976; Бресткин и др., 1997).

Ранее фермент ацетилхолинэстераза из эритроцитов донорской крови человека (АХЭч) как биохимический реактив производился в России на нескольких предприятиях Министерства здравоохранения. Ферменты из органов и тканей гид-робионтов в промышленных масштабах не производятся, не являются исключением и ХЭ. Повышенные требования к контролю безопасности производств и охраны окружающей среды привели к разработке ряда ферментных тест-систем с использованием ХЭ для оценки уровня загрязнений, в том числе промышленными и бытовыми ядами (Стойкова и др., 2000; Порус и др., 2008; Beljakova et al., 2001).

Основываясь на знании различий физико-химических свойств БАВ нервной ткани, представляло интерес создание комплексной технологии переработки нервной ткани головоногих моллюсков для получения БАД «Тинростим» и препарата ХЭ из одного источника в одном технологическом процессе.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явились поиск и характеристика сырьевых источников и разработка биотехнологических способов получения фермента холинэстеразы и БАД «Тинростим» из нервной ткани гидро-бионтов в одном технологическом процессе.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить, следующие задачи: обосновать использование зрительных ганглиев головоногих моллюсков как сырья'для производства ХЭ; определить рациональные параметры экстракции ХЭ из нервной* ткани кальмаров; обосновать технологию выделения фермента по характеристике конечного продута (термостабильность, субстратная и ингибиторная специфичность); обосновать технологию получения БАД «Тинростим» и препарата холинэстеразы в одном технологическом цикле.

Научная новизна работы. Определены оптимальные параметры хранения и обработки сырья - нервных ганглиев кальмаров. Впервые:

- определена биологическая активность различных по молекулярной массе белковых фракций БАД «Тинростим» и обоснована модификация метода его получения;

- установлено влияние детергента (тритона Х-100), целлюлолитических и протеолитических ферментов на экстрактивность ХЭ из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров;

- определены субстратная и ингибиторная специфичности, термостабильность и электрофоретическая характеристика очищенного фермента ХЭ из ганглиев кальмара;

- из одного вида сырья в одном технологическом процессе выделены и охарактеризованы БАД «Тинростим» и препарат ХЭ;

- разработана и утверждена технология получения ферментного препарата ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров.

Практическая значимость работы. Выполненные исследования послужили основанием для выбора наиболее перспективного источника получения фермента. Обоснован способ заготовки и хранения сырья - сублимированных ганглиев кальмаров. Разработаны способ получения фермента холинэстеразы, в основу которого положен метод дробного высаливания сульфатом аммония; принципиальная схема получения из одного вида сырья в одном технологическом процессе БАД «Тинростим» и препарата ХЭ. Разработана и утверждена нормативная документация на «Препарат фермента пропионилхолинэстеразы» (ТУ № 9289-295-00472012-05). Выпущена опытно-промышленная партия препарата фермента. Проведены промышленные испытания препарата фермента в оценке содержания токсических веществ в окружающей среде.

Защищаемые положения:

- характеристика субстратной и ингибиторной специфичности является показателем пригодности сырья для получения фермента ХЭ;

- модификация технологии БАД «Тинростим» на основе .ультрафильтрации позволяет сохранить ее биологическую активность;

- способ получения холинэстеразы, включающий дробное фракционирование сульфатом аммония позволяет получить термостабильный, высокочувствительный к ФОС фермент с высокой удельной активностью;

- комплексная технология переработки ганглиев кальмаров на основе мембранных технологий обеспечивает получение препарата ХЭ и БАД «Тинростим» в одном технологическом процессе.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на Первой международной научно-технической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы технологии живых систем» (Владивосток, 2005); на XV ежегодной рабочей встрече North Pacific Marine Science Organization (PICES) (Йокогама, Япония, 2006); на научно-практической конференции «Современное состояние водных биоресурсов», посвященной 70-летию С.М. Коновалова (Владивосток, 2008); Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы. Водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки» (Владивосток, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов, списка литературы (156 наименований, в том числе 56 иностранных). Изложена на 123 стр., иллюстрирована 26 рисунками и 29 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология пищевых продуктов (по отраслям)», Михеев, Евгений Валерьевич

105 ВЫВОДЫ

1. Разработана комплексная технология переработки оптических ганглиев кальмаров, позволяющая производить в одном технологическом цикле из одного источника два вида биологически активных препаратов (препарат ХЭ и БАД «Тинростим»), основанная на ограниченном протеолизе сырья с последующим разделением биологически активных компонентов методом ультрафильтрации. Комплексная технология позволяет получать препарат ХЭ с удельной активностью 24,7 Е/мг белка, а также БАД «Тинростим», по физико-химическим и органолептическим показателям не отличающийся от препарата, полученного классическим методом.

2. Разработана модификация способа получения БАД «Тинростим» из мороженых ганглиев кальмаров с использованием метода ультрафильтрации, позволяющая снизить количество используемого ацетона в 10 раз и получать БАД «Тинростим» с высокой иммунологической активностью.

3. На основании данных по определению удельной активности ХЭ ганглиев у 7 видов головоногих моллюсков обоснован выбор источников получения препарата ХЭ. Впервые определены параметры гидролиза тиохолиновых субстратов под действием ХЭ нервных ганглиев осьминога Octopus dofleini; каракатиц Sepiola biros-trata, Rossia pacifica; кальмаров Ommastrephes bartramii, Watasenia scintillans, Sepiotenthis lessoniana.

4. На примере ганглиев тихоокеанского кальмара установлены рациональные сроки хранения сырья различных способов обработки, которые составили 9 мес для мороженого сырья при -18 °С и 6 мес для сублимированных ганглиев при 5 °С.

5. Определены рациональные параметры экстракции фермента из мороженых и сублимированных ганглиев кальмаров: температура экстракции 18-25 °С; соотношение сырье : вода 3:1; время экстракции для мороженых ганглиев 6 ч, для сублимированных ганглиев 12-15 ч в зависимости от вида кальмара.

6. Показано, что обработка сублимированных ганглиев смесью органических растворителей (бутанол : гексан) позволяет перевести в экстракт 67 % общей активности ХЭ в сырье.

7. Показано влияние целлюлолитического и протеолитических ферментов на экстрактивность ХЭ из сублимированных ганглиев кальмаров. Обработка ганглиев пилорином и протамексом в концентрации 0,5 % массы сырья позволяет перевести в раствор 68 % общей активности в случае тихоокеанского кальмара и 63 % в случае кальмара Бартрама.

8. Разработана технологическая схема получения препаратов ХЭ из сублимированных ганглиев дальневосточных видов кальмаров методом фракционирования сульфатом аммония с удельной активностью 106,0 Е/мг белка из ганглиев тихоокеанского кальмара и 93,1 Е/мг белка из ганглиев кальмара Бартрама. Определена молекулярная масса холинэстераз, которая составляла 211-225 кДа в зависимости от вида кальмара.

9. Разработана и утверждена нормативная документация, ТУ № 9289-29500472012-05, на «Препарат фермента пропионилхолинэстеразы». Рассчитаны экономические показатели производства препарата ХЭ из ганглиев кальмара.

3.7. Заключение

Таким образом, в ходе исследований различными способами были получены препараты фермента холинэстеразы из дальневосточных видов кальмаров и эритроцитов крови человека, которые различались по активности, термостабильности и чувствительности к ФОС. Наибольшей удельной активностью характеризовался препарат из ганглиев тихоокеанского кальмара, полученный методом фракционирования сульфатом аммония. Также этот препарат оказался наиболее термостабилен. Высокой чувствительностью к ГД-42 отличался препарат, полученный из ганглиев кальмара Бартрама, обработанных пилорином. Наибольшую чувствительность к ДФФ показал препарат из кальмара Бартрама, полученный с использованием протамекса.

Метод ограниченного протеолиза с использованием пилорина позволил получить термостабильный препарат ХЭ с высокой чувствительностью к ФОС. Данный метод взят за основу для разработки технологии получения БАД «Тинростим» и ХЭ в одном технологическом цикле. В результате получен тинростим, по органо-лептическим и физико-химическим показателям не отличающийся от препарата, полученного классическим методом (ТИ 36-278-05). При этом выход тинростима составил 0,3 % массы сырья, в то время как выход препарата, получаемого традиционным способом (осаждением ацетона), составляет 1,0 %, а выход тинростима методом ультрафильтрации - 0,82 % массы использованного сырья. По-видимому, это связано с тем, что для получения тинростима стандартным способом и методом ультрафйльтрации в качестве сырья использовались мороженые ганглии кальмара, а в случае комплексной технологии были использованы сублимированные ганглии кальмара.

Таким образом, проведенные исследования показали, что комплексный метод получения ХЭ и БАД «Тинростим» позволяет получать препарат фермента холинэстеразы с высокой чувствительностью к ФОС, а также БАД «Тинростим», по органолептическим и физико-химическим показателям соответствующий препарату, полученному стандартным способом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Михеев, Евгений Валерьевич, 2009 год

1. А.с. 1259185 SU. Способ хроматографического разделения пептидов / В.П. Демушкин, Т.А. Малыгина, В.М. Зотов и др. 23.09.86. Бюл. № 35.

2. Абрамович Т.Д., Борзунина A.M., Голуб T.JI. О каталитических свойствах ацетилхолинэстеразы из эритроцитов человека // Биохимия. 1973. - Т. 38, № 6. -С.1137-1143.

3. Богатков С.В., Фролова Т.Т., Грачева И.М. и др. Оптимизация гидролиза белков щелочной протеиназой Bacillus subtilis // Прикл. биохим. и микробиол. -1982.-Т. 18, вып. 5.-С. 71-75

4. Боровская Г.А., Михеев Е.В., Эпштейн JI.M. и др. Метод ультрафильтрации в технологии получения тинростима // Изв. ТИНРО. — 2006. Т. 146. - С. 294— 299.

5. Боровская Г.А., Эпштейн JI.M. Физико-химические свойства тинростима и его применение в медицине // Изв. ТИНРО. 1999. - Т. 125. - С. 176-184.

6. Бресткин А.П., Брик И.Л., Волкова Р.И. и др. Влияние ионной силы органических растворителей на взаимодействие холинэстераз с субстратами и фосфо-рорганическими ингибиторами // Биохимия. 1970 - Т. 35, № 2. - С. 382-393.

7. Бресткин А.П., Вяземская М.М., Майзель Е.Б. Влияние тритона Х-100 на свойства ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека // Биохимия. 1978. -Т. 43, № 1.-С. 94-99.

8. Бресткин А.П., Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В. Субстратно-ингибиторная специфичность холинэстераз нервной ткани командорского кальмара // Нейрохи-мия. 1986. - Т. 5, № 3. - С. 264-270.

9. Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н. и др. Холнпэстеразы наземных животных и гидробионтов : монография. Владивосток : ТИНРО-Центр, 1997.-466 с.

10. Бресткин А.П., Майзель Е.Б., Розенгарт Е.В. Влияние некоторых органических растворителей на реакционную способность холинэстеразы // Биохимия. -1969.-Т. 34, вып. 5.-С. 1062-1067.

11. Бресткин А.П., Певзнер Д.Л. О свойствах ацетилхолинэстеразы мозга и эритроцитов быка // Биохимия. 1971. - Т. 36, № 1. - С. 81-86.

12. Бресткин А.П., Певзнер Д.Л. Октаноловый способ получения и каталитические свойства ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови теплокровных животных //Биохимия.-1966.-Т. 31, № 6. С. 1174-1180

13. Бресткин А.П., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. О свойствах холинэстеразы из хвостатого ядра мозга тюленя Phoca hispida ladogensis // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1971. - Т. 7, № 5. - С. 474-476.

14. Бузолева Л.С., Костюшко А.В., Кондрашова Н.М. Оценка клинико-иммунологической эффективности иммуномодуляторов природного происхождения при экспериментальной пневмонии у мышей // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. - № 3. - С. 64-67.

15. Гажа А.К. Иммуноакгивный пептид из оптических ганглиев моллюсков : дис. канд. биол. наук. Владивосток, 1994. -140 с.

16. Гафуров К.М. Дезоксирибонуклеазы : монография. Владивосток : Даль-наука, 1999.-230 с.

17. Говоруха А.Г., Малыгина Т.А., Сыропятов Б.Я. Сравнительное исследование свойств цитомединов гидробионтов // Технология гидробионтов : сб. науч. тр. Владивосток : ТИНРО, 1987. - С. 71-77.

18. Государственная Фармакопея СССР. 1987. XI изд., вып.1, 2.

19. Григорьева Г.М. Холинэстеразы зрительного ганглия кальмара Illex illece-brosus, каракатицы Sepia officinalis и эледоны Eledona sp. // Сравнительная физиология и нейрохимия / под ред. Е.М. Крепса. Л. : Наука, 1976. - С. 3-13.

20. Григорьева Г.М. Холинэстеразы зрительного ганглия кальмаров Ommastrephes sloani pacificus // Систематика и экология головоногих моллюсков. Л. : ЗИН АН СССР, 1983.-С. 137-139.

21. Григорьева Г.М., Конычева Н. Кинетические свойства холинэстераз зрительного ганглия кальмаров // Физиология и биохимия морских и пресноводных животных / под ред. Е.М. Крепса. Л.: Наука, 1979. - С. 194-204.

22. Григорьева Г.М., Краснова Т.И., Хованских А.Е. и др. Выделение и каталитические свойства растворимой и мембранной холинэстеразы мозга капустной мухи Delia brassicae // Биохимия. 1987. - Т. 52, № 7. - С. 1192-1200.

23. Давидович В.В. Получение и характеристика БАД «Моллюскам» из мантии и щупалец кальмаров // Материалы 2-го Международного симпозиума «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке». 2004. — С. 17—20.

24. Давидович В.В., Позднякова Ю:М. Состав и свойства ферментативных гидролизатов из двустворчатых моллюсков // Сб. тез. докл. Конф. молодых ученых ТИНРО. Владивосток: ТИНРО-Центр, 1999. - С. 202.

25. Дворецкая С. Новое в лечении детей, часто болеющих респираторно-вирусными инфекциями // Врач. 1996. - № 11. — С. 14-15.

26. Дроздов Н.С., Материнская Н.П. Практикум по биохимии. М. : Высш. шк., 1970. -255 с.

27. Кабачник М.И. Фосфорорганические физиологически активные вещества // Вести. АН СССР. 1964. - № 40. - С. 60-68.

28. Калиниченко Т.П., Ярочкин А.П., Тимчишина Г.Н., Кузнецов Ю.Н. Возможность ферментирования сырья при производстве майонеза из молок минтая // Изв. ТИНРО. 2008. - Т. 155. - С. 355-360. .

29. Карташева Н.В., Пашоков А.Н., Розенгарт В.И. Очистка ацетилхолинэстеразы мозга // Вопр. мед. химии. — 1967. —Т. 13, №1.,— С. 104—105.

30. Касьяненко Ю.И., Федорец Ю.А., Эпштейн Л.М. и др. Фосфагаза ткани зрительных ганглиев и гонад командорского кальмара // Исслед. по технол. новых, объектов промысла : сб. науч. тр- — Владивосток: ТШРО, 1980. С. 3-11.

31. Кизеветтер И.В. Биохимия сыр.»я воднох о происхождения : монография. -М.: Пищ. пром-сть, 1973. 416 с.

32. Клычкова Г.Ю. Разработка технологии комплексного препарата из хрящевой ткани кальмара, лосося и осетра // Материалы Всероссийской Интернет-конференции молодых ученых. Владивосток : ТИНРО-центр, 2004. - С. 164-170.

33. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованский А.Е. Различия в свойствах холинэстеразы командорского кальмара из разных районов обитания // Вопр. эволюц. физиол. : Десятое совещ. по эволюц. физиол. : тез. сообщ. JI. : Наука, 1986. - С. 126.

34. Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В., Хованский А.Е. и др. Ингибиторная специфичность холинэстеразы командорского и тихоокеанского кальмаров // Технология гидробионтов : сб. науч. тр. Владивосток : ТИНРО, 1987. - С. 46-54.

35. Козловская В.И., Мензикова О.В., Чуйко Г.М., Майер Ф.Л. Холинэстеразы водных животных // Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных. Л., 1990. - С. 42-66.

36. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики : монография. М. : Мир, 1979. - 280 с.

37. Костылев Э.Ф., Рябошапко А.П. Биохимия сырья водного происхождения : монография. М.: Лег. пром-сть, 1982. - 142 с.

38. Кузник Б.И., Пинелис И.С., Хавинсон В.Х. Применение пептидных биорегуляторов в стоматологии : монография. СПб.: Эскулап, 1999. - 142 с.

39. Купина Н.М., Герасимова Н.А., Поваляева Н.Т. Биохимический способ удаления кожи с мантии кальмара // ХИПС. 2001. -№ 1. - С. 25-28.

40. Леванидов И.П., Захарова В.П. Химический состав промысловых моллюсков и иглокожих Сахалинского района // Изв. ТИНРО. 1968. - Т. 65. - С. 221230.

41. Мецлер Д. Биохимия. Т. 2: Химические реакции в живой клетке : монография.-М.: Мир, 1980.-580 с.

42. Моралев C.H., Базюкин А.Б. Факторный анализ чувствительности холинэстераз к необратимым ингибиторам // Журн. эволюц. биохим. и физиол. — j 997 j-33.-С. 296-301.

43. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночные // Журн эволюц. биохим. физиол. 1999. - Т. 35, № 1. - С. 1-14.

44. Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. «Субстратное ингибирование» — один из аспектов субстратной специфичности холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2001. - Т. 37, № 5. - С. 358-372.

45. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение, очистка и идентификация имму-номодулирующего полипептида, содержащегося в тимусе телят и человека // Биохимия. 1981. - Т. 46, вып. 9. - С. 1652-1659.

46. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летыий опыт экспериментального и клинического изучения) : монография. СПб. : Наука, 1996 - 74 с.

47. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Роль клеточных медиаторов (цитомединов) в регуляции генетической активности // Изв. АН СССР. Сер. биол. — 1985. — Вып. 4 -С. 581-587.

48. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики монография. СПб.: Наука, 2000. - 158 с.

49. Мусил Я., Новакова О., Кунц К. Современная биохимия в cxeivrax : монография. -М. : Мир, 1984. -214 с.

50. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н., Бердутина А.В. Получение и очистка белковых гидролизатов // Прикл. биохим. и микробиол. 2000. - Т. 36, Jsfo 4. q 371379.

51. Неклюдов А.Д., Федорова Н.В., Илюхина В.П., Лисица Е.П. Ферментативный профиль автолизирующих дрожжей рода Saccharomyces // Прикл. биохим. и микробиол. 1993. - Т. 29, вып. 5. - С. 734-743.

52. Несис К.Н. Вертикальное распределение пелагических моллюсков // Журн. общ. биол. 1977. - Т. 38, вып. 4. - С. 547-558.

53. Несис К.Н. Краткий определитель головоногих моллюсков Мирового океана. -М. : Лег. и пищ. пром-сть, 1982. 360 с.

54. Несис К.Н. Океанические головоногие моллюски : монография. М. : Наука, 1985.-286 с.

55. Новгородцева Т.П., Караман Ю.К., Виткина Т.И., Касьянов С.П. Сравнительная характеристика биологической активности жиров из гепатопанкреаса камчатского краба и печени командорского кальмара // Вестн. ДВО РАН. 2007. -№ 6. - С.105-110.

56. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование : монография. М.: Наука, 1981. - 286 с.

57. Пат. РФ № 2250047 Пищевой общеукрепляющий профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов и способ его получения / Т.Н. Пивненко, Г.Ю. Клычкова, Н.Н. Ковалев и др. Бюл. изобретений. 2005. - № 11.

58. Певзнер Д.Л. Выделение, частичная очистка и некоторые свойства ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крупного рогатого скота // Биохимия. 1965. - Т. 30, вып. 5. - С. 980-985.

59. Певзнер Д.Л. Частичная очистка и свойства ацетилхолинэстеразы эритроцитов // Первый Всесоюзный биохимический съезд. Л., 1964. - Т. 2. - С. 109.

60. Певзнер Д.Л., Григорьева Г.М., Розенгарт Е.В., Яковлев В.А. Выделение и очистка холинэстераз из крови млекопитающих // Тез. докл. Всесоюз. совещ. по произв. очищ. ферм, препаратов. Рига, 1963. - С. 22.

61. Пивненко Т.Н. Трипсиноподобные протеазы дальневосточных лососей : дис. .канд. биол. наук. Киев : Ин-т биохимии им. Палладина, 1986. - 176 с.

62. Пивненко Т.Н., Эпштейн Л.М., Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Получение и характеристика белковых гидролизатов с использованием ферментных препаратов различной специфичности // Изв. ТИНРО. — 1997. Т. 120. - С. 23-31.

63. Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Влияние специфичности ферментных препаратов на нуклеотидный состав гидролизатов молок различных видов рыб // Сб. тез. докл. конф. молодых ученых ТИНРО. Владивосток : ТИНРО-Центр, 1999.-С. 216.

64. Позднякова Ю.М., Давидович В.В. Исследование субстратной специфичности панкреатических сериновых протеаз различного происхождения // Тез. докл. конф. молодых ученых ТИНРО. Владивосток : ТИНРО-Центр, 1997.

65. Порус М.В., Дубачева Г.В., Сиголаева Л.В. и др. Определение активностей холинэстераз в смеси с использованием двухэлектродной сенсорной системы // Сенсор, системы. 2008. - Т. 22, № 1. - С. 86-93.

66. Практическая химия белка : монография / под ред. А. Драбре. М. : Мир,1989.

67. Розенгарт Е.В. Реакционная способность холинэстераз командорского кальмара Berryteuthis magister. Субстраты и фосфорорганические ингибиторы // Журн. эволюц. биохим. физиол. 1996. - Т. 32, № 5. - С. 576-582.

68. Розенгарт Е.В. Сравнительный анализ чувствительности протеаз (химот-рипсин, трипсин) и холинэстераз разного происхождения к некоторым фосфорор-ганическим ингибиторам // Журн. эволюц. биохим. физиол. 2009. — Т. 45, № 3. -С.277-283.

69. Розенгарт Е.В. Субстратно-ингибиторный анализ холинэстеразы гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска Neptunea eulimata // Журн. эволюц. биохим. физиол. 2001. - Т. 37, № 5. - С. 401-405.

70. Розенгарт Е.В., Басова Н.Е. Сравнительная энзимология холинэстераз лежит в основе биохимического метода таксономии кальмаров И Журн. эволюц. биохим. и физиол. 2005. - Т. 41, № 6. - С. 490-499.

71. Розенгарт Е.В., Басова Н.Е., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Различные аспекты субстратной специфичности холинэстеразы зрительных ганглиев тихоокеанского кальмара Todarodes pacificus // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1996. -Т. 32, №4.-С. 384-391.

72. Розенгарт Е.В., Державин Д.К., Ковалев Н.Н. и др. Видовые различия в субстратной специфичности холинэстераз дальневосточных кальмаров семейства Gonatidae // ДАН. 1995. - Т. 342, № 5. - С. 703-704.

73. Розенгарт Е.В., Касьяненко Ю.И., Хованских А.Е., Эпштейн Л.М. Кислая фосфатаза кальмаров и других гидробионтов бассейна Тихого океана II Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1993. - Т. 29, № 2. - С. 127-133.

74. Розенгарт Е.В., Ковалев Н.Н., Басова Н.Е., Эпштейн Л.М. Ингибиторная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров семейства Gonatidae // ДАН. 2000. - Т. 370, № 5. - С. 693-695.

75. Розенгарт Е.В., Хованских А.Е., Эпштейн JI.M. Исследование гомогенности холинэстераз нервной ткани кальмаров методом субстратно-ингибиторногэ анализа // Журн. эволюц. биохим. и физиол. 1994. - Т. 30, № 1. - С. 15-21.

76. Савиных В.Ф., Шевцов Г.А. Кальмары северной части Тихого океана: состояние запасов и перспективы промысла // Сб. ВИНИТИ. М. : Мировой океан, 2001.-Вып. 2.-С. 181-184.

77. Садыков А.С., Розенгарт Е.В., Абдувахабов А.А., Асланов Х.А. Холинэстеразы. Активный центр и механизм действия : монография. Ташкент : ФАН, 1976.-204 с.

78. СанПиН 2.3.2.560-96: Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов // Санитарные правила и нормы. -М., 1997.-С. 209.

79. Скоупс Р. Методы очистки белков : монография. М. : Мир, 1985. — 358 с.

80. Соколов О.Ю., Зотова В.В., Кузнецов С.М. и др. Экстракорпоральная им-мунокоррекция в терапии некоторых заболеваний // Человек и лекарство : тез. докл. 3-го рос. нац. конгр. -М., 1996. С. 209.

81. Стойкова Е.Е., Белякова С.В., Будников Г.К., Евтюгин Г.А. Ферментные тест-системы для определения остаточных количеств фосфорорганических пестицидов в растительном материале // Всерос. конф. "Химический анализ веществ и материалов". М., 2000. - С. 128.

82. Суховерхова Г.Ю., Пивненко Т.Н. Исследование специфичности ферментов к гидролизу хрящевой ткани гидробионтов // Материалы научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы». -Калининград, 2006. С. 115-116.

83. ТИ № 36-46-07 по изготовлению ганглиев кальмара мороженых — сырья для производства БАД.

84. ТИ № 36-278-05 по изготовлению гидролизата ганглиев кальмара «Тинростим».

85. ТУ 6-16-1743-72. Препарат фермента ацетилхолинэстеразы из, эритроцитов крови человека, лиофилизированный.

86. ТУ 9280-1203-00472012-96. Пилорин марки А.

87. ТУ 9291-008-13684916-05. Препарат ферментный ЦеллоЛюкс-А для спиртовой и пивоваренной промышленности.

88. Турпаев Т.М., Абашкина Л.И., Бресткин А.П. и др. Холинэстераза зрительных ганглиев кальмара Ommastrephes sloanipacificus // Физиология и биохимия беспозвоночных.- Л.: Наука, 1968.-С. 121-130.

89. Швидкая З.П., Блинов Ю.Г. Химические и биотехнологические аспекты теплового консервирования гидробионтов дальневосточных морей : монография. -Владивосток: Дальнаука, 2008. 270 с.

90. Шевцова С.П., Бресткин А.П., Несис К.Н., Розенгарт Е.В. Об идентичности свойств холинэстераз зрительных ганглиев кальмара Бартрама из южной Атлантики и Большого Австралийского залива // Океанология. 1977. - Т. 17, вып. 6. -С. 1102-1105.

91. Эпштейн Л.М. Получение и свойства холинэстеразы : дис. . канд. биол. наук.-Л., 1974.

92. Эпштейн Л.М., Боровская Г.А., Левачев М.М. и др. Эффективность перо-рального применения нового иммунокорректора природного происхождения // Вопр. питан. 1997. -№ 1. - С. 10-13.

93. Эпштейн Л.М., Шевцов Г.А., Ковалев Н.Н., Розенгарт Е.В. Субстратная специфичность холинэстераз зрительных ганглиев кальмаров как показатель ценности сырья // Технология гидробионтов : сб. науч. тр. — Владивосток : ТИНРО, 1987.-С. 37-45

94. Яковлев В.А. Кинетика ферментативного катализа : монография. М.: Наука, 1965.-248 с.

95. Яковлев Г.М., Морозова В.Г., Хавинсон В.Х. Современные представления о цитомединах // Цитомедины. Функция в организме. Использование в клинической практике. Томск, 1986. - С. 9-11.

96. Яковлев Г.М., Новиков B.C., Хавинсон В.Х. Резистентность, стресс-регуляция : монография. Л.: Наука, 1990. - 238 с.

97. Aprison M.H., Jackson R.L. Solubilization of cholinesterase from rabbit caudate nuclei by surface active agents // Fed. Proc. 1961. - Vol. 20. - P. 341.

98. Ardle В., Thompson R.H.S., Wabster G.R. The action of lisolecithin and snake venom of whole cell preparations of brain, muscle and liver // J. Neurochem. 1960. -Vol. 5, № 2. - P. 135-144.

99. Barak D., Ordentlich A. et al. Allosteric modulation of acetylcholinesterase activity by peripheral ligands involves a conformational transition of the anionic subsite // Biochemistry. 1995. - Vol. 34. - P. 15444-15452.

100. Beljakova S.V., Stoikova E.E., Evtugyn G.A., Latypova V.Z. Enzymatic test kit for the rapid and sensitive detection of insecticides in the corn // Environ. Radioecol. Appl. Ecol. 2001. - Vol. 7, № 2. - P. 35-42.

101. Bergmann F., Rimon S., Segal R. Effect of pH on the activity of eel esterase towards different substrates // Biochem. J. 1958. - Vol. 68, № 3.

102. Bernheim F., Bernheim M.L. Action of drags on the cholinesterase of the brain. // J. Pharmacol. 1936. - Vol. 57. - P. 427-436.

103. Bourne Y., Taylor P., Marchot P. Acetylcholinesterase inhibition by fasciculin crystal structure of the complex // Cell. 1995. - Vol. 83. - P. 503-512.

104. Bullock K. Resistance of Acetylcholine esterase in dry preparations to certain organic solvents // Biochem. J. 1951. - Vol. 49, № 1.

105. Bullock Т.Н., Grunfest H., Nachmansohn D., Rothenberg M.A. Generality of the role of acetylcholine in nerve and muscle condition // J. Neurophysiol. — 1947. Vol. 10, № l.-P. 11-21.

106. Carlsen J.B., Svenmark A. Multiple forms of soluble butyrylcholinesterase in human brain // Biocem. Biophis. Acta. 1970. - Vol. 207. - P. 477-484.

107. Chan S.L., Shirachi D.Y., Hargava H.N. et al. Purification and properties of multiple forms of brain acetylcholinesterase // J. Neurochem. 1972. - Vol. 19, № 12. -P.2747-2758.

108. Choen J.R., Warringa M.G.P.Y. Methods to estimate the turnover number of preparations of red cell cholinesterase // Biochem. Biophys. Acta. 1953. - Vol. 11, № l.-P. 52-58.

109. Cygler M., Schrag J.D., Sussman J.L., et al. Relationship between sequence conservation and three-dimentional structure in a large family of esterases, lipase and related proteins // Protein Science. 1993. - Vol. 2. - P. 366-382.

110. Ecobichon D.J., Israel Y. Characterization of the esterases from electric tissue of Electrophorus by starch-gel electrophoresis II Can. J. Biochem. 1967. - Vol. 45, № 7. -P. 1099-1105.

111. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres V.Jr., Featherstone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. - Vol 7, № 1. - P. 88-95.

112. Folch J., Les M., Sloane-Stanly G.H. Method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. - Vol. 226, № 1. - p. 497-509.

113. Fournier D., Mutero A., Pralavorio M., Bride J.M. Drosophila acetylcholinesterase: mechanism of resistance to organophosphates II Chem. Biol. Interact. — 1993. -Vol. 87.-P. 233-238.

114. Gibney G., Camp S., Dionne M. Mutagenesis of essential functional residues in acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 7546-7550.

115. Glauert A.M. Electron microscopy of lipids and membranes // J. Roy. Microscop. Soc. 1968. - Vol. 88, № 1. - P. 49-70.

116. Gnatt A., Loewenstein Y., Yaron A. et al. Site-directed mutagenesis of active site residues reveals plasticity of human butyrylcholinesterase in substract and inhibitor interactions // J. Neurochem. 1994. - Vol. 62. - P. 749-755.

117. Haas R., Braudt P.T., Knigt J., Rosenbery T.L. Identification of amino components in a glicolipid membrane-binding domain at the C-terminus of human erythrocyte acetylcholinesterase//Biochemistry. 1986. - Vol. 25, № 11. -P. 3098-3105.

118. Ho I.K., EHman G.L. Triton solubilized acetylcholinesterase of brain // J. Neurochem. 1969.-Vol. 16, № 11.-P. 1505-1513.

119. Hsiao Y.M., Lai J.Y., Liao H.Y., Feng H.T. Purification and characterization of acetylcholinesterase from oriental fruit fly (Bactrocera dorsalis (Hendel)) (Diptera:

120. Tephritidae) // J. of Agricultural and Food Chemistry. 2004. - Vol. 52, Iss 17. - P. 5340-5346.

121. Hussein A.S., Grigg M.E., Selkirk M.E. Nippostrongylus brasiliensis: Characterisation of a somatic amphiphilic acetylcholinesterase with properties distinct from the secreted enzymes //Experimental Parasitology. 1999. - Vol. 91, Iss 2. - P. 144-150.

122. Jackson P., Whittaker N. Some characteristics of acetylcholinesterase extracted from human erythrocytes by three different detergents // Enzymologia. 1972. - Vol. 43. -P. 359-372.

123. Jackson R.L. Aprison M.H. Mammalian brain acetylcholinesterase. Effects of surface active agents // J. Neurochem. 1966. - Vol. 13. - P. 1367-1371.

124. Jackson R.L., Aprison M.H. Mammalian brain acetylcholinesterase: purification and properties //J. Neurochem. 1966. - Vol. 13. - P. 1356-1365.

125. Jebali J., Bani M., Guerbej H. et al. Effects of malathion and cadmium on acetylcholinesterase activity and metallothionein levels in the fish Seriola dumerilli // Fish. Physiol. Biochem. 2006. - Vol. 32. - P. 93-98.

126. Karnovsky M., Roots L.A. "Direct-colouring" thiocholine method for choli-nesterases // Histochem. Cytochem. 1964. - Vol. 12. - P. 219-226.1.uzinger W. The number of catalytic sites in acetylcholinesterase // Biochem. J. 1971.-Vol. 123, №2.-P. 134-141.

127. MacPhee-Quigley K., Taylor P., Taylor S. Primary structure of the catalytic subunits form two molecular form of acetylcholinesterase // Biol. Chem. 1985. - Vol. 260.-P. 12185-12189.

128. Marcos M.R., SanchezYague J., HernandezHernandez A., Llanillo M. Amphiphilic and hydrophilic forms of acetylcholinesterase from sheep platelets // Bio-chimicaetBiophysica Acta-Biomembranes.- 1998.-Vol. 1415, Iss l.-P. 163-173.

129. Massoulie J., Sussman J.L., Doctor B.P. Recommendation for nomenclature in cholinesterases // Multidisciplinary approaches to Cholinesterase Fanction : Plenum Press, 1992.-P. 285-288.

130. Miller D.M. Total solubilization of erythrocyte membranes by nonione detergents // Biochem. Biophis. Acta. 1970. - Vol. 207. - P. 716-722.

131. Nachmansohn D. Chemical and molecular basis of nerve activity. NY; L.: Academic Press, 1959. - 235 p.

132. Neuman E. The reaction of acetylcholine receptor and esterase and bioelectric signal generation //J. Physiol. Chem. 1981. - Vol. 362, № 10. - P. 1907-1911.

133. NietoCeron S., MoralNaranjo M.T., MunozDelgado E. et al. Molecular properties of acetylcholinesterase in mouse spleen // Neurochemistry International. 2004. -Vol. 45, Iss l.-P. 129-139.

134. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., et al. The alfa/beta hydrolase fold // Protein Engineering. 1992. - Vol. 5. - P. 197-211.

135. Ord M.B., Thomson R.H.S. Pseudo-cholinesterase activity in the central nervous system // Biochem. J. 1950. - Vol. 46. - P. 346.

136. Ord M.G., Thompson R.H.S. Pseudo-cholinesterases activity in the central nervous system //Biochem. J. 1952. - Vol. 51. - P. 245-251.

137. Ord M.G., Thompson R.H.S. The preparation of soluble cholinesterases from mammalian heart and brain // Biochem. J. 1951. - Vol. 49, № 1. - P. 191-199.

138. Palmer T. The Cholinesterases // J. of Biological Chemestry. 1991. - Vol. 266, №7.-P. 4025-4028.

139. Podolska M., Napierska D. Acetylcholinesterase activity in host (herring Clupea harengus) and parasites (Anisakis simplex larvae) from the southern Baltic// J. of Marine Science. 2006. - Vol. 63. - P. 161-168.

140. Radic Z., Gibney G., Kawanoto S. et al. Expression of recombinant acetylcholinesterase in a baculovirus system: kinetic properties of glutamate 199 mutants // Biochemistry. 1992. - Vol. 31. - P. 9760-9767.

141. Ripoll D.R., Faerman C.H., Axelsen P. H. et al. An electrostatic mechanism for substrate down the aromatic gorge of acetylcholinesterase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. -P. 5128-5132.

142. Rosenfeld С., Kousba A., Sultatos L.G. Interactions of rat brain acetylcholinesterase with the detergent Triton X-100 and the organophosphate paraoxon // Toxico-logical Sciences.-2001.-Vol. 63, Iss 2.-P. 208-213.

143. Shafferman A., Velan В., Ordentlich A. et al. Substrate inhibition of acetylcholinesterase: residues affecting signal transduction from the surface to the catalytic center // EMBO J. 1992. - Vol. 11. - P. 3561-3568.

144. Sussman J.L., Harel M., Frolow F. et al. Atomic structure of acetylcholinesterase fron Torpedo californica: A prototypic acetylcholine-binding protein // Science. 1991. - Vol. 253.-P. 872-879.

145. Tan R.C., Truong T.N., McCammon J.A., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: electrostatic steering increases the rate of ligand binding // Biochemistry. 1993. - Vol. 32.-P. 410-413.

146. Toschi G.A. A biochemical study of brain microsomes //Exp. Cell. Rec. 1959. -Vol. 16, №2.-P. 232-255.

147. Vellom D.C., Radic Z., Li Y. et al. Amino acid residue controlling acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase specificity // Biochemistry. 1993. - Vol. 32. - P. 12-17.

148. Wilson I.B., Harrison M.A., Ginsburg S. Carbamyl derivatives of acetylcholi-nesteiase // J. Biol. Chem. 1961. - Vol. 236, № 5. - P. 1498-1500.

149. Zoran A., Matjaz Z., Milan S. Inhibition of erythrocyte acetylcholinesterase by n-butanol at high concentration // Arch. Biochem. and Biophys. 2005. - Vol. 437, № 1. -P. 78-84.

150. ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ТИХООКЕАНСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ ЦЕНТР» ( ФГУП «ТИНРО-Центр»)1. ОКП 92 8902етрунин 05 г

151. Группа Н 28 (ОКС 67.120.30)1. ЩОКДАЮbHbijf директор . -Центр» Л.Н. Бочаров 5 //.2005 г

152. ПРЕПАРАТ ФЕРМЕНТА ПРОПИОНИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

153. Технические условия ТУ 9289-295-00472012-05 (впервые)

154. Дата введения в действие 30,12.2005 г1. РАЗРАБОТАНОЧ

155. Научный сотрудник Г. А. Боровска

156. Младшийнаучныйалрудник ^^ ЕВ.Михеев1. Владивосток 2005

157. ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО РЫБОЛОВСТВУ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УНИТАРНОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ТИХООКЕАНСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ РЫБОХОЗЯЙСТВЕННЫЙ ЦЕНТР» ( ФГУП «ТИНРО-Центр»)1. ОКП 92 8902лектор ЮХТ» 'етрунин 05 г

158. Группа Н 28 (ОКС 67.120.30)1. ЕРЖДАЮъшлй директор . ►-Центр» Л.Н. Бочаров £/£2005 г

159. ПРЕПАРАТ ФЕРМЕНТА ПРОПИОНИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

160. Технические условия ТУ 9289-295-00472012-05 (впервые)

161. Дата введения в действие 30.12.2005 г1. РАЗРАБОТАНОЧ

162. Научный сотрудник -^Pfcj^ Г. А. Боровска: Младший научный сотрудник ЕВ. Михеев1. Владивосток 2005

163. Результаты тестов приведены в таблице. ,»

164. Начальник лаборатории промышленной индикации1. Л.Ф. Морозова