КО-ЭКСПРЕССИЯ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ VEGF165 И FGF2 В СОСТАВЕ МУЛЬТИЦИСТРОННЫХ КОНСТРУКЦИЙ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Гаранина Екатерина Евгеньевна

• Гаранина Екатерина Евгеньевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Гаранина Екатерина Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1Боковой амиотрофический склероз (БАС)

1.1.1 Клеточная терапия бокового амиотрофического склероза

1.1.2 Генная терапия бокового амиотрофического склероза

1.2 Вирусные векторы для доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот

1.2.1 Аденовирусы

1.2.2. Адено-ассоциированные вирусы

1.2.3. Векторы на основе вируса простого герпеса (Herpes Simplex)

1.2.4 Лентивирусы

1.3Плазмидные векторы для переноса рекомбинантных нуклеиновых кислот

1.4 Стратегии ко-экспрессии генов

1.4.1. Сайты внутреннего встраивания в рибосому (IRES)

1.4.2. Двунаправленные промоторы

1.4.3. 2А-пептидные последовательности пикорновирусов

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Получение рекомбинантного аденовируса с использованием технологии

клонирования Gateway

2.1.1. ПЦР-амплификация

2.1.2 Клонирование продукта амплификации VEGF-FuP2A-FGF2 в

плазмидный вектор pDONR221 (Invitrogen)

2.1.3. Получение экспрессионной конструкции pAd/CMV/V5-Dest

2.1.4 Получение рекомбинантного аденовируса ко-экспрессирующего гены vegf165 и ff

2.2 Получение мультицистронной конструкции на основе плазмиды pEGFP-

N2, ко-экспрессирующей гены vegf165 и fgf2

2.2.1 Клонирование ПЦР-продуктов в плазмидные векторы pJET1.2/blunt и pEGFP-N2

2.3 Исследование ко-экспрессии генов vegf, fgf2 в составе экспрессионных плазмидных конструкций in vitro

2.3.1 Генетическая модификация культуры клеток HEK293T рекомбинантной плазмидной ДНК pAd-VEGF165-FuP2A-FGF2 и pVEGF165-FuP2A-FGF2-P2A-EGFP

2.3.2. Иммунофлуоресцентный анализ генетически модифицированных клеток

2.3.3. Оценка биосинтеза белка in vitro методом иммуноблоттинга

2.4 Исследование иммуногенности 2А-пептидных препаратов

2.4.1.Получение антител к 2А-пептиду

2.4.2 Иммуноферментный анализ

2.5 Исследование ко-экспрессии генов vegf165 и fgf2 на экспериментальной модели животных, моделирующих фенотип бокового амиотрофического склероза

2.5.1 Выделение и генетическая модификация мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека

2

Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток трансгенным мышам, модулирующих фенотип бокового амиотрофического склероза

2.5.3 Иммуногистохимический анализ экспрессии белков VEGF и FGF2 in

vivo

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Создание мультицистронной аденовирусной конструкции, содержащей кДНК генов vegf 165 и fgf2

3.1.2. Получение рекомбинантного аденовируса Ad5-VEGF165-FuP2A-FGF2

3.1.3 Создание мультицистронной плазмидной конструкции, содержащей

кДНК генов vegf165 и fgf2

3.2 Исследование ко-экспрессии, биосинтеза и ко-трансляционного расщепление рекомбинантных белков VEGF165 и FGF2 в первичных и иммортализованных культурах клеток человека

3.2.1 Исследование ко-экспрессии генов VEGF165 и FGF2 в генетически модифицированных первичных и перевиваемых клеточных культурах

3.2.2 Количественный анализ уровня экспрессии мРНК генов vegf165 и fgf2

3.3.1 Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков в составе мультицистронной аденовирусной конструкции

3.3.2 Исследование иммуногенных свойств рекомбинантных белков

VEGF165 и FGF2 в составе плазмидной конструкции in vivo

3.4 Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток из пуповинной крови человека трансгенным мышам с моделью

бокового амиотрофического склероза

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

цш (мкм) — микрометр Ad5—аденовирус серотипа 5 Aqp4 (aquaporin 4)—аквапорин 4 b.p. (base pairs), п.н. — пар нуклеотидов

BDNF (brain-derived neurotrophic factor)—нейротрофический фактор из головного мозга

CD (Cluster of Differentiation) — кластер дифференцировки

CD34 — мембранный белок, играющая роль на ранних этапах гемопоэза

CK—казеин киназа

CMV (Cytomegalovirus) — цитомегаловирус

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) — 4,6-диамидино-2-фенилиндол DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) — среда Игла модифицированная Дульбекко

DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) — фосфатно-солевой буфер Дульбекко

DPE (downstream promoter element) —нижестоящий промоторный элемент EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) — этилендиаминтетраацетат EF-1a (Elongation Factor-1 alpha) — фактор элонгации 1 альфа EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) — улучшенный зеленый флуоресцирующий белок

FBS (Fetal Bovine Serum) — сыворотка крови плодов коровы

FDA (food and drug administration)—департамент по контролю качества

продуктов и лекарственных препаратов

FGF (Fibroblast Growth Factor) — фактор роста фибробластов

FGFR (Fibroblast Growth Factor Receptor) — рецептор фактора роста

фибробластов

FMDV (Foot-and-mouth disease virus)—вирус ящура

G93A-SOD1 — трансгенные мышы с фенотипом бокового амиотрофического склероза человека

GDNF (glial cell-derived neurotrophic factor)—глиальный нейротрофический фактор

GPI—гликофосфатидил инозитол

HEK293T (Human Embryonal Kidney сell type 293, expressing simian virus 40 T

antigen) — клетки эмбриональной почечной линии 293Т человека,

экспрессирующие Т антиген вируса обезьян SV40

HNA (Human Nuclei Antigen) — человеческий ядерный антиген

kDa (кДа) — килодальтон

IFN у—интерферон гамма

IGF-1 (insulin-like growth factor)—инсулин-подобный фактор роста IL (interleukin)—интерлейкин

IP10 (interferon-gamma induced protein)—интерферон-гамма индуцибельный белок

L1-CAM (L1 Cell Adhesion Molecule) — молекула нейральной адгезии L1

LS-LB (Low Salt Luria-Bertani Medium) — низкосолевая среда Лурия-Бертани MCP-1(Monocyte chemoattractant protein-1)—белок-хемоаттрактант моноцитов 1 MIP-1a (Macrophage Inflammatory protein)—альфа форма макрофагагального воспалительного белка

NCAM1 (neural cell adhesion molecule 1)—нейрональная молекула клеточной адгезии

NLR (Nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) like receptors (s)— нуклеотид-связывающие олигомеризующие домен-подобные рецепторы Oct6 (Octamer-binding protein 6)—октамер-связывающий белок 6 OD (Optical Density) — оптическая плотность OPTN—оптинейрин

ORF (Open Reading Frame) — открытая рамка считывания

ORI (Origin of Replication) — точка начала репликации

PBS (Phosphat Buffer Solution) — фосфатно-солевой буфер

PDGF-B (platelet-derived growth factor B)- тромбоцитарный фактор роста бета

RPMI1640 (Roswell Park Memorial Institute Medium 1640) — среда для

культивирования клеток №1640, разработанная в Институте раковых

исследований Розвелла Парка

S100 (S100 protein) — белок S100

SDS (Sodium dodecyl sulfate) — додецилсульфат натрия

SH-SY5Y—культура клеток нейробластомы человека

siRNA (small interfering RNA) — малые интерферирующие РНК

SOD1 (Superoxide Dismutase 1) — супероксиддисмутаза

SPG11—белок спатаксин

TLR (toll-like receptor)—толл-подобный рецептор

TNFa (tumor necrosis factor alpha)—фактор некроза опухоли альфа

UTR (Untranslated Region) — нетранслируемая область

VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) — фактор роста эндотелия сосудов VEGFR (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor) — рецептор фактора роста эндотелия сосудов

WPRE (woodchuck post-transcriptional regulatory element)—пост-транскрипционный регуляторный элемент северо-американского лесного сурка

АСН—антисмысловые нуклеотиды АТ — антитела

БАС — боковой амиотрофический склероз БСА—бычий сывороточный альбумин ГСК — гемопоэтические стволовые клетки ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота кДНК — комплементарная ДНК

киРНК—короткая интерферирующая рибонуклеиновая кислота мкМ—микромоль мМ — миллимоль

МСК — мезенхимная стволовая клетка

нкРНК—некодирующая рибонуклеиновая кислота

НДЗ—нейродегенеративное заболевание

НСК—нейрональная стволовая клетка

НТФ—нейротрофический фактор

ОРС—открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР — обратная транскрипционная полимеразная цепная реакция

п.н.—пар нуклеотидов

плДНК — плазмидная ДНК

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ — полимеразная цепная реакция в реальном времени

рА — сигнал полиаденилирования

РНК — рибонуклеиновая кислота

СК — стволовые клетки

СК-ЖТ—стволовые клетки из жировой ткани

СМА—спинальная мышечная атрофия

ЦНС — центральная нервная система

цАМФ—циклический аденозин монофосфат

ЭПР—эндоплазматический ретикулум

ВВЕДЕНИЕ

Развитие методов генодиагностики, энзимодиагностики и научных принципов генной терапии открывают перспективы разработки альтернативных подходов и внедрения в практическую медицину технологий генной и клеточной терапии различных заболеваний человека, приводящих к ранней инвалидизации. Ряд нейродегенеративных заболеваний, в частности, боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, обусловлены нарушением различных биохимическов процессов, требующих более детального изучения. Существующие методы лечения вышеуказанных патологий носят паллиативный характер и не способствуют функциональному восстановлению больного. Таким образом, возникает необходимость разработки альтернативных подходов, а также анализа и синтеза биологически активных веществ с дальнейшим выснением их физиологического действия на организм.

На современном этапе генная терапия предполагает лечение с помощью терапевтических (рекомбинантных) генов человека, обеспечивающих синтез белков взамен собственных дефектных для коррекции биохимических процессов в организме, или, например, синтез дополнительных белков для стимулирования регенерации. Ряд заболеваний человека, в частности,

В зависимости от способа введения экзогенной ДНК в организм пациента существует два вида генной терапии — прямая генная терапия, когда терапевтические гены вводятся непосредственно в организм (внутримышечно, внутривенно, интратекально) или клеточно-опосредованная, при которой ауто- или аллогенные клетки вводятся в организм больного после их предварительной генетической модификации ех vivo.

Плазмидные векторы ввиду их биобезопасности активно применяют для доставки экзогенной ДНК в клетки человека. Стандартные и наиболее распространенные техники введения плазмидных векторов в

эукариотические клетки включают электропорацию или химическую трансфекцию с помощью катионных и/или липофильных надмолекулярных комплексов (C. Pichón et al., 2010; J.E. Ziello et al., 2010). Для лечения некоторых заболеваний наибольший терапевтический эффект может быть достигнут путем экспрессии нескольких терапевтических генов. Однако одновременное введение нескольких плазмид, кодирующих разные гены человека, не гарантирует стабильной ко-экспрессии трансгенов и, соответственно, биосинтеза каждого из белков в клетках-мишенях. В то же время, скоординированный совместный биосинтез рекомбинантных белков важен для создания оптимального тканевого микроокружения при паракринном механизме стимуляции регенерации или аутокринном механизме модуляции фенотипа клеток-мишеней.

Метод генетической модификации мононуклеарных клеток пуповинной крови человека двухкассетными плазмидными конструкциями (патент на изобретение РФ №2431669) оказался эффективным для обеспечения экспрессии мРНК клонированных генов с последующим биосинтезом рекомбинантных белков in vitro и in vivo. Трансфекция мононуклеарных клеток крови пуповины (МККП) плазмидой pBud-Sox2-Oct4, кодирующей транскрипционные факторы октамер связывающего белка 4 (Oct4) и Sox2 существенно повышала дифференцировочный потенциал клеток в различные типы: в эндотелиальные, микроглиальные и, что немаловажно, нейрональные. Модифицированные мононуклеарные клетки из пуповинной крови, сверхэкспрессирующие фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF) и основной фактор роста фибробластов 2 rarn(FGF2) при трансфекции плазмидой pBud-VEGF-FGF2, дифференцировались в астроцитоподобные клетки, которые морфологически имели звездчатую форму и экспрессировали характерный маркер астроцитов S100 (HNA+S100+) (A.A. Rizvanov et al., 2011).

Несмотря на биобезопасность плазмидных векторов, они обладают низкой эффективностью трансфекции in vivo и недолговременной

экспрессией трансгенов. Вирусный метод доставки рекомбинантных нуклеиновых кислот обеспечивает долговременную экспрессию трансгена и стабильную продукцию белковых макромолекул. По данным (февраль 2016 года) интернет-ресурса www.сlinicaltrials.gov восемь клинических испытаний с использованием адено-ассоциированных и одно — с использованием лентивирусного векторы для терапии заболеваний ЦНС ведутся в настоящее время или находятся на стадии завершения.

Репликационно-дефектные аденовирусы обладают рядом особенностей, оптимальных для применения в генной терапии: они способны легко трансдуцировать различные клеточные типы нервной ткани, в том числе пост-митотические нейроны мозга; обладают низкой патогенностью и высокой эффективностью экспрессии рекомбинантных генов (Б. АкН et а1., 1993); обеспечивают долговременную (2-7 лет) экспрессию трансгенов (М.В. Appaiahgari et а1., 2015). Для достижения ко-экспрессии различных трансгенов для терапии бокового амиотрофического склероза (БАС) ранее нами были разработаны различные комбинации аденовирусов, кодирующих кДНК генов ncam1, vegf165, gdnf (КК Islamov et al., 2015) для модификации МКПК и последующей трансплантации трансгенным мышам, модулирующим фенотип бокового амиотрофического склероза. Однако, как и в случае плазмидных векторов, ко-трансдукция клеток разными вирусными векторыми не гарантирует одновременный синтез рекомбинантных белков в каждой инфицированной клетке. Таким образом, поиск оптимального варианта обеспечения ко-экспрессии нескольких трансгенов в одной клетке является одной из важнейших задач регенеративной медицины.

С развитием технологий секвенирования существенно увеличилось количество исследований в области структурной организации геномов различных видов — оперонов, кластеров генов, а также стратегий регуляции и ко-экспрессии генов. Интерес к последним обусловлен развитием методов генной терапии, требующей одновременной и гарантированной экспрессии нескольких генов: терапевтических и репортерных белков, - генов

резистентности к антибиотикам и т.д. Векторы, демонстрирующие способность к ко-экспрессии двух и более генов и обеспечивающие адресную доставку в клетки-мишени in vitro и in vivo, являются объектами интенсивных исследований. Помимо поиска оптимального вектора-переносчика генетической информации, актуальной остается проблема выбора эффективной стратегии ко-экспрессии генов (P. de Felipe, 2002). 2А-пептидные последовательности пикорновирусов широко применяются для обеспечения ко-экспрессии нескольких генов. Преимущества данной стратегии заключаются в независимой от типа клеток ко-экспрессии белков, соединенных 2А-пептидной последовательностью. Несколько полипептидов синтезируется в равном количестве с одной мРНК под контролем общего промотора, а малый размер 2А-пептида (54-174 п.н.) позволяет значительно экономить генетическую информацию, что важно при применении векторов с ограниченной пакующей способностью. Однако наличие дополнительных аминокислотных остатков на С-конце пептида может оказывать существенное влияние на формирование вторичной и третичной структуры белка, а также иммуногенные свойства, что является одним из лимитирующих факторов для клинического применения. Решение данных проблем откроет дорогу к созданию аденовирусных конструкций, ко-экспрессирующих различные терапевтические белки посредством 2А-аминокислотных последовательностей вируса ящура, для генетической модификации стволовых клеток и разработке новых перспективных методов лечения нейродегенеративных заболеваний.

Цель работы — определение ко-экспрессии и выявление иммуногенных свойств белков фактора роста эндотелия сосудов и основного фактора роста фибробластов в клетках человека, модифицированных генетическими конструкциями, содержащих 2А-пептидные

последовательности пикорновирусов.

В рамках цели диссертационного исследования были поставлены следующие задачи:

1. Создать экспрессионные 2А-пептидные мультицистронные плазмидные и аденовирусные конструкции, кодирующие белки генов vegf165

и fgf2;

2. Исследовать ко-экспрессию генов, биосинтез и ко-трансляционное расщепление рекомбинантных белков в первичных и иммортализованных культурах клеток человека (эмбриональной линии почки человека, содержащей Т-антиген вируса SV40 (HEK293T); стволовых клетках из жировой ткани человека (СК-ЖТ), фибробластах из кожи человека, в мононуклеарных клетках крови пуповины человека), трансфицированных полученными плазмидными векторами или трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами.

3. Провести анализ иммуногенных свойств рекомбинантных белков в составе мультицистронных плазмидных и аденовирусных векторов на модели лабораторных животных in vivo.

4. Трансдуцировать мононуклеарные клетки крови пуповины человека аденовирусом, ко-экспрессирующим гены vegf и fgf2, соединенные 2А-пептидной последовательностью пикорновирусов, и исследовать биосинтез рекомбинантных белков, выживаемость, миграцию и дифференцировку генетически модифицированных клеток после трансплантации трансгенным мышам с моделью бокового амиотрофического склероза.

Научная новизна работы

В работе впервые созданы мультицистронные генетические конструкции с применением 2А-пептидных последовательностей пикорновирусов. Впервые показано, что разработанные генетические конструкции на основе плазмидного и аденовирусного векторов обеспечивают одновременную экспрессию генов и последующий биосинтез фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и основного фактора роста фибробластов (FGF2). Несомненной новизной обладают данные, полученные методом иммуноферментного анализа, свидетельствующие об отсутствии

иммунного ответа на 2А-пептидный антиген у лабораторных животных при введении рекомбинантного аденовируса in vivo. Также впервые получены данные, свидетельствующие о ко-транскрипции клонированных генов, биосинтезе и ко-трансляционном расщеплении рекомбинантных белков в генетически модифицированных клетках, трансфицированных рекомбинантными плазмидными и аденовирусными генетическими конструкциями.

Впервые разработан способ получения мультицистронной генетической конструкции и фармацевтической композиции на основе репликационно-дефектного аденовируса (заявка на патент №2015100445), показана их способность к синтезу мРНК клонированных генов с последующим биосинтезом рекомбинантных белков in vitro.

Принципиально новыми являются данные о способности МККП к трансдукции полученной конструкцией, о том, что генетически модифицированные клетки пуповинной крови человека, трансплантированные трансгенным мышам с фенотипом бокового амиотрофического склероза, выживают, мигрируют в спинной мозг, ко-экспрессируют рекомбинантные белки и дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры астроцитов и шванновских клеток.

Положения, выносимые на защиту:

Рекомбинантный аденовирус, ко-экспрессирующий гены сосудистого эндотелиального фактора роста и основного фактора роста фибробластов, соединенные в одной открытой рамке считывания через фурин-содержащую 2А-пептидную последовательность, обеспечивает биосинтез и ко-трансляционное расщепление рекомбинантных белков в клетках человека in vitro и in vivo.

Фурин-содержащие 2А-пептидные плазмидные и аденовирусные векторы не вызывают иммунный ответ на антиген вируса ящура.

Теоретическая и практическая ценность работы

Настоящее исследование закладывает научные принципы генотерапии с применением 2А-пептидных последовательностей пикорновирусов для обеспечения ко-экспрессии генов и биосинтеза рекомбинантных белков. Данные, полученные в рамках диссертационной работы, имеют практическую ценность для разработки методов генной и генно-клеточной терапии наследственных и приобретенных заболеваний человека.

Исследование иммуногенности 2А-пептидных плазмидных и вирусных векторов демонстрирует биобезопасность и возможность биомедицинского применения разработанных генетических конструкций.

Разработан способ получения мультицистронной конструкции и фармацевтической композиции на основе репликационно-дефектного аденовируса (подана заявка на получение патента на изобретение РФ №2015100445).

Апробированный метод генетической модификации мононуклеарных клеток крови пуповины человека 2А-пептидными вирусными конструкциями может быть использован для разработки эффективных методов терапии нейродегенеративных заболеваний человека.

Личное участие автора в полученных результатах

Автор принимал участие в формулировании научной проблемы и планировании экспериментов. Автором был получен весь экспериментальный материал, а также проведена статистическая обработка полученных данных; автор обсуждал и описывал полученные результаты. Автор участвовал в написании статей и патента на изобретение, проводил информационный поиск по исследуемой тематике.

Автором решена важная биохимическая задача по изучению молекулярных механизмов ко-экспрессии рекомбинантных белков, связанных между собой 2А-пептидными последовательностями пикорновирусов, а также клеточной дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток (МККП) на экспериментальной модели нейродегенеративных заболеваний, что вносит важный вклад в разработку

методов и научных принципов генной терапии. Данные, полученные лично автором, демонстрируют возможность применения мультицистронного рекомбинантного аденовируса в биологии и медицине как для обеспечения одновременного биосинтеза нескольких белков при трансдукции клеток, так и для применения в генно-клеточной терапии.

Связь работы с базовыми научными программами

Работа поддерживалась грантами РФФИ 11-04-00902-а «Исследование иммуногенности и особенностей функционирования 2А пептидов вируса ящура в мультицистронных экспрессионных векторых in vitro и in vivo»; грант РФФИ 13-04-12035-офи-м «Тканеинженерные, генные и клеточные технологии стимулирования регенерации периферического нерва»; грантом Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых докторов наук МД-433.2013.4 «Модуляция межклеточной коммуникации клеток человека в ответ на экзогенные генетические факторы»; грант Федеральной Целевой Программы № 14.A18.21.2011 «Разработка методов выделения и трансплантации стволовых клеток для экспериментальной клеточной терапии».

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «КО-ЭКСПРЕССИЯ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ VEGF165 И FGF2 В СОСТАВЕ МУЛЬТИЦИСТРОННЫХ КОНСТРУКЦИЙ»

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на следующих всероссийских и международных симпозиумах, конгрессах и конференциях: Всероссийская студенческая научная конференция памяти академика АН РТ проф. Д.М. Зубаирова (Казань, 2011); XV международная Пущинская школа -конференция молодых ученых (Пущино, 2011); XVI международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2012); V ежегодный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий (Москва, 2012); международная научная конференция студентов и молодых ученых «Современные теоретические и практические аспекты клинической медицины» (Одесса, 2012); XVII Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2012); III международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы

анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2013); I научно-практическая конференция студентов и молодых ученых Института фундаментальной медицины и биологии «Современные проблемы фундаментальной медицины и биологии» (Казань, 2013); VI ежегодный международный симпозиум «Актуальные вопросы генных и клеточных технологий» (Москва, 2013); международная научно-практическая конференция «Современные проблемы науки и образования» (Сочи, 2013); международная конференция «Scientific research and their practical application. Modern state and ways of development» (Киев, 2013); международная научно-практическая конференция «Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, 2014); IV международная научно-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и практической медицине» (Казань, 2014); XIX международная Пущинская школа -конференция молодых ученых (Пущино, 2015).

Публикация результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК для защиты кандидатских диссертаций, и 21 тезис докладов на международных и всероссийских конференциях и конгрессах.

Место выполнения работы

Работа выполнена на базе Казанского (Приволжского) федерального университета.

Структура и объем диссертационной работы

Материалы диссертационной работы изложены на 157 страницах машинописного текста. В работе приведено 32 рисунка и 14 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, заключения и списка литературы (263 наименования).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Боковой амиотрофический склероз (БАС)

Боковой амиотрофический склероз-нейродегенеративное заболевание, проявляющееся в зрелом возрасте, которое сопровождается гибелью нейронов. На сегодняшний день эффективные методы лечения БАС неизвестны. БАС—многофакторное заболевание, характеризующееся вариабельностью клинических проявлений и гетерогенностью этиологии; сопровождается избирательной дегенерацией мотонейронов, начинается в зрелом возрасте, протекает в течение 1 -5 лет с прогрессирующим параличом и заканчивается смертью. (D.W. Cleveland, 1999; M.C. Kiernan et al., 2011).

Наиболее частой формой БАС является спорадическая, которая составляет около 90% случаев. В остальных случаях наблюдается семейная форма. Частота встречаемости заболевания 2-3 случая на 100000 населения (A. Alonso et al., 2009; A. Chio et al., 2009).

Симптомы заболевания включают мышечную слабость и атрофию, совмещенную с прогрессирующим параличом, неминуемо приводящим к смерти, обычно спустя 5 лет после постановки диагноза. Преимущественно встречается спорадическая форма БАС, и лишь 5-10% случаев заболевания генетически обусловлены. (S.H. Appel et al., 2001; J.S. Henkel et al., 2009)

Однако несмотря на значимый прогресс в развитии теории, объясняющей генетическую природу бокового амиотрофического склероза, механизм, обуславливающий развитие БАС в случае спорадической формы, остается неизвестным (P.M. Andersen et al., 2011). Патогенетические механизмы, способствующие развитию болезни, включают

эксайтотоксичность, окислительный стресс, образование белковых агрегатов, разобщенную функцию митохондрий и метаболизма PKK, а также нарушения аксонного транспорта (L. Ferraiuolo et al., 2011). Эти процессы зачастую строго компартментализованы и отличаются своей активностью в перикарионе, нервных отростках и нервных окончаниях. Примечательно, что при БАС и других нейродегенеративных заболеваниях чаще всего первыми

поражаются аксоны и синапсы (L.M. Murray et al., 2010). Таким образом, ввиду избирательной уязвимости аксонов и синапсов изучение генетических механизмов развития БАС обещает предоставить не только ценную информацию о механизмах патогенеза, но и об арсенале терапевтических мишеней при раннем вмешательстве. По результатам растущего количества исследований в области генетики решающую роль в патогенезе БАС играют белки, связанные с РНК, например, TDP-43 и FUS (fused in sarcoma) (T.J. Kwiatkowski, Jr. et al., 2009; J. Sreedharan et al., 2008; C. Vance et al., 2009). FUS преимущественно локализуется в ядре и мигрирует между ядром и цитоплазмой (H. Zinszner et al., 1997). Данный белок участвует в сплайсинге мРНК и транспорте (C. Lagier-Tourenne et al., 2010). Наибольшее количество FUS-мутаций, приводящих к развитию БАС, случается в N-концевом участке, отвечающего за сигнальную последовательность и ядерную локализацию. Эти мутации приводят к аберрантной локализации белка в цитозоле. (D. Dormann et al., 2010; D. Ito et al., 2011). Хотя механизмы заболевания, в основе которых лежат FUS-мутации, в основном, остаются неясными, было показано, что мутантная форма белка приводит к цитотоксичности у дрожжей и индуцирует формирование гранул стресса в клетках Danio rerio (S. Ju et al., 2011; Z. Sun et al., 2011). Такие важные вопросы как состав мутантных FUS-агрегатов и патогенетическая роль, а также влияние мутаций на физиологические функции, остаются открытыми. Интересная взаимосвязь между метаболизмом РНК и БАС также наблюдается и у других белков, связанных с РНК, в частности, у белка, обеспечивающего выживание двигательных нейронов (survival motor neuron protein - SMN). Мутации гена SMN вызывают другое заболевание двигательных нейронов—спинальную мышечную атрофию (spinal muscular atrophy - SMA, СМА). Пониженное количество SMN-белка у пациентов со СМА, а также в экспериментальных моделях in vitro и in vivo, приводит к различным дефектам аксонов и синапсов. Примечательно, что и генетика человека, и данные экспериментов свидетельствуют о вовлечении SMN-

белка в патогенез БАС (E.J. Groen et al., 2013; T. Yamazaki et al., 2012), что предполагает частичное совпадение в механизмах БАС и СМА.

Белок SMN напрямую взаимодействует с FUS-белком, причем мутантные FUS-агрегаты ко-локализуются с белком SMN в перикарионах нейронов. Перераспределение SMN в сторону к FUS- агрегатам приводит к снижению количества белка SMN в аксонах. Поразительно, экспрессия мутантных форм FUS-белка и снижение уровня синтеза белка SMN в аксонах формирует схожие фенотипы у аксонов. Гиперэкспрессия полномерной формы SMN или С-терминального фрагмента SMN, опосредующего функционирование SMN-белка в аксонах, нивелирует дефекты аксонов, вызванные мутантной формой FUS-белка, тем самым демонстрируя функциональную взаимосвязь между мутантной формой FUS и SMN-белков.

Наиболее распространённая семейная форма БАС вызвана мутациями в конститутивном гене супероксид дисмутазы 1 (SOD1). Было обнаружено более 115 мутаций, являющихся причиной заболевания; они затрагивают все участки гена. При изучении моделей БАС у грызунов некоторых из мутаций в SOD1 было выявлено следующее - SOD1-опосредованная форма заболевания связана не с потерей активности дисмутазы, а с появлением токсических особенностей (L.I. Bruijn et al., 1998; A.G. Reaume et al., 1996). Первые указания на то, что митохондрии могут способствовать развитию заболевания, появились исходя из данных гистологического анализа, свидетельствующих о нарушении ультраструктуры митохондрий в мотонейронах при спорадической и наследственной форме БАС (A. Hirano et al., 1984; S. Sasaki et al., 2007; S. Sasaki et al., 1996). Аналогичные данные об измении морфологии были позднее получены при изучении митохондрий у животных с мутацией в гене sodl(M. Salehi et al., 2015).

Хотя SOD1—высоко экспрессирующийся цитозольный белок, часть SOD1 локализована в межмембранном пространстве митохондрий дрожжей (L.S. Field et al., 2003) и в клетках печени у крыс (A. Okado-Matsumoto et al., 2001). Для головного и спинного мозга данные по локализации мутантной

формы белка SOD1 противоречивы. Имеются данные, что большинство митохондрия-ассоциированных, дисмутаза-неактивных мутантов связано с цитоплазматической поверхностью, в то время как дисмутаза-активные мутантные формы ассоциированы на поверхности митохондрий и в межмембранном пространстве (J. Liu et al., 2004).

Избирательная ассоциация мутантной формы супероксид-дисмутазы, не подвергшейся фолдингу, с мембранами митохондрий в нейронах спинного мозга подтверждает тот факт, что природа связи мутантной формы SOD1 с митохондриями неодинакова во всех тканях. Данный феномен указывает на тканеспецифичный, уникальный состав шаперонов, уникальные компоненты на поверхности мембраны митохондрий, или образования незрелой формы белка SOD1, уникальные для спинного мозга, и обладающие селективной аффинностью к мембранам митохондрий. Ряд исследований определяет взаимодействие амилоидогенных белков с клеточной мембраной в качестве главной мишени, влияющей на токсичность и мембранную проницаемость. Также в литературе имеются данные относительно связывания и накопления агрегатов белка SOD1 на мембране митохондрий у трансгенных мышей с фенотипом БАС (J. Liu, et al., 2004). Несмотря на обширные исследования, точный механизм патогенеза, связанный с агрегацией SOD1 и влиянием агрегатных форм белка на заболевание у человека неизвестны.

1.1.1 Клеточная терапия бокового амиотрофического склероза

Стволовые клетки обладают удивительным потенциалом размножения и дифференцировки в различные клеточные типы в организме на протяжении всей жизни человека. Поддержание и регенерация тканей в зрелом организме происходят за счет резидентных стволовых клеток, которые различаются по способности к самообновлению и мультипотентности (N. Barker et al., 2010).

Многообещающие возможности клеточной терапии в замещении нейронов с нарушенной функцией и регенерации нервной ткани дают надежду пациентам с диагнозом бокового амиотрофического склероза (N.J.

Maragakis, 2010). Среди различных клеточных типов, тестируемых для терапии нейродегенеративных заболеваний (R.S. Pandya et al., 2011), наиболее часто встречаются нейрональные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, а также мезенхимальные стволовые клетки (J.R. Naegele et al., 2010). Считается, что нейрогенез в центральной нервной системе прекращается до или вскоре после рождения. Однако, в исследованиях 19801990 гг сообщается о том, что в мозге взрослого человека присутствуют нейрональные стволовые клетки, способные дифференцироваться в астроциты, олигодендроциты и нейроны (A. Alvarez-Buylla et al., 1995). Нейрональные стволовые клетки взрослого организма обладают удивительной пластичностью, поддаются репрограммированию в ходе нормальной дифференцировки и эпигенетическому репрограммированию в ходе де-дифференцировки в плюрипотентное состояние (D.K. Ma et al., 2009). В 2009 году Американской ассоциацией питания и производства лекарственных средств было одобрено 2 клинических испытания по трансплантации нейрональных стволовых клеток для терапии БАС в спинной мозг. В первом случае использовались нейрональные стволовые клетки, полученные из спинного мозга, в то время как во втором случае нейрональные стволовые клетки были получены из эмбриональных стволовых клеток (L. de Filippis, 2011).

Новым методом исследования механизмов патогенеза нейродегенераций и разработки соответствующих лекарственных средств стало перепрограммирование соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, которые в дальнейшем претерпевают экспансию и дифференцировку в специфические популяции нейронов. Доступность данного клеточного материала позволяет проводить in vitro мониторинг с начала заболевания, а также тестировать новые лекарственные средства непосредственно на клетках пациента для понимания патофизиологических механизмов при нейродегенерации (V.B. Mattis et al.,

2011). Первые индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, полученные от пациентов с диагнозом БАС, были использованы для дальнейшей дифференцировки в мотонейроны (J.T. Dimos et al., 2008). Также в литературе имеются данные по успешному репрограммированию и дифференцировке фибробластов в двигательные нейроны от пациентов с БАС, а также их здоровых братьев и сестер (M. Mitne-Neto et al., 2011). Показано, что предшественники мотонейронов, полученные из эмбриональных стволовых клеток, трансплантированные крысам, с мутацией в гене sodl, при которой в 93 положении глицин замещен на аланин (далее по тексту SOD1-G93A), демонстрировали повышенную выживаемость in vivo, увеличивая количество выживших эндогенных нейронов (T.J. Wyatt et al., 2011).

Первое клиническое испытание, одобренное FDA, по клеточной терапии бокового амиотрофического склероза было начато в 2010 году учеными из университета Мичигана и Эмори с использованием нейрональных стволовых клеток, полученных из NeuralStem, Inc. Также в 2010 году группой Karussis было сделано сообщение о клинических испытаниях (фаза I/II) по комбинированному интратекальному и внутривенному введению аутологичных МСК из костного мозга 19 пациентам с диагнозом БАС и 15 пациентам, страдающих рассеянным склерозом. Данное исследование было направлено на определение применимости и безопасности данного типа клеточной терапии; на протяжение 6 - 25 месяцев не наблюдалось никаких побочных эффектов, было показано улучшение клинической картины и стабилизация у ряда пациентов (D. Karussis et al., 2010). Результаты еще одного клинического испытания по терапии БАС (12 пациентов) показали, что трансплантация клеток не замедляет течение болезни (J. Gamez et al., 2010). Pastor с коллегами на модели БАС мышей анализировали эффект трансплантации цельного костного мозга и культивируемых мезенхимных стволовых клеток

в спинной мозг животных. В результате аблюдалось значительное улучшение двигательной активности (D. Pastor et al., 2012).

При боковом амиотрофическом склерозе характерна прогрессирующая гибель мотонейронов и утрата их связей с мышцами, что неизбежно приводит к параличу. Принимая во внимание относительную доступность к мышечным волокнам, Suzuki с коллегами сообщили об использовании мезенхимных стволовых клеток для доставки глиального нейротрофического фактора на модели семейной формы БАС у крыс. МСК человека, введенные в мышцу, способствовали прекращению мышечной дегенерации, обеспечивали нейропротекторный эффект и увеличивали выживаемость нейронов (M. Suzuki et al., 2008).

Показано, что растворимые факторы из МСК, выделенные из жировой ткани, способствовали повышению эффективности транспорта глутамата в SOD1-G93A астроцитах, что приводило к снижению глутамат-опосредованной эксайтотоксичности. Увеличение экспрессии глутамата сопровождалось ингибированием активации каспазы в мутантных астроцитах (Y.J. Guan et al., 2007). Также было показано, что при ко-культивировании СК-ЖТ человека с астроцитами SOD1-G93A увеличивался биосинтез таких нейропротекторных белков, как сосудистого эндотелиального фактора роста, фактора роста гепатоцитов и инсулин-подобного фактора роста.

Мононуклеарные клетки из костного мозга могут имплантироваться в паренхиму спинного мозга у пациентов с БАС (M. Blanquer et al., 2010). Методом внутрисосудистого введения была трансплантирована специфическая популяция c-kit- позитивных стволовых/прогениторных клеток из костного мозга здоровых подопытных мышей трансгенным SOD1-G93A мышам с моделью БАС. Трансплантированные клетки успешно приживались в спинном мозге и значительно замедляли развитие болезни, способствовали выживанию мотонейронов и улучшению нейромышечных функций (S. Corti et al., 2010).

Еще один потенциальный источник стволовых клеток—стволовые клетки крови пуповины, имеющие ряд преимуществ по сравнению с МСК из костного мозга, а именно: низкая патогенность и иммунная незрелость. Показано, что единичное внутривенное введение мононуклеарных клеток крови пуповины пре-симптоматическим G93A мышам задерживало развитие болезни и увеличивало продолжительность жизни (R. Chen et al., 2000; S. Garbuzova-Davis et al., 2003). В 2008 году группой Гарбузовой-Дэвис была установлена оптимальная доза МКПК, которая увеличивала продолжительность жизни мышей на 20-25% (S. Garbuzova-Davis et al., 2008). Множественное внутривенное введение МККП сдерживало развитие болезни, способствовало увеличению продолжительности жизни животных, усиливало выживание мотонейронов, снижало активацию астроцитов и клеток микроглии. Количество клеток и синхронизация начала лечения оказывали значительный эффект на прогрессирование БАС. Введение 16 млн клеток до появления первых симптомов оказалось наиболее перспективным: это позволило отложить начало развития заболевания и увеличить продолжительность жизни, в то время как при появлении первых симптомов требовались более высокие дозировки - 25 млн клеток (S. Garbuzova-Davis et al., 2012). При введении МККП наблюдалось снижение уровня про-воспалительных цитокинов в головном и спинном мозге, уменьшение количества микроглии в спинном мозге, а также восстановление лейкоцитарного профиля в крови подопытных животных. Эти результаты служат доказательством того, что терапия БАС с подходящей дозой МККП обеспечивает нейропротекторный эффект для двигательных нейронов через активное вовлечение МККП в ингибирование воспалительного ответа со стороны реципиента.

1.1.2 Генная терапия бокового амиотрофического склероза

Первым идентифицированным геном, мутации в котором послужили причиной 20% случаев семейной формы БАС стал ген Cu/Zn супероксид

дисмутазы 1 (sod1), который локализован на 21 хромосоме. (D.R. Rosen, 1993). Кроме того, были идентифицированы другие гены, кодирующие белки TDP43, FUS, оптинейрин и спатаксин. (V.V. Belzil et al., 2009; H. Daoud et al., 2009; H. Maruyama et al., 2010; A. Orlacchio et al., 2010; R. Traub et al., 2011).

Трансактивирующий ответ ДНК-связанный белок 43 (TAR) DNA-binding protein 43 (TDP-43), кодируемый геном TARDBP, высоко консервативный, повсеместно встречающийся ядерный белок. У данного белка имеются консервативные мотивы для узнавания РНК (RRM1/RRM2), фланкированные как на N-концевом, так и на карбоксильном домене, богатом глицином, которые опосредуют белок-белковые взаимодействия (M. Baralle et al., 2013; E. Buratti et al., 2005). Результаты недавних исследований показали, что TDP-43—ядерный нуклеопротеин, участвующий в сплайсинге экзонов, транскрипции генов, регуляции стабильности мРНК и образовании ядерных телец (Y.M. Ayala et al., 2006; J.K. Bose et al., 2008; E. Buratti et al., 2008). Предположительно, данный белок является одним из ключевых звеньев в процессе эмбриогенеза, так как мутация в данном гене в гомозиготном состоянии летальна и приводит к гибели эмбриона (C.F. Sephton et al., 2010). Мутации в гене, кодирующем белок TDP-43, в случае спорадической и наследственной формы БАС, преимущественно затрагивают карбоксильный конец, богатый глицином (G.S. Pesiridis et al., 2009), тем самым указывая на связь между конформационными изменениями в данном участке и патогенезом БАС. TDP-43 преимущественно локализуется в ядре, но в условиях патологии данный белок переносится в цитозоль (H. Tsuji et al., 2012; Y.J. Zhang et al., 2009). Таким образом, нарушение нормального функционирования ядерного белка TDP-43 ввиду неправильной локализации в цитоплазме, а также его агрегация—потенциальные механизмы БАС (M. Neumann et al., 2006). Внутриклеточные агрегаты фосфорилированного белка TDP-43 являютя основным компонентом убиквитин-позитивных включений в головном мозге у пациентов с БАС и дегенерацией лобно-височной доли. Nonaka с соавторами были исследованы взаимосвязи между

фосфорилированием и агрегацией ТЭР-43: экспрессия гиперактивной формы казеин киназы 15 (СК151-317) способствует нарушению локализации и аккумуляции фосфорилированного белка ТЭР-43 в цитоплазме клеток нейробластомы 8И-8У5У. Нерастворимая фосфорилированная форма белка ТБР-43, полученная из клеток, ко-экспрессирующих ТБР-43 и СК151-317, инициирует агрегацию ТЭР-43 в культуре клеток, тем самы указывая на прионоподобные свойства агрегированного белка ТЭР-43 под действием казеин киназы СК151-317. Высокая токсичность и изменения ТЭР-43 также наблюдались у дрожжей, экспрессирующих ТЭР-43 и СК151-317. Таким образом, нарушение активации СК15 служит причиной фосфорилирования ТЭР-43 с дальнейшим фомированием агрегатов в цитоплазме, которые, в свою очередь, могут инициировать нейродегенеративные процессы (Т. Кодака ^ а1., 2016).

Среди генов, мутации в которых обуславливают развитие БАС, оптинейрин (ОРТК) является фактически единственным геном, мутации в котором приводят к утрате функций белка. Оптинейрин дикого типа подавляет активность ядерного фактора каппа В (КБ-кВ), в то время, как мутантная форма данного белка не способна к супрессии. Исследовательскими группами Бако и Лк17ик1 было показано, что выключение гена оптинейрина в нейрональных клетках при применении киРНК привело к утрате эндогенной активности оптинейрина усиленному синтезу белку КБ-кВ. Также ими было установлено, что инактивация гена ОРТК приводит к гибели нейрональных клеток по проапоптотическому пути. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что неправильная активация транскрипционного фактора КБ-кВ лежит в основе БАС, вызванного утраченной функцией оптинейрина (М. Л^иМ е1 а1., 2013; Бако е1 а1., 2012).

В семьях, члены которой больны БАС, было обнаружено более 50 мутаций в гене, кодирующем БиБ-белок. Большинство из них носит доминантный характер, точечные (т1ввеше) мутации, в основном,

затрагивают область, кодирующий С-концевой сигнал ядерной локализации (R.P. Zakaryan et al., 2006). Мутации в гене fus зачасту являются причиной наиболее агрессивной формы БАС, начинающейся в юном возрасте (A. Conte et al., 2012). Точный патогенетический механизм, связанный с биосинтезом аберрантной формы белка, неизвестен. Предположительно, что мутация в гене, кодирующем белок FUS, приводит к биосинтезу и накоплению агрегатов аберрантной формы белка в ядре и цитоплазме пораженных нейронов и глии (I.R. Mackenzie et al., 2010; R. Rademakers et al., 2010).

Белок FUS преимущественно локализуется в ядре и играет немаловажную роль в репарации ДНК и транскрипции, сплайсинге и биосинтезе белка (C. Lagier-Tourenne et al., 2012). В нейронах белок FUS также обнаруживается в дендритах и накапливается в синапсах как комплекс РНК-белок, связанный с рецепторами ^метил^-аспартата в тельцах нейронов и дендритах (H. Husi et al., 2000). Таким образом, белок FUS предположительно играет роль в модуляции синаптической активности в ЦНС путем регуляции транспорта мРНК и локальном бисинтезе белка в нейронах.

Боковой амиотрофический склероз подтипа 5—наиболее часто встречаемая форма рецессивного наследования, характеризующаяся началом до 25 лет с замедленным течением (A. Hentati et al., 1998; G. Stevanin et al., 2007). Исследование с участием 22 пациетов из семей с БАС выявило мутации в локусе 15q15-21 и мутации в гене spg11, кодирующем белок спатаксин (G. Stevanin, et al., 2007). Всего идентифицировано 12 мутаций в данном гене, 10 из которых нонсенс-мутации или же инсерции и делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания, что приводит к утрате функции белка (A. Orlacchio, et al., 2010). Спатаксин (SPG11) — белок с 4 трансмембранными доменами, обнаруживается в ЦНС, в особенности, в кортикальных и спинальных двигательных нейронах, а также в сетчатке. Накопление спатаксин в немиелинизированных аксонах свидетельствует о нарушении аксонного транспорта (R.P. Murmu et al., 2011)

Интерферирующие РНК и терапия антисмысловыми нуклеотидами РНК-интерференция—процесс, при котором некодирующие микроРНК (miRNA) ингибируют и регулируют экспрессию гена, связываясь с мРНК. (C.C. Mello et al., 2004). Этот эндогенный механизм подавления экспрессии генов пристально изучается для применения в терапии аутосомно-доминантных (гетерозиготное состояние) заболеваний, которые возможно излечить путем эффективного выключения мутантной доминантной аллели (J.L. Dreyer, 2011).

Антисмысловые нуклеотиды. На сегодняшний день ведется несколько клинических испытаний по применению антисмысловых нуклеотидов (АСН) в терапевтических целях. Это относительно небольшие молекулы (около 10 кДа), обладающие рядом привлекательных особенностей. Короткие синтетические олигонуклеотиды (15-25 н.) связываются с целевой мРНК в специфических участках, таким образом, индуцируя деградацию РНК-мишени и модулируя процесс сплайсинга. Эффективная доставка в головной и спинной мозг является решающим фактором для применения АСН.

РНК-интерференция гена sodl. Семейная форма БАС возникает в результате мутаций, вызвынных нарушением функции супероксид дисмутазы 1 , нежели отсутствием самого фермента. Данная форма заболевания может послужить отличным примером для РНК-интерференции При внутримышечном введении лентивирусов в комплексе с шпилечными РНК наблюдалось сниженная экспрессия супероксид дисмутазы 1, а также улучшение выживаемости нейронов и задержка развития симптомов БАС (G.S. Ralph et al., 2005).

Интраспинальные инъекции вирусов, содержащих киРНК, также способствовали отсрочке развития заболевания (C. Raoul et al., 2005). Данный протекторный эффект наблюдался исключительно при сайленсинге генов в ЦНС, в то время как нокдаун SOD1 в мышцах оказался неэффективным (T.M. Miller et al., 2006). Дальнейшие исследования по применению киРНК на крысах подтвердили возможность ингибирования биосинтеза мутантной

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гаранина Екатерина Евгеньевна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Генин, А.М. Биоэтические правила проведения исследований на человеке и животных в авиационной, космической и морской медицине / А.М. Генин, А.Е. Ильин, А.С. Капланский, Т.Б. Касаткина, и др. // Авиакосмическая и экологическая медицина. - 2001. - T.4. - C.14-20

2. Гусева, Д.С. Генетически модифицированные мононуклеары пуповинной крови - стимуляторы нейрорегенерации при дегенеративных заболеваниях центральной нервной системы / Д.С. Гусева, А.А. Ризванов, А.П. Киясов, Р.Р. Исламов // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - Т.8, №3. - С. 106-112

3. Кудряшова, Н.В. Мононуклеарные клетки пуповинной крови человека, трансфицированные двухкассетными плазмидами (VEGF+нейротрофический фактор), для терапии бокового амиотрофического склероза // Н.В. Кудряшова, Д.С. Гусева, И.И. Салафутдинов, Ф.В. Баширов, А.П. Киясов, А.А. Ризванов, Р.Р. Исламов // Гены и клетки. - 2012. - Т.7, №3. -С. 92-97

4. Масгутов, Р.Ф. Современные тенденции лечения повреждений периферических нервов / Р.Ф. Масгутов, А.А. Ризванов, А.А. Богов М., А.Р. Галлямов, А.П. Киясов, А.А. Богов // Практическая медицина. - 2013. - №1. -С. 99-103

5. Способ получения лекарственного препарата генетически модифицированных клеток. Заявители: Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казанский государственный медицинский университет, Исламов Р.Р., Ризванов А.А., Киясов А.П. Авторы: Исламов Р.Р., Ризванов А.А., Блатт Н.Л., Газизов И.М., Йылмаз Т.С., Калигин М.С., Киселёв С.Л., Кудряшова Н.В., Ланник Н.И., Салафутдинов И.И., Шафигуллина А.К., Шахин Ф., Юнусов Д.Ш., Ялвач М.Э., Киясов А.П. Патент на изобретение №2431669. Заявка №2009123656. Приоритет изобретения 23 июня 2009 г. Зарегистрирован в Государственном реестре

изобретений РФ 20 октября 2011 г. Срок действия патента истекает 23 июня 2029 г.

6. Способ стимулирования нейрорегенерации с помощью генетических конструкций. Заявители: Казанский (Приволжский) федеральный университет, Челышев Ю.А., Шаймарданова Г.Ф., Мухамедшина Я.О., Исламов Р.Р., Ризванов А.А., Салафутдинов И.И. Патент на изобретение №2459630. Заявка №2011116853. Приоритет изобретения 27.04.2011г. Зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 27.08.2012 г. Срок действия патента истекает 27.04.2031г.

7. Шаймарданова, Г.Ф. Посттравматические изменения структуры спинного мозга крысы при трансплантации мононуклеарных клеток крови пуповины человека, модифицированных генами vegf и fgf2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, С.С. Архипова, А.А. Ризванов, И.И. Салафутдинов, Ю.А. Челышев // Морфология. - 2011. - №6. - C. 36-42

8. Шаймарданова, Г.Ф. Эффект трансплантации в область травматического повреждения спинного мозга крысы мононуклеарных клеток крови пуповины человека, экспрессирующих рекомбинантные гены VEGF и FGF2 / Г.Ф. Шаймарданова, Я.О. Мухамедшина, А.А. Ризванов, И.И Салафутдинов, Ю.А. Челышев // Морфология. - 2012. - Т. 142, № 4. - С. 3136

9. Adachi, N. Bidirectional gene organization: a common architectural feature of the human genome / N. Adachi, M.R. Lieber // Cell. - 2002. - Vol.109, №7. -P.807-809

10. Afshari, F.T. Schwann cell migration is integrin-dependent and inhibited by astrocyte-produced aggrecan / F.T. Afshari, J.C. Kwok, L. White, J.W. Fawcett // Glia. - 2010. - Vol.58, №7. - P.857-869

11. Agol, V.I. Paradoxes of the replication of picornaviral genomes / V.I. Agol, A.V. Paul, E. Wimmer // Virus Res. - 1999. - Vol.62, №2. - P.129-147

12. Akizuki, H. Optineurin suppression causes neuronal cell death via NF-kappaB pathway / M. Akizuki, H. Yamashita, K. Uemura, H. Maruyama, H.

Kawakami, H. Ito, R. Takahashi // J Neurochem. - 2013. - Vol.126, №6. - P.699-704

13. Akli, S. Transfer of a foreign gene into the brain using adenovirus vectors / S. Akli, C. Caillaud, E. Vigne, L.D. Stratford-Perricaudet, L. Poenaru, M. Perricaudet, A. Kahn, M.R. Peschanski // Nat Genet. - 1993. - Vol.3, №3. -P.224-228

14. Aldhammen, Y.A. Immune recognition of gene transfer vectors: focus on adenovirus as a paradigm / Y.A. Aldhamen, S.S. Seregin, A. Amalfitano // Front Immunol. - 2011. - Vol.2. - P.40

15. Alonso-Padilla, J. Development of Novel Adenoviral Vectors to Overcome Challenges Observed With HAdV-5-based Constructs / J. Alonso-Padilla, T. Papp, G.L. Kajan, M. Benko, M. Havenga, A. Lemckert, B. Harrach, A.H. Baker // Mol Ther. - 2015

16. Alonso, A. Incidence and lifetime risk of motor neuron disease in the United Kingdom: a population-based study / A. Alonso, G. Logroscino, S.S. Jick, M.A. Hernan // Eur J Neurol. - 2009. - Vol.16, №6. - P.745-751

17. Alvarez-Buylla, A. Neuronal stem cells in the brain of adult vertebrates / A. Alvarez-Buylla, C. Lois // Stem Cells. - 1995. - Vol.13, №3. - P.263-272.

18. Andersen, P.M. Clinical genetics of amyotrophic lateral sclerosis: what do we really know? / P.M. Andersen, A. Al-Chalabi // Nat Rev Neurol. - 2011. -Vol.7, №11. - P.603-615

19. Appaiahgari, M.B. Adenoviruses as gene/vaccine delivery vectors: promises and pitfalls / M.B. Appaiahgari, S. Vrati // Expert Opin Biol Ther. -2015. - Vol.15, №3. - P.337-351

20. Appel, S.H. Activated microglia: the silent executioner in neurodegenerative disease? / S.H. Appel, E.P. Simpson // Curr Neurol Neurosci Rep. - 2001. - Vol.1, №4. - P.303-305

21. Appleby, S.L. Co-expression of a scFv antibody fragment and a reporter protein using lentiviral shuttle plasmid containing a self-processing furin-2A sequence / S.L. Appleby, Y. Irani, L.A. Mortimer, H.M. Brereton, S. Klebe, M.C.

Keane, P.J. Cowan, K.A. Williams // J Immunol Methods. - 2013. - Vol.397, №12. - P.61-65

22. Appledorn, D.M. Adenovirus vector-induced innate inflammatory mediators, MAPK signaling, as well as adaptive immune responses are dependent upon both TLR2 and TLR9 in vivo / D.M. Appledorn, S. Patial, A. McBride, S. Godbehere, [et al.] // J Immunol. - 2008. - Vol.181, №3. - P.2134-2144

23. Arber, C. The immunogenicity of virus-derived 2A sequences in immunocompetent individuals / C. Arber, H. Abhyankar, H.E. Heslop, M.K. Brenner, H. Liu, G. Dotti, B. Savoldo // Gene Ther. - 2013. - Vol.20, №9. -P.958-962

24. Arien-Zakay, H. Human umbilical cord blood stem cells: rational for use as a neuroprotectant in ischemic brain disease / H. Arien-Zakay, S. Lecht, A. Nagler, P. Lazarovici // Int J Mol Sci. - 2010. - Vol.11, №9. - P.3513-3528

25. Arroyo, E.J., Promyelinating Schwann cells express Tst-1/SCIP/Oct-6 / E.J. Arroyo, J.R. Bermingham, Jr., M.G. Rosenfeld, S.S. Scherer // J Neurosci. - 1998. - Vol.18, №19. - P.7891-7902

26. Audigier, S. Potent activation of FGF-2 IRES-dependent mechanism of translation during brain development / S. Audigier, J. Guiramand, L. Prado-Lourenco, C. Conte, [et al.] // Rna. - 2008. - Vol.14, №9. - P.1852-1864

27. Ayalla, Y.M. TDP43 depletion rescues aberrant CFTR exon 9 skipping / Y.M. Ayala, F. Pagani, F.E. Baralle // FEBS Lett. - 2006. - Vol.580, №5. -P.1339-1344

28. Azzouz, M. Lentiviral vectors for treating and modeling human CNS disorders / M. Azzouz, S.M. Kingsman, N.D. Mazarakis // J Gene Med. - 2004. -Vol.6, №9. - P.951-962

29. Baralle, M. The role of TDP-43 in the pathogenesis of ALS and FTLD / M. Baralle, E. Buratti, F.E. Baralle // Biochem Soc Trans. - 2013. - Vol.41, №6. -P.1536-1540

30. Barker, N. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs / N. Barker, S. Bartfeld, H. Clevers // Cell Stem Cell. - 2010. -Vol.7, №6. - P.656-670

31. Beckman, R. Architecture of the protein-conducting channel associated with the translating 80S ribosome / R. Beckmann, C.M. Spahn, N. Eswar, J. Helmers, P.A. Penczek, [et al.] // Cell. - 2001. - Vol.107, №3. - P.361-372

32. Behrstock, S. Human neural progenitors deliver glial cell line-derived neurotrophic factor to parkinsonian rodents and aged primates / S. Behrstock, A. Ebert, J. McHugh, S. Vosberg, [et al.] // Gene Ther. - 2006. - Vol.13, №5. -P.379-388

33. Belsham, G.J. Translation and replication of FMDV RNA / G.J. Belsham // Curr Top Microbiol Immunol. - 2005. - Vol.288. - P.43-70

34. Belzil, V.V. Mutations in FUS cause FALS and SALS in French and French Canadian populations / V.V. Belzil, P.N. Valdmanis, P.A. Dion, H. Daoud, E. Kabashi, [et al.] // Neurology. - 2009. - Vol.73, №15. - P.1176-1179

35. Benevento, M. Adenovirus composition, proteolysis, and disassembly studied by in-depth qualitative and quantitative proteomics / M. Benevento, S. Di Palma, J. Snijder, C.L. Moyer, [et al.] // J Biol Chem. - 2014. - Vol.289, №16. -P.11421-11430

36. Berges, B.K. Transduction of brain by herpes simplex virus vectors / B.K. Berges, J.H. Wolfe, N.W. Fraser // Mol Ther. - 2007. - Vol.15, №1. - P.20-29

37. Bernstein, J. PDGF2/c-sis mRNA leader contains a differentiation-linked internal ribosomal entry site (D-IRES) / J. Bernstein, O. Sella, S.Y. Le, O. Elroy-Stein // J Biol Chem. - 1997. - Vol.272, №14. - P.9356-9362

38. Bett, A.J. An efficient and flexible system for construction of adenovirus vectors with insertions or deletions in early regions 1 and 3 / A.J. Bett, W. Haddara, L. Prevec, F.L. Graham // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1994. - Vol.91, №19. - P.8802-8806

39. Bird, A.P. CpG-rich islands and the function of DNA methylation / A.P. Bird // Nature. - 1986. - Vol.321, №6067. - P.209-213

40. Blanquer, M. A surgical technique of spinal cord cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis / M. Blanquer, M.A. Perez-Espejo, J.F. Martinez-Lage, F. Iniesta, [et al.] // J Neurosci Methods. - 2010. - Vol.191, №2. - P.255-257

41. Boillee, S. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia / S. Boillee, K. Yamanaka, C.S. Lobsiger, N.G. Copeland, N.A. Jenkins, [et al.] // Science. - 2006. - Vol.312, №5778. - P.1389-1392

42. Bornes, S. Translational induction of VEGF internal ribosome entry site elements during the early response to ischemic stress / S. Bornes, L. Prado-Lourenco, A. Bastide, C. Zanibellato, [et al.] // Circ Res. - 2007. - Vol.100, №3. -P.305-308

43. Bose, J.K. TDP-43 overexpression enhances exon 7 inclusion during the survival of motor neuron pre-mRNA splicing / J.K. Bose, I.F. Wang, L. Hung, W.Y. Tarn, C.K. Shen // J Biol Chem. - 2008. - Vol.283, №43. - P.28852-28859

44. Braunstein, S. A hypoxia-controlled cap-dependent to cap-independent translation switch in breast cancer / S. Braunstein, K. Karpisheva, C. Pola, J. Goldberg, T. Hochman, [et al.] // Mol Cell. - 2007. - Vol.28, №3. - P.501-512

45. Bruijn, L.I. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1 / L.I. Bruijn, M.K. Houseweart, S. Kato, K.L. Anderson, S.D. Anderson, E. Ohama, A.G. Reaume, R.W. Scott, D.W. Cleveland // Science. - 1998. - Vol.281, №5384. - P.1851-1854

46. Buratti, E. Multiple roles of TDP-43 in gene expression, splicing regulation, and human disease / E. Buratti, F.E. Baralle // Front Biosci. - 2008. -Vol.13. - P.867-878

47. Buratti, E. TDP-43 binds heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A/B through its C-terminal tail: an important region for the inhibition of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator exon 9 splicing / E. Buratti, A. Brindisi, M. Giombi, S. Tisminetzky, [et al.] // J Biol Chem. - 2005. - Vol.280, №45. -P.37572-37584

48. Burger, C. Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system / C. Burger, O.S. Gorbatyuk, M.J. Velardo, [et al.] // Mol Ther. - 2004. - Vol.10, №2. - P.302-317

49. Camper, N. Stable expression and purification of a functional processed Fab' fragment from a single nascent polypeptide in CHO cells expressing the mCAT-1 retroviral receptor / N. Camper, T. Byrne, R.E. Burden, J. Lowry, [et al.] // J Immunol Methods. - 2011. - Vol.372, №1-2. - P.30-41

50. Cearley, C.N. Expanded repertoire of AAV vector serotypes mediate unique patterns of transduction in mouse brain / C.N. Cearley, L.H. Vandenberghe, M.K. Parente, E.R. Carnish, [et al.] // Mol Ther. - 2008. - Vol.16, №10. - P.1710-1718

51. Cearley, C.N. Transduction characteristics of adeno-associated virus vectors expressing cap serotypes 7, 8, 9, and Rh10 in the mouse brain / C.N. Cearley, J.H. Wolfe // Mol Ther. - 2006. - Vol.13, №3. - P.528-537

52. Chae, J.K. Coadministration of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor enhances collateral vascularization / J.K. Chae, I. Kim, S.T. Lim, M.J. Chung, [et al.] // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2000. - Vol.20, №12. -P.2573-2578

53. Chang, C.W. Efficient expression of vascular endothelial growth factor using minicircle DNA for angiogenic gene therapy / C.W. Chang, L.V. Christensen, M. Lee, S.W. Kim // J Control Release. - 2008. - Vol.125, №2. -P.155-163

54. Chen, R. The potential for the use of mononuclear cells from human umbilical cord blood in the treatment of amyotrophic lateral sclerosis in SOD1 mice / R. Chen, N. Ende // J Med. - 2000. - Vol.31, №1-2. - P.21-30

55. Chio, A. Epidemiology of ALS in Italy: a 10-year prospective population-based study / A. Chio, G. Mora, A. Calvo, L. Mazzini, [et al.] // Neurology. -2009. - Vol.72, №8. - P.725-731

56. Chng, J. Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expression in CHO cells / J. Chng, T. Wang, R. Nian, A. Lau, [et al.] // MAbs. -2015. - Vol.7, №2. - P.403-412

57. Clement, A.M. Wild-type nonneuronal cells extend survival of SOD1 mutant motor neurons in ALS mice / A.M. Clement, M.D. Nguyen, E.A. Roberts, M.L. Garcia, S. Boillee, [et al.] // Science. - 2003. - Vol.302, №5642. - P.113-117

58. Cleveland, D.W. From Charcot to SOD1: mechanisms of selective motor neuron death in ALS / D.W. Cleveland // Neuron. - 1999. - Vol.24, №3. - P.515-520

59. Cohen, S.N. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro / S.N. Cohen, A.C. Chang, H.W. Boyer, R.B. Helling // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1973. - Vol.70, №11. - P.3240-3244

60. Coldwell, M.J. Initiation of Apaf-1 translation by internal ribosome entry / M.J. Coldwell, S.A. Mitchell, M. Stoneley, M. MacFarlane, A.E. Willis // Oncogene. - 2000. - Vol.19, №7. - P.899-905

61. Conte, A. P525L FUS mutation is consistently associated with a severe form of juvenile amyotrophic lateral sclerosis / A. Conte, S. Lattante, M. Zollino, G. Marangi, M. Luigetti, [et al.] // Neuromuscul Disord. - 2012. - Vol.22, №1. -P.73-75

62. Conte, C. Fibroblast growth factor 1 induced during myogenesis by a transcription-translation coupling mechanism / C. Conte, N. Ainaoui, A. Delluc-Clavieres, M.P. Khoury, R. Azar, [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2009. - Vol.37, №16. - P.5267-5278

63. Conte, C. FGF2 translationally induced by hypoxia is involved in negative and positive feedback loops with HIF-1alpha / C. Conte, E. Riant, C. Toutain, F. Pujol, [et al.] // PLoS One. - 2008. - Vol.3, №8. - P.e3078

64. Cornelis, S. Identification and characterization of a novel cell cycle-regulated internal ribosome entry site / S. Cornelis, Y. Bruynooghe, G. Denecker, S. Van Huffel, S. Tinton, R. Beyaert // Mol Cell. - 2000. - Vol.5, №4. - P.597-605

65. Corti, S. Systemic transplantation of c-kit+ cells exerts a therapeutic effect in a model of amyotrophic lateral sclerosis / S. Corti, M. Nizzardo, M. Nardini, C. Donadoni, S. Salani, [et al.] // Hum Mol Genet. - 2010. - Vol.19, №19. - P.3782-3796

66. Creancier, L. c-myc Internal ribosome entry site activity is developmentally controlled and subjected to a strong translational repression in adult transgenic mice / L. Creancier, P. Mercier, A.C. Prats, D. Morello // Mol Cell Biol. - 2001. -Vol.21, №5. - P.1833-1840

67. Creancier, L. Fibroblast growth factor 2 internal ribosome entry site (IRES) activity ex vivo and in transgenic mice reveals a stringent tissue-specific regulation / L. Creancier, D. Morello, P. Mercier, A.C. Prats // J Cell Biol. - 2000. - Vol.150, №1. - P.275-281

68. Daoud, H. Contribution of TARDBP mutations to sporadic amyotrophic lateral sclerosis / H. Daoud, P.N. Valdmanis, E. Kabashi, P. Dion, [et al.] // J Med Genet. - 2009. - Vol.46, №2. - P.112-114

69. de Felipe, P. Polycistronic viral vectors / P. de Felipe // Curr Gene Ther. -2002. - Vol.2, №3. - P.355-378

70. de Felipe, P. Co-translational, intraribosomal cleavage of polypeptides by the foot-and-mouth disease virus 2A peptide / P. de Felipe, L.E. Hughes, M.D. Ryan, J.D. Brown // J Biol Chem. - 2003. - Vol.278, №13. - P. 11441-11448

71. de Felipe, P. Inhibition of 2A-mediated 'cleavage' of certain artificial polyproteins bearing N-terminal signal sequences / P. de Felipe, G.A. Luke, J.D. Brown, M.D. Ryan // Biotechnol J. - 2010. - Vol.5, №2. - P.213-223

72. de Felipe, P. Targeting of proteins derived from self-processing polyproteins containing multiple signal sequences / P. de Felipe, M.D. Ryan // Traffic. - 2004. - Vol.5, №8. - P.616-626

73. de Filippis, L. Neural stem cell-mediated therapy for rare brain diseases: perspectives in the near future for LSDs and MNDs / L. de Filippis // Histol Histopathol. - 2011. - Vol.26, №8. - P.1093-1109

74. Delluc-Clavieres, A. Efficient gene transfer in skeletal muscle with AAV-derived bicistronic vector using the FGF-1 IRES / A. Delluc-Clavieres, C. Le Bec, L. Van den Berghe, C. Conte, [et al.] // Gene Ther. - 2008. - Vol.15, №15. -P.1090-1098

75. Deyle, D.R. Adeno-associated virus vector integration / D.R. Deyle, D.W. Russell // Curr Opin Mol Ther. - 2009. - Vol.11, №4. - P.442-447

76. Di Giorgio, F.P. Non-cell autonomous effect of glia on motor neurons in an embryonic stem cell-based ALS model / F.P. Di Giorgio, M.A. Carrasco, M.C. Siao, T. Maniatis, K. Eggan // Nat Neurosci. - 2007. - Vol.10, №5. - P.608-614

77. Dimos, J.T. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons / J.T. Dimos, K.T. Rodolfa, K.K. Niakan, L.M. Weisenthal, H. Mitsumoto, [et al.] // Science. - 2008. - Vol.321, №5893. - P.1218-1221

78. Donnelly, M.L. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein 'cleavage' mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal 'skip' / M.L. Donnelly, G. Luke, A. Mehrotra, X. Li, [et al.] // J Gen Virol. - 2001. - Vol.82, №5. - P.1013-1025

79. Dormann, D. ALS-associated fused in sarcoma (FUS) mutations disrupt Transportin-mediated nuclear import / D. Dormann, R. Rodde, D. Edbauer, E. Bentmann, I. Fischer, [et al.] // EMBO J. - 2010. - Vol.29, №16. - P.2841-2857

80. Doronina, V.A. Dissection of a co-translational nascent chain separation event / V.A. Doronina, P. de Felipe, C. Wu, P. Sharma, [et al.] // Biochem Soc Trans. - 2008. - Vol.36, №Pt 4. - P.712-716

81. Dreyer, J.L. Lentiviral vector-mediated gene transfer and RNA silencing technology in neuronal dysfunctions / J.L. Dreyer // Mol Biotechnol. - 2011. -Vol.47, №2. - P.169-187

82. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system / T. Dull, R. Zufferey, M. Kelly, R.J. Mandel, [et al.] // J Virol. - 1998. -Vol.72, №11. - P.8463-8471

83. Eisenhaber, B. Enzymes and auxiliary factors for GPI lipid anchor biosynthesis and post-translational transfer to proteins / B. Eisenhaber, S. MaurerStroh, M. Novatchkova, G. Schneider, F. Eisenhaber // Bioessays. - 2003. -Vol.25, №4. - P.367-385

84. El Amrani, A. Coordinate expression and independent subcellular targeting of multiple proteins from a single transgene / A. El Amrani, A. Barakate, B.M. Askari, X. Li, [et al.] // Plant Physiol. - 2004. - Vol.135, №1. - P.16-24

85. Fang, J. Stable antibody expression at therapeutic levels using the 2A peptide / J. Fang, J.J. Qian, S. Yi, T.C. Harding, [et al.] // Nat Biotechnol. - 2005.

- Vol.23, №5. - P.584-590

86. Fang, J. An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo / J. Fang, S. Yi, A. Simmons, G.H. Tu, M. Nguyen, [et al.] // Mol Ther. - 2007. - Vol.15, №6. - P.1153-1159

87. Fernandez, N. Structural analysis provides insights into the modular organization of picornavirus IRES / N. Fernandez, A. Garcia-Sacristan, J. Ramajo, C. Briones, E. Martinez-Salas // Virology. - 2011. - Vol.409, №2. - P.251-261

88. Ferraiuolo, L. Molecular pathways of motor neuron injury in amyotrophic lateral sclerosis / L. Ferraiuolo, J. Kirby, A.J. Grierson, M. Sendtner, P.J. Shaw // Nat Rev Neurol. - 2011. - Vol.7, №11. - P.616-630

89. Field, L.S. Factors controlling the uptake of yeast copper/zinc superoxide dismutase into mitochondria / L.S. Field, Y. Furukawa, T.V. O'Halloran, V.C. Culotta // J Biol Chem. - 2003. - Vol.278, №30. - P.28052-28059

90. Fussenegger, M. pQuattro vectors allow one-step multigene metabolic engineering and auto-selection of quattrocistronic artificial mammalian operons / M. Fussenegger, S. Moser, J.E. Bailey // Cytotechnology. - 1998. - Vol.28, №1-3.

- P.229-235

91. Gamez, J. Cellular transplants in amyotrophic lateral sclerosis patients: an observational study / J. Gamez, F. Carmona, N. Raguer, J. Ferrer-Sancho, G.A. Martin-Henao, [et al.] // Cytotherapy. - 2010. - Vol.12, №5. - P.669-677

92. Garbuzova-Davis, S. Ultrastructure of blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier in SOD1 mice modeling ALS / S. Garbuzova-Davis, E. Haller, S. Saporta, I. Kolomey, [et al.] // Brain Res. - 2007. - Vol.1157. - P.126-137

93. Garbuzova-Davis, S. Multiple intravenous administrations of human umbilical cord blood cells benefit in a mouse model of ALS / S. Garbuzova-Davis, M.C. Rodrigues, S. Mirtyl, S. Turner, S. Mitha, [et al.] // PLoS One. - 2012. -Vol.7, №2. - P.e31254

94. Garbuzova-Davis, S Human umbilical cord blood treatment in a mouse model of ALS: optimization of cell dose / S. Garbuzova-Davis, C.D. Sanberg, N. Kuzmin-Nichols, A.E. Willing, C. Gemma, [et al.] // PLoS One. - 2008. - Vol.3, №6. - P.e2494

95. Garbuzova-Davis, S Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation / S. Garbuzova-Davis, A.E. Willing, T. Zigova, S. Saporta, E.B. Justen, [et al.] // J Hematother Stem Cell Res. - 2003. - Vol.12, №3. - P.255-270

96. Gonzalez-Herrera, I.G. Testosterone regulates FGF-2 expression during testis maturation by an IRES-dependent translational mechanism / I.G. Gonzalez-Herrera, L. Prado-Lourenco, F. Pileur, C. Conte, [et al.] // Faseb j. - 2006. -Vol.20, №3. - P.476-478

97. Greggio, S. Intra-arterial transplantation of human umbilical cord blood mononuclear cells in neonatal hypoxic-ischemic rats / S. Greggio, S. de Paula, P.N. Azevedo, G.T. Venturin, J.C. Dacosta // Life Sci. - 2014. - Vol.96, №1-2. - P.33-39

98. Grieger, J.C. Production and characterization of adeno-associated viral vectors / J.C. Grieger, V.W. Choi, R.J. Samulski // Nat Protoc. - 2006. - Vol.1, №3. - P.1412-1428

99. Groen, E.J. ALS-associated mutations in FUS disrupt the axonal distribution and function of SMN / E.J. Groen, K. Fumoto, A.M. Blokhuis, J.

Engelen-Lee, Y. Zhou, [et al.] // Hum Mol Genet. - 2013. - Vol.22, №18. -P.3690-3704.

100. Grundstrom, E. GDNF but not BDNF is increased in cerebrospinal fluid in amyotrophic lateral sclerosis / E. Grundstrom, D. Lindholm, A. Johansson, K. Blennow, H. Askmark // Neuroreport. - 2000. - Vol. 11, №8. - P.1781-1783

101. Guan, Y.J. Increased stem cell proliferation in the spinal cord of adult amyotrophic lateral sclerosis transgenic mice / Y.J. Guan, X. Wang, H.Y. Wang, K. Kawagishi, [et al.] // J Neurochem. - 2007. - Vol.102, №4. - P.1125-1138

102. Haj-Yasein, N.N. Glial-conditional deletion of aquaporin-4 (Aqp4) reduces blood-brain water uptake and confers barrier function on perivascular astrocyte endfeet / N.N. Haj-Yasein, G.F. Vindedal, M. Eilert-Olsen, G.A. Gundersen, O. Skare, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2011. - Vol.108, №43. - P.17815-17820

103. Halpin, C. Self-processing 2A-polyproteins--a system for co-ordinate expression of multiple proteins in transgenic plants / C. Halpin, S.E. Cooke, A. Barakate, A. El Amrani, M.D. Ryan // Plant J. - 1999. - Vol.17, №4. - P.453-459

104. Harper, S.Q. Progress and challenges in RNA interference therapy for Huntington disease / S.Q. Harper // Arch Neurol. - 2009. - Vol.66, №8. - P.933-938

105. Harvey, B.K. HSV amplicon delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor is neuroprotective against ischemic injury / B.K. Harvey, C.F. Chang, Y.H. Chiang, W.J. Bowers, M. Morales, [et al.] // Exp Neurol. - 2003. - Vol.183, №1. -P.47-55

106. He, B. Stable expression of native Coagulation factor VIII using the 2A self-processing sequence and furin cleavage site / B. He, Y. Pan, L. Chen, Y. Xu, N. Chen, [et al.] // Thromb Res. - 2011. - Vol.128, №6. - P.e148-153

107. Hendrickx, R. Innate immunity to adenovirus / R. Hendrickx, N. Stichling, J. Koelen, L. Kuryk, [et al.] // Hum Gene Ther. - 2014. - Vol.25, №4. - P.265-284

108. Henkel, J.S. Microglia in ALS: the good, the bad, and the resting / J.S. Henkel, D.R. Beers, W. Zhao, S.H. Appel // J Neuroimmune Pharmacol. - 2009. -Vol.4, №4. - P.389-398

109. Hentati, A. Linkage of a commoner form of recessive amyotrophic lateral sclerosis to chromosome 15q15-q22 markers / A. Hentati, K. Ouahchi, M.A. Pericak-Vance, D. Nijhawan, A. Ahmad, [et al.] // Neurogenetics. - 1998. - Vol.2, №1. - P.55-60

110. Hermening, S. Improved high-capacity adenoviral vectors for high-level neuron-restricted gene transfer to the CNS / S. Hermening, S. Kugler, M. Bahr, S. Isenmann // J Virol Methods. - 2006. - Vol.136, №1-2. - P.30-37

111. Hirano, A. Fine structural study of neurofibrillary changes in a family with amyotrophic lateral sclerosis / A. Hirano, I. Nakano, L.T. Kurland, D.W. Mulder, P.W. Holley, G. Saccomanno // J Neuropathol Exp Neurol. - 1984. - Vol.43, №5. - P.471-480

112. Howland, D.S. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS) / D.S. Howland, J. Liu, Y. She, B. Goad, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2002. - Vol.99, №3. - P.1604-1609

113. Husi, H. Proteomic analysis of NMDA receptor-adhesion protein signaling complexes / H. Husi, M.A. Ward, J.S. Choudhary, W.P. Blackstock, S.G. Grant // Nat Neurosci. - 2000. - Vol.3, №7. - P.661-669

114. Ilan, Y. Insertion of the adenoviral E3 region into a recombinant viral vector prevents antiviral humoral and cellular immune responses and permits long-term gene expression / Y. Ilan, G. Droguett, N.R. Chowdhury, Y. Li, K. Sengupta, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1997. - Vol.94, №6. - P.2587-2592

115. Islamov, R.R. Symptomatic improvement, increased life-span and sustained cell homing in amyotrophic lateral sclerosis after transplantation of human umbilical cord blood cells genetically modified with adeno-viral vectors expressing a neuro-protective factor and a neural cell adhesion molecule / R.R. Islamov, A.A.

Rizvanov, M.A. Mukhamedyarov, Salafutdinov, II, E.E. Garanina, [et al.] // Curr Gene Ther. - 2015. - Vol.15, №3. - P.266-276

116. Ito, D. Nuclear transport impairment of amyotrophic lateral sclerosis-linked mutations in FUS/TLS / D. Ito, M. Seki, Y. Tsunoda, H. Uchiyama, N. Suzuki // Ann Neurol. - 2011. - Vol.69, №1. - P.152-162

117. Jazwa, A. Combined vascular endothelial growth factor-A and fibroblast growth factor 4 gene transfer improves wound healing in diabetic mice / A. Jazwa, P. Kucharzewska, J. Leja, A. Zagorska, A. Sierpniowska, [et al.] // Genet Vaccines Ther. - 2010. - Vol.8. - P.6

118. Johnson, P.A. Cytotoxicity of a replication-defective mutant of herpes simplex virus type 1 / P.A. Johnson, A. Miyanohara, F. Levine, T. Cahill, T. Friedmann // J Virol. - 1992. - Vol.66, №5. - P.2952-2965

119. Jostock, T. Combination of the 2A/furin technology with an animal component free cell line development platform process / T. Jostock, Z. Dragic, J. Fang, K. Jooss, [et al.] // Appl Microbiol Biotechnol. - 2010. - Vol.87, №4. -P.1517-1524

120. Ju, S. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity / S. Ju, D.F. Tardiff, H. Han, K. Divya, [et al.] // PLoS Biol. - 2011. - Vol.9, №4. - e1001052

121. Kantor, B. Methods for gene transfer to the central nervous system / B. Kantor, R.M. Bailey, K. Wimberly, S.N. Kalburgi, S.J. Gray // Adv Genet. - 2014. - Vol.87. - P.125-197

122. Kaplitt, M.G. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain / M.G. Kaplitt, P. Leone, R.J. Samulski, X. Xiao, [et al.] // Nat Genet. - 1994. - Vol.8, №2. - P.148-154

123. Karussis, D. Safety and immunological effects of mesenchymal stem cell transplantation in patients with multiple sclerosis and amyotrophic lateral sclerosis / D. Karussis, C. Karageorgiou, A. Vaknin-Dembinsky, B. Gowda-Kurkalli, J.M. Gomori, [et al.] // Arch Neurol. - 2010. - Vol.67, №10. - P.1187-1194

124. Kawasaki, T. Oct6, a transcription factor controlling myelination, is a marker for active nerve regeneration in peripheral neuropathies / T. Kawasaki, N.

Oka, H. Tachibana, I. Akiguchi, H. Shibasaki // Acta Neuropathol. - 2003. -Vol.105, №3. - P.203-208

125. Kiernan, M.C. Amyotrophic lateral sclerosis / M.C. Kiernan, S. Vucic, B.C. Cheah, M.R. Turner, [et al.] // Lancet. - 2011. - Vol.377, №9769. - P.942-955

126. Kirchmaier, S. Golden GATEway cloning--a combinatorial approach to generate fusion and recombination constructs / S. Kirchmaier, K. Lust, J. Wittbrodt // PLoS One. - 2013. - Vol.8, №10. - e76117

127. Klump, H. Retroviral vector-mediated expression of HoxB4 in hematopoietic cells using a novel coexpression strategy / H. Klump, B. Schiedlmeier, B. Vogt, M. Ryan, [et al.] // Gene Ther. - 2001. - Vol.8, №10. -P.811-817

128. Kozak, M. Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes / M. Kozak // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1986. - Vol.83, №9. - P.2850-2854

129. Krisky, D.M. Deletion of multiple immediate-early genes from herpes simplex virus reduces cytotoxicity and permits long-term gene expression in neurons / D.M. Krisky, D. Wolfe, W.F. Goins, P.C. Marconi, [et al.]// Gene Ther. -1998. - Vol.5, №12. - P.1593-1603

130. Kupatt, C. Cotransfection of vascular endothelial growth factor-A and platelet-derived growth factor-B via recombinant adeno-associated virus resolves chronic ischemic malperfusion role of vessel maturation / C. Kupatt, R. Hinkel, A. Pfosser, C. El-Aouni, A. Wuchrer, [et al.] // J Am Coll Cardiol. - 2010. - Vol.56, №5. - P.414-422

131. Kutach, A.K. The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters / A.K. Kutach, J.T. Kadonaga // Mol Cell Biol. - 2000. - Vol.20, №13. - P.4754-4764

132. Kwiatkowski, T. Mutations in the FUS/TLS gene on chromosome 16 cause familial amyotrophic lateral sclerosis / T.J. Kwiatkowski, Jr., D.A. Bosco, A.L. Leclerc, E. Tamrazian, C.R. Vanderburg, [et al.] // Science. - 2009. - Vol.323, №5918. - P.1205-1208

133. Kwon, I. Designer gene delivery vectors: molecular engineering and evolution of adeno-associated viral vectors for enhanced gene transfer / I. Kwon, D.V. Schaffer // Pharm Res. - 2008. - Vol.25, №3. - P.489-499

134. Lagier-Tourenne, C. TDP-43 and FUS/TLS: emerging roles in RNA processing and neurodegeneration / C. Lagier-Tourenne, M. Polymenidou, D.W. Cleveland // Hum Mol Genet. - 2010. - Vol.19, №R1. - P.46-64

135. Lagier-Tourenne, C. Divergent roles of ALS-linked proteins FUS/TLS and TDP-43 intersect in processing long pre-mRNAs / C. Lagier-Tourenne, M. Polymenidou, K.R. Hutt, A.Q. Vu, [et al.]// Nat Neurosci. - 2012. - Vol.15, №11. - P.1488-1497

136. Lagrange, T. New core promoter element in RNA polymerase II-dependent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB / T. Lagrange, A.N. Kapanidis, H. Tang, D. Reinberg, R.H. Ebright // Genes Dev. -1998. - Vol.12, №1. - P.34-44

137. Levi-Montalcini, R. The nerve growth factor 35 years later / R. Levi-Montalcini // Science. - 1987. - Vol.237, №4819. - P.1154-1162

138. Li, B. VEGF-induced activation of the PI3-K/Akt pathway reduces mutant SOD1-mediated motor neuron cell death / B. Li, W. Xu, C. Luo, D. Gozal, R. Liu // Brain Res Mol Brain Res. - 2003. - Vol. 111, №1-2. - P.155-164

139. Li, W. Muscle-derived but not centrally derived transgene GDNF is neuroprotective in G93A-SOD1 mouse model of ALS / W. Li, D. Brakefield, Y. Pan, D. Hunter, T.M. Myckatyn, A. Parsadanian // Exp Neurol. - 2007. - Vol.203, №2. - P.457-471

140. Li, Z.H. Improved therapeutic outcome following combination immunogene vaccination therapy in murine myeloma / Z.H. Li, X.Y. Wen, S. Mandelbaum, N. Falcioni, T.S. Hawley, [et al.] // Leuk Lymphoma. - 2003. - Vol.44, №10. -P.1775-1784

141. Lim, S.T. Viral vectors for neurotrophic factor delivery: a gene therapy approach for neurodegenerative diseases of the CNS / S.T. Lim, M. Airavaara, B.K. Harvey // Pharmacol Res. - 2010. - Vol.61, №1. - P.14-26

142. Lin, J.M. Transcription factor binding and modified histones in human bidirectional promoters / J.M. Lin, P.J. Collins, N.D. Trinklein, Y. Fu, H. Xi, R.M. Myers, Z. Weng // Genome Res. - 2007. - Vol.17, №6. - P.818-827

143. Liu, H. Atomic structure of human adenovirus by cryo-EM reveals interactions among protein networks / H. Liu, L. Jin, S.B. Koh, I. Atanasov, S. Schein, [et al.] // Science. - 2010. - Vol.329, №5995. - P.1038-1043

144. Liu, J. Toxicity of familial ALS-linked SOD1 mutants from selective recruitment to spinal mitochondria / J. Liu, C. Lillo, P.A. Jonsson, C. Vande Velde, [et al.]// Neuron. - 2004. - Vol.43, №1. - P.5-17

145. Lorens, J.B. Stable, stoichiometric delivery of diverse protein functions / J.B. Lorens, D.M. Pearsall, S.E. Swift, B. Peelle, [et al.] // J Biochem Biophys Methods. - 2004. - Vol.58, №2. - P.101-110

146. Luke, G.A. Occurrence, function and evolutionary origins of '2A-like' sequences in virus genomes / G.A. Luke, P. de Felipe, A. Lukashev, S.E. Kallioinen, [et al.] // J Gen Virol. - 2008. - Vol.89, №Pt 4. - P.1036-1042

147. Lunn, J.S. Stem cells: comprehensive treatments for amyotrophic lateral sclerosis in conjunction with growth factor delivery / J.S. Lunn, M.P. Hefferan, M. Marsala, E.L. Feldman // Growth Factors. - 2009. - Vol.27, №3. - P.133-140

148. Ma, D.K. Adult neural stem cells in the mammalian central nervous system / D.K. Ma, M.A. Bonaguidi, G.L. Ming, H. Song // Cell Res. - 2009. - Vol.19, №6. - P.672-682

149. Machitani, M. Adenovirus Vector-Derived VA-RNA-Mediated Innate Immune Responses / M. Machitani, T. Yamaguchi, K. Shimizu, F. Sakurai, K. Katayama, [et al.] // Pharmaceutics. - 2011. - Vol.3, №3. - P.338-353

150. Mackenzie, I.R. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia / I.R. Mackenzie, R. Rademakers, M. Neumann // Lancet Neurol. - 2010. - Vol.9, №10. - P.995-1007

151. Maragakis, N.J. Stem cells and the ALS neurologist / N.J. Maragakis // Amyotroph Lateral Scler. - 2010. - Vol. 11, №5. - P.417-423

152. Marcel, V. p53 acts as a safeguard of translational control by regulating fibrillarin and rRNA methylation in cancer / V. Marcel, S.E. Ghayad, S. Belin, G. Therizols, A.P. Morel, [et al.] // Cancer Cell. - 2013. - Vol.24, №3. - P.318-330

153. Marchetto, M.C. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells / M.C. Marchetto, A.R. Muotri, Y. Mu, [et al.] // Cell Stem Cell. - 2008. - Vol.3, №6. -P.649-657

154. Martin, P. Development of a new bicistronic retroviral vector with strong IRES activity / P. Martin, O. Albagli, M.C. Poggi, K.E. Boulukos, P. Pognonec // BMC Biotechnol. - 2006. - Vol.6. - P.4

155. Martinez-Salas, E. A single nucleotide substitution in the internal ribosome entry site of foot-and-mouth disease virus leads to enhanced cap-independent translation in vivo / E. Martinez-Salas, J.C. Saiz, M. Davila, G.J. Belsham, E. Domingo // J Virol. - 1993. - Vol.67, №7. - P.3748-3755

156. Maruyama, H. Mutations of optineurin in amyotrophic lateral sclerosis / H. Maruyama, H. Morino, H. Ito, Y. Izumi, [et al.] // Nature. - 2010. - Vol.465, №7295. - P.223-226

157. Mattis, V.B. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology? / V.B. Mattis, C.N. Svendsen // Lancet Neurol. - 2011. - Vol.10, №4. - P.383-394

158. Mello, C.C. Revealing the world of RNA interference / C.C. Mello, D. Conte, Jr. // Nature. - 2004. - Vol.431, №7006. - P.338-342

159. Menetret, J.F. The structure of ribosome-channel complexes engaged in protein translocation / J.F. Menetret, A. Neuhof, D.G. Morgan, K. Plath, [et al.] // Mol Cell. - 2000. - Vol.6, №5. - P.1219-1232

160. Miller, T.M. Gene transfer demonstrates that muscle is not a primary target for non-cell-autonomous toxicity in familial amyotrophic lateral sclerosis / T.M. Miller, S.H. Kim, K. Yamanaka, M. Hester, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. -2006. - Vol.103, №51. - P.19546-19551

161. Miller, V.M. RNA interference in neuroscience: progress and challenges / V.M. Miller, H.L. Paulson, P. Gonzalez-Alegre // Cell Mol Neurobiol. - 2005. -Vol.25, №8. - P.1195-1207

162. Minamitani, T. Adenovirus virus-associated RNAs induce type I interferon expression through a RIG-I-mediated pathway / T. Minamitani, D. Iwakiri, K. Takada // J Virol. - 2011. - Vol.85, №8. - P.4035-4040

163. Minskaia, E. Optimisation of the foot-and-mouth disease virus 2A co-expression system for biomedical applications / E. Minskaia, J. Nicholson, M.D. Ryan // BMC Biotechnol. - 2013. - Vol.13. - P.67

164. Mitne-Neto, M. Downregulation of VAPB expression in motor neurons derived from induced pluripotent stem cells of ALS8 patients / M. Mitne-Neto, M. Machado-Costa, M.C. Marchetto, [et al.] // Hum Mol Genet. - 2011. - Vol.20, №18. - P.3642-3652

165. Mukhamedshina, Y.O. Adenoviral vector carrying glial cell-derived neurotrophic factor for direct gene therapy in comparison with human umbilical cord blood cell-mediated therapy of spinal cord injury in rat / Y.O., G.F. Shaymardanova, E.E. Garanina [et al.] // Spinal Cord. - 2015. - [Epub ahead of print]

166. Murmu, R.P. Cellular distribution and subcellular localization of spatacsin and spastizin, two proteins involved in hereditary spastic paraplegia / R.P. Murmu, E. Martin, A. Rastetter, T. Esteves, [et al.] // Mol Cell Neurosci. - 2011. - Vol.47, №3. - P.191-202

167. Murray, L.M. Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy / L.M. Murray, K. Talbot, T.H. Gillingwater // Neuropathol Appl Neurobiol. - 2010. -Vol.36, №2. - P.133-156

168. Naegele, J.R. Recent advancements in stem cell and gene therapies for neurological disorders and intractable epilepsy / J.R. Naegele, X. Maisano, J. Yang, S. Royston, E. Ribeiro // Neuropharmacology. - 2010. - Vol.58, №6. -P.855-864

169. Nagai, M. Astrocytes expressing ALS-linked mutated SOD1 release factors selectively toxic to motor neurons / M. Nagai, D.B. Re, T. Nagata, A. Chalazonitis, T.M. Jessell, [et al.] // Nat Neurosci. - 2007. - Vol.10, №5. - P.615-622

170. Nagelhus, E.A. Immunogold evidence suggests that coupling of K+ siphoning and water transport in rat retinal Muller cells is mediated by a coenrichment of Kir4.1 and AQP4 in specific membrane domains / E.A. Nagelhus, Y. Horio, A. Inanobe, A. Fujita, [et al.] // Glia. - 1999. - Vol.26, №1. - P.47-54

171. Naldini, L. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector / L. Naldini, U. Blomer, P. Gallay, D. Ory, R. Mulligan, [et al.]// Science. - 1996. - Vol.272, №5259. - P.263-267

172. Nanbru, C. Alternative translation of the proto-oncogene c-myc by an internal ribosome entry site / C. Nanbru, I. Lafon, S. Audigier, M.C. Gensac, S. Vagner, [et al.] // J Biol Chem. - 1997. - Vol.272, №51. - P.32061-32066

173. Neumann, M. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis / M. Neumann, D.M. Sampathu, L.K. Kwong, A.C. Truax, M.C. Micsenyi, [et al.] // Science. - 2006. - Vol.314, №5796. -P.130-133

174. Nielsen, S. Specialized membrane domains for water transport in glial cells: high-resolution immunogold cytochemistry of aquaporin-4 in rat brain / S. Nielsen, E.A. Nagelhus, M. Amiry-Moghaddam, C. Bourque, [et al.] // J Neurosci. - 1997. - Vol.17, №1. - P.171-180

175. Nonaka, T. Phosphorylation of TAR DNA-binding Protein of 43 kDa (TDP-43) by Truncated Casein Kinase 1delta Triggers Mislocalization and Accumulation of TDP-43 / T. Nonaka, G. Suzuki, Y. Tanaka, F. Kametani, S. Hirai, [et al.] // J Biol Chem. - 2016. - Vol.291, №11. - P.5473-5483

176. Oehmig, A. Update on herpesvirus amplicon vectors / A. Oehmig, C. Fraefel, X.O. Breakefield // Mol Ther. - 2004. - Vol.10, №4. - P.630-643

177. Okado-Matsumoto, A. Subcellular distribution of superoxide dismutases (SOD) in rat liver: Cu,Zn-SOD in mitochondria / A. Okado-Matsumoto, I. Fridovich // J Biol Chem. - 2001. - Vol.276, №42. - P.38388-38393

178. Orlacchio, A. SPATACSIN mutations cause autosomal recessive juvenile amyotrophic lateral sclerosis / A. Orlacchio, C. Babalini, A. Borreca, C. Patrono, R. Massa, [et al.] // Brain. - 2010. - Vol.133, №Pt 2. - P.591-598

179. Palmenberg, A.C. Picornaviral processing: some new ideas / A.C. Palmenberg // J Cell Biochem. - 1987. - Vol.33, №3. - P.191-198

180. Pandya, R.S. Central nervous system agents for ischemic stroke: neuroprotection mechanisms / R.S. Pandya, L. Mao, H. Zhou, S. Zhou, [et al.] // Cent Nerv Syst Agents Med Chem. - 2011. - Vol. 11, №2. - P.81-97

181. Pastor, D. Comparative effects between bone marrow and mesenchymal stem cell transplantation in GDNF expression and motor function recovery in a motorneuron degenerative mouse model / D. Pastor, M.C. Viso-Leon, J. Jones, J. Jaramillo-Merchan, [et al.] // Stem Cell Rev. - 2012. - Vol.8, №2. - P.445-458

182. Pelletier, N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA / J. Pelletier, N. Sonenberg // Nature. - 1988. - Vol.334, №6180. - P.320-325

183. Pesiridis, G.S. Mutations in TDP-43 link glycine-rich domain functions to amyotrophic lateral sclerosis / G.S. Pesiridis, V.M. Lee, J.Q. Trojanowski // Hum Mol Genet. - 2009. - Vol.18, №R2. - P. 156-162

184. Pfutzner, W. Retroviral bicistronic vectors / W. Pfutzner // Drug News Perspect. - 2008. - Vol.21, №9. - P.473-480

185. Philpott, N.J. Use of nonintegrating lentiviral vectors for gene therapy / N.J. Philpott, A.J. Thrasher // Hum Gene Ther. - 2007. - Vol.18, №6. - P.483-489

186. Pichon, C. Chemical vectors for gene delivery: uptake and intracellular trafficking / C. Pichon, L. Billiet, P. Midoux // Curr Opin Biotechnol. - 2010. -Vol.21, №5. - P.640-645

187. Provost, E. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos / E. Provost, J. Rhee, S.D. Leach // Genesis. - 2007. - Vol.45, №10. - P.625-629

188. Qiao, C. A novel gene expression control system and its use in stable, high-titer 293 cell-based adeno-associated virus packaging cell lines / C. Qiao, B. Wang, X. Zhu, J. Li, X. Xiao // J Virol. - 2002. - Vol.76, №24. - P.13015-13027

189. Rademakers, R. Fus gene mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis / R. Rademakers, H. Stewart, M. Dejesus-Hernandez, C. Krieger, N. Graff-Radford, [et al.] // Muscle Nerve. - 2010. - Vol.42, №2. - P.170-176

190. Rahim, A.A. Efficient gene delivery to the adult and fetal CNS using pseudotyped non-integrating lentiviral vectors / A.A. Rahim, A.M. Wong, S.J. Howe, S.M. Buckley, [et al.] // Gene Ther. - 2009. - Vol.16, №4. - P.509-520

191. Ralph, G.S. Silencing mutant SOD1 using RNAi protects against neurodegeneration and extends survival in an ALS model / G.S. Ralph, P.A. Radcliffe, D.M. Day, J.M. Carthy, [et al.] // Nat Med. - 2005. - Vol.11, №4. -P.429-433

192. Raoul, C. Lentiviral-mediated silencing of SOD1 through RNA interference retards disease onset and progression in a mouse model of ALS / C. Raoul, T. Abbas-Terki, J.C. Bensadoun, S. Guillot, G. Haase, [et al.] // Nat Med. - 2005. -Vol.11, №4. - P.423-428

193. Reaume, A.G. Motor neurons in Cu/Zn superoxide dismutase-deficient mice develop normally but exhibit enhanced cell death after axonal injury / A.G. Reaume, J.L. Elliott, E.K. Hoffman, N.W. Kowall, R.J. Ferrante, [et al.] // Nat Genet. - 1996. - Vol.13, №1. - P.43-47

194. Reddy, V.S. Crystal structure of human adenovirus at 3.5 A resolution / V.S. Reddy, S.K. Natchiar, P.L. Stewart, G.R. Nemerow // Science. - 2010. -Vol.329, №5995. - P.1071-1075

195. Rizvanov, A.A. Genetically modified human umbilical cord blood cells expressing vascular endothelial growth factor and fibroblast growth factor 2 differentiate into glial cells after transplantation into amyotrophic lateral sclerosis transgenic mice / A.A. Rizvanov, D.S. Guseva, I.I. Salafutdinov, , N.V. Kudryashova, [et al.] // Exp Biol Med (Maywood). - 2011. - Vol.236, №1. - P.91-98

196. Rizvanov, A.A. Retrogradely transported siRNA silences human mutant SOD1 in spinal cord motor neurons / A.A. Rizvanov, M.A. Mukhamedyarov, A. Palotas, R.R. Islamov // Exp Brain Res. - 2009. - Vol.195, №1. - P.1-4

197. Rosen, D.R. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis / D.R. Rosen // Nature. - 1993. -Vol.364, №6435. - P.362

198. Rothstein, J. Excitotoxicity and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis / J.D. Rothstein // Clin Neurosci. - 1995. - Vol.3, №6. - P.348-359

199. Rothstein, J.D. Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate / J.D. Rothstein, M. Dykes-Hoberg, C.A. Pardo, [et al.] // Neuron. - 1996. - Vol.16, №3. - P.675-686

200. Rowland, L.P. Amyotrophic lateral sclerosis / L.P. Rowland, N.A. Shneider // N Engl J Med. - 2001. - Vol.344, №22. - P.1688-1700

201. Rux, J.J. Structural and phylogenetic analysis of adenovirus hexons by use of high-resolution x-ray crystallographic, molecular modeling, and sequence-based methods / J.J. Rux, P.R. Kuser, R.M. Burnett // J Virol. - 2003. - Vol.77, №17. -P.9553-9566

202. Ryan, M.D. Foot-and-mouth disease virus 2A oligopeptide mediated cleavage of an artificial polyprotein / M.D. RyanJ. Drew // Embo j. - 1994. -Vol.13, №4. - P.928-933

203. Ryan, M.D. Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediated by residues located within a 19 amino acid sequence / M.D. Ryan, A.M. King, G.P. Thomas // J Gen Virol. - 1991. - Vol.72 (Pt 11). - P.2727-2732

204. Sako, W. Nuclear factor kappa B expression in patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis and hereditary amyotrophic lateral sclerosis with optineurin mutations / W. Sako, H. Ito, M. Yoshida, H. Koizumi, [et al.] // Clin Neuropathol. - 2012. - Vol.31, №6. - P.418-423

205. Sakurai, F. Optimization of adenovirus serotype 35 vectors for efficient transduction in human hematopoietic progenitors: comparison of promoter

activities / F. Sakurai, K. Kawabata, T. Yamaguchi, T. Hayakawa, H. Mizuguchi // Gene Ther. - 2005. - Vol.12, №19. - P.1424-1433

206. Salehi, M. Mitochondrial membrane disruption by aggregation products of ALS-causing superoxide dismutase-1 mutants / M. Salehi, M. Nikkhah, A. Ghasemi, S.S. Arab // Int J Biol Macromol. - 2015. - Vol.75. - P.290-297

207. Santos-Silva, A. FGF/heparin differentially regulates Schwann cell and olfactory ensheathing cell interactions with astrocytes: a role in astrocytosis / A. Santos-Silva, R. Fairless, [et al.] // J Neurosci. - 2007. - Vol.27, №27. - P.7154-7167

208. Sarkis, C. Non-integrating lentiviral vectors / C. Sarkis, S. Philippe, J. Mallet, C. Serguera // Curr Gene Ther. - 2008. - Vol.8, №6. - P.430-437

209. Sasaki, S. Mitochondrial alterations in dorsal root ganglion cells in sporadic amyotrophic lateral sclerosis / S. Sasaki, Y. Horie, M. Iwata // Acta Neuropathol. -2007. - Vol.114, №6. - P.633-639

210. Sasaki, S. Dendritic synapses of anterior horn neurons in amyotrophic lateral sclerosis: an ultrastructural study / S. Sasaki, M. Iwata // Acta Neuropathol.

- 1996. - Vol.91, №3. - P.278-283

211. Sephton, C.F. TDP-43 is a developmentally regulated protein essential for early embryonic development / C.F. Sephton, S.K. Good, S. Atkin, C.M. Dewey, [et al.] // J Biol Chem. - 2010. - Vol.285, №9. - P.6826-6834

212. Shu, J. Silencing of bidirectional promoters by DNA methylation in tumorigenesis / J. Shu, J. Jelinek, H. Chang, L. Shen, T. Qin, [et al.] // Cancer Res.

- 2006. - Vol.66, №10. - P.5077-5084

213. Sims, K. Targeting adenoviral transgene expression to neurons / K. Sims, Z. Ahmed, A.M. Gonzalez, M.L. Read, [et al.] // Mol Cell Neurosci. - 2008. -Vol.39, №3. - P.411-417

214. Smale, S.T. The RNA polymerase II core promoter / S.T. Smale, J.T. Kadonaga // Annu Rev Biochem. - 2003. - Vol.72. - P.449-479

215. Southgate, T. Gene transfer into neural cells in vitro using adenoviral vectors / T. Southgate, K.M. Kroeger, C. Liu, P.R. Lowenstein, M.G. Castro // Curr Protoc Neurosci. - 2008. - Vol.Chapter 4. - P. 23

216. Sreedharan, J. TDP-43 mutations in familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis / J. Sreedharan, I.P. Blair, V.B. Tripathi, [et al.] // Science. - 2008. - Vol.319, №5870. - P.1668-1672

217. Steiner, D.F. The proprotein convertases / D.F. Steiner // Curr Opin Chem Biol. - 1998. - Vol.2, №1. - P.31-39

218. Stevanin, G. Mutations in SPG11, encoding spatacsin, are a major cause of spastic paraplegia with thin corpus callosum / G. Stevanin, F.M. Santorelli, H. Azzedine, P. Coutinho, [et al.] // Nat Genet. - 2007. - Vol.39, №3. - P.366-372

219. Storkebaum, E.Treatment of motoneuron degeneration by intracerebroventricular delivery of VEGF in a rat model of ALS / E. Storkebaum, D. Lambrechts, M. Dewerchin, M.P. Moreno-Murciano, [et al.] // Nat Neurosci. -2005. - Vol.8, №1. - P.85-92

220. Suhonen, J. Ex vivo and in vivo gene delivery to the brain / J. Suhonen, J. Ray, U. Blomer, F.H. Gage, B. Kaspar // Curr Protoc Hum Genet. - 2006. -Vol.Chapter 13. - P 13

221. Sun, M. Comparison of the capability of GDNF, BDNF, or both, to protect nigrostriatal neurons in a rat model of Parkinson's disease / M. Sun, L. Kong, X. Wang, X.G. Lu, Q. Gao, A.I. Geller // Brain Res. - 2005. - Vol.1052, №2. -P.119-129

222. Sun, Z. Molecular determinants and genetic modifiers of aggregation and toxicity for the ALS disease protein FUS/TLS / Z. Sun, Z. Diaz, X. Fang, M.P. Hart, A. Chesi, [et al.] // PLoS Biol. - 2011. - Vol.9, №4. - e1000614

223. Suzuki, M. Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS / M. Suzuki, J. McHugh, C. Tork, B. Shelley, A. Hayes, [et al.]// Mol Ther. -2008. - Vol.16, №12. - P.2002-2010

224. Sypecka, J. Mesenchymal cells of umbilical cord and umbilical cord blood as a source of human oligodendrocyte progenitors / J. Sypecka, A. Sarnowska // Life Sci. - 2015. - Vol.139. - P.24-29

225. Szilvassy, S.J. Differential homing and engraftment properties of hematopoietic progenitor cells from murine bone marrow, mobilized peripheral blood, and fetal liver / S.J. Szilvassy, T.E. Meyerrose, P.L. Ragland, B. Grimes // Blood. - 2001. - Vol.98, №7. - P.2108-2115

226. Szymczak, A.L. Correction of multi-gene deficiency in vivo using a single 'self-cleaving' 2A peptide-based retroviral vector / A.L. Szymczak, C.J. Workman, Y. Wang, K.M. Vignali, S. Dilioglou, [et al.] // Nat Biotechnol. - 2004. - Vol.22, №5. - P.589-594

227. Towne, C. Systemic AAV6 delivery mediating RNA interference against SOD1: neuromuscular transduction does not alter disease progression in fALS mice / C. Towne, C. Raoul, B.L. Schneider, P. Aebischer // Mol Ther. - 2008. -Vol.16, №6. - P.1018-1025

228. Towne, C. Neuroprotection by gene therapy targeting mutant SOD1 in individual pools of motor neurons does not translate into therapeutic benefit in fALS mice / C. Towne, V. Setola, B.L. Schneider, P. Aebischer // Mol Ther. -2011. - Vol.19, №2. - P.274-283

229. Traub, R. Research advances in amyotrophic lateral sclerosis, 2009 to 2010 / R. Traub, H. Mitsumoto, L.P. Rowland // Curr Neurol Neurosci Rep. - 2011. -Vol.11, №1. - P.67-77

230. Trinklein, N.D. An abundance of bidirectional promoters in the human genome / N.D. Trinklein, S.F. Aldred, S.J. Hartman, D.I. Schroeder, [et al.] // Genome Res. - 2004. - Vol.14, №1. - P.62-66

231. Tsuji, H. Molecular analysis and biochemical classification of TDP-43 proteinopathy / H. Tsuji, T. Arai, F. Kametani, T. Nonaka, [et al.] // Brain. - 2012. - Vol.135, №Pt 11. - P.3380-3391

232. Tuszynski, M.H. A phase 1 clinical trial of nerve growth factor gene therapy for Alzheimer disease / M.H. Tuszynski, L. Thal, M. Pay, D.P. Salmon, [et al.] // Nat Med. - 2005. - Vol.11, №5. - P.551-555

233. Uesaka, M. Bidirectional promoters are the major source of gene activation-associated non-coding RNAs in mammals / M. Uesaka, O. Nishimura, Y. Go, K. Nakashima, K. Agata, T. Imamura // BMC Genomics. - 2014. - Vol.15. - P.35

234. Vagner, S. Alternative translation of human fibroblast growth factor 2 mRNA occurs by internal entry of ribosomes / S. Vagner, M.C. Gensac, A. Maret, F. Bayard, [et al.] // Mol Cell Biol. - 1995. - Vol.15, №1. - P.35-44

235. Vagner, S. Alternative translation initiation of the Moloney murine leukemia virus mRNA controlled by internal ribosome entry involving the p57/PTB splicing factor / S. Vagner, A. Waysbort, M. Marenda, M.C. Gensac, F. Amalric, A.C. Prats // J Biol Chem. - 1995. - Vol.270, №35. - P.20376-20383

236. Valencia, P. Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells / P. Valencia, A.P. Dias, R. Reed // Proc Natl Acad Sci U S A. -2008. - Vol.105, №9. - P.3386-3391

237. Vance, C. Mutations in FUS, an RNA processing protein, cause familial amyotrophic lateral sclerosis type 6 / C. Vance, B. Rogelj, T. Hortobagyi, K.J. De Vos, [et al.] // Science. - 2009. - Vol.323, №5918. - P.1208-1211

238. Vaziri, H. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age / H. Vaziri, W. Dragowska, R.C. Allsopp, T.E. Thomas, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 1994. - Vol.91, №21. - P.9857-9860

239. Veeravalli, K.K. Human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells upregulate myelin basic protein in shiverer mice / K.K. Veeravalli, V.R. Dasari, D. Fassett, [et al.]// Stem Cells Dev. - 2011. - Vol.20, №5. - P.881-891

240. Wang, J. Feasibility of using a dual-promoter recombinant baculovirus vector to coexpress EGFP and GDNF in mammalian cells / J. Wang, C. Cai, S. Wang, S. Liu, [et al.] // Exp Ther Med. - 2014. - Vol.7, №6. - P.1549-1554

241. Wang, X. Umbilical cord blood cells regulate the differentiation of endogenous neural stem cells in hypoxic ischemic neonatal rats via the hedgehog signaling pathway / X. Wang, Y. Zhao, X. Wang // Brain Res. - 2014. - Vol.1560.

- P.18-26

242. Wang, Y.Q. Neuroprotective mechanisms of vascular endothelial growth factor / Y.Q. Wang, F.Y. Sun // Sheng Li Ke Xue Jin Zhan. - 2007. - Vol.38, №3.

- P.202-207

243. Watkins, B.A. Specific tropism of HIV-1 for microglial cells in primary human brain cultures / B.A. Watkins, H.H. Dorn, W.B. Kelly, R.C. Armstrong, [et al.] // Science. - 1990. - Vol.249, №4968. - P.549-553

244. Wehrwein, E.A. GDNF is regulated in an activity-dependent manner in rat skeletal muscle / E.A. Wehrwein, E.M. Roskelley, J.M. Spitsbergen // Muscle Nerve. - 2002. - Vol.26, №2. - P.206-211

245. Wilby, M.J. N-Cadherin inhibits Schwann cell migration on astrocytes / M.J. Wilby, E.M. Muir, J. Fok-Seang, B.J. Gour, [et al.] // Mol Cell Neurosci. -1999. - Vol.14, №1. - P.66-84

246. Wishnew, J. Umbilical cord blood transplantation to treat Pelizaeus-Merzbacher Disease in 2 young boys / J. Wishnew, K. Page, S. Wood, L. Galvin, [et al.] // Pediatrics. - 2014. - Vol.134, №5. - e1451-1457

247. Wolfrum, N. Adenovirus signalling in entry / N. Wolfrum, U.F. Greber // Cell Microbiol. - 2013. - Vol.15, №1. - P.53-62

248. Woltjen, K. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells / K. Woltjen, I.P. Michael, P. Mohseni, [et al.] // Nature. -2009. - Vol.458, №7239. - P.766-770

249. Wu, R. Nerve injection of viral vectors efficiently transfers transgenes into motor neurons and delivers RNAi therapy against ALS / R. Wu, H. Wang, X. Xia, H. Zhou, C. Liu, M. Castro, Z. Xu // Antioxid Redox Signal. - 2009. - Vol.11, №7. - P.1523-1534

250. Wyatt, T.J. Human motor neuron progenitor transplantation leads to endogenous neuronal sparing in 3 models of motor neuron loss / T.J. Wyatt, S.L.

Rossi, M.M. Siegenthaler, [et al.] // Stem Cells Int. - 2011. - Vol.2011. -P.207230

251. Xia, X. Allele-specific RNAi selectively silences mutant SOD1 and achieves significant therapeutic benefit in vivo / X. Xia, H. Zhou, Y. Huang, Z. Xu // Neurobiol Dis. - 2006. - Vol.23, №3. - P.578-586

252. Yamazaki, T. FUS-SMN protein interactions link the motor neuron diseases ALS and SMA / T. Yamazaki, S. Chen, Y. Yu, B. Yan, [et al.] // Cell Rep. - 2012.

- Vol.2, №4. - P.799-806

253. Yang, S. Development of optimal bicistronic lentiviral vectors facilitates high-level TCR gene expression and robust tumor cell recognition / S. Yang, C.J. Cohen, P.D. Peng, Y. Zhao, [et al.] // Gene Ther. - 2008. - Vol.15, №21. -P.1411-1423

254. Yuen, E.C. Nerve growth factor and the neurotrophic factor hypothesis / E.C. Yuen, C.L. Howe, Y. Li, D.M. Holtzman, W.C. Mobley // Brain Dev. - 1996.

- Vol.18, №5. - P.362-368

255. Zakaryan, R.P. Identification and characterization of the nuclear localization/retention signal in the EWS proto-oncoprotein / R.P. Zakaryan, H. Gehring // J Mol Biol. - 2006. - Vol.363, №1. - P.27-38

256. Zanotto, E. The bidirectional promoter of two genes for the mitochondrial translational apparatus in mouse is regulated by an array of CCAAT boxes interacting with the transcription factor NF-Y / E. Zanotto, Z.H. Shah, H.T. Jacobs // Nucleic Acids Res. - 2007. - Vol.35, №2. - P.664-677

257. Zhang, W. Design, expression and characterization of a novel coexpression system of two antiarthritic molecules / W. Zhang, F. Wang, J. Yan, X. Zhang, Y. Wang, [et al.] // Appl Microbiol Biotechnol. - 2013. - Vol.97, №14. - P.6301-6314

258. Zhang, Y.J. Aberrant cleavage of TDP-43 enhances aggregation and cellular toxicity / Y.J. Zhang, Y.F. Xu, C. Cook, T.F. Gendron, [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2009. - Vol.106, №18. - P.7607-7612

259. Zheng, C. VEGF reduces astrogliosis and preserves neuromuscular junctions in ALS transgenic mice / C. Zheng, M.K. Skold, J. Li, I. Nennesmo, B. Fadeel, J.I. Henter // Biochem Biophys Res Commun. - 2007. - Vol.363, №4. -P.989-993

260. Ziello, J.E. Cellular endocytosis and gene delivery / J.E. Ziello, Y. Huang, I.S. Jovin // Mol Med. - 2010. - Vol.16, №5-6. - P.222-229

261. Zinszner, H. TLS (FUS) binds RNA in vivo and engages in nucleo-cytoplasmic shuttling / H. Zinszner, J. Sok, D. Immanuel, Y. Yin, D. Ron // J Cell Sci. - 1997. - Vol.110 ( Pt 15). - P.1741-1750

262. Zitvogel, L. Construction and characterization of retroviral vectors expressing biologically active human interleukin-12 / L. Zitvogel, H. Tahara, Q. Cai, W.J. Storkus, [et al.] // Hum Gene Ther. - 1994. - Vol.5, №12. - P.1493-1506

263. Zufferey, R. Self-inactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery / R. Zufferey, T. Dull, R.J. Mandel, A. Bukovsky, [et al.] // J Virol. -1998. - Vol.72, №12. - P.9873-9880