Комплексная характеристика функционирования АВС-транспортеров в солидных опухолях человека методом проточной цитофлюориметрии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Равчеева, Анна Борисовна

• Равчеева, Анна Борисовна
• кандидат биологических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Равчеева, Анна Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. I. Лекарственная устойчивость и механизмы ее реализации в клетке.

1.2. Семейство АВС-транспортеров.

1.3. Взаимосвязь фенотипа множественной лекарственной резистентности и клинических характеристик опухоли.

1.4. Влияние функции АВС-транспортеров на внутриклеточное распределение доксорубицина.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы оценки функциональной активности АВС-транспортеров.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Адаптация метода оценки функциональной активности АВС-транспортеров для исследования плотных тканей.

3.2. Метод проточной цитофлюориметрии позволяет регистрировать перераспределение антрациклина между ядром и цитоплазмой и определять присутствие в клетках опухоли ядерной фракции АВС-транспортеров.

3.3. Зависимость интенсивности внутриклеточной флюоресценции доксорубицина от концентрации ингибитора.

3.4. Алгоритм оценки фенотипа множественной лекарственной резистентности.

3.5. Внеклеточная концентрация доксорубицина регулирует его распределение в клетках с фенотипом множественной лекарственной резистентности.

3.6. Выраженность ответной реакции опухолевых клеток на воздействие ингибиторов транспортеров определяется внеклеточной концентрацией антрациклина.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексная характеристика функционирования АВС-транспортеров в солидных опухолях человека методом проточной цитофлюориметрии»

Одна из важных проблем в онкологии - врожденная и развивающаяся в процессе * лечения невосприимчивость опухоли к цитостатикам, отличающимся по строению и механизму действия, так называемая множественная лекарственная резистентность. Среди ряда причин, обуславливающих феномен множественной лекарственной резистентности, важная роль отводится семейству ABC-транспортеров, представляющих собой АТФ-зависимые насосы, которые выбрасывают во внеклеточное пространство входящие в клетку цитостатики. Спектр субстратов ABC-транспортеров широк и включает большинство эффективных противоопухолевых препаратов, применяемых в клинике: антрациклины, винкаалкалоиды, подофилотоксины, таксаны, актномицин Д, митоксантрон, амсакрин, митрамицин, митомицин С, топотекан и иринотекан. В литературе эта большая группа противоопухолевых лекарств называется МЛУ-препаратами.

В настоящее время перспективным считается преодоление множественной лекарственной резистентности, реализованной через систему обратного транспорта, путем применения модификаторов, блокирующих активность ABC-транспортеров и, тем самым, повышающих эффективность уже используемых в клинике цитостатиков. Этот подход с некоторой долей успеха применяется для преодоления множественной лекарственной резистентности в случае лейкозов, когда в качестве модифицирующего агента используют блокатор активности Pgp, одного из представителей семейства обратных транспортеров Другой путь - "обойти" лекарственную резистентность, исключив из схемы терапии МЛУt препараты, к которым предполагается невосприимчивость.

Прежде чем рекомендовать включить в схему модификатор активности обратных транспортеров или рекомендовать исключить из курса химиотерапии цитостатик, к которому нечувствительны опухолевые клетки, необходимо оценить активность обратной транспортной системы в данной опухоли и ее восприимчивость к воздействию модификатора. До сих пор экспрессию ABC-транспортеров продолжают определять методами обратной полимеразной цепной реакции и иммуногистохимии.

Несмотря на однозначно доказанную связь между экспрессией обратных транспортеров и развитием множественной лекарственной резистентности в экспериментах на культуре клеток in vitro, наблюдают частое отсутствие корреляции между уровнем экспрессии транспортеров в опухолевых клетках и чувствительностью к противоопухолевой химиотерапии. Неудачи при попытках провести такие корреляции в клинике отчасти объясняются неадекватностью перечисленных методов для определения присутствия в опухолевых клетках активных транспортеров. Ввиду существования таких сложных регуляторных механизмов как транскрипционная, посттранскрипционная и трансляционная регуляции, в клетке может отсутствовать работающий белок, и в то же время присутствовать 4

РНК, кодирующая транспортер, или сам белок, но в неактивной форме. Есть и еще причины, которые не позволяют признать метод имнуногистохимии адекватным для идентификации обратных транспортеров в клетке. Во-первых, в метод иммуногистохимии заложена ошибка, » обусловленная субъективностью оценки наличия положительной реакции при окрашивании срезов ткани. Во-вторых, в данном подходе присутствует также объективная ошибка, связанная с неотработанностью методики. Неоднократно продемонстрировано, что антитела к разным эпитопам белков обратных транспротеров могут давать не перекрывающееся положительное окрашивание В связи с высказанными соображениями становится очевидным, что при оценке экспрессии обратных транспортеров необходимо ориентироваться на функциональную активность транспортеров, то есть маркером множественной лекарственной резистентности является именно функционирующий транспортер.

Функциональную активность ABC-транспортеров определяют по изменению внутриклеточного накопления субстрата транспортеров после воздействия ингибитора активности транспортера. Одновременно, оценивается и чувствительность данной опухоли к воздействию модификатора. Если субстрат является флюоресцирующей меткой, то для регистрации его концентрации в клетке используют метод проточной цитофлюориметрии. Этот подход используют в случае лейкозов в качестве диагностического этапа при прогнозировании эффективности использования блокатора Pgp с целью повышения чувствительности опухоли к цитостатику. ' Проведение функционального теста методом цитометрии в потоке ограничено опухолями, клетки которых находятся в суспензии. Применение даже самых "мягких" 4 методов получения суспензии клеток из плотной ткани с использованием протеолитических ферментов приводит к неконтролируемому повреждению плазматической мембраны клетки, и, следовательно, к искажению результатов тестирования функциональной активности обратных транспортеров, так как ABC-транспортеры являются, в том числе, плазматическими белками. Адаптация функционального теста для оценки активности транспортеров в плотных тканях впервые позволит провести такое исследование в солидных опухолях, составляющих основную долю онкологических заболеваний, что безусловно важно для достижения прогресса в изучении и преодолении множественной лекарственной резистентности.

Все выше сказанное обуславливает актуальность исследования, его цели и задачи.

Целью настоящего исследования является разработка подхода прижизненной количественной оценки функциональной активности обратных транспортеров в плотных тканях, в том числе солидных опухолях человека, методом проточной цитофлюориметрии.

Для достижения поставленной цели необходимо: 1. подобрать оптимальные условия проведения оценки функциональной активности АВС-, транспортеров в плотных тканях, решив следующие задачи:

• разработать подход к активации активности обратной транспортной системы в клетках в тех случаях, когда опухолевый образец на предваряющем исследование этапе достаточно длительное время находится в неадекватных условиях для сохранения функции транспортеров;

• выработать способ получения суспензии интактных опухолевых клеток их плотного опухолевого узла;

• определить оптимальные временные показатели проведения исследования, оптимальные дозы модельного препарата доксорубицина (субстрата ABC-транспортеров) и специфических ингибиторов разных представителей обратных транспортеров;

• разработать алгоритм анализа данных, получаемых при оценке функциональной активности ABC-транспортеров с помощью проточного цитофлюориметра.

2. проверить адекватность созданного подхода, ориентируясь на способность выявлять с помощью данной методики

• фенотипы множественной лекарственной резистентности, различающиеся по спектру экспрессированных транспортеров;

• фенотип множественной лекарственной резистентности, совпадающий с показателями, определяемыми методом спектрофлюориметрии для того же образца солидной опухоли;

• существенные отличия в частоте экспрессии функционально активных транспортеров в клетках опухолей, различающихся по чувствительности к химиотерапии (в данной работе рассматривается пара - рак молочной железы, для которого исходно характерна высокая чувствительность к химиотерапии, и немелкоклеточный рак легкого, характеризующийся врожденной устойчивостью к цитостатикам).

Научная новизна и практическая значимость

В данной диссертационной работе решена задача по адаптации метода проточной цитофлюориметрии для оценки функциональной активности обратных транспортеров в плотных тканях, что впервые позволяет использовать метод цитометрии в потоке для прижизненного количественного дифференцированного определения функциональной активности транспортных белков в солидных опухолях человека. Выработан оптимальный алгоритм оценки активности ABC-транспортеров, удобный для проведения рутинных исследований и позволяющий характеризовать фенотип множественной лекарственной резистентности наиболее полно и с высокой степенью надежностью. Показана возможность идентифицировать присутствие в опухолевых клетках активных транспортеров, отличных от

Pgp и MRP, что доказывает важность включения в схему исследования азида натрия, энергетического яда и блокатора обратного транспорта в целом.

Метод проточной цитометрии впервые использован в новом качестве - для определения характера внутриклеточного распределения цитостатика. Учитывая выявленное свойство проточного цитофлюориметра установлено, что ингибиторы обратных 6 транспортеров, влияя на активность цитоплазматических и/или ядреных транспортеров, изменяют не только тотальную концентрацию препарата в клетке, но и его распределение между ядром и цитоплазмой.

Выявлен новый механизм регуляции внутриклеточного распределения МЛУ-препаратов. Внутриклеточное распределение доксорубицина между ядром и цитоплазмой, контролируемое ABC-транспортерами, регулируется его внеклеточной концентрацией: при высокой внеклеточной концентрации антрациклина увеличивается доля препарата, поступившего в ядро и связавшегося с ДНК Учитывая, что определяющим в реализации эффективности подавляющего большинства противоопухолевых препаратов является их взаимодействие именно с ядреными мишенями клетки, полученные результаты свидетельствуют о том, что лечебный эффект высокодозной химиотерапии в отношении опухолей с фенотипом множественной лекарственной резистентности должен превышать ожидаемый от повышения доз препаратов в интервале терапевтических, а следовательно, применение такой терапии, несмотря на ее чрезвычайную сложность, оправдано.

В процессе разработки методики выявлен новый подход к интерпретации данных, полученных с помощью метода проточной цитофлюориметрии, что позволяет описать ранее неучитываемые при определении фенотипа множественной лекарственной характеристики активности обратных транспортеров:

• сочетание активностей плазматической и ядерной форм транспортеров, из которых складывается суммарная активность обратного выброса цитостатиков из клетки;

• степень доступности ядра и место преимущественной локализации цитостатика в клетке, контролируемое транспортерами обоих защитных барьеров;

• выраженность экспрессии, присутствующих в клетке транспортеров.

Перечисленные выше новые параметры активности обратных транспортеров наряду с таким показателем как спектр экспрессированных транспортеров позволит дифференцированно подходить к оценке фенотипа множественной лекарственной резистентности солидных опухолей человека, учитывать все характеристики, по которым могут различаться опухоли.

Разработанный подход прижизненной количественной дифференцированной оценки функциональной активности обратных транспортеров в плотных тканях методом проточной цитофлюориметрии предполагается использовать:

1) для выбора адекватного метода определения экспрессии активных транспортеров в клетках опухолей различных локализаций;

2) для сравнения опухолей различных локализаций по разным характеристикам функциональной активности обратных транспортеров;

3) для определения "тяжести" фенотипа множественной лекарственной резистентности у конкретного больного с целью предсказания чувствительности к химиотерапии и коррекции 7 схемы терапии, путем исключения из нее МЛУ-препаратов, к которым предполагается невосприимчивость;

4) для индивидуального прогнозирования эффективности воздействия модификаторов » активности транспортеров в случае выявления их экспрессии в опухоли.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Равчеева, Анна Борисовна

выводы

1. Метод лазерной проточной цитофлюорометрии, адаптированный для изучения плотных тканей, впервые позволяет проводить прижизненную количественную дифференцированную оценку функциональной активности ABC-транспортеров в солидных опухолях человека разных локализаций.

2. Фенотип множественной лекарственной устойчивости солидных опухолей человека характеризуется широким спектром сочетаний функциональной активности разных АВС-транспортеров, регулирующих ядерную и цитоплазматическую внутриклеточную локализацию цитостатиков.

3. Внеклеточная концентрация препарата является важным фактором регуляции внутриклеточного распределения противоопухолевых лекарств, в том числе их накопления в ядре.

4. Выработаны критерии оценки "тяжести" фенотипа множественной лекарственной резистентности, которая усугубляется с увеличением количества и выраженности экспрессии ABC-транспортеров, а также с уменьшением степени доступности ядра для цитостатиков.

5. Выработан оптимальный алгоритм оценки функциональной активности АВС-транспортеров, позволяющий получать наиболее полную характеристику фенотипа множественной лекарственной резистентности конкретной опухоли и адекватно прогнозировать эффективность действия противоопухолевых препаратов, в том числе и в комбинации с ингибиторами функции ABC- транспортеров.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Равчеева, Анна Борисовна, 0 год

1. Богуш Т.А., Баранов Е.П., Козорез А.Б., Танкович НИ. «Прижизненная оценка накопления доксорубицина в разных типах клеточных культур». Антибиотики и химиотерапия 1990; т.35(11): 16-18.

2. Allen J.D., Brinkhuis R.F., Wijnholds J. et all. «Amplification and overexpression in cell lines selected for resistance to topotecan, mitoxantrone, or doxorubicin». Cancer Res 1999; 59: 4237 - 4241.

3. Allikmets R., Schriml L.M., Hutchinson A., Romano-Spica V., and Dean M. «А human placenta-specific ATP-binding cassette gene (ABCP) on chromosome 4q22 that is involved in multidrug resistance». Cancer Res 1998, 58: 5337 -5339.

4. Allouche M., Bettaieb A., Vindis C., Rousse A., Grignon C., Laurent G. «Influence of Bcl-2 overexpression on the ceramide pathway in daunorubicin-induced apoptosis of leukemic cells». -Oncogene 1997; 14(15): 1837-45.

5. Alton P.A., Harris A.L. «The role of DNA topoisomerases II in drug resistance». -Br J Haematol 1993; 85 (2): 241-5.

6. Ambudkar S.V., Dey S., Hrycyna C.A., Ramachandra M, Pastan /., Gottesman M.M. «Biochemical, cellular, and pharmacological aspects of the multidrug transporter». -Annu Rev Pharmacol Toxicol 1999; 39: 361-98.

7. Arced R.J. «Clinical significance of P-glycoprotein in multidrug resistance malignancies». -Blood 1993; 81 (9): 2215-22.

8. Barnouin K., Leier I., Jedlitschky G., Pourtier-Manzanedo A., Konig J., Lehmann W.D., Keppler D. «Multidrug resistance protein-mediated transport of chlorambucil and melphalan conjugated to glutathione». Br J Cancer 1998; 77: 201 -209.

9. Beer T.W., Rowlands D.C., Crocker J. «Detection of the multidrug resistance marker P glycoprotein by immunohistochemistry in malignant lung tumours». Thorax 1996; 51 (5): 526-9.

10. BorstP. «Genetic mechanisms of drug resistance». Acta Oncol 1991; 30(1):87-105.

11. Borst P., Evers R., Kool M., Wijnholds J. «А family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins». J Natl Cancer Inst 2000; 92(16): 1295-302.

12. Bosch /., Croop J. «Р-glycoprotein multidrug resistance and cancer». Biochim Biophys Acta 1996; 1288(2): F37-54.

13. Bourhis J., Benard J., Hartmann O., Boccon-Gibod L., Lemerle J., Riou G. «Correlation of MDR1 gene expression with chemotherapy in neuroblastoma». J Natl Cancer Inst 1989; 81(18): 1401-5.

14. Bradley G., Juranka P.F., Ling V. «Mechanism of multidrug resistance». Biochim Biophys Acta 1988 ; 948(1): 87-128.

15. Brinkmann U. and Eichelbaum M. «Polymorphisms in the ABC drug transporter gene MDRlv>. -Pharmacogenomics J 2001; 1:59 -64.

16. Broxterman H.J., Lankelma J., Pinedo H.M. «How to probe clinical tumour samples for P-glycoprotein and multidrug resistance-associated protein». Eur J Cancer 1996; 32A(6): 1024-33.

17. Broxterman H.J., Lankelma J., Pinedo H.M., Eekman C.A., Wahrer D.C., Ossenkoppele G.J., Schuurhuis G.J. «Theoretical and practical considerations for the measurement of P-glycoprotein function in acute myeloid leukemia». Leukemia 1997; 11(7): 1110-8.

18. Buschman E., Arceci R.J., Croop J.M., Che M., Arias I.M., Housman D.E., Gros P. «Mdr2 encodes P-glycoprotein expressed in the bile canalicular membrane as determined by isoform-specific antibodies». J Biol Chem 1992; 267(25): 18093-9.

19. Buschman E., Gros P. «The inability of the mouse mdr2 gene to confer multidrug resistance is linked to reduced drug binding to the protein». Cancer Res 1994; 54(18): 4892-8.

20. Chen C.J., Chin J.E., Ueda K„ Clark D.P., Pastan I., Gottesman M.M., Roninson LB. «Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdrl (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells». Cell 1986; 47:381 -389.

21. Childs S. and Ling V. «The MDR superfamily of genes and its biological implications». -Important Adv Oncol. 1994; 21-36.

22. Chiou S.K., Rao L., White E. «Bcl-2 blocks p53-dependent apoptosis». Mol Cell Biol 1994; 14(4): 2556-63.

23. Chu G. «Cellular responses to cisplatin. The roles of DNA-binding proteins and DNA repair». J Biol Chem 1994; 269(2): 787-90.

24. Davies R., Budworth J, Riley J, Snowden R., Gescher A., Gant TW. «Regulation of P81glycoprotein 1 and 2 gene expression and protein activity in two MCF-7/Dox cell line subclones». -Br J Cancer 1996; 73(3): 307-15.

25. Dean M, Allikmets R. «Evolution of ATP-binding cassette transporter genes». Curr Opin Genet Dev 1995; 5: 779-785.31 .Dean M„ Hamon Y., Chimini G. «The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily». J Lipid Res 2001; 42: 1007 -1017.

26. Decottignies A., GoffeauA. «Complete inventory of the yeast ABC proteins». Nat Genet 1997; 15: 137-145.

27. DelaFlor-Weiss E„ Uziely В., Muggia F.M. «Protracted drug infusions in cancer treatment: an appraisal of 5-fluorouracil, doxorubicin, and platinums». Ann Oncol 1993; 4(9): 723-33.

28. Dive C. «Avoidance of apoptosis as a mechanism of drug resistance». J Intern Med Suppl 1997; 740: 139-45.

29. Dolfini E., Dasdia Т., Arancia G., Molinari A., Calcabrini A., Scheper R.J., Flens M.J., Gariboldi M.B., Monti E. «Characterization of a clonal human colon adenocarcinoma line intrinsically resistant to doxorubicin». Br J Cancer 1997; 76:67 -76.

30. Doyle L.A., Yang W„ Abruzzo L. V. et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 15665 15670.

31. Doyle L.A., Yang W., Abruzzo L. V., Krogmann Т., Gao Y., Rishi A.K., Ross D.D. «А multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells». Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:15665 -15670.

32. Egyhazi S„ Edgren M.R, Hansson J., Krockel D., Mannervik В., Ringborg U. «Role of 06-methylguanine-DNA methyltransferase, glutathione transferase M3-3 and glutathione in resistance to carmustine in a human non-small cell lung cancer cell line».

33. Eur J Cancer 1997; 33(3): 447-52.

34. Ejendal K.F., Hrycyna C.A. «Multidrug resistance and cancer: the role of the human ABC transporter ABCG2». Curr Protein Pept Sci 2002; 3(5): 503-11.

35. Fojo A.T., Ueda K., Slamon D.J., Poplack D.G., Gottesman M.M., Pastan I. «Expression of a multidrug-resistance gene in human tumors and tissues». Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:265 -269.

36. Giaccia A.J., Kastan M.B. «The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals». Genes Dev 1998; 12(19): 2973-83.

37. Goldstein L.J., GalskiH., FojoA., Willingham M„ Lai S.L., Gazdar A., Pirker R., Green A., Crist W., Brodeur G.M. et al. «Expression of a multidrug resistance gene in human cancers». J Natl Cancer Inst 1989; 81(2): 116-24.

38. Grant C.E., Valdimarsson G., Hipfner D.R., Almquist K.C., Cole S.P., Deeley R.G. «Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs». Cancer Res 1994; 54(2): 357-61.

39. Gros P., Croop J., Housman D. «Mammalian multidrug resistance gene: complete cDNA sequence indicates strong homology to bacterial transport proteins». Cell 1986; 47:371 -380.

40. Guo W„ Healey J.H., Meyers P.A., Ladanyi M„ Huvos A.G., Bertino J.R., Gorlick R. «Mechanisms of methotrexate resistance in osteosarcoma». Clin Cancer Res 1999; 5(3): 621-7.

41. Hector S., Bolanowska-Higdon W., Zdanowicz J., Hitt S„ Pendyala L. «In vitro studies on the mechanisms ofoxaliplatin resistance». Cancer Chemother Pharmacol 2001; 48(5): 398-406.

42. Higgins C.F. «АВС-transporters: from microorganisms to man». Annu Rev Cell Biol 1992; 8: 67-113.

43. Hipfner D.R., Deeley R.G., Cole S.P. «Structural, mechanistic and clinical aspects of MRP1». -Biochim Biophys Acta 1999; 1461: 359-76.

44. Hipfner D.R., Deeley R.G., Cole S.P. «Structural, mechanistic and clinical aspects of MRP1». -Biochim Biophys Acta 1999; 1461: 359 -376.

45. Hirohashi Т., Suzuki H., Sugiyama Y «Characterization of the transport properties of cloned rat multidrug resistance-associated protein 3 (MRP3)». J Biol Chem 1999; 274: 15181-5.

46. Hooijberg J.H., Broxterman H.J., Kool M„ Assaraf Y.G., Peters G.J., Noordhuis P., Scheper R. J., Borst P., Pinedo H.M., Jansen G. «Antifolate resistance mediated by the multidrug resistance proteins MRP1 and MRP2». Cancer Res 1999; 59:2532 -2535.

47. Jedlitschky G., Leier /., Buchholz U„ Barnouin K, Kurz G„ Keppler D. «Transport of glutathione, glucuronate, and sulfate conjugates by the MRP gene-encoded conjugate export pump».- Cancer Res 1996; 56: 988-94.

48. Jedlitschky G., Leier I., Buchholz U„ Center M, Keppler D. «АТР-dependent transport of glutathione S-conjugates by the multidrug resistance-associated protein». Cancer Res 1994; 54: 4833-6.

49. Kast C., Gros P. «Epitope insertion favors a six transmembrane domain model for the carboxy-terminal portion of the multidrug resistance-associated protein». Biochemistry 1998; 37:2305 -2313.

50. Kawasaki M, Nakanishi Y., Kuwano К, Takayama K, Kiyohara С., Hara N. «Immunohistochemically detected p53 and P-glycoprotein predict the response to chemotherapy in lung cancer». Eur J Cancer 1998; 34(9): 1352-7.

51. Klein I., Sarkadi В., Varadi A. «An inventory of the human ABC proteins». Biochim Biophys Acta 1999; 1461:237-262.

52. Kokkinakis D.M., Ahmed M.M., Delgado R., Fruitwala M.M., Mohiuddin M., Albores-Saavedra J. «Role of 06-methylguanine-DNA methyltransferase in the resistance of pancreatic tumors to DNA alkylating agents». Cancer Res 1997; 57(23): 5360-8.

53. Konig J., Nies A.T., Cui Y, Leier I., Keppler D. «Conjugate export pumps of the multidrug resistance protein (MRP) family: localization, substrate specificity, and MRP2-mediated drug resistance». Biochim Biophys Acta 1999; 1461: 377-94.

54. Kreisholt J., Sorensen M, Jensen P.В., Nielsen B.S., Andersen C.B., Sehested M. «Immunohistochemical detection of DNA topoisomerase Ilalpha, P-glycoprotein and multidrug resistance protein (MRP) in small-cell and non-small-cell lung cancer».

55. Br J Cancer 1998; 77(9): 1469-73.

56. Lazaris A.C., Kavantzas N.G., Zorzos H.S., Tsavaris N.V., Davaris P.S. «Markers of drug resistance in relapsing colon cancer». J Cancer Res Clin Oncol 2002; 128(2): 114-8.

57. Leier /., Jedlitschky G„ Buchholz U„ Cole S.P., Deeley R.G., Keppler D. «The MRP gene encodes an ATP-dependent export pump for leukotriene C4 and structurally related conjugates». J Biol Chem 1994; 269: 27807-10.

58. Litman Т., Brangi M., Hudson E„ Fetsch P., Abati A., Ross D., Miyake K„ Resau J., Bates S. «The multidrug-resistant phenotype associated with overexpression of the new ABC half-transporter, MXR (ABCG2)». J Cell Sci 2000; 113(11): 2011 - 2021.

59. Lockhart A.C., Tirona R.G., Kim R.B. «Pharmacogenetics of ATP-binding cassette transporters in cancer and chemotherapy». Mol Cancer Ther 2003; 2(7): 685-98.

60. Loe D. W„ Deeley R. G„ Cole S.P. «Biology of the multidrug resistance-associated protein, MRP». Eur J Cancer 1996; 32A(6): 945-57.

61. Maliepaard M„ van Gastelen M.A., Tohgo A. et al. «Circumvention of breast cancer resistance protein (BCRP)-mediated resistance to camptothecins in vitro using non-substrate drugs or the BCRP inhibitor GF120918». Clin Cancer Res 2001; 7(4): 935 - 941.

62. Merkel D.E., Fuqua S.A., TandonA.K., Hill S.M., Buzdar A.U., McGuire W.L. «Electrophoretic analysis of 248 clinical breast cancer specimens for P-glycoprotein overexpression or gene amplification». J Clin Oncol 1989; 7(8): 1129-36.

63. Michaelis S„ Berkower C. «Sequence comparison of yeast ATP binding cassette (ABC) proteins». Cold Spring Harbor Symposium in Cold Spring Harbor, NY, 1995.

64. Michaelis S. «STE6, the yeast a-factor transporter». Sem Cell Biol 1993; 4:17-27

65. Miyake K., Mickley L., hitman T. et al. «Molecular cloning of cDNAs which are highly overexpressed in mitoxantrone-resistant cells: demonstration of homology to ABC transport genes». -Cancer Res 1999; 59:8-13.

66. Nikaido H., HallJ.A. «Overview of bacterial ABC transporters». Methods Enzymol 1998; 292:3 -20.

67. Res 1997; 57(19): 4285-4300.

68. Paulusma C.C., BosmaP.J., Zaman G.J.R., Bakker C.T.M., Otter M., Scheffer G.L., Scheper R.J., Borst P., Oude Elferink R.P.J. «Congenital jaundice in rats with a mutation in a multidrug resistance-associated protein gene». Science 1996; 271:1126-1128.

69. Perego P., De Cesare M., De Isabella P. «А novel 7-modified camptothecin analog overcomes breast cancer resistance protein-associated resistance in a mitoxantrone-selected colon carcinoma cell line». -Cancer Res 2001; 61: 6034 6037.

70. Pommier Y., Leteurtre F., Fesen M.R., Fujimori A., Bertrand R„ Solary E„ Kohlhagen G., Kohn K. W. «Cellular determinants of sensitivity and resistance to DNA topoisomerase inhibitors». Cancer Invest 1994; 12(5): 530-42.

71. Punzi J.S., Duax W.L., Strong P., Griffin J.F., Flocco M.M., Zacharias D.E., Carrell H.L., Tew K.D., Glusker J.P. «Molecular conformation of estramustine and two analogues». Mol Pharmacol 1992; 41(3): 569-76.

72. Qin В. and McClarty G. «Effect of 6-thioguanine on Chlamydia trachomatis growth in wild-type and hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase-deficient cells». J Bacteriol. 1992; 174 (9): 2865-2873.

73. Rosenberg M.F., Callaghan R., Ford R.C., Higgins C.F. «Structure of the multidrug resistance P-glycoprotein to 2.5 nm resolution determined by electron microscopy and image analysis». J Biol Chem 1997; 272:10685 -10694.

74. Sanfilippo 0., Ronchi E., De Marco C., Di Fronzo G., Silvestrini R. «Expression of P-glycoprotein in breast cancer tissue and in vitro resistance to doxorubicin and vincristine». Eur J Cancer 1991; 27(2): 155-8.

75. Sauerbrey A., Sell W„ Steinbach D„ Voigt A., Zintl F. «Expression of the BCRP gene (ABCG2/MXR/ABCP) in childhood acute lymphoblastic leukaemia». Br J Haematol 2002; 118: 147- 150.

76. Schinkel A.H. «The physiological function of drug-transporting Р-glycoproteins». Semin Cancer Biol 1997; 8:161 -170.

77. Schisselbauer J.C., Silber R, Papadopoulos E„ Abrams K., LaCreta F.P., Tew K.D. «Characterization of glutathione S-transferase expression in lymphocytes from chronic lymphocytic leukemia patients». Cancer Res 1990; 50(12): 3562-8.

78. Schneider J., Bak M., Efferth Т., Kaufmann M., Mattern J., Volm M. «P-glycoprotein expression in treated and untreated human breast cancer». Br J Cancer 1989; 60(6): 815-8.

79. Schuetz J.D., Connelly M.C., Sun D., Paibir S.G., Flynn P.M., Srinivas R. V. et al. «MRP4: a previously unidentified factor in resistance to nucleoside-based antiviral drugs». Nat Med 1999; 5: 1048-51.

80. Schwarzenbach H. «А diagnostic tool for monitoring multidrug resistance expression in human tumor tissues». Anal Biochem 2002; 308(1): 26-33.

81. Shen H., Kauvar L., Tew K.D. «Importance of glutathione and associated enzymes in drug response». Oncol Res 1997; 9(6-7): 295-302.

82. Sinha B.K., Mimnaugh E.G., Rajagopalan S„ Myers C.E. «Adriamycin activation and oxygen free radical formation in human breast tumor cells: protective role of glutathione peroxidase in adriamycin resistance». Cancer Res 1989; 49(14): 3844-8.

83. Stambolic V, Suzuki A., de la PompaJ.L., Brothers G.M., Mirtsos C., Sasaki Т., Ruland J., Penninger J.M., Siderovski D.P., Мак T.W. «Negative regulation of PKB/Akt-dependent cell

84. Survival by the tumor supressor PTEN». Cell 1998; 95(1): 29-39.

85. Steinbach D„ Sell W., Voigt A. et al. «BCRP gene expression is associated with a poor response to remission induction therapy in childhood acute myeloid leukemia». Leukemia 2002; 16: 1443 - 1447.

86. Sugawara /., Akiyama S., Scheper R.J., Itoyama S. «Lung resistance protein (LRP) expression in human normal tissues in comparison with that of MDR1 and MRP». Cancer Lett 1997; 112(1): 23-31.

87. Thiebaut F., Tsuruo Т., Hamada H., Gottesman M.M., Pastan I., Willingham M.C. «Cellular localization of the multidrug-resistance gene product P-glycoprotein in normal human tissues». Proc Natl Acad Sci USA 1987; 84:7735 -7738.

88. Volk E.L., Farley K.M., Wu Y., Li F„ Robey R. W., Schneider E. «Overexpression of wild-type breast cancer resistance protein mediates methotrexate resistance». Cancer Res 2002; 62(17): 5035 -5040.

89. Wijnholds J., Mol C.A., van Deemter L., de Haas M, Scheffer G.L., Baas F. et al. «Multidrug-resistance protein 5 is a multispecific organic anion transporter able to transport nucleotide analogs». Proc Natl Acad Sci U S A 2000; 97: 7476-81.

90. Wishart G.C., Plumb J.A., Going J. J., McNicolA.M., McArdle C.S., Tsuruo Т., Kaye S.B. «Р-glycoprotein expression in primary breast cancer detected by immunocytochemistry with two monoclonal antibodies». Br J Cancer 1990; 62(5): 758-61.

91. Yokoyama H., Ishida Т., Sugio K., Inoue Т., Sugimachi K. «Immunohistochemical evidence that P-glycoprotein in non-small cell lung cancers is associated with shorter survival». Surg Today 1999; 29(11): 1141-7.