Количественное определение микробных сообществ полости рта с использованием хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Струкова, Елена Геннадьевна

• Струкова, Елена Геннадьевна
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Струкова, Елена Геннадьевна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Применение метода масс-спектрометрии микробных маркеров (МСММ) для идентификации микроорганизмов в биологических объектах

1.2. Природные антимикробные средства - эфирные масла, получение, химический состав

1.3. Бактерицидная активность эфирных масел

1.4. Антиоксидантная активность эфирных масел

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Оборудование

2.2. Материалы

2.3. Методы

2.3.1. Анализ химических маркеров микроорганизмов слизистой оболочки полости рта

2.3.2. Определение метрологических характеристик

2.3.3. Получение эфирных масел б

2.3.4. Определение состава эфирных масел по масс-спектрам и линейным индексам удерживания

2.3.5. Определение бактерицидной активности эфирных масел по отношению к чистым культурам микроорганизмов

2.3.6. Хроматографическое изучение антиоксидантной активности эфирных масел

2.3.7. Оценка эффективности бактерицидного действия эфирного масла на микробиоту полости рта

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Хромато-масс-спектрометрическое исследование химических маркеров микроорганизмов слизистой оболочки полости рта

3.2. Метрологические характеристики аналитической методики определения химических маркеров микроорганизмов

3.3. Химический состав эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона

3.4. Бактерицидная активность эфирных масел по отношению к чистым культурам микроорганизмов

3.5. Антиоксидантная активность эфирных масел

3.6. Количественная оценка эффективности бактерицидного действия эфирного масла пихты сибирской на микробиоту слизистой оболочки полости рта

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Количественное определение микробных сообществ полости рта с использованием хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров»

Актуальность.

Газовая хроматография используется во многих областях медицины и биологии: в экологии для определения содержания вредных примесей в воздухе, воде и пищевых продуктах: в токсикологии и судебной медицине - для диагностики отравлений техническими жидкостями (хлорпроизводными углеводородов, алкоголем и его суррогатами) и пестицидами самой различной структуры: в фармакологии и фармации для контроля качества препаратов, исследования метаболизма лекарственных средств [1 - 2].

Применение газовой хроматографии в исследовании биополимеров стало возможным после разработки методов расщепления липидов, углеводов и белков до более простых компонентов и превращение их в летучие соединения открыли широкую область применения метода в биохимическом анализе [3].

В исследовании липидов, в особенности жирных кислот, газовая хроматография произвела настоящую революцию и до настоящего времени не имеет альтернативы. Первым анализом, выполненным с помощью газовой хроматографии, стало определение Джеймсом и Мартином карбоновых кислот. В процессе метаболизма микробные клетки производят низшие карбоновые кислоты, причем набор кислот является как бы визитной карточкой того или иного микроорганизма [4-5].

Например, хотя культурально-биохимическим методом можно определять любые известные микроорганизмы, однако при рутинных клинических анализах оказывается практически не реальным оценить вклад трудно культивируемых микроорганизмов, прежде всего - анаэробов в инфекционно-воспалительном процессе из-за дороговизны и длительности процедуры. Иммуно-серологический метод является непрямым, поскольку выявляет не возбудителя, а иммунный ответ на него, который может иметь индивидуальные вариации. Известные молекулярно-биологические методы, при несомненных преимуществах - прямое определение возбудителя, высокие 5 специфичность и чувствительность, универсальность, скорость, возможность диагностики хронических и латентных инфекций — имеют такие серьезные недостатки, как частые ложноположительные результаты и невозможность адекватной количественной оценки [6, 7, 8].

Однако существует альтернативный способ определения микробных сообществ методом хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров. В основе метода лежит высокоточное определение специфических маркерных молекул, входящих в состав клеточных липидов микроорганизмов. Метод представляет собой идентификацию микробных сообществ по специфическим жирным кислотам методом хромато-масс-спектрометрии по селективным ионам [9].

Высокочувствительный и селективный метод газовой хроматографии -масс спектрометрии (ГХ-МС) позволяет одновременно измерять концентрации более сотни микробных маркеров непосредственно в анализируемом материале: крови, моче, биоптатах и других биологических жидкостях и тканях, а также в небиологических пробах, минуя стадии предварительного посева на питательные среды или использование тестовых биохимических материалов [10].

Метод хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров является самым информативным и быстрым для оценки воздействия на большое количество микробных сообществ, например для оценки воздействия антимикробных средств на микробиоту. Существуют работы по оценке микробных сообществ методом хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров в различных экологических объектах [11, 12, 13], подробно исследована микробиота слизистой кишечника при различных заболеваниях [14, 15, 16], микроэкология кишечника и кожи [ 17, 18, 19, 20, 21, 22]. Метод разрешен Росздравнадзором для применения в качестве новой медицинской технологии (Разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).

В данной работе проведен ряд исследований по созданию методики определения химических маркеров микроорганизмов в слизистой оболочке 6 полости рта. Полость рта населена определенной микробиотой, которая несет защитные функции. Микробиота ротовой полости первой встречается с микроорганизмами и вирусами, попадающими в ротовую полость извне, и не пропускает их во внутреннюю среду, является показателем уровня «защитного порога» организма человека. Таким образом, слизистая оболочка ротовой полости является доступным объектом исследования и может использоваться для экспресс-диагностики ряда заболеваний.

Ротовая полость густо заселена микроорганизмами, причем распределение микроорганизмов различно в зависимости от места локализации (миндалины, защечные пазухи, язык, зев) [23]. Слизистая оболочка полости рта является интересным объектом исследования, микробиота имеет большое количественное и видовое разнообразие. Микробная популяция полости рта выполняет двоякое значение: с одной стороны — роль биологического барьера, с другой потенциального резервуара аутоинфекции. Возможности проявления как защитных свойств этими микроорганизмами, так и их патогенности определяются состоянием всего организма и тканей полости рта [24, 25].

Цель работы - создание методики хромато-масс-спектрометрического определения микроорганизмов по химическим маркерам в биологическом объекте с возможностью контроля подавления роста микроорганизмов эфирными маслами.

Задачи исследования:

1. Исследовать химические продукты метаболизма микроорганизмов (карбоновые кислоты, альдегиды, стерины, стеролы) населяющих слизистую оболочку полости рта и оценить возможности их использования в качестве специфичных маркеров микроорганизмов.

2. Разработать методику хромато-масс-спектрометрического определения состава микроорганизмов слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров и провести оценку ее метрологических характеристик.

3. Определить химический состав эфирных масел растений Сибирского региона по данным хромато-масс-спектрометрического анализа с целью прогнозирования их бактерицидных свойств и выявления в них потенциально токсичных компонентов.

4. Оценить бактерицидную активность исследуемых эфирных масел при их прямом воздействии на чистые тест-культуры некоторых условно-патогенных микроорганизмов с использованием классического биохимического метода.

5. Оценить антиоксидантную активность исследуемых эфирных масел по продуктам реакции ингибирования автоокисления низших альдегидов с использованием метода хромато-масс-спектрометрии.

6. Исследовать возможности разработанной методики хромато-масс-спектрометрического определения состава микроорганизмов на слизистой оболочки полости рта, для контроля подавления роста микроорганизмов эфирными маслами (оценки их бактерицидной активности).

Научная новизна полученных в работе результатов заключается в следующем:

1. Предложен способ определения микроорганизмов слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию химических микробных маркеров с использованием данных хромато-масс-спектрометрического анализа.

2. Установлена специфичная взаимосвязь между наличием определенных микроорганизмов, населяющих слизистую оболочку полости рта, и количественным составом выбранных химических маркеров.

3. Установлено влияние химического состава эфирных масел ряда дикорастущих растений Сибирского региона на их бактерицидную и антиоксидантную активность.

4. Предложено использование разработанного способа хромато-масс-спектрометрического определения микроорганизмов по количественному содержанию химических маркеров для контроля подавления роста микроорганизмов эфирными маслами. 8

Практическая значимость

Разработана методика, позволяющая определить состав микробного сообщества слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров с возможностью последующей оценки бактерицидной активности эфирных масел методом хромато-масс-спектрометрии, и оценены ее метрологические характеристики.

Создан электронный банк аналитических данных, содержащий масс-спектры электронного удара и хроматографические индексы удерживания по 157 соединениям - основным компонентам эфирных масел. Получены данные по антиоксидантной активности эфирных масел ряда дикорастущих растений Сибирского региона.

Определена минимальная бактерицидная концентрация этих эфирных масел по отношению к грамотрицательным и грамположительным условно-патогенным микроорганизмам.

Показана эффективность бактерицидного воздействия эфирного масла пихты сибирской на микрофлору слизистой оболочки полости рта лиц с хроническими заболеваниями верхних дыхательных путей, оцененное по результатам хромато-масс-спектрометрического анализа химических маркеров микроорганизмов.

Все данные, полученные в работе, имеют многоцелевой характер и могут быть востребованы для прогноза воздействия эфирных масел на здоровье человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Специфические химические маркеры микроорганизмов населяющих слизистую оболочку полости рта.

2. Методику хромато-масс-спектрометрического определения состава микрорганизмов микробного сообщества слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров и ее метрологические характеристики.

2. Компонентный химический состав эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона: пихты сибирской, сосны сибирской, дягиля лекарственного, мяты перечной, мелиссы лекарственной, укропа пахучего, тимьяна енисейского.

3. Бактерицидная активность эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона к чистым тест-культурам некоторых условно-патогенных микроорганизмов.

4. Антиоксидантная активность исследованных эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона, оцененная по продуктам реакции ингибирования автоокисления транс-2-гексеналя с использованием метода хромато-масс-спектрометрии.

5. Бактерицидное действие эфирного масла пихты сибирской на микроорганизмы слизистой оболочки полости рта путем отслеживания содержания химических маркеров микроорганизмов по хромато-масс-спектрометрическим данным.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на научных конференциях: на IV Всероссийской научной конференции «Новые достижение в химии и химической технологии растительного сырья» (2009 г., г. Барнаул), на III и IV научно-практической конференции «Химическая наука и образование Красноярья» (2009 г. и 2010 г., г. Красноярск), на Международной конференции «Экологии Южной Сибири и сопредельных территорий» (2009 г., г. Абакан), на симпозиуме с международным участием «Питание в профилактике социально-значимых заболеваний» (2009 г., г. Красноярск), на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2010» (2010 г., г. Москва, Съезд аналитиков России «Аналитическая химия — новые методы и возможности», (2010 г., г. Москва), на Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (2010 г., г. Краснодар).

Работа выполнена на кафедре аналитической и органической химии и в в лаборатории хроматографических методов анализа Центра коллективного пользования Сибирского Федерального Университета.

По материалам диссертации опубликовано 16 работ, в том числе — 3 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Струкова, Елена Геннадьевна

выводы

1. Исследованы хромато-масс-спектрометрические характеристики (времена удерживания и масс-спектры электронного удара) для специфических химических маркеров микроорганизмов населяющих слизистую оболочку полости рта, установлен качественный и количественный состав микробиоты включающий себя 32 микроорганизма.

2. Разработана методика хромато-масс-спектрометрического определения состава микроорганизмов микробного сообщества слизистой оболочки полости рта по количественному содержанию специфичных химических микробных маркеров (жирных кислот, альдегидов, стеринов) и проведена оценка ее метрологических характеристик (линейный диапазон, повторяемость, точность, предел количественного определения и внутрилабораторная прецизионность).

3. Исследован химический состав использованных в работе эфирных масел дикорастущих растений Сибирского региона, создан электронный банк аналитических данных, содержащий масс-спектры электронного удара и хроматографические индексы удерживания по 157 соединениям, являющимся основными компонентами эфирных масел.

4. Изучена бактерицидная активность использованных в работе эфирных масел в зависимости от их концентрации по отношению к тест-культурам условно-патогенных микроорганизмов с использованием биохимического метода (путем) серийных разведений в бульоне. Установлено, что некоторые эфирные масла имеют бактерицидную концентрацию в 6-8 раз ниже значения фенольного коэффициента.

5. Установлено, что в случае модельной реакции автоокисления транс-2- -гексеналя использованные в работе эфирные масла при концентрациях выше 25 мкг/мл обладают антиоксидантной активностью, которая достигает 97-98%, что свидетельствует о положительном воздействии эфирного масла при применении в ингаляциях.

144

6. Показана эффективность разработанной методики на примере изучения бактерицидной активности эфирного масла пихты сибирской к микробиоте слизистой оболочки полости рта, путем отслеживания содержания химических маркеров микроорганизмов по хромато-масс-спектрометрическим данным. Выявлено, что ингаляции эфирным маслом пихты сибирской приводит к снижению концентрации некоторых микроорганизмов {Streptococcus mutans, Streptococcus, Eubacterium moniliforme, Propionibacterium freudenreichii, Lactobacillus, Clostridium ramosum), не изменяя состава нормальной микробиоты полости рта, способствует повышению защитного порога организма.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Струкова, Елена Геннадьевна, 2010 год

1. Хроматография в биологии и медицине: сб. научн. трудов / под ред.

2. Р.Т. Тогузова, М.И. Савиной. Москва: 2-й МОЛГМИ им. Н.И. Пирогова, 1985. — 158 с.

3. Яворская, С.Ф. Газовая хроматография — метод определения вредных веществ в воздухе и биологических средах: С. Ф. Яворская. М.: Медицина, 1972. - 236 с.

4. Митрука, Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине: Пер. с англ. / Б. М. Митрука. М.: Медицина, 1978. - 600 с.

5. Зеленин, К.Н. Газовая хроматография в медицине / К. Н. Зеленин // Соросовский образовательный журнал. — 1996. — № 11. — С. 20 — 22.

6. Литвинов, Л.Д. Газовая хроматография в биологии и медицине: Л. Д. Литвинов, Б. А. Руденко. М.: Медицина, 1971. - 280 с.

7. Persing, D. Н. Polymerase chain reaction: trenches to benches / D. H. Persing // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29, № 7. - p. 1281 - 1285.

8. Пат. 2086642 Российская Федерация, C12N 1/00, 1/20, C12Q 1 /4. Способ определения родового (видового) состава ассоциации микроорганизмов / Г. А. Осипов ; Приоритет от 24 дек. 1993г.

9. Осипов, Г. А. Хромато-масс-спектрометрическое обнаружение микроорганизмов в анаэробных инфекционных процессах / Г. А. Осипов, А. М. Демина // Вестник РАМН. 1996. - Т. 13, №2. - С. 52 - 59.

10. Турова, Е. С. Изучение структуры микробного сообщества, активного в биотрансформации минералов железа в каолине / Е. С. Турова, Г. А. Осипов // Микробиология. 1996. - Т. 65, № 5. - С. 682 - 689.

11. Ручкина, И. Н. Роль острых кишечных инфекций и нарушений микробиоценоза в этиологии и патогенезе синдрома раздраженного кишечника: Диссертация доктора медицинских наук: 14.00.07 / Ручкина Ирина Николаевна. М., 2005. - 318 с.

12. Полеско, И. В. Клинико-патогенетические аспекты десквамативных поражений кожи: Диссертация доктора медицинских наук: 14.00.11 / Полеско Ирина Васильевна. М., 2009. - 169 с.

13. Ionescu, G. Abnormal fecal microflora and malabsorption phenomena in atopic eczema patients / G. Ionescu, R. Kiehl, L. Ona, R. Schüler // J. Adv. Med. 1990.-3.-p. 71-89.

14. Полеско, И. В. Спектрометрическое исследование состава микроорганизмов кишечника у больных себорейным дерматитом / И. В. Полеско, Ю. С. Бутов, Г. А. Осипов, В. В. Малиновская // Рос. журн. кож. и вен. бол. 2006. - № 3. - С. 23 - 27.

15. Ипатова, М. Г. Значение микробного фактора в развитии воспалительных заболеваний кишечника у детей / М. Г. Ипатова, Г. А. Осипов, С. С. Хромова // Четырнадцатая российская гастроэнтерологическая неделя. — Москва. — октябрь 2009. С. 29 — 32.

16. Парфенов, А. И. Коррекция микрофлоры кишечника пробиотиками у больных антибиотико-ассоциированной диареей / А. И. Парфенов, И. Н. Ручкина, Г. А. Осипов // Справочник поликлинического врача. — Т. 4. -№2.-2006.-С. 85-91.

17. Захаров, А. А. Анализ микрофлоры ротовой полости обследованных людей с различными заболеваниями / А. А. Захаров, Н. А. Ильина // Успехи современного естествознания. 2007. - № 12. - С. 353 - 355.

18. Хуснутдинова, JI.M. Микрофлора слизистой оболочки миндалин человека в норме при патологии / JL М. Хуснутдинова // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. — 2006. — №1. — С.60-63.

19. Chemical Methods in Bacterial Systematics: Eds M. Goodfellow. D.E. Minnikin. New York.: Academic Press. — 1985. — 410 c.

20. Осипов Г. А. Хромато-масс-спектрометрическое исследование микроорганизмов и их сообществ: Диссертация доктора биологических наук: 03.00.07 / Осипов Георгий Андреевич. — М., 1995. — 243 с.

21. Moss, С. W. Identification of microorganisms by gas chromatographic -mass spectrometric analysis of cellular fatty acids / C. W. Moss, S. R. Dees // ^Chromatography. 1985. - Vol.12. - P. 595 - 604.

22. Jantzen, E.Whole-cell and lipopolysaccharide fatty acids and sugars of gramnegative bacteria in Chem. methods in bacterial systematics: E. Jantzen, K. Bryn. NY.: Acad. Press. - 1985. - p. 145 - 172.

23. Andreev, L. V. Peculiarities of fatty acid composition of the genus Caulobacter/ L. V. Andreev, V. N. Akimov, D. I. Nikitin // Folia Microbiol -1986 Vol. 31 — p. 144- 153.

24. Вейант, Р. Определитель нетривиальных патогенных грамотрицательных бактерий: Пер. с англ. / У. Мосс, Д. Холлис, Дж. Джордан, Э. Кук, М. Дейншвар. М. Мир, 1999. - с. 612 - 783.

25. Morgan, S.L. Profiling, structural characterization, and trace detection of chemical markers for microorganisms by gas chromatography mass spectrometry/ S. L. Morgan, A. Fox, J. Gilbart // J.Microbiol. Methods. -1989.-Vol. 9.-P. 57-69.

26. Larsson, L. Determination of microbial chemical markers by gas chromatography-mass-spectrometry potential for diagnosis and studies on metabolism in situ.// APMIS. - 1994. - 102. 3. - P. 161 - 169.

27. Maitza, S. K. Defermination of lipid A and endotoxin in serum by mass-spectroscopy / S. K. Maitza, M. C. Schotz, Т. T. Yoshikawa, L. B. Guze // Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 1978. - V.75. -P.3993.

28. Brandtzaeg, P. Meningococcal endotoxin in lethal septic shock plasma studied by gas chromatography, mass-spectrometry, ultracentrifugation and electron microscopy / P. Brandtzaeg, K. Bryn, P. Kierulf // J.Clin.Investig. 1992. -89.- P. 816-823.

29. Sud, I. J. Detection of 3-hydroxy fatty acids of picogram levels in biologic specimens. A chemical method for the detection of Neisseria gonorrhoael / I. J. Sud, D.S. Feingold // The Journal of Investigative Dermatology. — 1979. -V.73.-P. 521 -526.

30. Bronds, J. Chemotaxonomy at a crossroads? Gas chromatographic analysis of a single colony from the bacterium Haemophylus aphrophilus / J. Bronds, J. Olsen//J.Chrom.,Biomed.Appl. 1986. -Vol.374. -№1.- P. 119-124.

31. Larsson, L. Determination of ergosterol in organic dust by gas chromatography-mass spectrometry/ Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications // L. Larsson, A. Saraf, B. O. Axelsson. - 1995. - 666.1. - P. 77 - 84.

32. Larsson, L. Use of gas chromatography-ion trap tandem mass spectrometry for the detection and characterization of microorganisms in complex samples / L. Larsson, A. Saraf // Mol. Biotechnol. 1997. - 7.3. - P. 279 - 287.

33. Ferrando, R. 3-Hydroxy fatty acids in saliva as diagnostic markers in chronic periodontitis / R. Ferrando, B. Szponar, A. Sanchez, L. Larsson, and Valero-Guillen PL. // J Microbiol Methods. 2005. - Vol. 62. - 3. - P. 285 - 291.

34. Brondz, J. Microbial chemotaxonomy. Chromatography, electrophoresis and relevant profiling techniqnes / J. Brondz, J. Olsen // J. Chrom., Biomed. Appl. 1986.-Vol. 379.-P.367-411.

35. Goodfellow, M. Chemical methods in Procariotic Systematics: M. Goodfellow, A. G. O'Donnell. 1994. - UK.:John Willey and Sons. - P. 375411.

36. Stead, D. E. Evaluation of a commercial microbial identification system based on fatty acid profiles for rapid, accurate identification of plant pathogenic bacteria / D. E. Stead, J. E. Sellwood, J. Wilson, // J.Appl.Bacteriol. 1992. -72.- P. 315-321.

37. Nichols, P. D. Measurement of methanotroph and methanogen signature phospholipids for use in assessment of biomass and community structure in model system / P. D. Nichols, C. A. Mancuso, D. C. White // Org.Geochem. -1987. Vol. 11. - №6. - P. 451 - 462.

38. Shekhovtsova, N. V. Analysis of lipid biomarkers in rocks of the Archean crystalline basement / N. V. Shekhovtsova, G. A. Osipov, N. V. Verkhovtseva, L. A. Pevzner // Proceedings of SPIE. 2003. - Vol.4939. - P. 160 - 168.151

39. Schaechter, M. Mechanisms of Microbial Disease/ M. Schaechter, G. Medoff, B. J. Eisenstein // Williams & Wilkins. 1993. - P. 699.

40. McNabb, A. Fatty acid characterization of rapidly growing pathogenic aerobic actinomycetes as a means of identification / A. McNabb, R. Shuttleworth, R. Behme, W. D. Colby // J. Clin. Microbiol. 1997. - 35. - P. 1361 - 1368.

41. Manual of Clinical Microbiology. 5-th ed. Editor in Chief Albert Balows. -Washington: 1991.-P. 317-318.

42. Hattori, M. The Human Intestinal Microbiome / M. Hattori, T. D. Taylor //A New Frontier of Human Biology DNA RESEARCH. 2009. - №16. - P. 112.

43. Tsuchiya, H. Fligh-Perfomance Liquid Chromatographic analysis of bacterial fatty acid composition for chemotaxonomic characterization of oral streptococci / H. Tsuchiya, S. Masara, M. Kato // J. Clin.Microbiol. 1986. -Vol. 24.-№i.81 -85.

44. Томников, А. Ю. Микрофлора полости рта: учеб. методич. пособие / А. Ю. Томников, В. И. Корженевич ; Самара. — Самарский Государственный Университет. — 1996. — 17 с.

45. Николаев, Ю.А. Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю. А. Николаев, В. К. Плакунов // Микробиология. 2007. - Т. 76. - №. 2. - С. 149-163.

46. Медицинская микробиология : учеб. пособие для студ. мед. вузов ; под. ред. В. И. Покровского, О. К. Поздеева; Москва: ГЭОТАР МЕДИЦИНА. -1998.- 1200 с.

47. Шлегель, Г. Общая микробиология: Пер. с нем. / Г. Шлегель. М.: Мир. 1987-567 с.

48. Иоргенсен, Дж. X. Микробиологический справочник для клиницистов : Пер. с англ. / Дж. X. Йоргенсен, М. А. Пфайлер. М.: Мир. - 2006. - 243 с.

49. Janssen, А. М. Antimicrobial activities of essential oils / A. M. Janssen, J. J. Scheffer, A. Baerheim Svendsen // Pharmacy World & Science. — 2005. — №2. -P. 193 -197.

50. Faleiro, M.L., Antimicrobal activity of essential oils isolated from Portugese endemic species of THYMUS / Letters in Applied Microbiology // M. L. Faleiro, M. G. Miguel. 2003. - P. 35 - 40.

51. Sartoratto, Adilson. Composition and antimicrobial activity of essential oils from aromatic plants sed in Brazil / Adilson Sartoratto, Ana Lucia M. Machado, Camila Delarmelina // Brazilian Journal of Microbiology. 2004. -№35.-P. 275-280.

52. Hammer, K. A. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts / K. A. Hammer, C. F. Carson , T. V. Riley // J. Appl. Microbiol. 1999. -Vol. 86. - №6. - P. 985 - 990.

53. Inouye, S. Antibacterial activity of essential oils and their major constituents against respiratory tract pathogens by gaseous contact / S. Inouye, T. Toshio,

54. Yamaguchi // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. — 2001. — 47. — P. 565 -573.

55. Tabanca, N. Composition and antimicrobial activity of the essential oil of origanum&times / N. Tabanca, F. Demirci, T. Ozek //Chemistry of Natural Compounds.-2001.-37.-P. 238-241.

56. Beatriz, L. Antimicrobal activity of extracts, essential oil and metabolites obtained from Tagetes Mendocina / L. Beatriz // Journal of the Chilean Chemical Society. 2009. - vol.54. - №1. - P. 68 - 72.

57. Ezeugwu, Co. Antimicrobial Activity and Terpenoids of the Essential Oil of hyptis Suaveolens / Co. Ezeugwu, Okunji, R. Dale, M. S. Sanson, Tempesta // Pharmaceutical Biology. 1990. - Vol. 28. - №1. - P. 73 - 76.

58. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел лимона, розового грейпфрута, кориандра, гвоздики и их смесей / Т. А. Мишарина, A. JI. Самусенко // Приют, биохимия и микробиология. 2008. - Т. 44. -№4. - С. 482 - 486.

59. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел. Автоокисление эфирных масел лавра, фенхеля и их смеси с эфирным маслом кориандра / Т. А. Мишарина, А. Н. Полшков //Прикл. биохимия и микробиология. 2005. - Т.41. - №6. - С. 693 - 702.

60. Шутова, А. В. Оценка антиоксидантной активности экстрактов и эфирных масел пряно-ароматических лекарственных растений / А. В. Шутова // Растительные ресурсы. 2007. - Т. 43. - №1. - С. 112 - 125.

61. Лубосандоржиева, П. Б. Содержание биологически активных веществ в некоторых растениях Забайкалья и их антиоксидантная активность / П. Б. Лубосандоржиева // Химия растительного сырья. 2009. - №3. - С. 133 — 137.

62. Шилова, И. В. Антиоксидантная активность экстрактов надземной части лабазника вязолистного / И. В. Шилова, Е. А.Краснов, Е. И.Короткова, М. Г. Нагаев, А. Н. Лукина // Химико-фармацевтический журнал. 2006. - Т. 40.-№12.-С. 22-24.

63. Токин, Б. П. Фитонциды. Эксперимент. Исследования, вопросы теории и практики : Б. П. Токин. — М.: Госкультпросветиздат, 1975. — 176 с.

64. Токин, Б. П. Фитонциды : 2-е изд. / Б. П. Токин. М.: Изд-во АН СССР, 1951.-238 с.

65. Токин, Б. П. Фитонциды, их роль в природе : Б. П. Токин. — JL: Изд-во Ленингр. ун-та, 1957. 158 с.

66. Войткевич, С. А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии : С. А. Войткевич. — М.: Пищевая промышленность, 1999. — 284 с.

67. Ткачев, А. В. Исследование летучих веществ растений : А. В. Ткачев. -Н.: Изд-полиграф. пред. «Офсет», 2008. 969 с.

68. Обухов, А. Н. Дикорастущие лекарственные растения : А. Н. Обухов. -Краснод.: Краснодар, книж. изд-во, 1952. 347 с.

69. Солдатенков, А. Т. Основы органической химии душистых веществ для прикладной эстетики и ароматерапии : А. Т. Солдатенков, H. М. Колядина. М.: ИКЦ Академкнига, 2006. - 240 с.

70. Гринкевич, Н. И. Химический анализ лекарственных растений : Учеб. пособие для фармацевтических вузов / Н. И. Гринкевич, Л. Н. Сафранович. М.: Высш. школа, 1983. - 176 с.

71. Сур, С. В. Методы выделения, идентификации и определения терпеновых соединений / С. В. Сур // Химико-фармацевтический журнал. 1990. - Т. 24. - № 5. - С. 42 - 50.

72. Adams, R. P. Identification of Essention Oil by Gas Chromatography/ R. P. Adams // Mass Spectroscopy. — Allured publishing Corporation. — Illinois. — USA. 1995. -475 P.

73. Joulain, D. Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydracarbons : D. Joulain. -EB.: Verlag, 2001.-658 P.

74. Ткаченко, К. Г. Особенности переработки растительного сырья для увеличения выхода эфирных масел / К. Г. Ткаченко, И. Г. Зенкевич, М. М. Коробова // Растительные ресурсы. 1998. - Т. 34. - №3. - С. 129 -137.

75. Ткаченко, К. Г. Использование растворов неорганических солей для увеличения выхода эфирных масел методом гидродистилляции / К. Г. Ткаченко, И. Г. Зенкевич, М. М. Коробова // Растительные ресурсы. — 1998.-Т. 34. — №3. —С. 107-111.

76. Сур, С. В. Состав эфирных масел лекарственных растений / С. В. Сур // Растительные ресурсы. — 1993. Т.29. - вып.1. - С. 98 - 117.

77. Зюков, Д. Г. Технология и оборудование эфирномасличного производства : Д. Г. Зюков. — М.: Пищевая промышленность, 1979. — 191 с.

78. Pepeljnjaki, S. Antimicrobial activity of juniper berry essential oil (Juniperus communis L., Cupressaceae) / S. Pepeljnjaki, I. Kosalec, Z. Kalo // Acta. Pharm. 2005. - Vol.55. - P. 417-422.

79. Полуэктова, Т. В. Антимикробные свойства противоклиматического сбора / Н. Э. Коломиец, Г. И. Калинкина, М. Т. Джумаева // Бюллетень сибирской медицины. 2006. - Т.2. - С. 122- 125.

80. Малыхина, Т. В. Возможности применения эфирных масел в лечении и профилактике симптомов дисгормональной мастопатии и связанных с ней проблем / Т. В. Малыхина // Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2006. - Т.42. - №2. - С. 202 - 209.

81. Dunning, Trisha. Applying a quality use of medicines framework to using essential oils in nursing practice / Trisha Dunning // Complementary Therapies in Clinical Practice. 2005. - Vol.11. - Issue 3. - P. 172 - 181.

82. Schnaubelt, K. Essential oil therapy according to traditional Chinese medical concepts / K. Schnaubelt // International Journal of Aromatherapy. — 2005. — Vol.15.-Issue 2.-P. 98-105.

83. Wannissorn, B. Antibacterial properties of essential oils from Thai medicinal plants/ B. Wannissorn, S. Jarikasem, T. Siriwangchai, S. Thubthimthed // Fitoterapia. 2005. - Vol.76. - Issue 2. - P. 233 - 236.

84. Mantle, D. Comparison of methods for determination of total antioxidant status: application to analysis of medicinal plant essential oils / D. Mantle, G.156

85. John // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 1998. - Vol.121. - Issue 4. - P. 385 - 391.

86. Hernandez, T. Antimicrobial activity of the essential oil and extracts of Cordia curassavica (Boraginaceae) / M. Canales, B. Teran, M. Canales, B. Teran // Journal ofEthnopharmacology.-2007.-Vol.111.— Issue l.-P. 137—141.

87. Maria, Rota C. Antimicrobial activity and chemical composition of Thymus vulgaris, Thymus zygis and Thymus hyemalis essential oils / Rota C. Maria, A. Herrera, Rosa M. Martinez //Food Control. 2008. - Vol.19. - Issue 7. - P. 681-687.

88. Shunying, Zhu. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oils of Chrysanthemum indicum / Zhu Shunying, Yang Huaidong, Zou Guolin // Journal of Ethnopharmacology. 2005. - Vol.96. - Issues 1-2. — P. 151-158.

89. Jianqing, Yu. Chemical composition and antimicrobial activity of the essential oil of Scutellaria barbata / Yu Jianqing, Lei Jiachuan, Yu Huaidong, Cai Xuan, Zou Guolin // Phytochemistry. 2004. - Vol.65. - Issue 7 - P. 881 -884.

90. Gornemann, T. Antispasmodic activity of essential oil from Lippia dulcis Trev / T. Gornemann, R. Nayal, H. Pertz, F. Melzig // Journal of Ethnopharmacology. -2008.-Vol.117.-Issue 1.-P. 166-169.

91. Воробьёв, А. А. Медицинская и санитарная микробиология : А. А. Воробьёв, Ю. С. Кривошеин, В. П. Широбоков. — М.: Издательский центр «Академия», 2003. 480 с.

92. Ozturk, Suzan. The chemical composition of essential oil and in vitro antibacterial activities of essential oil and methanol extract of Ziziphora persica

93. Bunge / Suzan Ozturk, Sezai Ercisli // Journal of Ethnopharmacology. — 2006. -Vol.106.-Issue 3.-P. 372-376.

94. Skocibusic, M. Antibacterial activity of Achillea clavennae essential oil against respiratory tract pathogens / M. Skocibusic, N. Bezic, V. Dunkic, A. Radonic // Fitoterapia. 2004. - Vol.75. - Issues 7-8. - P. 733 - 736.

95. Braca, A. Chemical composition and antimicrobial activity of Momordica charantia seed essential oil / A. Braca, T. Siciliano, M. D'Arrigo, M. Germano Paola // Fitoterapia. 2008. - Vol.79. - Issue 2. - P. 123 - 125.

96. George ,V. Chemical composition and antimicrobial activity of essential oil from the rhizomes of Amomum cannicarpum / V. George, J. Mathew, B. Sabulal, M. Dan, S. Shiburaj // Fitoterapia. 2006. - Vol.77. - Issue 5. - P. 392-394.

97. Коротяев, А. И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология : учеб. / А. И. Коротяев, Бабичев С.А. Спб.: СпецЛит, 2008. - 767 с.

98. Руководство к практическим занятиям по микробиологии : учеб. пособие / под редакцией Н. С. Егорова. — 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Изд-во МГУ, 1995. 224 с.

99. Tubaro, F. Analysis of plasma antioxidant capacity by competition kinetics / F. Tubaro, A. Ghiselli, P. Rapuzzi, M. Maiorino, F. Ursini // Free Radicals in Biology and Medicine. 1998. - Vol.24. - P. 1228-1234.

100. Lussignoli, S. A microplate-based colorimetric assay of the total peroxyl radical trapping capability of human plasma / S. Lussignoli, M. Fraccaroli, G. Andrioli, G. Brocco, P. Bellavite // Analytical Biochemistry. 1999. - № 269. -P. 38-44.

101. Krasovska, A. Chemiluminescence detection of peroxyl radicals and comparison of antioxydant activity of phenolic compounds / A. Krasovska, D. Rosiak, K. Czkapiak, M. Lukaszewicz // Current topics in Biophysics. — 2000. -Vol.24.-P. 89-95.

102. Cao, G. H. Oxygen Radical Absorbency Capacity Assay for Antioxidants /

103. G. H. Cao, H. M. Alessio, R. G. Cutler // Free Radicals In Biology And Medicine. 1993. - Vol.3. - №14. - P. 303 - 311.

104. Cao, G. H. Automated-Assay of Oxygen Radical Absorbency Capacity with the Cobas Fara-Ii / G. H. Cao, C. P. Verdon, A. H. B. Wu, H. Wang, R. L. Prior // Clinical Chemistry.- 1995. Vol.41. - P. 1738 - 1744.

105. Cao, G. H. Procyanidins, anthocyanins and antioxidant capacity in wines / G.

106. H. Cao, C. Sanchez-Moreno, R. L. Prior // Faseb Journal. 2000. - Vol.14. -P. A564-A564.

107. Cao, G. H. Hyperoxia-induced changes in antioxidant capacity and the effect of dietary antioxidants / G. H. Cao, B. Shukitt-Hale, P. C. Bickford, J. A. Joseph, J. McEwen, R. L. Prior // Journal of Applied Physiology. 1999. - V. 86.-P. 1817-1822.

108. Yang, X. F. Fe(II)-EDTA Chelate-Induced Aromatic Hydroxylation of Terephthalate as a New Method for the Evaluation of Hydroxyl Radical-Scavenging Ability / X. F. Yang, X. Q. Guo // The Analyst. 2001. - №126. -P. 928-932.

109. Labuda, J. Detection of Antioxidative Activity of Plant Extracts at the DNA

110. Modified Screen-Printed Electrode / J. Labuda, M. Buckovâ, L. Heilerovâ, A.160

111. Caniova-Ziakova, E. Brandsteterova, J. Mattusch, R. Wennrich // Sensors. — 2002.-Vol.2.-P. 1-10.

112. Korbut, O. Damage to DNA indicated by an electrically heated DNA-modified carbon paste electrode / O. Korbut, M. Buckova, P. Tarapcik, J. Labuda, P. Griindler // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2001. — Vol.506.-P. 143-148.

113. Короткова, E. И. Новый способ определения активности антиоксидантов/ Е. И. Короткова // Журнал физической химии. — 2000. — Т.74. №9. - С. 1544 - 1546.

114. Korotkova, Е. I. Study of antioxidant properties by voltammetry / E. I. Korotkova, Y. A. Karbainov, A. V. Shevchuk // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2002. - Vol.518. - № 1. - P. 56-60.

115. Yang, B. Estimation of the antioxidant activities of flavonoids from their oxidation potentials/ B. Yang, A. Kotani, K. Arai, F. Kusu // Analytical Sciences (Japan). 2001. - Vol. 17. - P. 599 - 604.

116. Psotova , J. Determination of total antioxidant capacity in plasma by cyclic voltammetry. Two case reports / J. Psotova , J. Zahalkova, J. Hrbac, V. Simanek, J. Bartek // Biomedical Papers. 2001. - Vol.145. - №2. - P. 81-83.

117. Ghiselli, A. A fluorescence- based method for measuring totalplasma antioxidant capability / A. Ghiselli, M. Serafini, G. Maiani, E. Azzini, A. Ferro-Luzzi // Free Radicals In Biology And Medicine. 1995. - Vol.18. - P. 29-36.

118. DeLange, R. J. Phycoerythrin fluorescence-based assay for peroxy radicals: a screen for biologically relevant protective agents / R. J. DeLange, A. N. Glazer // Analytical Biochemistry. 1989. - Vol.177. - P. 300 - 306.

119. Glazer, A. N. Phycoerythrin fluorescence-based assay for reactive oxygen species / A. N. Glazer// Methods of Enzymology. 1990. - Vol.186. - P. 161— 168.

120. Abella, A. A method forsimultaneous determination of plasma and erythrocyte antioxidant status. Evaluation of the antioxidant activity of vitamin161

121. E in healthy volunteers / A. Abella, C. Messaoudi, D. Laurent, D. Marot, J. Chalas, J. Breux, C. Claise, A. Lindenbaum // British Journal of Clinical Pharmacology. 1996.-Vol.42.- P. 737-741.

122. Benzie, I. F. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of «antioxidant power»: the FRAP assay / I. F. Benzie, J. J. Strain // Analitycal Biochemistry. 1996. - Vol.239. - P. 70 - 76.

123. Dasgupta, A. In vitro lipid peroxidation of human serum catalyzed by cupric ion: antioxidant rather than prooxidant role of ascorbate / A. Dasgupta, T. Zdunek // Life Sciences. 1992. - Vol.50. - P. 875 - 882.

124. Dat, J. F. Changes in Salicylic Acid and Antioxidants during Induced Thermotolerance in Mustard Seedlings / J. F. Dat, С. H. Foyer, I. M. Scott // Plant Physiology. 1998. - Vol.118. - P. 1455 - 1461.

125. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел / Т. А. Мишарина, М. Б. Теренина, Н. И. Крикунова // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. - Т.44. - № 4. - С. 482 - 486.

126. Мишарина, Т. А. Антиоксидантные свойства эфирных масел лимона / Т. А. Мишарина, М. Б. Теренина, Н. И. Крикунова, И. Б. Медведева // Прикладная биохимия и микробиология. — 2009. — Т.45. — №6. — С. 710 — 716.

127. Голубев, С. В. Компонентный состав эфирного масла пихты сибирской Красноярской лесостепи и Эвенкии / С. В. Голубев, И. Д. Зыкова, А. А. Ефремов // Мат. III конференции «Химическая наука и образование Красноярья». Красноярск. — 2009. - С. 12-15.

128. Федянина, Е. П. Химический состав эфирного масла тимьяна енисейского / Е. П. Федянина, А. А.Ефремов, JI. С. Соколова // Мат. III конференции «Химическая наука и образование Красноярья». — Красноярск. 2009. - С. 77 - 93.

129. Хасанов, В. В. Методы исследования антиоксидантов / В. В. Хасанов, Г. JI. Рыжова, Е. В. Мальцева // Химия растительного сырья. 2004. - №3. -С. 63-75.

130. Foti, М. С. Mechanism of inhibition of lipid peroxidation by y-terpinene, an unusual and potentially usefull hydrocarbon antioxidant / M. C. Foti, K. U. Ingold // J. Agric. Food Chem. 2003. - Vol.51. - № 9. - P. 2758 - 2765.

131. Huang, D. The chemistry behind antioxidant capacity assay / D. Huang, B. Ou, R. L. Prior // J.Agric. Food Chem. 2005. - Vol.53. - № 6. - P. 1841 -1856.

132. Lee, K. G. Determination of antioxidant potential of volatile extracts isolated from various herbs and spices / K. G. Lee, T. Shibamoto // J.Agric. Food Chem. 2002. - Vol.50. - № 15. - P. 4947 - 4952.

133. Yanagimoto, K. Antioxidative activity of fractions obtained from brewed coffee / K. Yanagimoto, H. Ouchi, K. G. Lee, T. Sibamoto // J.Agric. Food Chem. 2004. - Vol.52. - №3. - P. 592 - 596.163

134. Lee, S.-J. Identification of volatile components in basil (Ocinum basilicum L.) and thyme leaves {Thymus vulgaris L.) and their antioxidant properties / S.-J. Lee, T. Umano Shibamoto, K.-G. Lee // Food Chemistry. 2005. - Vol.91. -P. 131-137.

135. Акимов, Ю. А. Действие эфирных масел на патогенную микрофлору органов дыхания/ Ю. А. Акимов, И. Ф. Остапчук // «Симпозиум по эфиромасличным растениям и маслам». — Симферополь. — 1985. — кН. 2. — С. 42.

136. Леви, М. И. Быстрый метод определения чувствительности бактериальных культур к различным антибиотикам в жидкой среде / М. И. Леви, И. А. Горожанкина, Л. А. Сагатовская // Антибиотики. — 1967. — №1. С. 57-65.

137. Струкова Е.Г., Ефремов A.A., Гонтова A.A., Соколова Л.С. Воздействие эфирных масел сибирского региона на условно-патогенные микроорганизмы//Химия растительного сырья. 2009. № 4. С. 79-82.

138. ГОСТ Р ИСО 5725-2002 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений . 6 частей — Введ. впервые; дата введ. 01.11.2002. М.: ИПК Издательство стандартов, 2002 - 350 с.

139. РМГ 61-2003 ГСИ. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки. Введ. впервые ; дата введ. 01.01.2005. — М.: ИПК Издательство стандартов, 2005. — 69 с.

140. ГОСТ Р 52361-2005 Контроль объекта аналитический. Термины и определения. Введ. Впервые ; дата введ. 01.01.2006. М.: ИПК Издательство стандартов, 2005. - 18 с.

141. Зозуля, Ю. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга : Ю. А. Зозуля, В. А. Барабой, Д.

142. A. Сутковой. М.: Знание-М, 2000. - 344 с.

143. Донцов, В. И. Старение: механизмы и пути преодоления : В. И. Донцов,

144. B. Н. Крутько, А. А. Подколзин. М.: Биоинформсервис, 1997. - 89 с.

145. Осипов, А. Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А. Н. Осипов, О. А. Азизова, Ю. В. Владимиров //Успехи.биол.химии. -1990.-Т. 31.-С. 180-208.