Клонирование и анализ промотора гена арахиса тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат биологических наук Беляев, Денис Вадимович

• Беляев, Денис Вадимович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Беляев, Денис Вадимович

Страница

БЛАГОДАРНОСТИ.iii

СПИСОК ТАБЛИЦ .vii

СПИСОК РИСУНКОВ .viii

Тезисы диссертации, представленной в отдел аспирантуры университета Флориды как одно из требований учебного плана для степени доктора философии.xii

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование и анализ промотора гена арахиса»

Проблема афлатоксина .2

Развитие плода арахиса .3

Гены, которые могут быть использованы для защиты арахиса против заражения A.flavus.4

Обзор избранных тканеспецифичных контрольных элементов 7

CArG бокс.8

Последовательность ядра ACGT и G-бокс .9

GT-бокс.12

Металлотионеин-подобные гены растений .16

Конкретные цели диссертации.18

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .19

Дифференциальная амплификация .19

Выделение продуктов дифференциальной амплификации из геля

20

Полимеразная цепная реакция.21

Нозерн-гибридизация.22

Выделение геномной ДНК .23

Саузерн-гибридизация .24

Конструирование плазмид .24

Выделение плазмидной и фагмидной ДНК, подбор олигонуклеотидов, определение и анализ последовательностей ДНК.28

Создание Частичной Геномной Библиотеки Арахиса.30

Выделение поли(А) РНК .32

Удлинение праймера.32

Пять-штрих RACE.33

Трансформация люцерны с помощью Agrobacterium .34

Определение активности фермента NPTII.35

Измерение активности b-глюкуронидазы.36

Обратная транскрипция - ПЦР fRT-PCR).38

Транзиентная экспрессия репортерного гена в протопластах табака .39

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.40

Идентифицирование, клонирование и охарактеризовывание кДНК, специфичных для кожуры .40

Клонирование и охарактеризовывание геномной копии POD3.49

Клонирование 5'- конца кДНК POD3 .59

Анализ последовательности кДНК клона POD3 .61

Структура гена POD3 .62

Два места начала транскрипции, как показано экспериментами по удлинению праймера.63

Клонирование конструкций POD3-GUS.66

Анализ экспрессии репортерного гена в трансгенной люцерне . 67

Транзиентная экспрессия химерных конструкций в суспензионных клетках табака.78

ЗАКЛЮЧЕНИЕ .86

БИБЛИОГРАФИЯ.89

АВТОБИОГРАФИЯ.95

СПИСОК ТАБЛИЦ

Таблица Страница

1. Стадии развития плода арахиса.5

2. Праймеры, использованные для дифференциальной амплификации. Все праймеры даны в ориентации 5-3'. (AGC) ознацает, что на этом месте в одинаковой вероятностью включёно одно из оснований A, G, or С.20

3. Праймеры, использованные для субклонирования, картирования начала транскрипции и гибридизации .31

4. Праймеры для определения последовательности F5.31

5. Среды, использованные для трансформации люцерны с помощью Agrobacterium.35

СПИСОК РИСУНКОВ

Рисунок Страница

• 1. Химерные конструкции POD3-GUS.26

2. Места соединения последовательностей POD3 и GUS в использованных конструкциях. Последовательности, кодирующие аминокислоты белка, даны прописными буквами, а последовательности интронов - строчными. Кодируемые аминокислоты даны под последовательностями нуклеотидов. Сайты BamHI, использованные для клонирования, подчёркнуты. 3' концы последовательностей POD3 даны жирным шрифтом и их координаты (см. Рис. 8) напечатаны над ними.Триплеты АТС на 3' концах последовательностей кодируют первый метионин (М) в гене GUS.

27

3. Гель с продуктами дифференциальной амплификации. На верхней строчке приведены последовательности четырех обратных полиТ праймеров, привязанных к началу полиА последовательности, внизу - последовательности пяти прямых праймеров длиной Юнт (см. Таблицу 2). Таким образом, получается 20 комбинаций праймеров. Каждая комбинация использовалась для амплификации мРНК из семян и кожуры. Продукты этих реакций были нанесены на гель рядом друг с другом, слева реакции с мРНК из семян и справа - из кожуры. мРНК POD3 (в квадрате) была амплифицирована с T12(AGC)T и прямым праймером №3 и была выбрана для дальнейшего изучения.41

4. Гибридизация РНК арахиса, показывающая, что, из всех проанализированных тканей, POD3 экспрессируется в кожуре, но не в семенах. Общая РНК из следующих тканей была перенесена на гибридизационную мембрану: 1 - оболочка семени, 2 - листья, 3 - кожура и 4 - семена. А. Гибридизация с зондом POD3. Дан размер POD3 мРНК, измеренный РНК маркером. В. Контрольная гибридизация 28S рДНК шпината с такой же РНК, как и в А.47

5. Гибридизация по Саузерну геномной ДНК арахиса с POD3 зондом. ДНК была обработана указанными рестриктазами транслированного гена POD3 и наиболее близкого к нему, из всех опубликованных, металлотионеин-подобного белка из папайи. Дан номер Генбанка, присвоенный последовательности мРНК из папайи. Вертикальными чертами обозначены идентичные аминокислоты. Точки указывают на сходные аминокислоты, и две точки указывают на более похожие аминокислоты, чем обозначенные одной точкой. Подчёркнуты консервативно расположенные цистеины (С).62

12. Продукты реакции удлинения праймера POD3-ld на полиакриламидном геле. Контрольная ДНК pUC19 была просеквенирована с универсальным секвенирующим праймером. POD3-ld использовался как для реакций удлинения праймера с мРНК из кожуры, так и для секвенирования F5. Даны температуры реакций удлинения праймера. Продукты этих реакций указаны контурными стрелками.64

13. Продукты реакции удлинения праймера POD3-4d на полиакриламидном геле. POD3-4d использовался как для реакций удлинения праймера с мРНК из кожуры, так и для секвенирования F5. Даны температуры реакций удлинения праймера. Продукты этих реакций указаны контурными стрелками.65

14. Анализ активности NPTII неочищенных экстрактов листьев трансгенной люцерны. pARS 102-4 - растение для положительного контроля, wt - нетрансформированное растение. Остальные растения трансформированы В5 .69

15. Листья люцерны, обработанные X-Gluc. Растения 10А, 26 и 30 были трансформированы В5. pARS102 - положительный контроль.70

16. Данные MUG тестов экстрактов листьев люцерны. На горизонтальной оси обозначены различные трансформанты, wt - нетрансформированное растение, control - положительный контроль растение pARS 102-4, остальные растения трансформированы с В5 (POD3-GUS). Указаны стандартные отклонения от средних значений в серии от 2 до 4 измерений.

71

17. Анализ химерной мРНК POD3-GUS в трансгенных растениях люцерны. А, С - гели, содержащие продукты ОТ-ПЦР, окрашенные бромистым этидием. В, D - результаты гибридизаций ДНК, перенесённой с гелей А и С, соответственно, с радиоактивно меченным зондом PODHYB. В

6. Поиск рестриктазы, которая даёт одну полосу высокой молекулярной массы при гибридизации геномной ДНК арахиса с зондом POD3. Полоса ДНК размером 7 kb, полученная после обработки ДНК Xbaln гибридизации с POD3, отмечена стрелкой. l=BamHI, 2=SalI, 3=PstI, 4=PvuII, 5=HincII, 6=DraI, 7=Sau3AI, 8=НтсПП-порезанная ДНК фага 1,9=ScaI, 10=XbaI, ll=RsaI, 12=ClaI, 13=SmaI, 14=Bsu36I, 15=KpnI, 16=ApaI, 17=EcoRV, 18=MspI, 19=NdeI, 20=SacI. Обозначены размеры полос ДНК маркера.51

7.Анализ клонов, выщепленных из позитивных блляшек. А.

Плазмиды, п вектор) и 7 kb фрагмент (вставка), в то время как другие клоны не дали 7 kb фрагмента. Обозначены размеры фрагментов. В. Амплификация плазмидной ДНК со специфичными для POD3 праймерами RES53 и RES58 (см. Материалы и Методы). 100 bp -100 bp маркер молекулярного веса ДНК. Обозначены размеры полос маркёра. F5 и F5B дали фрагмент ожидаемого размера, 163 bp.52

8. Частичная последовательность F5 от 5-конца геномного клона до З'-конца кДНК POD3. Показаны последовательности праймеров для ПЦР и гибридизации. Указаны предсказанные TATA боксы и сигнал полиаденилирования. Места начала транскрипции обозначены как +1. Инициирующие и терминирующие кодоны обозначены Ми*, соответственно. Последовательность кДНК, полученной дифференциальной амплификацией, подчёркнута. Последовательность кДНК, полученная путём 5' RACE, дана жирным шрифтом. Последовательности интронов даны строчными буквами . 54

9. Агарозный гель продуктов 5' RACE, полученных с обратным ген- специфичным праером POD3-ld. Левая дорожка содержит продукт ПЦР 5' RACE (обозначен стрелкой), и правая дорожка содержит 100 bp маркер. Даны размеры полос.58

10. Скрининг продуктов 5' RACE с помощью одной секвенирующей реакции. Показан фрагмент геля, содержащий продукты секвенирующих реакций с дидезоксиОТР терминатором. Дорожки содержат различные ДНК матрицы. D5, D6, D7 и D8 - клоны 5' RACE. F5 - геномный клон POD3 (контроль). G нуклеотиды, находящиеся в одинаковых позициях в D5 и F5, отмечены <.60

11. Сравнение аминокислотных последовательностей

В и D подписаны только дорожки, содержащие сигнал гибридизации. Гибридизующиеся фрагменты размером 141 bp указаны в В и D стрелками. Дорожки гелей обозначены следующим образом: 1 ng, 10 ng - количество РНК из кожуры арахиса, использованное в качестве положительного контроля ОТ-ПЦР, М - маркер 50 bp. Указаны размеры фрагментов маркера. Остальные дорожки гелей обозначены номерами трансгенных растений и использованным для ОТ-ПЦР типом ткани, wtp - РНК из кожуры нетрансформированной люцерны. Использовались следующие типы тканей - yl - молодые листья, dl - тёмные листья, 1 - листья, р - кожура, s - семена . 72

18. Покрашенный бромистым этидием агарозный гель, содержащий РНК, использованные для ОТ-ПЦР. Каждая дорожка содержит 4 mg общей РНК из листьев (leaf), молодых листьев (yl), тёмных листьев (dl), кожуры (р) или семян (s) указанных растений люцерны.74

19. Усреднённые результаты по транзиентной экспрессии GUS в протопластах табака. А. Эксперимент, проведённый 04.04.01. В. Эксперимент, проведённый 11.05.01. .79.

20. Гипотеза о сайленсере.85

Тезисы диссертации, представленной в отдел аспирантуры университета Флориды как одно из требований учебного плана для степени доктора философии

КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ПРОМОТОРА ГЕНА АРАХИСА ДЕНИС ВАДИМОВИЧ БЕЛЯЕВ Май 2002 года

Председатель учёного совета: Рекс Ланел Смит Кафедра Молекулярной и клеточной биологии растений

Промотер одного из генов арахиса (Arachis hypogaea L.) был клонирован и проанализирован. кДНК гена, сильно экспрессируюгцегося в кожуре (POD3), была клонирована с помощью дифференциальной амплификации. Эта кДНК была использована как зонд для Нозерн-гибридизации с РНК из разных тканей. POD3 РНК была обнаружена в кожуре и не была обнаружена в семенах, листьях и шелухе. ?? Полная нуклеотидная последовательность POD3 мРНК была определена с помощью методик 5'RACE и удлинения затравки. Эта кДНК содержит открытую рамку считывания длиной 65 аминокислот, которая гомологична металлотионеинам. Геномная копия гена была выделена из частичной геномной библиотеки собственного приготовления. У гена POD3 имеются три экзона и два интрона. Участки геномной ДНК, имеющие 5' конец, совпадающий с 5' концом геномного клона и 3' конец в первом, втором и третьем экзонах гена были клонированы с репортерным геном ветаглюкуронидазы (GUS). Полученные конструкции были названы PODGUS1, PG1 и В5, соответственно, и экспрессированы в протопластах табака. Экспрессия GUS с PODGUS1 была наиболее сильной и превосходила уровень экспрессии с 35S промотора вируса мозаики цветной капусты. Конструкция В5 была использована для трансформации люцерны и экспрессия гена GUS была обнаружена в листьях. Этот новый промотор может быть использован для генетической инженерии арахиса с целью уменьшить содержание афлатоксина путем биосинтеза противогрибного вещества в кожуре и не в съедобных семенах, для улучшения других свойств кожуры или для изучения регуляции экспресии генов арахиса.

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Беляев, Денис Вадимович

ГЛАВА 4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Был клонирован и проанализирован сильный конститутивный промотор из арахиса, который должен быть весьма полезен для генетической инженерии этого и других видов растений. Промотор был обнаружен с помощью дифференциальной амплификации мРНК из кожуры и семян арахиса. Был выбран фрагмент кДНК, POD3, который амплифицировался из кДНК из кожуры, но не семян. Нозерн-гибридизация показала, что POD3 экспрессируется в значительной степени в кожуре и в некоторой степени в оболочке семени, а экспрессия в семени или листьях отсутствует. Геномный клон, соответствующий POD3, был выделен из парциальной библиотеки фрагментов геномной ДНК размерами около 7 kb, порезанной Xbal и клонированных в Lambda ZAP II. Этот клон был назван F5 и содержал последовательность POD3 и 3,9 kb впереди неё, где находились регуляторные элементы. Были картированы два места начала транскрипции, три экзона общей длиной 499 bp и два длинных интрона размерами 1938 bp и 635 bp гена POD3.

Анализ элементов промотора был затруднён тем, что арахис плохо поддаётся трансформации и воспроизводимый протокол до сих пор не существует. Для анализа промотора были выбраны две системы, трансгенная люцерна (из семейства бобовых, к которому принадлежит арахис) и протопласты табака. Были клонированы три химерные конструкции промотор-GUS, названные PODGUS1, PG1 и В5, без интронов, с первым интроном и с двумя интронами POD3, соответственно. Конструкция В5 была стабильно интегрирована в геном люцерны и в трансгенных растениях была обнаружена экспрессия GUS. Все конструкции были транзиентно экпрессированы в протопластах табака и PODGUS1 экспрессировал GUS сильнее, чем конструкция 35S-GUS, служившая положительным контролем. Конструкции с интроном (интронами), PG1 и В5, были примерно в 6 раз слабее. Эти данные говорят о том, что промотор гена POD3 без интронов весьма сильный и что первый интрон гена или оба интрона ослабляют экспрессию. На Рис. 20 приведена модель, объясняющая эти данные. Вкратце, гипотетический сайленсер в первом интроне гена POD3 подавляет экспрессию во всех тканях, кроме кожуры. Мы думаем, что в семенах с сайленсером связывается репрессор, белок, действующий in trans, который взаимодействует с РНК полимеразой II и предотвращает инициацию транскрипции или вызывает преждевременную терминацию транскрипции. В кожуре, репрессор на связан со своим местом (сайленсером), так как, например, он не экспрессируется или связан с другим белком.

Нами не было получено экспериментальное подтверждение тканеспецифичной экспрессии с этого промотора, но эта модель объясняет тканеспецифичную экспрессию гена POD3 в арахисе. Если этот промотор будет также тканеспецифичным в трансгенном арахисе, то он будет иметь особую ценность для придания новых признаков кожуре без экспрессии в семенах. Промотор может использоваться для экспрессии антигрибного гена для предотвращения загрязнения арахиса афлатоксином, который приводит к серьёзным проблемам здравоохранения во всём мире. Отсутствие продукта антигрибного гена в семенах трансгенного арахиса может снять ряд вопросов о наличии чужеродного гена в этой важной сельскохозяйственной культуре.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Беляев, Денис Вадимович, 2002 год

1. Ausubel F, Brent R, Kingston R, Moore D, Seidman J, Smith J, and Struhl K. 1994. Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons, Inc.

2. Azaizeh HA, Pettit RE, Smith OD, and Taber RA. 1989. Reaction of Peanut Genotypes under Drought Stress to Aspergillus flavus and A. parasiticus. Peanut Science 16:109113.

3. Bevan M, Barnes WM, and Chilton MD. 1983. Structure and transcription of the nopaline synthase gene region of T- DNA. Nucleic Acids Res 11:369-385.

4. Brown JW, Smith P, and Simpson CG. 1996. Arabidopsis consensus intron sequences. Plant MolBiol 32:531-535.

5. Chee PP and Slightom JL. 1995. Transformation of soybean (Glycine max) via Agrobacterium tumefaciens and analysis of transformed plants. Methods Mol Biol 44:101-119.

6. Cheng M, Jarret RL, li Z, Xing A, and Demski JM. 1996. Production of fertile transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports 15:653-657.

7. Cherkaoui S, Lamsaouri O, Chlyah A, and Chlyah H. 2000. Durum wheat x maize crosses for haploid wheat production: influence of parental genotypes and various experimental factors. Plant breeding 119:31-36.

8. Chern MS, Bobb AJ, and Bustos MM. 1996. The regulator of MAT2 (ROM2) protein binds to early maturation promoters and represses PvALF-activated transcription. Plant Cell 8:305-321.

9. Christensen AH and Quail PH. 1996. Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genes in monocotyledonous plants. Transgenic Res 5:213-218.

10. Clancy M, Vasil V, Hannah LC, and Vasil IK. 1994. Maize Shrunken-1 intron and exon regions increase gene expression in maize protoplasts. Plant Science 98:151-161.

11. Coolbear P. 1994. Reproductive biology and development. In: Smartt J., editor. Thegroundnut crop. London: Chapman and Hall, p 138-172.

12. Coupe SA, Taylor JE, and Roberts JA. 1995. Characterisation of an mRNA encoding a metallothionein-like protein that accumulates during ethylene-promoted abscission of Sambucus nigra L. leaflets. Planta 197:442-447.

13. Cuero RG and Osuji GO. 1995. Aspergillus flavus-induced chitosanase in germinating corn and peanut seeds: A. flavus mechanism for growth dominance over associated fungi and concomitant aflatoxin production. Food Addit Contam 12:479-483.

14. Czarnecka-Verner E, Yuan CX, Scharf KD, Englich G, and Gurley WB. 2000. Plants contain a novel multi-member class of heat shock factors without transcriptional activator potential. Plant Mol Biol 43:459-471.

15. Dellaporta S, Wood J, and Hicks J. 1983. A Plant DNA Minipreparation: Version II. Plant Molecular Biology Reporter 1:19-21.

16. Deng XY, Wei ZM, and An HL. 2001. Transgenic peanut plants obtained by particle bombardment via somatic embryogenesis regeneration system. Cell Res 11:156-160.

17. Draper J, Scott R, and Armitage PE. 1988. Plant Genetic Transformation and Gene Expression. Blackwell Scientific Publications.

18. Egnin M, Mora A, and Prakash CS. 1998. Factors enhancing Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer in peanut {Arachis hypogaea L.). In vitro Cell and Developmental Biology-Plant 34:310-318.

19. Fakhoury AM and Woloshuk CP. 2001. Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal alpha-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus. Mol Plant Microbe Interact 14:955-961.

20. Germain S, Bonnet F, Fuchs S, Philippe J, Corvol P, and Pinet F. 1999. Dissection of silencer elements in first intron controlling the human renin gene. J Hypertens 17:899905.

21. Germann UA, Schoenlein PV, Zimonjic DB, PopescuNC, Pastan I, and Gottesman MM. 1994. Putative "MDR enhancer" is located on human chromosome 20 and not linked to the MDR1 gene on chromosome 7. Genes Chromosomes Cancer 10:267-274.

22. Ghoshal К and Jacob ST. 2001. Regulation of metallothionein gene expression. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 66:357-384.

23. Graf D, Fisher AG, and Merkenschlager M. 1997. Rational primer design greatly improves differential display-PCR (DD- PCR). Nucleic Acids Res 25:2239-2240.

24. Hattori T, Vasil V, Rosenkrans L, Hannah LC, McCarty DR, and Vasil IK. 1992. The Viviparous-1 gene and abscisic acid activate the CI regulatory gene for anthocyanin biosynthesis during seed maturation in maize. Genes Dev 6:609-618.

25. Jefferson RA, Burgess SM, and Hirsh D. 1986. beta-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci U S A 83:8447-8451.

26. Keenan JI and Savage GP. 1994. Mycotoxins in groundnuts, with special reference to aflatoxin. In: Smartt J., editor. The groundnut crop. London: Chapman and Hall, p 509551.

27. Martinez-Garcia JF, Huq E, and Quail PH. 2000. Direct targeting of light signals to a promoter element-bound transcription factor. Science 288:859-863.

28. Mathivanan N, Kabilan V, and Murugesan K. 1998. Purification, characterization, and antifungal activity of chitinase from Fusarium chlamydosporum, a mycoparasite to groundnut rust, Puccinia arachidis. Can J Microbiol 44:646-651.

29. Matsumura H, Nirasawa S, and Terauchi R. 1999. Technical advance: transcript profiling in rice (Oryza sativa L.) seedlings using serial analysis of gene expression (SAGE). Plant J 20:719-726.

30. McKently AH, Moore GA, Doostdar H, and Niedz RP. 1995. Agrobacteriummediated transformation of peanut (Arachisjiypogaea L.) embryo axes and the development of transgenic plants. Plant Cell Reports 14:699-703.

31. Meier I, Callan KL, Fleming AJ, and Gruissem W. 1995. Organ-specific differential regulation of a promoter subfamily for the ribulose-l,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase small subunit genes in tomato. Plant Physiol 107:1105-1118.

32. Mikami K, Katsura M, Ito T, Okada K, Shimura Y, and Iwabuchi M. 1995. Developmental and tissue-specific regulation of the gene for the wheat basic/leucine zipper protein HBP-la(17) in transgenic Arabidopsis plants. Mol Gen Genet 248:573-582.

33. Ni M, Dehesh K, Tepperman JM, and Quail PH. 1996. GT-2: in vivo transcriptional activation activity and definition of novel twin DNA binding domains with reciprocal target sequence selectivity. Plant Cell 8:1041-1059.

34. Orozco BM and Ogren WL. 1993. Localization of light-inducible and tissue-specific regions of the spinach ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase (rubisco) activase promoter in transgenic tobacco plants. Plant Mol Biol 23:1129-1138.

35. Paik-Ro OG, Seib JC, and Smith RL. 2002. Seed-specific, developmentally regulated genes of peanut. Theoretical and Applied Genetics 104:236-240.

36. Park CM, Berry JO, and Bruenn JA. 1996. High-level secretion of a virally encoded antifungal toxin in transgenic tobacco plants. Plant Mol Biol 30:359-366.

37. Pawlowski K, Kunze R, De Vries S, and Bisseling T. 1994. Isolation of total, poly(A) and polysomal RNA from plant tissues. In: Gelvin SB and Schilperoort RA, editors. Plant Molecular Biology Manual. Dordrecht Netherlands: Kluwer Academic, p 1-13.

38. Powell WA, Catranis CM, and Maynard CA. 1995. Synthetic antimicrobial peptide design. Mol Plant Microbe Interact 8:792-794.

39. Powell WA, Catranis CM, and Maynard CA. 2000. Design of self-processing antimicrobial peptides for plant protection. Lett Appl Microbiol 31:163-168.

40. Punja ZK and Raharjo SHT. 1996. Response of transgenic cucumber and carrot plants expressing different chitinase enzymes to inoculation with fungal pathogens. Plant Disease 80:999-1005.

41. Riechmann JL, Krizek BA, and Meyerowitz EM. 1996. Dimerization specificity of Arabidopsis MADS domain homeotic proteins APETALA1, APETALA3, PISTILLATA, and AGAMOUS. Proc Natl Acad Sci U S A 93:4793-4798.

42. Robinson NJ, Tommey AM, Kuske C, and Jackson PJ. 1993. Plant metallothioneins.

43. Biochem J 295 (Pt 1):1-10.

44. Rohini VK and Sankara Rao K. 2001. Transformation of peanut (Arachis hypogaea L.) with tobacco chitinase gene: variable response of transformants to leaf spot disease. Plant Science 160:889-898.

45. Sambrook J, Fritsch E, and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring harbor Laboratory press.

46. Sanders PR, Winter JA, Barnason AR, Rogers SG, and Fraley RT. 1987. Comparison of cauliflower mosaic virus 35S and nopaline synthase promoters in transgenic plants. Nucleic Acids Res 15:1543-1558.

47. Singsit C, Adang MJ, Lynch RE, Anderson WF, Wang A, Cardineau G, and Ozias-Akins P. 1997. Expression of a Bacillus thuringiensis crylA(c) gene in transgenic peanut plants and its efficacy against lesser cornstalk borer. Transgenic Res 6:169-176.

48. Southern EM. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Biol 98:503-517.

49. Stark K, Kirk DL, and Schmitt R. 2001. Two enhancers and one silencer located in the introns of regA control somatic cell differentiation in Volvox carteri. Genes Dev 15:14491460.

50. Swartz EA and Owens GK. 1996. Transcriptional regulation of the smooth-muscle alpha-actin gene promoter by an inverted CARG element and 2 M-CAT motifs. FASEB Journal 10:1976.

51. Tieman DM, Ciardi JA, Taylor MG, and Klee HJ. 2001. Members of the tomato LeEIL (EIN3-like) gene family are functionally redundant and regulate ethylene responses throughout plant development. Plant J 26:47-58.

52. Wilhelm V, Neckelman G, Allende JE, and Allende CC. 2001. The genomic structure of two protein kinase CK2alpha genes of Xenopus laevis and features of the putative promoter region. Mol Cell Biochem 227:175-183.

53. Yan В and Pring DR. 1997. Transcriptional initiation sites in sorghum mitochondrial DNA indicate conserved and variable features. Curr Genet 32:287-295.

54. Yan B, Raben N, Lu N, and Plotz PH. 2001. Identification and characterization of a tissue-specific silencer element in the first intron of the human acid maltase gene. Hum Genet 109:186-190.

55. Yang H, Singsit C, Wang A, Gonsalves D, and Ozias-Akins.P. 1998. Transgenic peanut plants containing a nucleocapsid protein gene of tomato spotted wilt virus show divergent levels of gene expression. Plant Cell Reports 17:693-699.

56. Ye XY and Ng ТВ. 2001. Hypogin, a novel antifungal peptide from peanuts with sequence similarity to peanut allergen. J Pept Res 57:330-336.

57. Zhu B, Chen TH, and Li PH. 1996. Analysis of late-blight disease resistance and freezing tolerance in transgenic potato plants expressing sense and antisense genes for an osmotin-like protein. Planta 198:70-77.1. АВТОБИОГРАФИЯ