Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Рунова, Ольга Леонидовна

• Рунова, Ольга Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рунова, Ольга Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика рецептора ЛНП.

1.2. Мультидоменная структура рецептора ЛНП.

1.3. Структурно-функциональная организация лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП.

1.4. Структура гена РЛНП.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Штаммы Е. coli, питательные среды, условия роста.

2.2. Плазмидные векторы.

2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.4. Трансформация E.coli.

2.5. Гибридизация.

2.6. Очистка рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, слитого с ß-галактозидазой.

2.7. рЕТ система.

2.7.1. Индукция DE3 лизогенов.

2.7.2. Получение клеточного экстракта и белков культуральной среды для хроматографии на смоле His-Bind.

2.7.3. Подготовка смолы His-Bind и аффинная хроматография.

2.8. Культивирование фибробластов человека линии НТ-1080 и получение клеточных лизатов.

2.9. Получение антител к рекомбинантному лиганд-связывающему домену

РЛН человека.

2.10. Денатурация и рефолдинг рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП.

2.11. Оценка лиганд-связывающей активности рекомбинантного белка в иммунохимическом тесте на микроячеечных планшетах.

2.12. Визуализация РЛНП в белках клеточных лизатов и рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП (с помощью и ммуноблоттинга и лигандного блоттинга).

2.12.1. Иммуноблоттинг.

2.12.2. Лигандный блоттинг.

2.13. Аналитические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии pUEX.

3.2. Выделение рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП в виде слитого белка.

3.3. Клонирование фрагмента кДНК рецептора ЛНП в векторах серии рЕТ.

3.4. Выделение лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП в виде рекомбинантного индивидуального белка.

3.5. Характеристика антител к рекомбинантному лиганд-связывающему домену рецептора ЛНП.

3.6. Анализ функциональной активности рекомбинантного лиганд-связывающего домена рецептора ЛНП.

3.7. Исследование взаимодействия белков Escherichia coli с ЛНП человека.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. 93 ВЫВОДЫ. 97 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование фрагмента кДНК, кодирующего лиганд-связывающий домен рецептора липопротеинов низкой плотности человека, в экспрессионных плазмидных векторах Escherichia coli, и анализ продуктов экспрессии»

Актуальность проблемы.

Изучение структурно-функциональных отношений в мультидоменных белках клеточной поверхности, функционирующих как рецепторы специфических белковых или иных лигандов и участвующих либо в переносе веществ между клетками и внеклеточными пространствами, либо в передаче сигналов от внеклеточных лигандов, является одной из центральных проблем современной молекулярной медицины. Среди рецепторов, интернализирующих связанные лиганды, наиболее изучен рецептор липопротеинов низкой плотности (РЛНП). Прогресс в исследовании РЛНП связан, прежде всего, с классическими работами Голдштейна и Брауна (Brown, Goldstein, 1976, 1986; Goldstein, Brown, 1989), которые впервые описали РЛНП и показали, что одно из наиболее распространенных аутосомно-доминантных заболеваний человека - семейная гиперхолестеринемия обусловлена мутациями в гене РЛНП с гетерогенными биохимическими проявлениями (количественный дефицит РЛНП, нарушение его лиганд-связывающей активности, блоки интернализации комплекса РЛНП-лиганд и реутилизации РЛНП с его возвращением на поверхность клетки). В дальнейшем эти авторы и их сотрудники (Yamamoto et al., 1984) осуществили клонирование кДНК, кодирующей РЛНП, определили ее нуклеотидную последовательность и исследовали экзонно-интронную структуру гена РЛНП. На основании этих данных в разных странах, в том числе, в России, проведено изучение нарушений структуры мутантных аллелей гена РЛНП у больных с семейной гиперхолестеринемией (Мандельштам и др., 1995а, б, 1998; Chakir et al., 1998а, б; Mandelshtam et al., 1998), которое продемонстрировало множественность и гетерогенность этих мутаций (к настоящему времени описано более 300 мутаций гена РЛНП (Hobbs et al., 1992; Varret et al., 1997), в России - 8 мутаций). В то же время все представления о пространственной и мультидоменной структуре РЛНП основаны лишь на предсказаниях, базирующихся на сведениях об аминокислотной последовательности этого белка, и лишь в последние годы появились сообщения о прямом анализе трехмерных структур относительно коротких фрагментов РЛНП (цистеин-богатых повторов внеклеточного домена), изолированных в виде рекомбинантных белков - продуктов экспрессии соответствующих плазмид в клетках Escherichia coli (Bieri et al., 1995; Daly et al., 1995a,6; Blacklow, Kim, 1996; Fass et al., 1997). В связи с этим мы предприняли попытку получить рекомбинантный белок со структурой и активностью полноразмерного лиганд-связывающего домена РЛНП человека. Актуальность этой темы исследования обусловлена следующими соображениями: 1) для оценки общей функциональной активности РЛНП необходимы сведения о трехмерной структуре полноразмерного лиганд-связывающего домена; 2) наличие индивидуального белка -лиганд-связывающего домена РЛНП имеет существенное значение для выяснения функциональных последствий мутационных аминокислотных замен и делеций в этом домене; 3) на основе рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП может быть создана простая бесклеточная тест-система для изучения структурных аномалий ЛНП-частиц и их белковых компонентов, нарушающих их связывание с РЛНП; 4) лиганд-связывающий домен РЛНП в перспективе может найти применение в качестве специфического твердофазного сорбента для элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии. Наряду с этими конкретными направлениями использования лиганд-связывающего домена РЛНП в научных исследованиях и в практической медицине, его получение в виде рекомбинантного белка должно способствовать решению общей проблемы так называемых растворимых рецепторов, представляющих собой внеклеточные (как правило, N-концевые) фрагменты мембранных рецепторов и функционирующих как антагонисты мембранных рецепторов, которые конкурируют с ними за высокоаффинное связывание лигандов (Tomida et al., 1994; Han et al., 1994). Механизмы образования таких растворимых рецепторов in vivo могут быть разнообразными (ограниченный протеолиз со "слущиванием" внеклеточных фрагментов рецептора в среду, инициация транскрипции с альтернативных промоторов, альтернативный сплайсинг пре-мРНК, сдвиги рамки считывания с ранней терминацией, экспрессия неаллельных генов, кодирующих растворимые рецепторы и др.). Рекомбинантные лиганд-связывающие домены различных поверхностных рецепторов используются для анализа структурной организации комплексов рецептор-лиганд. В отдельных работах показано, что в среде культивирования клеток и в биологических жидкостях человека содержится белок, соответствующий по размерам и по последовательности аминокислот лиганд-связывающему домену РЛНП и обладающий антивирусной активностью (Fischer et al., 1993). В связи с этими соображениями получение в препаративных количествах рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека должно способствовать как дальнейшему исследованию природного растворимого РЛНП, так и созданию высокоспецифических способов модулирования активности мембранного РЛНП в культурах клеток и в многоклеточном организме.

Цели и задачи исследования.

Основной целью работы было конструирование векторных плазмид, кодирующих лиганд-связывающий домен РЛНП и изучение его иммунохимической специфичности и функциональной активности. Для достижения этой цели были поставлены следующие этапные задачи исследования:

1. Конструирование экспрессионных плазмид, кодирующих лиганд-связывающий домен РЛНП, на основе векторов серий pUEX и рЕТ и плазмиды pLDLR-З, содержащей полноразмерную кДНК РЛНП.

2. Оптимизация экспрессии этих рекомбинантных ДНК в бактериальных клетках.

3. Разработка процедур выделения рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП в виде гомогенного белка.

4. Получение антител к рекомбинантным белкам и изучение их специфичности и перекрестных взаимодействий с РЛНП клеток человека.

5. Оптимизация процедур восстановления-денатурации и рефолдинга для получения функционально активного рекомбинантного белка, обладающего ЛНП-связывающей активностью.

Научная новизна работы.

Впервые выделен и охарактеризован полноразмерный лиганд-связывающий домен РЛНП человека - продукт экспрессии соответствующего фрагмента кДНК РЛНП в плазмидных векторах Е. coli. Разработаны препаративные методы выделения этого белка в гомогенном виде. В результате процедур восстановления-денатурации и последующего рефолдинга рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП достигнуто реконструирование его специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности.

Практическая значимость работы.

Полученные антитела к рекомбинантному лиганд-связывающему домену РЛНП перекрестно реагируют с природным РЛНП клеток человека и могут использоваться для его иммунохимической детекции в реакции иммуноблоттинга и количественного определения. Лиганд-связывающий домен РЛНП, обладающий специфической ЛНП-связывающей активностью, в перспективе может найти применение для создания тест-системы определения аномальных ЛНП в крови человека и для специфической элиминации ЛНП из крови больных с различными формами гиперхолестеринемии. 9

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Сконструированы плазмидные экспрессионные векторы, направляющие высокоэффективный синтез рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Escherichia coli.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП препаративно выделен в виде электрофоретически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам этого рекомбинантного белка (слитого с ß-галактозидазой и индивидуального), дающие перекрестную иммунологическую реакцию с природным РЛНП мембран клеток человека.

4. Для получения функционального активного рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП, синтезируемого в клетках Escherichia coli, необходимо его восстановление, денатурация и последующий рефолдинг путем медленного диализа против кальций-содержащих буферных растворов. При этом происходит реконструкция специфической кальций-зависимой ЛНП-связывающей активности, первоначально не определяемой для исходного рекомбинантного белка.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Рунова, Ольга Леонидовна

ВЫВОДЫ.

1. На основе экспрессионных векторов pUEX2 и рЕТ22Ь(+) сконструированы рекомбинантные плазмиды, направляющие высокоэффективный синтез рекомбинантного лиганд-связывающего домена РЛНП человека в клетках Е. coli в виде слитого с ß-галактозидазой белка - pUEXL45 и индивидуального белка - рЕТЬЗЗ.

2. Рекомбинантный лиганд-связывающий домен РЛНП выделен в виде индивидуального электрофоретически гомогенного белка.

3. Получены антитела к двум формам рекомбинантного белка (слитого с бактериальной ß-галактозидазой и индивидуального), дающие иммунологическую реакцию с природным РЛНП плазматических мембран клеток человека.

4. Пространственная укладка рекомбинантного домена РЛНП в клетках Е. coli отличается от конформации природного белка.

5. Получен функционально активный индивидуальный белок рекомбинантного домена РЛНП путем его денатурации-рефолдинга методом медленного диализа против буфера, содержащего ионы кальция.

6. В клетках Е. coli впервые обнаружен белок с молекулярной массой 48 кДа, обладающий эффективной кальций-зависимой ЛНП-связывающей активностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рунова, Ольга Леонидовна, 1999 год

1. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз. СПб: Питер Пресс, 1995.-304 с.

2. Мандельштам М,Ю., Голубков В.И., Шур Ю.А., Липовецкий Б.М., Гайцхоки B.C. Новая мутация 347 delGCC в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека. // Биоорганическая химия. 1998. - Т. 24, №10. - с. 797 - 800.

3. Мандельштам М,Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки B.C. Мультиэкзонная делеция в гене рецептора липопротеинов низкой плотности человека, как причина семейной гиперхолестеринемии. // Генетика. 1995а. - Т. 31, №2. - с. 259 - 263.

4. Мандельштам М,Ю., Липовецкий Б.М., Шварцман А.Л., Гайцхоки B.C. Молекулярная гетерогенность семейной гиперхолестеринемии в популяции жителей Санкт-Петербурга. // Генетика. 19956. - Т. 31, № 4. - с. 521 - 527.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. Пер. с англ., М.: Мир, 1984. - 480 с.

6. Харбоу Н., Ингильд А. Иммунизация, выделение иммуноглобулинов, определение титра антител. В кн.: Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу, VI. Получение антисывороток (ред. Н.Аксельсен, И.Крелль, Б.Вееке).М.: Мир, 1977. - с.200 - 205.

7. Basu S.K., Goldstein J.L., Brown M.S. Characterization of the low density lipoprotein receptor in membranes prepared from humann fibroblasts // J. Biol. Chem. 1978. - vol. 253. - p. 3852 -3856.

8. Beisiegel U., Schneider W.J., Brown M.S., Goldstein J.L. Immunoblot analysis of low density lipoprotein receptors in fibroblasts from subjects with familial hypercholesterolemia // J. Biol. Chem. 1982. - vol.257, N21. -p.13150- 13156.

9. Bieri S., Djordjevic J.T., Daly N.L. et al. Disulfide bridges of a cystein-rich repeat of the LDL receptor ligand-binding domain // Biochemistry. 1995. - vol.34. - p. 13059 - 13065.

10. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant Plasmid DNA // Nucl. Acid Res. 1979. - vol.7, N6. - p.l513 - 1524.

11. Blacklow S.C., Kim P.S. Protein folding and calcium binding defects arising from familial hypercholesterolemia mutations of the LDL receptor // Nature Structural biology. 1996. -vol.3, N9. - p.758 - 762.

12. Bressan G.M., Stanley K.K. pUEX, a bacterial expression vector related to pEX with universal host specificity // Nucl. Acids Res. 1987. - vol.15, N23. - p.10056.

13. Brown M.S., Anderson R.G.W., Goldstein J.L. Recycling receptors: the round-trip itinerary of migrant membrane proteins // Cell. 1983. - vol. 32. - p. 663 - 667.

14. Brown M.S., Goldstein J.L. Receptor-mediated control of cholesterol metabolism // Science. -1976. -vol.191, -p.150- 154.

15. Brown M.S., Goldstein J.L. How LDL receptors influence cholesterol and atherosclerosis // Sci. Amer. 1984. - vol. 251. - p. 58 - 66.

16. Brown M.S., Goldstein J.L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis // Science. 1986. - vol.232, N4746. - p.34 - 47.

17. Brown M.S., Herz J., Goldstein J.L. Calcium cages, acid baths and recycling receptors // Nature. 1997. - vol.388. - p.629, 630.

18. Catomeris P., Thibert R. J., Draisey T.F. Low-density lipoprotein binding assay using the calf adrenocortical low-density lipoprotein receptor. // Clinical Biochemistry. — 1994. vol. 27, N4. -p. 249-257.

19. Chen W.-J., Goldstein J.L., Brown M.S. NPXY, a sequence often found in cytoplasmic tails is required for coated pitmediated internalization of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1990. - vol.265, N6. - p.3116 - 3123.

20. Cummings R.D., Kornfeld S., Schneider WJ. et al. Biosynthesis of the N- and O-linked oligosaccharides of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1983. - vol.258. -p.15261 - 15273.

21. Dagert V., Ehrlich S.D. Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells // Gene. 1979. - vol.6, N1. - p.23 - 28.

22. Daly N.L., Djordjevic J.T., Kroon P.A., Smith R. Three-dimensional structure of the second cysteine-rich repeat from the human low-density lipoprotein receptor // Biochemistry. 1995a. -vol.34.-p. 14474- 14481.

23. Daly N.L., Scanion M.J., Djordjevic J.T. et al. Three-dimensional structure of a cysteine-rich repeat from the low-density lipoprotein receptor // Procced. Natl. Acad. Sei. USA 19956. -vol.92. - p.6334 - 6338.

24. Daniel T.O., Schneider W.J., Goldstein J.L., Brown M.S. Visualization of lipoprotein receptors by ligand blotting // J. Biol. Chem. 1983. - vol.258, N7. - p.4606 - 4611.

25. Davis C.G., van Driel I.R., Russell D.W. et al. The low density lipoprotein receptor. Identification of aminoacids in cytoplasmic domain required for rapid endocytosis // J. Biol. Chem. 1987a. - vol.262, N9. - p.4075 - 4082.

26. Davis C.G., Elhammer A.,Russell D.W. et al. Deletion of clustered O-linked carbohydrates does not impair function of low density lipoprotein receptor in transfected fibroblasts // J. Biol. Chem. 1986a. - vol.261, N6. - p.2828 - 2838.

27. Davis C.G., Goldstein J.L., Suedhof T.C. et al. Acid-dependent ligand dissociation and recycling of LDL receptor mediated by growth factor homology region // Nature. 19876. -vol.326, N6115. - p.760 - 765.

28. Davis C.G., Lehrman M.A., Russell D.W. et al. The J.D. mutation in familial hypercholesterolemia: aminoacid substitution in cytoplasmic domain impedes internalization of LDL receptors // Cell. 19866. - vol.45, N1. - p. 15 - 24.

29. Esser V., Limbird L.E., Brown M.S. t al. Mutational analysis of the ligand-binding domain of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1988. - vol.263, N26. - p.13282 - 13290.

30. Fass D., Blacklow S.C., Kim P.S., Berger J.M. Molecular basis of familial hypercholesterolemia from structure of LDL receptor module // Nature. 1997. - vol.388. -p.691 -693.

31. Filipovic I. Effect of inhibiting N-glycosylation on the stability and binding activity of the low density lipoprotein receptor // J. Biol. Chem. 1989. - vol.264, N15. - p.8815 - 8820.

32. Fisher D.G., Tal N., Novick D., Barak S., Rubinstein M. An antiviral soluble form of the LDL receptor inducedby interferon. // Science. 1993. - vol. 262, N5131. - p. 250 - 253.

33. Gilbert W. Genes-in-piece revisited // Science. 1985. - vol. 228, N4701. - p. 823 - 824.

34. Goldstein J.L., Anderson R.G.W., Brown M.S. Coated pits, coated vesicles and receptor-mediated endocytosis // Nature. 1979. - vol. 279. - p. 679 - 685.

35. Goldstein J.L., Basu S.K., Brown M.S. Receptor-mediated endocytosis of LDL in cultured cells // Meth. Enzymol. 1983. - vol. 98. - p. 241 - 260.

36. Goldstein J.L., Brown M.S. The low-density lipoprotein pathway and its relation to atherosclerosis // Ann. Rev. Biochem. 1977. - vol. 46. - p. 897 - 930.

37. Goldstein J.L., Brown M.S. The LDL-receptor and the regulation of cellular cholesterol metabolism // J. Cell Biochem. 1985. - suppl., N3. - p.131 -137.

38. Goldstein J.L., Brown M.S. Familial hypercholesterolemia // In: The Metabolic Basis of Inherited Deseases / Eds. C.R.Scriver, A.L.Beaudet, W.S.Sly, D.Valle. N.Y., McGraw Hill, 6th Edn.- 1989.-p.1215 1250.

39. Grunstein M., Hogness D. Colony hybridization: a method for the isolation of cloned DNAs, that contain a specific gene // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1975. - vol.72, N10. - p.3961 -3965.

40. Han J., Mathison J.C., Ulevich R. J., Tobias P. Lipopolysacharide (LPS) binding protein, truncated at Ile-197, binds LPS but does not transfer LPS to CD14. // J. Biol. Chem. 1994. -vol.269, N 11. -p. 8172-8175.

41. Herz J., Willnow T.E. Functions of the LDL receptor gene family // Ann. N.Y. Acad. Sei. -1994.-vol.737.-p.14-19.

42. Hobbs H.H., Brown M.S., Goldstein J.L. Molecular Genetics of the LDL Receptor Gene in Familial Hypercholesterolemia // Human Mutation. 1992. - vol.1. - p.445-466.

43. Hobbs H.H., Lehrman M.A., Yamamoto T., Russell D.W. Polymorphism and evolution of Alu sequences in the human low density lipoprotein receptor gene // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1985. - vol.82, N22. - p.7651 - 7655.

44. Hobbs H.H., Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. The LDL receptor locus in familial hypercholesterolemia: mutational analysis of a membrane protein // Annu. Rev. Genet. 1990. -vol.24.-p. 133 - 170.

45. Kingsley D.M., Kozarskey K.F., Hobbie L., Krieger M. Reversible defects in O-linked glycosylation and LDL receptor expression in a UDP-Gal/UDP-GalNAc 4-epimerase deficient mutant // Cell. 1986. - vol.44. - p.749 - 759.

46. Knott T.J., Rail S.C., Innerarity T.L. et al. Human apolipoprotein B: structure of carboxylterminal domains, sites of gene expression, and chromosomal localization // Science. -1985.-vol.230.-p.37-43.

47. Kozarsky K.F., Kingsley D.M., Krieger M. Use of a mutant cell line to study the kinetics and function of O-linked glycosylation of low density lipoprotein receptors // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA. 1988. - vol.85, N12. - p.4535 - 4539.

48. Kyhse-Anderson J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from Polyacrylamide to nitrocellulose. // J. Biochem. And Biophys. Meth. 1984. - vol. 10. - p. 203 - 209.

49. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - vol.227, N5259. - p.680 - 685.

50. Lehrman M.A., Goldstein J.L., Russell D.W., Brown M.S. Duplication of seven exones in LDL receptor gene caused by Alu-Alu recombination in a subject with familial hypercholesterolemia // Cell. 1987a. - vol.48, N5. - p.827 - 835.

51. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. -1951. vol.193, N1. - p.265 - 275.

52. Maeda Y., Koga H., Yamada H. et al. Effective renaturation of reduced lysozyme by gentle removal of urea // Protein Engng.- 1995. vol.8, N2. - p.201 - 205.

53. Maeda Y., Ueda T., Imoto T. Effective renaturation of denatured and reduced immunoglobulin G in vitro without assistance of chaperone // Protein Engng. 1996. - vol.9, N1. - p.95 - 100.

54. Mahley R.W. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology // Science. 1988. - vol. 240. - p. 622 - 630.

55. Mahley R.W., Innerarity T.L. Lipoprotein receptors and cholesterol homeostasis // Biochim. Biophys. Acta. 1983. - vol.737. - p. 197 - 222.

56. Mahley R.W., Innerarity T.L., Rail S.C., Weisgraber K.H. Plasma lipoproteins: apolipoprotein structure and function // J. Lipid Res. 1984. - vol. 25. - p. 1277 - 1294.

57. Mandel M., Higa A. Calcium deendent bacteriophage DNA infection. // J. Mol. Biol. 1970. -vol. 53.-p. 154.

58. PCR technology. Principles and applications for DNA amplification. Ed. Erlich H. A. Stocktons New York and Mc Milan London, 1989. p. 7 - 16.73. pET system manual 3rd edition. Novagen, 1993. Medison, USA.

59. Promega protocols and applications guide. Promega, 1990. p.40,41. - Medison, USA.

60. Reed K.C., Mann D.A. Rapid transfer of DNA from agarose gels to nylon membranes // Nucl. Acid Res. 1985. - vol.13, N20. - p.7207 - 7221.

61. Russell D.W., Brown M.S., Goldstein J.L. Different combinations of cysteine-rich repeats mediate binding of low density lipoprotein receptor to two different proteins // J. Biol. Chem. -1989. vol.264, N36. - p.21682 - 21688.

62. Russell D.W., Schneider W.J., Yamamoto T. et al. Domain map of the LDL receptor sequence homology with the epidermal growth factor precursor // Cell. 1984. - vol.37. - p.577 - 585.

63. Russell D.W., Yamamoto T., Schneider W.J. et al. cDNA cloning of the bovine low density lipoprotein receptor: feed-back regulation of a receptor mRNA // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1983. - vol.80, N24. - p.7501 - 7505.

64. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - c.

65. Schneider W.J. The low density lipoprotein receptor // Biochim. Biophys. Acta. 1989. -vol.988.-p.303 -317.

66. Schneider W.J., Basu S.K., McPhaul M.J. et al. Solubilization of the low density lipoprotein receptor // Proceed. Natl. Acad. Sei. USA 1979. - vol.76. - p.5577 - 5581.

67. Schneider W.J., Beisiegel U., Goldstein J.L., Brown M.S. Purification of the low density lipoprotein receptor, an acidic glycoprotein of 164.000 molecular weight // J. Biol. Chem. -1982. vol.257. - p.2664 - 2673.

68. Schneider W.J., Goldstein J.L., Brown M.S. Partial purification and characterization of the low density lipoprotein receptor from bovine adrenal cortex // J. Biol. Chem. 1980. - vol.255. -p.11442- 11447.

69. Schneider W.J., Slaughter C.J., Goldstein J.L. et al. Use of anti-peptide antibodies to demonstrate external orientation of NH2-terminus of the LDL receptor in the plasma membrane of fibroblasts // J. Cell Biol. 1983. - vol.97. - p.1635 - 1640.

70. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - vol.98, N3. - p.503 - 517.

71. Suedhof T.C., Goldstein J.L., Brown M.S., Russell D.W. The LDL receptor gene: a mosaic of exons shared with different proteins // Science. 1985a. - vol.228, N4701. - p.815 - 822.

72. Suedhof T.C., Russell D.W., Goldstein J.L. et al. Cassette of eight exons shared by genes for LDL receptor and IGF precursor // Science. 19856. - vol.228, N4701. - p.893 - 895.

73. Tolleshaug H., Goldstein J.L., Schneider W.J., Brown M.S. Posttranslational processing of the LDL receptor and its genetic disruption in familial hypercholesterolemia // Cell. 1982. -vol.30.-p.715-724.

74. Tomida M., Yamamoto-Yamaguchi Y., Hozum M. Three different cDNAs encoding mouse D-factor/LIF receptor. // J. Biochem. 1994. - vol. 115. - p. 557 - 562.

75. Varret M., Rabes J.P., Collod-Beroud G. et al. Software and database for the analysis ofmutations in the human LDL receptor gene // Nucl. Acids Res. 1997. - vol. 25. - p. 172 -180.

76. Weisgraber K.H., Innerarity T.L., Mahley R.W. Role of the lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1978. - vol.253. - p.9053 - 9062.

77. Yamamoto T., Bishop R.W., Brown M.S. et al. Deletion in cysteine-rich region of LDL receptor impedes transport to cell surface in WHHR rabbit // Nature. 1986. - vol.232, N4755. -p.1230- 1237.

78. Yamamoto T., Davis C.G., Brown M.S. et al. The human LDL receptor: a cysteine-rich protein with multiple Alu sequences in its mRNA // Cell. 1984. - vol.39, N1. - p.27 - 38.108