Клональный анализ при изучении наследственной патологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, Терехов, С.М.

• Терехов, С.М.
• 1984

Оглавление диссертации Терехов, С.М.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Понятие о пролиферативном потенциале . II

ГЛАВА П. Причины уменьшения митотической активности культуры диплоидных клеток. Концепция смены периодов покоя и активного размножения в клеточном цикле.

ГЛАВА Ш. Ядерно-цит оплазматиче с кии контроль проли-феративного потенциала. Негативный контроль клеточного размножения.

ГЛАВА 17. Генетический контроль событий в клеточном цикле млекопитающих.

ГЛАВА У. Генетический контроль пролиферативного потенциала. Соответствие медцу пролифератив-ными характернотиками клеток in vitro и in vivo.

ГЛАВА У1. Понятие о прогероидных синдромах. Хромосомный дисбаланс.

ГЛАВА УП. Предрасположенность к злокачественным новообразованиям. Диффузный полипоз толстой кишки.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА УШ. Материал и методики.

- Получение и культивирование штаммов

- Условия культивирования и постановки экспериментов по клонированию.

- Определение индекса меченых клеток

- Электронномикроскопичеокий анализ

- Стимуляция размножения клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЖВА IX. Клонирование диплоидных клеток человека (методические особенности)

ГЛАВА X. Первая фаза роста культур клеток, полученных из материала абортусов.

ГЛАВА XI. Первая фаза роста постнатальных штаммов

ГЛАВА ХП. Характеристики пролиферации при длительном культивировании диплоидных штаммов

ГЛАВА Ж. Характеристики пролиферации штаммов, полученных из различных тканей эмбриона человека

ГЛАВА Х1У. Изменчивость показателей "индекс меченых клеток" и "эффективность клонирования" в нормальных диплоидных штаммах, при хромосомном дисбалансе и при аденоматозе толстого кишечника

ГЛАВА ХУ. Обсуждение полученных результатов

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клональный анализ при изучении наследственной патологии»

В последние годы большое внимание уделяется изучению наследственных болезней на клеточном уровне [78, 9, 10, II, 77]. Такой подход позволяет решить целый ряд важных вопросов.

1. Показать наследственный характер клеточных изменений, наблюдаемых в организме и воспроизводимых в культуре. Клетки, введенные в культуру, освобождаются от влияния целого организма, благодаря чему можно отличить первичные изменения, вызванные генетическим дефектом самой клетки, от вторичных, вызванных влиянием генетически дефектного организма. С помощью культивирования клеток можно доказать генетическую природу заболевания. В самом деле, если клетки, выделенные из организма, сохраняют в ряду клеточных поколений in vitro фенотипический признак, характеризующий данную патологию, то это свидетельствует о наследственном её характере. Это особенно важно при исследовании такой патологии, где невозможен ни близнецовый, ни генеалогический анализ (например, при исследовании эмбриолетальности).

2. Раскрыть основные звенья патогенеза заболевания.

3. Обеспечить целенаправленный поиск первичного молеку-лярно-биохимического дефекта путем выявления нарушений клеточной функции или признака.

4. С помощью гибридизации клеток (в одних случаях достаточно образования синкарионов или гетерокарионов, в других необходимо получение гибридных клонов) исследовать генетическую гетерогенность и "привязать" ген или гены, ответственные за возникновение этой болезни, к определенной хромосоме.

Кроме этого культивирование клеток широко используется для пренатальной диагностики наследственных болезней, для диагностики наследственных дефектов метаболизма, для картирования генов человека, для генно-инженерных и молекулярно-биологичес-ких исследований.

Исследование культивируемых клеток особенно важно и перспективно в отношении болезней, связанных с нарушением морфогенеза ("абиотрофии", системные дисплазии), а также при исследовании болезней с неизвестным первичным биохимическим дефектом (муковисвддоз, мышечная дистрофия Дюшена, некоторые формы сахарного диабета, наследственные синдромы с предрасположенностью к злокачественным новообразованиям - семейный полипоз толстого кишечника, туберозный склероз и пр.).

Необходимость исследования наследственной патологии на клеточном уровне была подчеркнута еще в 1956 году McKusick, который писал, что культура фибробластов, возможно, является одной из наиболее обещающих методик для изучения наследственных болезней соединительной ткани. Первой целью исследования на культуре клеток должно быть воспроизведение in vitro морфологических аномалий. Далее автор указывает, что если морфологические аномалии фибробластов в культуре соответствуют болезни донора, то должны быть предприняты исследования по биохимической характеристике этих аномалий [150].

Это предсказание было реализовано через 10 лет при изучении мукополисахаридозов [161, 65]. В настоящее время возможности для изучения наследственных болезней на клеточном уровне значительно расширились. Во-первых, в культивируемых клетках могут быть продемонстрированы не только морфологические анома-' лии, но и физиологические. Например, уменьшение пролиферативного потенциала клеток можно наблюдать при синдроме преждевременного старения (прогерии) [84, 13б]. Во-вторых, определенные клеточные аномалии, дефекты или особенности могут быть продемонстрированы в культивируемых фибробластах не только при болезнях соединительной ткани, но и при заболеваниях, поражающих другие ткани. Это связано с плейотропными действиями генов. Здесь уместно напомнить, что, согласно McKusick (1978), в основе генетической диагностики лежат 3 принципа: генетическая гетерогенность, плейотропизм и изменчивость. Существование наследственных синдромов чаще всего обусловлено плейотропным действием генов. Обнаружение аномалий роста фибробластов при синдром© Гарднера, сахарном диабете позволяет думать, что многие наследственные болезни с ограниченной локализацией патологического процесса на самом деле являются системными. Если это так, то это позволит расширить круг наследственных заболеваний, которые могут быть изучены при помощи культивируемых вне организма клеток.

По мнению ведущих специалистов в области изучения морфогенеза и его нарушений, решающими клеточными феноменами в этом -процессе являются пролиферация, дифференцировка, миграция и программированная гибель клеток [17, 18]. При этом необходимо подчеркнуть, что указанные события не являются изолированными друг от друга, а самым тесным образом сопряжены. Совершенно ясно, что столь сложное поведение отдельных клеток и клеточных масс находится под сложным генетическим контролем. Выпадение в результате мутаций отдельных элементов этой системы или нарушение её функционирования в результате хромосомного дисбаланса может привести к нарушению развития, что было показано при изучении развития экспериментальных животных [156].

В течение долгого времени едва ли не общепризнанным было мнение, согласно которому главная функция клеточной пролиферации в ходе эмбрионального развития состоит в производстве клеток, принимающих участие в процессах дифференциации и формообразования. Широкую известность получило высказывание о том, что пролиферация поставляет "сырой материал" для морфогенеза. Вместе с тем, в последние годы процесс пролиферации в ходе эмбриогенеза все чаще анализируют под другим углом зрения. Изменения клеточных циклов рассматривают как один из активных факторов (причин) дифференциации клеток. Активация новых генов и направление процесса дифференциации по тому или другому пути могли бы зависеть от определенных событий клеточного цикла р7, 18]. Представления о роли клеточных клонов в эмбриогенезе говорят в пользу того, что избирательная пролиферация определенных клеток играет существенную роль в эмбриогенезе. Таким образом, изменения способности клеток к размножению может быть важным моментом в понимании процессов старения млекопитающих и развития целого ряда наследственных заболеваний.

Для медико-генетических исследований в большинстве случаев применяются фибробласты, получаемые из эмбрионального материала или из биоптата кожи пациентов. Вполне возможно применение и других типов клеток, однако методы их культивирования находятся в стадии разработки.

Фибробласты представляют собой основные клеточные элементы соединительной ткани. Именно эти клетки активно мигрируют из эксплантантов in vitro и дают начало клеточному штамму. Этот тип клеток достаточно хорошо изучен как in vivo, так и in vitro. Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что фибр области, введенше в культуру, полностью соответствуют фибробластам рыхлой соединительной ткани и не претерпевают сколь-нибудь заметной перестройки in vitro £9, 10, IlJ. Фибр о-бласты являются вполне адекватным объектом ввиду того, что многие болезни, особенно абиотрофии и системные дисплазии (согласно эмбриологическим и патоморфол огическим данным) связаны с дефектами мезодермы и её ближайших производных, к каковым относятся фибробласты. Кроме того, в фибробластах представлены многие структуры (цитоскелет, мембраны, рецепторы), свойственные и другим типам клеток, а также многие ферментативные активности, часто затрагиваемые мутациями, приводящими к наследственным болезням.

Несмотря на большое количество исследований культивируемых клеток при различных наследственных заболеваниях, опубликованных в литературе, они не объединены общей методологией и недостаточно учитывают генетически обусловленную индивидуальную изменчивость по целому ряду признаков клеток. Генетическая тождественность ядер соматических клеток ядрам зигот многоклеточного организма, то есть сохранение соматическими клетками (фиб-робластами, в частности) в онтогенезе всей полноты генетической информации данного организма, говорит в пользу того, что культивируемые клетки могут "представлять" генотип донора, и, что особенно важно, воспроизводить его в ряду клеточных поколений. Таким образом, межиндивидуальные (межштаммовые) различия, вероятнее всего, отражают генотипические различия, существующие между отдельными индивидуумами в популяции и затрагивающие все признаки, в том числе и клеточные.

К методическим недостаткам многих имеющихся работ можно отнести следующие.

1. Исследованию подвергаются отдельные признаки, явным образом не относящиеся к патогенезу данного заболевания.

2. Исследуется, как правило, небольшое количество клеточных штаммов как в норме, так и при данном заболевании.

Данная работа посвящена применению клонального анализа клеток in vitro для изучения наследственных болезней у человека. При её планировании мы выбрали один из возможных аспектов применения данного метода: эффективность клонирования, выраженная через долю клеток, способных образовывать колоши, состоящие из 16 и большего числа клеток, является показателем проли-феративного потенциала штамма. Представления о пролиферативном потенциале как генетическом признаке организма в настоящее время достаточно хорошо обоснованы. Показана высокая достоверная положительная корреляция между эффективностью клонирования и количеством делений, которые клетки могут пройти in vitro. Определение пролиферативного потенциала по эффективности клонирования штамма имеет ряд важных преимуществ, главным из которых является время, необходимое для получения результатов. В случае обычного серийного культивирования - это 9-12 месяцев, в случае эффективности клонирования -18 суток. Другое, непосредственно вытекающее из первого, состоит в восцроизводимости условий постановки экспериментов, которые легче контролировать в течение 18 суток, чем одного года.

Для выполнения подобного исследования особое значение приобретает разработка высокоэффективного метода клонирования и стандартизация проведения экспериментов.

Конечная цель исследования - изучить пролиферативный потенциал клеток при наследственных болезнях - могла быть достигнута после решения ряда конкретных задач. Эти задачи были следующие.

1. Подобрать оптимальные условия для высокоэффективного и хорошо воспроизводит,юго метода клонирования диплоидных клеток человека.

2. Выяснить влияние длительности культивирования штаммов на результаты, получаемые с помощью клоналъного анализа. Насколько стабилен показатель "эффективность клонирования"?

3. Определить масштабы изменчивости эффективности клонирования в зависимости от тканевого происхождения штамма, пола, онтогенетической стадии донора (эмбриональные штаммы, постнаталь-ные штаммы).

4. Определить масштабы индивидуальной (межштаммовой) изменчивости эффективности клонирования.

Свой выбор наследственных заболеваний мы остановили на хромосомном дисбалансе и диффузном полипозе кишечника. Судя по литературным данным, эти заболевания можно отнести к оппозитным группам. Хромосомный дисбаланс часто относят к "прогероидным синдромам", тогда как полипоз кишечника является заболеванием с наследственной предрасположенностью к злокачественным новообразованиям, и ряд авторов приводит данные, свидетельствующие о том, что культивируемые фибробласты кожи от таких больных обнаруживают свойства трансформированных клеток.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА I. ПОНЯТИЕ О ПРОЛШЕРАТИВНОМ ПОТЕНЦИАЛЕ

Диплоидные клетки человека и животных, культивируемые in vitro , имеют ограниченную, определенную дош каждого вида животного способность размножаться митозом. Это явление было открыто Хейфдиком [lI7, 113, 114] на культивируемых фибробластах эмбриона человека. Впоследствии оно было подтверждено в разных лабораториях на фибробластах целого ряда видов животных ^47, 52-55]. Еще сравнительно мало известно об иных, не фибробласт-ных, клетках. Однако было показано, что эпителиальные [83], гли-альные [16б], стромальные костномозговые [153] клетки человека характеризуются ограниченной способностью к размножению.

В культуре нормальных диплоидных клеток всегда отмечаются три последовательные фазы её развития. По терминологии Хейфлика, это следующие фазы: 1-я - первичная культура, состоящая из свежеизолированных первичных клеток организма-донора; 2-я - растущая культура, состоящая из пролиферирующих клеток; 3-я - культура в ходе инволюции, состоящая из клеток, которые больше не делятся или делятся редко.

На практике число клеточных генераций определяют следующим образом. В сплошной культуре все клетки находятся в контакте друг с другом и больше не делятся - классическое явление контактного ингибирования [2б]. Если сплошную культуру разделить на две и каждую половину клеток пересадить во флакон того же объема, то клетки разделятся в среднем один раз, после чего культура снова станет сплошной. Следовательно, число субкультур (или пассажей), которое может дать первичная культура при делении её каждый раз пополам, приблизительно равно числу клеточных поколений, которое эта культура может произвести. При культивировании эмбриональных клеток человека 1-я и 2-я фазы развития культуры растягиваются на срок около 10 месяцев, а в 3-й фазе культуры могут поддерживаться до 6 месяцев.

В литературе часто используется понятие пролиферативного потенциала. Потенциал делений, или пролиферативный потенциал -это величина, характеризующая число делений, которые могут совершить клетки культуры до своей гибели. Для культуры эмбриональных диплоидных клеток человека эту величину принимают равной 50 - 10, таккак культура совершает примерно 50 удвоений JlI3, 114]. Точное число генераций зависит от того, какой штамм используется, и от условий культивирования клеток.

Чтобы отличить процессы, связанные с митотическим циклом, от прочих процессов метаболизма, было введено понятие митотичес-кого времени. Для учета факторов, не сопряженных с клеточным делением, но связанных с активным метаболизмом, было введено понятие метаболического времени [95]. Хотя некоторые исследователи и отождествляют метаболическое время с календарным, эти понятия следует различать, так как существует состояние полностью выключенного метаболизма. Хранение клеток при температуре жидкого азота с последующим размораживанием и культивированием не приводило к уменьшению пролиферативного потенциала клеток [lI3, 114]. Эти результаты показали постоянство потенциала деления клеток и независимость его от времени, необходимого для полного завершения цикла делений.

Для того, чтобы выяснить, с чем коррелирует потенциал деления, с митотическим или метаболическим временем, несколько клеточных штаммов помещали в среду с пониженным содержанием (всего 0,5$) сыворотки крови плода теленка. В этих условиях фиб-робласты человека не могли делиться, но сохраняли метаболическую активность, В таком состоянии клетки могли находиться, по крайней мере, в течение 6 месяцев. Повышение концентрации сыворотки до 10% возвращало культуру в состояние активной пролиферации. Оказалось, что опытные культуры идентичны контрольным по числу совершенных удвоений, но гибель их наступает позднее на срок, равный времени нахождения культуры в непролиферирующем состоянии £71].

Гольдштейн и Сингал [95] провели эксперименты с культурами фибробластов человека, находящимися в состоянии контактного торможения деления при нормальном (10$) содержании сыворотки крови теленка в питательной среде. В этом состоянии культуры находились в течение 105-170 дней до тех пор, пока контрольные культуры фибробластов человека не прекращали расти после 52-62 удвоений популяции. Затем начинали пересевать культуры фибробластов, находившиеся в состоянии контактного ингибирования размножения. Гибель этих культур наступала через 195-240 дней. Общее же число совершенных удвоений популяции было лишь незначительно меньше (47-53 удвоения), чем в контроле, что вполне естественно, так как полностью исключить клеточное деление в условиях контактного торможения невозможно.

Результаты приведенных выше экспериментов показали, что продолжительность жизни клеток ограничена не календарным временем их существования, а цролиферативным потенциалом. Клетки "расходуют" свой пролиферативный потенциал лишь при делении. В настоящее время это показано не только для фибробластов, но и для глиальных p66j, эпителиальных [83] , стромальных костномозговых [ 153] клеток человека, а также целого ряда клеток других видов животных [136-139, 32, 43].

Имеются основания предполагать, что счет делений происходит не только в культуре клеток, но и в организме человека и животных. Так, с увеличением возраста донора на один год пролифе-ративный потенциал культуры фибробластов человека уменьшается на 0,15-0,33 удвоений популяции [180, 182, I84J. Известно, что при многократной пересадке клеток костного мозга в облученную мышь у этих клеток падает способность образовывать колонии J. Некоторые исследователи считают этот факт доказательством ограниченной способности клеток костного мозга к делению in vivo [169]. Концепция пролиферативного потенциала хорошо согласуется с результатами гетерохронной трансплантации органов и тканей. Было установлено, что трансплантируемые ткани мышей имели ограниченную продолжительность жизни, несмотря на то, что они все время находились в молодых реципиентах [70|.

Дикхюйзен [74] высказал предположение, что ограниченная способность к делению может создать in vivo положительное селективное преимущество. По его мнению, если какая-то клетка окажется в организме не на своем месте, то она может выйти из-под контроля нормальных тканевых механизмов, ингибирущих деление. Врожденный предел способности к делению мог бы препятствовать переходу таких клеток на путь неограниченной пролиферации. Естественный отбор должен благоприятствовать механизмам, лимитирующим число делений, так как неограниченный рост "отбившихся" клеток привел бы к гибели животного. Возможно, что число делений является результатом равновесия между отбором на высокий проли-феративный потенциал, необходшлый для нормального замещения поврежденных или "изношенных11 клеток, и отбором на ограниченный потенциал для пресечения злокачественного роста. Дикхюйзен (1974) высказал мысль, что доброкачественные опухоли и атеро-склеротические бляшки образуются из клеток, которые отделились от своей нормальной ткани и лимитированы в росте, благодаря ограниченному потенциалу удвоения.

Действительно, £38] (1976) привел данные, указывающие на то, что 75-80$ атеросклеротических бляшек имеют моноклональное происхождение. Pearson et ai. fI67U исследовали сосуды женщин, гетерозиготных по сцепленному с Х-хромосомой локусу Г-6-ВДГ. Нормальные ткани таких женщин содержали оба изофермен-та Г-6-ЩЦГ (А и Б), в то время как атеросклеротические бляшки содержали только один.

Идея о том, что ограниченная способность клеток к делению дает селективное преимущество организму, очень интересна и в настоящее время интенсивно обсуждается [42, 129, 195].

Bremermann £ 42 ] приходит к сходным с Дикхюйзеном (1974) выводам и считает, что ограниченная способность клеток к размножению представляет собой механизм, лимитирующий рост клонов клеток до опасных размеров в условиях , когда перестают работать обычные механизмы контроля клеточной пролиферации, связанные с действием кейлонов, гормонов, ростовых факторов. По его мнению, нарушение этого предела приводит к злокачественному росту. Кло-нальное происхождение опухолей и последующая селекция наиболее ся веским доводом в пользу такой точки зрения.

Walton С195 О в своей работе уделяет основное внимание другому аспекту этой проблемы: индивидуальное развитие организма основано на смене, одних клеточных элементов другими. Даже у tt агрессивных" клонов во время образования опухоли зрелого организма для поддержания его определенного размера и формы необходимо замещение изношенных или поврежденных клеток. Существование наследственных болезней, основным фенотипическим признаком которых являются признаки преждевременного старения и атрофии тканей, свидетельствует о том, что существуют гены, которые в случае их мутации могут приводить к преждевременному исчерпанию пролиферативных потенций в пределах клона или клонов.

Действительно, известно, что у мышей существуют мутации, вызывающие преждевременную гибель определенных клонов меланоцитов, что проявляется в специфической окраске шерсти Г156]. Хорея Ген-тингтона у человека является примером болезни с генетически запрограммированной преждевременной гибелью клеток в центральной нервной системе [134].

Невзирая на многие спорные моменты в развернувшейся в настоящее время дискуссии о значении ограничения потенциала удвоения клеток, неоспоримым является сам факт его существования. В конечном счете только две категории клеток избегают этот предел деления: генетически измененные клетки и зародышевые клетки, которые испытывают "мейотическое омоложение" и дают генетически ре-комбинированную зиготу. Первые являются чем-то вроде клеток-анархистов, которые не подчиняются больше командам организма, более того, становясь опухолевыми, они могут далее убить организм и при этом погибнуть сами. О вторых можно сказать, что они представляют "генетический сейф вида", если использовать терминологию, с помощью которой Полянский (1974) характеризует микронуклеус инфузорий.

Hayfiick J^108 ] предполагает, что раковые клетки могут размножаться неопределенно долго как in vitro , так и in vivo вследствие того, что они характеризуются чрезвычайно широкой генотигшческой изменчивостью не только качественной, но и количественной, приводящей к изменению числа копий генов. У гамет нет неограниченной способности к делению, пока они не объединены в зиготу. Таким образом, генетическая изменчивость по Hayfiick может обеспечить репрограммирование и "перезарядку" потенциала деления. Нормальные соматические клетки имеют ограниченный, видоспецифичес-кий потенциал деления. Это всеобщий закон для Metazoa.

ГЛАВА П. ПРИЧИНЫ УМЕНЬШЕНИЯ МИТОТМЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КУЛЬТУРЫ ДИПЛОИДНЫХ КЛЕТОК. КОНЦЕПЦИЯ СМЕНЫ ПЕРИОДОВ ПОКОЯ И АКТИВНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ В КЛЕТОЧНОМ ЦИКЛЕ

Митотическая активность культуры может снижаться, по крайней мере, по двум причинам: если уменьшается доля клеток, способных делиться, или если увеличивается время, необходимое клетке для деления. В промежуточном варианте возможно существование гетерогенной популяции, состоящей из клеток, не способных делиться, и с.» клеток, цроходящих по циклу с различной скоростью.

Снижение доли делящихся клеток цри длительном культивировании штаммов было обнаружено многими исследователями с применением самых различных методов. Merz, Ross (1969) проводили настолько редкий посев фибробластов человека, что все клетки оставались одиночными в том случае, если они не делились. На основании полученных данных авторы пришли к следующим выводам: I) популяция представляет собой смесь практически неделшцихся клеток и фибробластов, кинетика деления которых подчиняется уравнению первого порядка; 2) доля практически неделящихся клеток увеличивается в процессе длительного культивирования.

Сходные результаты были показаны при исследовании включения меченного радиоактивным тритием тимидина диплоидными фибробласта-ми человека [99].

Исследования с применением клонального анализа показали, что при длительном культивировании уменьшается доля клеток, способных образовывать колонии, состоящие из 16 и более клеток [188]. Эта ' зависимость была линейной, а воспроизводимость результатов настолько высокой, что было предложено использовать этот показатель для определения пролиферативного потенциала культуры. Такта было показано, что различия в скорости размножения между штаммами определяются числом клоногенных клеток £182, 183J.

Увеличение периода митотического цикла в процессе длительного пассирования культур наблюдали многие авторы, используя различные методы.

Радиоавтографическим методом обнаружено увеличение минимального времени генерации фибробластов человека с 16 до 21-22 часов jl40-I42j. Кинематографическое исследование выявило увеличение среднего времени между делениями с 16,8 до 32 часов £27, 28]. Выход клеток из митотического цикла, а также увеличение его длительности соцровожцалось накоплением клеток преимущественно в Gi -фазе клеточного цикла. Maciera-Coeiho сделал вывод, что не существует клеток, не способных делиться, и в культурах Ш фазы роста много клеток с исключительно длительным клеточным циклом [140, 142]. Однако, это мнение расходится с теориями, которые пытаются объяснить утрату штаммами способности к размножению обогащением культур клетками, не способными делиться [79, 80]. Оно противоречит также опытам, поставленным на клеточных клонах [27-29, 188, 189 ] , если только не разделять мнения Maciera-Coeiho , что прекращение митозов у клеток клона индуцируется особыми условиями культивирования, необходимыми для получения клона.

Westermark[ 198"] разработал метод "миниклонов", позволяющий определять пролиферативные потенции индивидуальных клеток и, что особенно важно, изучать динамику изменения этих потенций. Суть метода состояла в следующем. Чашки для культивирования покрывали агарозой, к которой нормальные диплоидные клетки не прикрепляются. Сверху агарозы накладывали мелкоячеистую сетку и напыляли палладием. Полученные таким образом "палладиевые островки" являлись хорошей поверхностью для прикрепления и размножения клеток. Преимущество метода состояло в следующем: I) плотность посева клеток была значительно выше, чем при обычном клонировании (именно на низкой плотности посева клеток при клонировании бшю основано большинство критических замечаний относительно "особых условий культивирования, необходимых для получения клонов";

2) клетки были изолированы друг от друга "агарозовыми мостиками";

3) метод позволял изучать динамику размножения потомков исходной клетки.

Biomquist et ai. 4j, J показали, что клетки в миниклонах обладают практически идентичными характеристиками размножения, что и клетки массовой культуры. И, наконец, в 1983 году Ponten et ai. , используя этот метод, доказали, что уменьшение митоти-ческой активности культуры обусловлено исключительно увеличением доли неделящихся клеток и полностью подтвердили результаты, полученные с применением клонального анализа. Эти же авторы отметили, что популяция глиальных клеток человека является гетерогенной по способности клеток к размножению. Даже на ранних пассажах культивирования значительная доля клеток в популяции обладает низким пролиферативным потенциалом.

Сходные результаты были получены на лимфоцитах человека. Известно, что культура лимфоцитов крови человека является гетерогенной популяцией. За одно и то же время разные клетки могут пройти различное число клеточных делений. Это может быть следствием различий во времени клеточного цикла или во времени, когда клетки вступают в клеточный цикл в ответ на воздействие ФГА. Чтобы проверить эти предположения, Morimoto Kanehis et al.j^ I57 j ВВОДИЛИ в среду БДУ для определения количества делении, прошедших клетками (метод дифференциальной окраски сестринских хроматид) и им-пульсно вводили 3Н-тимидин в различные сроки после стимуляции ФГА для определения времени начала синтеза ДНК. Авторы пришли к выводу, что независимо от длительности пререпликативного периода, продолжительность клеточного цикла лимфоцитов составляет 12-14 часов.

Таким образом, культуры диплоидных клеток состоят из двух субпопуляций, одна из которых обладает высоким, а другая низким про-лиферативным потенциалом. Соотношение этих двух субпопуляций и определяет пролиферативные характеристики штамма.

Эти результаты находятся в хорошем соответствии с современными представлениями о контроле размножения клеток, согласно которым, клетки высших организмов после митоза могут переходить в состояние G0 или "вне цикла" [l4j, из которого они возвращаются в клеточный цикл лишь при наличии адекватного экзогенного стимула к размножению. Предложено называть период отсутствия клеточной пролиферации периодом покоя [l3j. Было высказано предположение, что способность клетки переходить в состояние покоя преопределена генетически, а сам переход обусловлен фактора!® внешней среды £25J.

В состоянии покоя клетки могут находится неопределенно долго, не переходя к подготовке к синтезу ДНК ели делению [36, 37, 186J. Одновременно в клетках активируются метаболические процессы, направленные на поддержание состояния покоя, которое является особым физиологическим состоянием клеток, обеспечивающим их жизнедеятельность в условиях длительного отсутствия пролиферации [l4j. Было показано также, что продолжительность пререпликативного периода от момента получения покоящейся клеткой сигнала, стимулирующего деление, до начала синтеза ДНК возрастает пропорционально увеличению времени пребывания клетки в состоянии покоя [Зб].

В настоящее время концепция смены периодов покоя и активного размножения клеточного цикла является хорошо обоснованной и разделяется большинством исследователей. Значение состояния покоя заключается, главным образом, в том, что оно служит необходимой предпосылкой для специализации клеток в многоклеточном организме и адекватной регуляции численности клеточных популяций в тканях и органах [21J.

Большое значение состояния покоя имеет для функционирования стволовых клеток. Стволовые клетки составляют небольшую часть клеточной популяции, они делятся сравнительно редко и большую часть своего жизненного цикла пребывают в состоянии покоя, но при этом обладают высоким пролиферативным потенциалом. Благодаря тому, что стволовые клетки делятся редко, они могут сохранять полную биологическую информацию [102]: известно, что в результате многочисленных делений опасность потери или искажения информации увеличивается. Это свойство стволовых клеток приобретает особое значение при половом размножении организмов. Ряд клеточных поколений связан между собой стволовой линией (клетки зародышевого пути). На определенных этапах этого пути клетки могут в течение длительного времени находится в состоянии покоя, что способствует сохранению исходной информации, необходимой для поддержания биологического вида в раду поколений.

ГЛАВА Ш. да>Н0-1ДОПМЗМТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОЖФЕРАТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА. НЕГАТИВНЫЙ КОНТРОЛЬ КЛЕТОЧНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ

В 1961 году Hayflick, Moorhead высказали предположение, что ограничение пролиферативного потенциала определяется внутриклеточными процессами, а не влиянием окружающей среды jlI7]. Это утверждение Hayfiick (1965) доказал экспериментально. Он смешал две культуры клеток человека разного "репликативного возраста", взятые из женского и мужского организмов (мужские клетки были на 49 пассаже, а женские - на 13 пассаже). Через 17 пассажей после смешения, культура состояла только из женских клеток, при этом она совершила столько же удвоений, сколько и контрольная культура женских клеток. Продолжительность жизни культуры, состоящей из "молодых" и "старых" клеток была равна продолжительности жизни контрольных, не смешанных культур, то есть гибель одних клеток не влияла на состояние других.

Опыты по слиянию "стареющих" меток поздних пассажей (Ш фаза роста культуры) с "молодыми" пролиферирующими клетками ранних пассажей (П фаза роста культуры) позволили оценить характер изменений в клетках, которые приводят к потере пролиферативной активности. Первые опыты по слиянию гетероплоидных, асинхронно размножающихся клеток со стареющими указывали на восстановление способности к синтезу ДНК у ядер стареющих клеток в таких гетерокарионах [90j. Позднее было показано, что в гетерокарионах между стареющими и молодыми диплоидными клетками человека доминантным отзывается фенотип стареющих клеток, причем синтез ДНК в ядрах молодых клеток прекращался. При слиянии стареющих клеток с клетками, трансформированными вирусом sv-40 или с клетками HeLa наблюдали обратное явление: в ядрах стареющих клеток восстанавливался синтез ДНК [190].

Эти работы, однако, не позволили оценить вклад ядра и цитоплазмы в подавление размножения клеток. Характер ядерно-цитоплаз-матических отношений в ограничении пролиферативного потенциала был изучен Wright, Hayfiick ^205j при исследовании цитоплазмати-ческих гибридов (цибридов). Оказалось, что распределение клонов цибридов, реконструированных из старых цитопластов и молодых клеток, а также из молодых цитопластов и молодых клеток, сходны и практически не отличаются от распределений, характеризующих контрольные клетки (клетки проходили в среднем около 20 генераций). Иные результаты были получены при анализе цибридов, реконструированных из молодых цитопластов и старых клеток, а также старых цитопластов и старых клеток. В обоих случаях число числа генераций не превышало 5 и в среднем было равно 2-3.

Таким образом, внесение старой цитоплазмы не повлияло на про-лиферативную способность молодых клеток, а молодая цитоплазма не вызывала усиления митотической активности старых клеток, их "омолаживания". На основании этих данных Wright, Hayfiick сделали вывод, что ограниченная способность фибробластов человека к размножению in vitro является проявлением генетически запрограммированных событий и находится под контролем ядра.

Однозначную интерпретацию этих работ затруднил, однако, ряд фактов. Во-первых, это отсутствие цитоплазматического маркера в клетках, использованных для слияния и, следовательно, прямого доказательства того, что авторы имели дело с цибридами. Во-вторых, невозможность оценить влияние веществ, примененных для отбора цибридов.

Более прямой ответ о роли ядра и цитоплазмы в ограничении потенциала деления клеток был получен при изучении'реконструированных клеток. Успешную реконструкцию клеток из кариопластов и цито-пластов молодых и старых клеток wi -38 впервые осуществили Mig-gleton-Harris, Hayfiick [l59j. Этим авторам удалось получить размножающиеся реконструированные клетки и исследовать образованные ими клоны. Оказалось, что клетки, реконструированные из старых кариопластов и молодых цитопластов,практически не способны к размножению (менее 1% клеток делится два раза) и все погибают через 4 недели после слияния. Клетки, реконструированные из молодых кариопластов и старых цитопластов, жили до 16 недель и делились значительно больше, чем клетки, реконструированные из старых кариопластов и молодых цитопластов, но значительно меньше, чем клетки, реконструированные из молодых цитопластов и молодых кариопластов.

Таким образом, эксперименты Miggleton-Harris, Hayfiick ^I59j впервые показали, что, во-первых, молодая цитоплазма "не спасает" от гибели старые ядра, во-вторых, цитоплазма старой клетки влияет на молодое ядро, сокращая продолжительность его жизни и ускоряя события, ответственные за переход культуры в Ш фазу роста.

Drescher-Lincoln, Smith[73] реконструировали клетки из старых фибробластов колеи и легкого человека и из молодых гомологичных клеток. Клетки энуклеировали центрифугированием после обработки их цитохалазином В. Продукты слияния идентифицировали одним из трех методов: по наличию гранул латекса в цитоплазме и нефлуоресцирую-щему ядру после предварительной нагрузки цитопласта латексом и обработки продуктов слияния красителем Hoechst 33528; по наличию гранул латекса и радиографической метки в случае предварительной инкубации молодых клеток с 3Н-лейцином; по гранулам разных размеров, которыми метили исходные клетки разных возрастов. Исследовали синтез ДНК в продуктах слияния. Показали, что цитоплазма старых клеток на 40$ подавляет этот процесс в продуктах слияния по сравнению с цитоплазмой молодых клеток. Авторы пришли к заключению, что стареющие клетки продуцируют агенты, локализующиеся в цитоплазме и ингибирующие синтез ДНК.

Принципы эндогенного контроля перехода клеток из состояния пролиферации в состояние покоя и обратно были сформулированы в результате анализа экспериментов по слиянию покоящихся и пролиферирующих клеток [21, 14] .

Было показано, что существуют различия между данными по слиянию покоящихся клеток и по слиянию клеток, находящихся в периоде g-i , с синхронно размножающимися клетками. Так, например, ядра покоящихся клеток после слияния с клетками, находившимися в периоде s , вступают в синтез ДНК не сразу, как ядра , а через 2-3 часа, что указывало на необходимость какой-то перестройки их хроматина под действием индукторов синтеза ДНК и перехода в состояние готовности к вступлению в период s , характерное для ядер G1 . Полученные результаты указывали на функциональное отличие периода покоя от периода G-], что подтверждало реальность существования особого состояния покоя в жизни клетки, с другой стороны, подавление вступления в период s клеток, находящихся в периоде Gi , после слияния их с покоящимися клетками свидетельствовало о наличии в покоящихся клетках ингибитора клеточного размножения, препятствующего достижению критического уровня ^акторов инициации синтеза ДНК в периоде g-j и началу репликации ДНК. Если размножающиеся клетки уже вступили в период s или mi-itоз, они оказываются нечувствительными к ингибитору и продолжают пролиферировать.

Таким образом, было высказано предположение, что состояние покоя определяется и поддерживается эндогенным ингибитором клеточного размножения. Еоли в среде имеется достаточное количество стимуляторов клеточного размножения (факторы сыворотки, гормоны), клетки стохастически покидают период покоя вследствие падения концентрации ингибитора или его инактивации.

Заключение диссертации по теме «Другие cпециальности», Терехов, С.М.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что пролиферативный потенциал культивируемых клеток, учитываемый по показателю "эффективность клонирования", является индивидуальной характеристикой клеточного штамма.

2. Показано, что в клетках эмбрионального и постнатального происхождения существует вариабельность эффективности клонирования от штамма к штамму.

3. Обнаружено снижение эффективности клонирования клеток, полученных от спонтанных абортусов с хромоеомными аномалиями по сравнению с диплоидными клетками, полученными от медицинских абортусов. Хромосомный дисбаланс в постнатальных штаммах не приводит к снижению эффективности клонирования по сравнению с диплоидным контролем.

4. При комплексном исследовании культивируемых клеток от больных с аденоматозом толстого кишечника не обнаружено отличий от нормы ни по морфологии клеток и клеточного слоя, ни по количеству полиплоидных клеток, ни по показателям пролиферации.

5. На основании собственных и литературных данных предполагается, что изменчивость пролиферативного потенциала может модифицировать экспрессивность хромосомного дисбаланса по принципу условно-усилительного тропизма.

Хочу выразить глубокую благодарность безвременно ушедшей Александре Алексеевне Прокофкевой-Бельговской - моему научному руководителю.

Сердечно благодарю канд. мед. наук Кира Николаевича Гринберга за постоянную помощь и поддержку в работе.

Благодарю коллектив лаборатории цитогенетики человека Института медицинской генетики АМН СССР за повседневную помощь.

Список литературы диссертационного исследования Терехов, С.М., 1984 год

1. Бродский В.Я., Урываева И.В. Клеточная полиплоидия, пролифе-рация и дифференцировка. М., "Наука", 1981.

2. Бродский В.Я., Урываева И.В. Развитие и свойства полиплоидных клеточных популяций в онтогенезе млекопитающих. Онтогенез, 1970, Л I, с.229-247.

3. Бродский В.Я., Урываева И.В. Соматическая полиплоидия в развитии тканей. Онтогенез, 1974, Л 5, с.594-605.

4. Ван-Ганзен П. Старение клеток in vitro. Цитология, 1979,т.21, J* 6, с.627-649.

5. Варшавер Н.Б. Культивирование клеточных клонов млекопитающихи человека. Цитология, 1961, т.З, Л 6, с.653-661.

6. Гаврилова Н.С., Гаврилов Л.А. Эволюция представлений о механизмах "старения" культур клеток животных. Всесоюзный симпозиум "Молекулярные и клеточные механизмы старения". Киев, 1981, с.39-41.

7. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Культуры диплоидных клеток какобъект изучения молекулярных механизмов старения. Успехи современной биологии, 1978, т.85, вып.2, с.267-283.

8. Гаврилов Л.А., Гаврилова Н.С. Старение в клеточных культурах.

9. В кн.: Биология старения. (Под ред. Д. Чеботарева). Л., "Наука", с.236-248.

10. Гринберг К.Н. Диагностические проявления хромосомного дисбаланса. В кн.: Прогресс в медицинской генетике. М., "Медицина", 1978, с.181-186. 10. Гринберг К.Н. Клеточная генетика. В кн.: Перспективы медицинской генетики. М., "Медицина", 1982, с.66-93.

11. Гринберг К.Н. Клеточная генетика в изучении наследственныхболезней. Вестник АМН СССР, 1982, № 6, 361-365.

12. Давиденков С.Н. Эволюционно-генетические проблемы в неврологии. Л., 1947.

13. Епифанова О.И., Терских В.В. Периоды покоя и активной пролиферации в жизненном цикле клетки. Еурн. общ. биол., 1968, т.29, В 4, с.392-402.

14. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Активные метаболические процессы в покоящихся клетках. Цитология, 1982, т.24, Л II, с.1259-1274.

15. Епифанова О.й., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиесяклетки. М., "Наука", 1983.

16. Конюхов Б.В. Генетика развития позвоночных. М., "Наука",1980.

17. Конюхов Б.В. Роль генов в регуляции клеточной пролиферации.

18. Изв. АН СССР. Серия "Биология", 1977, 5, с.747-761.

19. Корочкин Л.И. Взаимодействие генов в развитии. М., "Наука",1977.

20. Кулиев A.M. Фенотипические аспекты хромосомных эмбриолеталей человека. Автореферат докт.дисс. М., 1975.

21. Кухаренко В.И., Кулиев A.M., Гринберг К.Н., Терских В.В.

22. Митотические циклы в диплоидных штаммах, полученных из кожных биопсий доноров. Цитология, 1974, т.16, Л 16, с.1228-1232.

23. Полуновский В.А. Генетический контроль размножения клетоки эволюция клеточного цикла. Цитология, 1982, т.24, В 12, с.1379-1393.

24. Полянский Ю.И. Генетический аппарат инфузорий и его эволюция.

25. Природа, 1974, Ш 4, с.14-23.

26. Терехов С.М., Гецадзе Х.А., Гринберг К.Н. Клональная гетерогенность фибробластов разных тканей эмбриона человека in vitro . Бюлл.экспер.биол. и мед., 1984, № 5, с.590-592.

27. Терехов С.М., Гецадзе Х.А., Гринберг К.Н. Клональная структура популяций диплоидных клеток человека Цитология, 1983, т.25, № 9, с.1096.

28. Терских В.В. Периоды покоя в нормальных и малигнизированныхклеточных системах.

29. Abercrombie М. Contact inhibition: the phenomen and itsbiological implication. Nat. Cancer Inst. Monogr., 1976, v.26, №2, p.249-264.

30. Absher P.M., Absher R.G. Clonal variation and aging ofdiploid fibroblast. Exp. Cell Res., 1976, v.103, №2, p.247-255.

31. Absher P.M., Absher R.G., Barnes W.D. Geneology of clonesof diploid fibroblasts. Exp. Cell Res., 1974, v.88, №1, p.95-104.

32. Absher P.M., Ryan H.S. Comparison of pulmonary endothelialcell and fibroblast proliferation usin time lapse cinematographic analysis. Tissue, Cell, 1982, v. 13, №4, p.645-650.

33. A comparison of the proliferative and replicative lifespan kinetics of cell cultures derived from mono zygonic twins. Ryan J.M., Ostrow D.G., Breakfuld A.O., Gerson E.S., Upchurch L. In Vitro, 1981, v.17, №1, p.20-27.

34. Adam G. Population dynamic model of cell-density dependentgrowth regulation and aging of fibroblasts in vitro. J.Theor.Biol., 1980, v.2, №2, p.233-257.

35. Adolphe M., Ronot X., Jaffray P. Effect of donor's age ongrowth kinetics of rabbit articular chondrocytes in culture, Mech. Ageing and Develop., 1983, v.23, №2, p.191-198.

36. Ahilon J., Tabor E., Becker J. Colony forming ability ofataxia-telangiectasia skin fibroblasts is an indicator of their early senescence and increased demand for growth factors. Exp. Cell. Res., 1982, v.140, №1, p.191-200.

37. Anatomic and chromosomal anomalies in 639 spontaneous abortuses. Hum.Genet., 1980, v.55, 87-98.

38. Augenlicht L.H., Baserga R. Changes in the GQ state of

39. WI-38 fibroblasts at different times after confluence. Exper. Cell. Res., 1974, 89, 255-262.

40. Baserga R, Multiplication and division in mammalian cells.1. N.Y., 1978.

41. Baserga R., Costlow M., Rovera G. Changes in membranefunction and chromatin template activity in diploid and transformed cells in culture. Fed.Proc., 1973, 32, p.2115-2118.

42. Benditt E. Implication of the monoclonal character ofhuman atherosclerotic plaques. Beitr.Pathol., 1976, v.158, №4, p.405-416.

43. Bierman B. Ehe effect of donor age on the in vitro lifespanof culturel human arterial smooth muscle cells. In Vitro, 1978, v.14, K°9, p.951-957.

44. Bishop C.E. A miniaturised single stemp method of cell cloning. J. Immunol. Meth., 1981, v.46, №1, p.47-51.

45. Blomquist E., Westermark В., Ponten J. Ageing of human glialcells in culture: increase in fraction of non-dividersas demonstrated by minicloning technique. Mech. Aging and Develop., 1980, v.12, №2, p.173-183.

46. Bremerraann H.J. Reliability of proliferation controls.

47. The Hayfiick limit and its breakdown in cancer. J.Theor. Biol., 1982, v.97, №4, p.641-662.

48. Brocxbank K.G., Pleomacher R.E., Van-Peer C.M. An in vitroanalysis of murine hemopoietic fibroblastoid progenitors and fibroblastoid cell function during aging. Mech.Ageing and Develop., 1983, v.22, H°1, p.11-21.

49. Brown W.T., Darlington G.I. Thermolable enzymes in progeriaand Werner syndrome. Evidence contrary to the protein error hypothesis. Am.J.Hum.Genet., 1980, 32, p.614-619.

50. Bruce S.A., Deamond S.E. Relationship between in vitro lifespan and in vivo age of sirian hamster fibroblasts. -In Vitro, 1981, v.17, №3, p.239-240.

51. Burmer G.C., Zeigler C.I., Noerwood Т.Н. Evidence forendogenous polypeptide mediated inhibition of cell cycle transit in human diploid cells. J.Cell Biol., 1982, v.94, №1, p.187-192.

52. Cameron I.L. Cell proliferation and renewal in aging mice.

53. J.Gerontol., 1972, 27, p.162-172.

54. Cellular replication and aging. Mech. Ageing and Develop.,1979, 9, p.313-324.

55. Conkie D., Young D.B., Paul J. Friend cell variants temperature-sensitive for growth. Exper. Cell Res., 1980, 126, p.439-444.

56. Cristofalo V.J. Animal cell culture as a model system forthe study of aging. Adv.Gerontol.Res., 1972, 4, p.45-79.53» Cristofalo V.J. Thymidine labelling index as a criterion of aging in vitro. Gerontology, 1976, 22, 1-2, p.9-27.

57. Cure S., Boue A., Boue J. Growth characteristics of humanembriohic cell lines with chromosomal anomalies. Bio-medicine, 1974, 21, p.233-236.

58. Cytogenetic evidence of clonal attenuation as the mechanismdetermining the in vitro lifespan of human fibroblast cultures. Salk D., Au K., Hoehn H., Martin G.M. Eur.J. Cell Biol., 1980, v.22, №1, p.552-561.

59. Cytogenetics of Werner's syndrome cultured skin fibroblastsvariegated translocation mosaicism. Salk D., Au K., Hoehn H., Martin G.M, Cytogenet. Cell Genet., 1981, v.30, №2, p.92-107.

60. Danes B.S. Hereditary colon cancer syndromes: on in vitrostudy. Clin.Genet., 1980, v.18, №2, p.128-136.

61. Danes B.S. In vitro tetraploidy in familial polyposis coli.1.ncet, 1980, 200-201.

62. Danes B.S. Increased tetraploidt: cell-specific for the

63. Gardner gene in the cultured cell. Cancer, 1976, 38, p.1983.

64. Danes B.S. Modifying Alleles in the Heritable colorectaecancer syndromes with polyps. In: Colorectae cancer. Prev. Epidemiol, and Screen. Int. Symp., New York, 1980, p.13-81.

65. Danes B.S. Progeria: a cell culture otudy on aging. J.Clin.1.vest., 1971, 50, p.2000-2003.

66. Danes B.S., Aim T. In vitro evidence of genetic heterogeneitywithin the heritable colon cancer coli with polyposis syndrome. Scand. J. Gastroenterol., 1981, 16, №3, 424-429.

67. Danes B.S., Aim T. In vitro studies on adenomatosis of thecolon and rectum. J.Med.Genet., 1979, v.16, №6, p.417-422.

68. Danes B.S., Gardner E.J. The Gardner syndrome a cell culturestudy on kindred 109. J.Med.Genet., 1978, 15, p.346-351.

69. Danes B.S., Krush A. The Gardner*s syndrome: a family studyin cell culture. J.Nat.Cancer Inst., 1977, v.58, №3, p.771-775»

70. Daniel С.?/. Aging of cells during serial propagation in vivo.

71. Adv. Gerontol. Res., 1972, 4, p.167-199.

72. Dell'Orco R.D., Crissman H.A., Steinkamps J.A., Kraemer M.M.

73. Population analysis of arrested human diploid fibroblasts by flow microfluometry. Exper.Cell.Res., 1974, 92, p.271-274.

74. Dominance of the senescence phenotype in heterokaryous betweenreplicative and post replicative fibroblast-like cells. Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1974, 71, p.235-240.

75. Drescher-Lincoln O.K., Smith J.R. Inhibition of DNA synthesisin proliferating human diploid fibroblasts by fusion with senescent cytoplasts. Exp. Cell Res., 1983, v.144, №2, p.455-462.

76. Dykhuizen D. Evolution of cell senescence, atherosclerosisand benign tumors. Nature, 1974, 251, p.616-618.

77. Effect of chromosome constitution da growth and longevity ofhuman skin fibroblast cultures. Hoehn H., Simpson M., Bryant E.M., Rabinovitch P.S., Salk D., Martin G.M. Am.J.Med.Genet., 1980, 7, 141-154.

78. Fraumenin J. Genetic factors. In: Cancer medicine. Philadelphia1973, p.7-12.

79. Galjaard H. Cell biology and Health Care. In: Cell Biological

80. Aspects of Disease. Boerhaave Ser., v.19, Leiden Univ. Press, 1981, p.309-318.

81. Gaiter S.H. Metabolic errors of the whole organism reflectedin cell cultures systems. In: Retention of Functional Differentiation in Cultured Cells, 1964, p.63-69.

82. Gelfant S. A new concept of tissue and tumor cell proliferation. Cancer Res., 1977, 37, p.3845-3862.

83. Gelfant S. Cycling noncycling cell transition in tissueaging, immunological surveillance, transformation and tumor growth. Int.Rev.Cytol., 1981, 70, p.1-25.

84. Gelfant S., Smith J.G. Aging noncycling cells an explanation.

85. Science, 1972, 178, p.357-361.

86. Gilchrest B.A. In vitro assessment of keratinocyte aging.

87. J.Invest.Dermatol., 1983, v.81, №1, p.184-189.

88. Glowaski I., Trepman E., Folkman J. Cell shape and phenotypic expression in chondrocytes. Proc.Soc.Exp.Biol, and Med., 1983, v.172, №1, p.93-98.

89. Goldstein S. Lifespan of cultured cells in progerial.1.ncet, 1969, 1, p.424-433.

90. Goldstein S. The role of DNA repair in aging of culturedfibroblasts from xeroderma pigmentosum and normal. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1971, 137, p.730-734.

91. Goldstein S. Aging in vitro. Growth of cultured cells fromthe Galapagos tortoise. Exp. cell Res., 1974, v.83, №3, p.297-302.

92. Goldstein S. Human genetics disorders that feature prematureonset and accebrated of biological aging. In: Shneider E.L. (ed.). The Genetics of Aging. Plenum Press, New York, London, 1978, p.171-214.

93. Goldstein S. Protein sunthetic errors in cultured humanfibroblasts; implication for cellular aging and carcinogenesis. 12-th Congr. Gerontol. Hamburg, July 12-17, 1981, Abstr. vol.1, S.i; s.a; 77.

94. Goldstein S., Harley C.B. Biological aging of cultured humanfibroblasts; relevance to immunological aging. Aging and Immun. Proc» Int. Symp. London, Ontario, 1979, New York, 1979, p.197-209.

95. Goldstein S., Lin C.C. Rescue of senescent human fibroblastsby hybridization with hamster cells in vitro, Exp.Cell Res., 1972, 70, p.436-439.

96. Goldstein S., Moerman E.Y. Defective protein in normal andabnormal human fibroblast during aging in vitro. Inter-discipl. Topics Geront., 1976, 10, p.24-30.

97. Goldstein S., Moerman E.Y. Heat labile enzymes in skin fibroblasts from subjects with progeria. Hew Engl.J.Med., 1977, 292, p.1306-1313.

98. Goldstein S., Moerman E.Y., Soelder J.S., Gleason R.E., Barnei

99. D.M. Chronologic and physiologic age effect replicative life span of fibroblasts from diabetics, prediabetics and normal donors. Science, 1978, 199, p.781-792.

100. Goldstein S., Niewiarowski S., Singal D. Pathological impliestions of7 cell aging in vitro. Fed.Proc., 1975, 34, p.56-63.

101. Goldstein S., Singal D.P. Alteration of fibroblast gene products in vitro from a subject with Werner's syndrome. Nature, 1974, 251, p.718-725.

102. Goldstein S., Singal D.P. Senescence of cultured human fib-:roblasts. Mitotic versus metabolic time. Exp.Cell Res., 1974, v.88, №2, p.359-364.

103. Gottardi A. Genetic analysis of growth pattern in cellpopulations in vitro. Lincei-Rend. Sc. fis. mat. e nat., 1969, v.XLVII, 5, p.70-78.

104. Gregory P.W., Castle W.E. Further studies on the embryologicalbasis of size inheritance in the rabbit. J.Exp.Zool., 1931, 59, p.199-211.

105. Grove G.L., Cristofalo V.J. Characterization of the cellcycle of the cultured human diploid cells. J.Cell Physiol., 1977, 90, p.415-422.

106. Growth abnormalities of cultured human skin fibroblastsderived from individuals with hereditary adenomatosis of the colon and rectum. Pfeffer L., Lipkin M., Stutman 0., Kopelovich L. J. Cell Physiol., 1976, v.89, H°1, p.29-37.

107. Hadorn E. Developmental genetics and letal factors. London,1961.

108. Hall A.K. Stem cell is a stem cell is a stem cell. Cell,1983, v.33, №1, p.11-12.

109. Hamaguchi H., Morito F., Kondo J. Growth characteristics and

110. Biochemical properties of cultured skin fibroblasts from patients with familial polyposis coli. Jap.J.Hum.Genet., 1979, v.24, №3, p.221-222.

111. Hartwell L.H. Cell division from a genetic perspective.

112. J.Cell Biol., 1978, 77, p.637-642.

113. Hartwell L.H. Saccharomyces cerevisiae cell cycle. Bacterid.

114. Rev., 1974, 38, p.164-198.

115. Hartwell L.A. Sequential function of gene products relativeto DNA synthesis in the yeast cell cycle. J.Molec.Biol., 1976, 104, p.803-817.

116. Hassold Т., Sandison A. The effect of chromosome constitutionon growth in culture of human spontaneous abortions. Hum.Genet., 1983, v.63, №2, p.166-170.

117. Hayfiick L. Current theories of biological aging. Federat.1. Proc., 1975, 34, p.9-13.

118. Hayfiick L.Aging and death of vertebrate cells. In: A.Viidiked.). Lectures on Gerontology, Academic Press, London, 1980, p.165-177.

119. Hayfiick L. Origing of aging. Environmental physiology. Agingheart and altitude by Elseirer North Holland. *1980, p.399-414.

120. Hayfiick L. Recent advances in the cell biology of aging.

121. Mech. Aging Dev., 1980, v.14, №1, p.59-79.

122. Hayfiick L. In vitro correlates of in vivo aging. 12-th Int.

123. Congr. Gerontol. Hamburg. July, 12-17, 1981. Abstr., vol.1, S.i; s.a; p.74.

124. Hayfiick L. The limited in vitro lifetime of human diploidcell strains. Exp.Cell Res., 1965, v.37, №3, p.614-636.

125. Hayfiick L. Tisuue cultures and mycoplasmas. Tex.Rep.Biol.Med.,1965, 23, p.285-303.

126. Hayfiick L. The longeirty of cultured human cells. J. of

127. American Geriatr. Society, 1974, v.22, №1, p.1-12.

128. Hayfiick L. The cellular basis for biological aging. In:

129. Finch C. and Hayfiick L. (eds.). Hand book of the biology of aging, New York, 1977, p.159-179.

130. Hayfiick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of humandiploid cell strains. Exper. Cell Res., 1961, 25, p.585-621.

131. Hecht F. Letter to editor: Who will survive with trisomy13 or 18? A call for cases 10 years old or above. Am.J.Med.Genet., 1981, 10, p.417-425.

132. Heim S. In vitro growth characteristics of skin fibroblastsfrom patients with adenomatosis of the colon and rectum and their relatives. Clin.Genet., 1983, 23, p.41-48.

133. Heiniger H.J.,Chen H.W., Meier H. Studies of the geneticcontrol of cell proliferation. I. Clearance of DNA-bound radiactivity in 19 inbred strains and hybrid mice. Life Sci., 1972, part 2, 11, p.87-96.

134. Heterogenous Response to X-Ray and Ultraviolet Light1.radiations of Cultured Skin Fibroblasts in Two Families with Gardner's Syndrome. J.Nat.Cancer Inst., 1982, 68, p.697-701.

135. Hirschhorn K., Bloch-Shtacher L. Transformation of genetically abnormal cells. In: The University of Texas MD Anderson Hosp. and Tumor Inst, at Houston 23rd Annual Symp. on Fundamental Cancer Res. Williams & Wilkins, Baltimore, 1970, p.191-202.

136. Holliday R., Thompson K.V.A. Genetic effect of the longevityof cultured human fibroblasts. III. Correlation with altere glucose-6-phosphate dehydrogenase. Gerontology, 1983, v.29, №2, p.89-96.

137. Howard A., Pelc S.R. Synthesis of desoxyribonucleic acidand in normal and irradiated cells and its relation to chromosome breakage. Heredity, 1953» 6, p.261-273.

138. In vitro cultivation of cells from aneuploid human embryos.

139. Boue A., Boue J., Cure S., Deluchat C., Perrandin N. In vitro, 1975, 11, p.404-413.

140. Jennings S.D., Ham R.G. Clonal growth, of primary culturesof human hyaline chondrocytes in a deffined medium. Cell Biol.Int.Rep., 1983, v.7, №2, p.149-159.

141. Jonak G.J., Baserga R. Cytoplasmic regulation of two G1-specific temperature-sensitive functions. Cell, 1979, 18, p.117-123.

142. Jonak G.J., Baserga R. The cytoplasmic appearance of threefunctions expressed during the GQ-G.j-S transition is nucleus-dependent. J.Cell Physiol., 1980, 105, p.347-354.

143. Kirkwood T.B.L., Cremer P.L. Cytogerontology since 1881.

144. A reapraisal of August Weismann and a review of modern progress. Hum.Genet., 1982, v.60, №2, p.101-121.

145. Kopelovich L. Adenomatosis of the colon and rectum. Relevance to in heritance and suspectibility mechanisms in human cancer. Cancer Surv., 1981, p.71-91.

146. Kontermann K., Bayreuther K. The cellular aging of ratfibroblasts in vitro is a differentiation process. Gerontology, 1979, v.25, №2, p.261-274.

147. Liskay R.M. A mammalian somatic cell mutant defective in G^.

148. J.Cell Physiol., 1974, 84, p.49-56.

149. Mackey M.C., Dormer P. Continuous maturation of proliferating erythroid precursors. Cell and Tissue Kinet., 1982, v. 15, №4, p.381-392.

150. Martin J. Huntington's disease: genetically programmed celldeath in the human central nervous system. Nature, 1982, v.259, №5860, p.205-206.

151. Martin G.M. Genetic syndromes in man with the potentialrelevance to the pathobiology of aging. In: Genetic effect of aging. N.Y., 1978, p.5-39.

152. Martin G.M. Cellular aging. Clonal senescence. Am. J.Pathol.,1977, v.89, №2, p.484-511.

153. Martin G.M. Recent tendence in biological science. 12th1.t.Congr.Gerontol. Hamburg, July 12-17, 1981, Abstr. vo.1, S.i; s.a; p.18.

154. Martin G.M., Spargue C.A., Epstein C. Replicative lifespanof cultivated human cells. Effects of Donor's age, tissue and genotype. Laboratory Investigation, 1970, v.23, №1, p.86-92.

155. Maciera-Coelho A. Kinetics of the proliferation of humanfibroblasts during their lifespan in vitro. Mech. Ageing and Develop., 1977, 6, p.341-343.

156. Macieira-Coelho A. The decreased growth potential in vitroof human fibroblasts of adult origin. In: E.Holeckova and V.J.Cristofalo (eds.), Aging in Cell and Tissue Cultures. Plenum Press, New York, 1970, p.121-132.

157. Macieira-Coelho A. Are non-dividing cells present in agingcell cultures? Nature, 1974, 248, p.421-422.

158. Macieira-Coelho A. Metabolism of aging cells in cultures.1.troduction. Gerontology, 1976, v.22, №1-2, p.3-8.

159. Macieira-Coelho A. Implication of the reorganization of thecell genome for aging or immortalization of dividing cells in vitro. Gerontology, 1980, v.26, №5, p.276-282.

160. Macieira-Coelho A., Arrazone B. Aging of human fibroblastsis a succession of subtle changes in the cell cycle and has a final short stage with abrupt events. Exp.Cell Res., 1982, v. 141, №4, p.325-332.

161. Macieira-Coelho A., Pobten J., Philipson L. The divisioncycle and RNA synthesis in diploid human cells at different passage levels in vitro. Exp.Cell.Res., 1966, v.42, №4, p.673-684.

162. Macieira-Coelho A., Ponten J., Philipson L. Inhibition ofthe division cycle in confluent cultures of human fibroblasts in vitro. Exp.Cell.Res., 1966, v.43, №1, p.20-29.

163. Macieira-Coelho A., Schachtschabel D.O. Rational for theutilization of tissue culture in aging research. 12th Int. Congr. Gerontol. Hamburg, July, 12-17, 1981. Abstr., vol.1, S.i; s.a; p.79.

164. McKusick v. Вклад клинической генетики в генетику человека.

165. Х1У Международный генетический конгресс. Москва, 1978. Пленарные заседания, симпозиумы, с.101-102.

166. McKusick V. Heritable Disorders of Connective Tissue. 1st

167. Edition. 1956. St.Louis, C.V.Mosby Co.

168. McLaren A., Bowman P. Genetic effects of the timing ofearly development in the mouse. J.Embryol. and Exp.Morphol., 1973, 30, p.491-498.

169. Merz G.S., Ross J.D. Viability of human diploid cells asa function of th in vitro age. J.Cell Сотр.Physiol.,1969, v.74, №2, p.219-222.

170. Metz Т., Bekaert E., Verdonk G. Similarity between in vitroand in vivo cellular aging. Mech.Ageing Dev., 1983, v.22, №1, p.71-78.

171. Mets Т., Verdonk G. Variation in the stromal cell population of human bono marrow during aging. Mech.Ageing Dev., 1981, v.15» №1, p.41-49.

172. Mets Т., Verdonk G. In vitro aging of human bone marrowderived stromal cells. Mech.Ageing Dev., 1981, v.16, №1, p.81-89.

173. Mintz B. Gene control of mammalian development and disease.1.t. Cancer Res.Sci. Rept., 1971-1972, 17, p.101-109.

174. Morimoto K., Sato M., Koizumi A. Proliferative kenetics ofhuman lymphocytes in culture measured by autoradiography and sistem chromatid differential staining. Exp. Cell Res., 1983, v.145, №2, p.349-356.

175. Moriwaki K., Imai H.T. Mechanism of ploidy shift fromdiploidy to tetraploidy in MSPC-1 mouse myeloma. Exp.Cell Res., 1978, v.111, p.483-489.

176. Muggleton-Harris A.L., Hayflick L. Cellular aging studiesby the reconstruction of replicating cells from nuclei and cytoplasms isolated from normal human diploid cells. Exp.Cell Res., 1976, v.103, №2, p.321-330.

177. Nakatsu S.L., Masek M.A., Landrum S. Activity of DNA templates during cell division and cell differentiation. Nature, 1974, 248, p.334-335.

178. Neufeld E. Contribution of cell culture to studies oflysosomal enzymes. V.Intern.Congr.Human Genetics, 1976.

179. Nibaldo I. Differentiation of skeletal muscle in culture.

180. Cell Sturt. and Funct., 1982, v.7, №2, p.91-109.

181. Novel L. Cell Differ.: Mol.Basis, and Probl. Berlin e.a.1982, p.99-254.

182. Nowell P.C. Tumor progression and clonal evolution: therole of genetic instability. In: Chromosome mutationand neoplasia. Ed. J.German. New York, 1983, p.413-433.

183. Paton G.R., Solver M.P., Allison A.C. Comparison of cellcycle time in normal and trisomic cells. Humangenetic, 1974, 23, p.173-182.

184. Ponten J., Stein W.D., Shall S. A quantitative analysis ofthe aging of human glial cell in culture. J.Cell Physiol., 1983, v. 117, №3, p.342-352.

185. Pearson Т., Kramer E., Solez K., Heptinstall R. The humanatherosclerotic plaque. Amer.J.Pathol., 1977, 86, p.657-664.

186. Prescott D.M. Reproduction of eucariotic cells. N.Y., 1976.

187. Reincke V., Hannon H.C., Rosenblatt M., Hellamm S. Proliferation capacity of murine hemapoietic stem cells in vitro. Science, 1982, 215, p.1619-1622.

188. Riccardi V., Mulvihill J. (ed.). Neurofibromatosis (von

189. Recklinghausen disease). Genetics, Cell Biology and Biochemistry, 1981, Ravon Press.

190. Rohme D. Evidence for a relationship between longevity ofmammalian species and lifespan of normal fibroblasts in vitro and erithrocytes in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci,USA, 1981, v.78, №8, p.5009-5013.

191. Roscoe D.H., Robinson H., Carbonell A.W. DNA synthesis andmitosis in temperature sensitive Chinese hamster cell line. J.Cell Physiol., 1973, 82, p.333-338.

192. Rossini M., Baserga S., Huang C.H. Changes in RNA polymerase II in a cell cyclin-specific temperature-sensitive mutant of hamster cells. J.Cell Physiol., 1980, 103, p.97-103.

193. Salk D. Werner's syndrome. A review of recent research withan analysis of connective tissue metabolism. Growth control of cultured cells and chromosomal aberrations. Hum. Genet., 1982, v.62, №1, p.1-15.

194. Segal D.J., McCoy E.E. Studies on Down's syndrome in tissueculture. Growth rates and protein contents of fibroblast cultures. J.Cell Physiol., 1973, 83, p.85-90.

195. Shapiro S.D., Quattromani F., Jorgenson R.J. Tricho-dentoosseous syndrome: heterogeneity or clinical variability. Am.J.Med.Genet., 1983, 14, p.224-235.

196. Sheinin R. Temperature-sensitive mutants in the study ofcell cycle progression in mammalian cells. In: Nuclear-cytoplasmic interaction of the cell cycle. N.Y., p.105-166.

197. Shiomi Т., Sato A. Cell cycle studies in a temperature-sensetive cell division mutant of mammalian cells. Cell Struct, and Funct., 1978, 3, p.95-102.

198. Schneider E.L., Braunschweiger K., Mitsui J. The effectof serum batch on the in vitro lifespan on cell cultures derived from old and young human donors. Exp.Cell Res., 1978, v. 115, №1, p.47-52.

199. Schneider E.L., Chase C.A. Relationship between age ofdonor and in vitro lifespan of human diploid fibroblasts. Interdiscip. Top. Gerontol., 1976, v.10, №1, p.62-75.

200. Schneider R.L., Epstein E.J. Replication rate and lifespanof cultured fibroblasts in Down's syndrome. Proc.Soc, Exptl. Biol. Ned., 1972, 141, p.1092-1094.

201. Schneider E.L., Mitsui J. The relationship between in vitrocellular aging and in vivo human age. Proc.Natl.Acad Sci USA, 1976, v.73, №10, p.3584-3588.

202. Schneider E.L., Mitsui J. Examination of the relationshipbetween in vitro cellular aging and in vivo human age. J.Cell.Biol., 1982, v.70, N02, part 2, p.305a.

203. Schneider E.L., Smith J.R. The relationship of in vitrostudies to in vivo human aging. International review of Cytology, 1981, 69, p.261-270.

204. Schneider E.L., Towlkes B.J. Measurement of DNA contentand cell volume in senescent human fibroblasts utilizing flow multiparameter single cell analysis. Exp.Cell Res.,1976, 98, p.298-302.

205. Smets L.A. Activation of nuclear chromatin and the releasefrom contact inhibition of 3^3 cells. Exp.Cell Res.,1973, 79, p.239-243.

206. Smith B.J., Wigglesworth N.M. A cell line which is temperature sensitive for cytokinesis. J.Cell Biol., 1972,v.80. p.253-260.

207. Smith J.M., Pereira-Smith O.M., Schneider E.L. Colony sizedistributions as a measure of in vivo and in vitro aging. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1978, 75, p.1353-1356.

208. Smith J.R., Hayfiick L. Variation in the lifespan of clonesderived from human diploid cell strains. J.Cell Biol.,1974, 62, p.48-53.

209. Synkaryon and heterokaryon analyses of clonal senescence.

210. Norwood Т.Н., Hoehn H., Martines A.O., Martin G.M. In: Senescence. Dominant or recessive in somatic cell crosses? Ed. by W.Nichols, D.G.Murphy. N.Y., L., Plenum Press,1977, p.23-37.

211. The cellular Basis of morphogenetic charage. Group report.

212. Gerhart J., Berking S., Cooke J., Freeman G.L., Nildebrandt A., Jokusch H., Lawrence P., Nusslein-Volhard C., Oster G., Sander K., Sauer H.W., Steut G., Wessells N., Wolhert L. Life Sci. Res. Rep., 1982, №22, p.87-114.

213. Thompson K.V.A., Holliday R. Genetic effect on the longevityof cultured human fibroblasts. I. Werner's syndrome. Gerontology, 1983, v.29, №2, p.73-82.

214. Thompson K.V.A., Holliday R. Genetic effect on the longevityof cultured human fibroblasts. II. DNA repair deficient syndromes. Gerontology, 1983> v.29, №2, p.83-88.

215. Wang K.J. Temperature-sensitive mammalian cell line blockedin mitosis. Nature, 1974, 24Q, 76-78.

216. Werner I. Control of pigment synthesis in culture. Yale

217. J. of Biol, and Med., 1973, 46, p.444-463.

218. Westermark B. Growth control in miniclones of human glialcells. Exp. Cell Res., 1978, v.111, №2, p.295-299.

219. Whittaker J.R. The melanotic expression of embryonic pigmentcells: regulation in vitro and in situ. In: Control mechanisms on the expression of cellular phenotypes. N.Y. Acad.Press, 1970,,p.89-101.

220. Whitten W.K., Dagg C.P. Influence of spermatozoa on thecleavage rate of mouse eggs. J.Exp.Zool., 1962, 148, p.173-183.

221. Wissinger W., Wang R.J. Studies on cell division in mammaliarcells. IV. A temperature-sensitive cell line defective in postmetaphase chromosome movement. Exp.Cell.Res., 1978, 112, p.89-94.

222. Woityk R.I.,. Goldstein S. Clonal selection in culturedhuman fibroblasts: Role of protein synthetic errors. J.Cell.Biol., 1982, 95, p.704-710.

223. Wright W.E., Hayflick L. Nuclear control of cellular agingdemonstrated by hybridization of enucleate and whole cul-tired normal human fibroblasts. Exper.Cell Res., 1975, v.96, p.113-121.