Клинико-экспериментальная фармакокинетика нового антибактериального средства Фтортиазинон тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Савицкий Марк Владиславович

• Савицкий Марк Владиславович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Савицкий Марк Владиславович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антибиотикорезистентность. Распространенность и подходы к ее преодолению

1.2. Антивирулентные средства

1.3. Доклинические исследования фармакодинамики Фтортиазинона

1.4. Фармакокинетические исследования при разработке новых лекарственных средств

1.5. Доклинические исследования фармакокинетики субстанции фтортиазинона

ВЫВОДЫ К ГЛАВЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Реактивы и оборудование

2.2. Экспериментальные животные

2.2.1. Кролики

2.2.2. Крысы

2.2.3. Мыши

2.3. Добровольцы

2.4. Методы исследования

2.4.1. Количественное определение фтортиазинона

2.4.2. Исследование биотрансформации фтортиазинона

2.4.3. Методика определения сигнальных молекул quorum sensing

2.4.4. Определение метаболитов триптофанового обмена

2.5. Расчет фармакокинетических параметров

2.6. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Разработка и валидация метода количественного определения фтортиазинона

3.1.1. Разработка метода количественного определения фтортиазинона

3.1.2. Валидация метода количественного определения фтортиазинона

3.2. Фармакокинетика фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона у кроликов

3.2.1. Биодоступность фтортиазинона у кроликов

3.2.2. Фармакокинетика глюкуронида фтортиазинона у кроликов

3.2.3. Экскреция фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона с калом и мочой

у кроликов

3.3. Фармакокинетика фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона у крыс

3.3.1. Фармакокинетика и линейность дозирования фтортиазинона у крыс

3.3.2. Фармакокинетика глюкуронида фтортиазинона у крыс

3.3.3. Распределение фтортиазинона по органам крыс

3.3.4. Распределение глюкуронида фтортиазинона по органам крыс

3.3.5. Экскреция фтортиазинона с калом у крыс

3.4. Доклиническое исследование фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона

у мышей

3.4.1. Сравнительная фармакокинетика, распределение по органам и изучение метаболизма фтортиазинона в крови инфицированных и неинфицированных мышей

3.4.2. Профилирование сигнальных молекул QS в легких инфицированных мышей, получивших фтортиазинон или плацебо

3.4.3. Метаболомное исследование крови и легких инфицированных мышей, получивших фтортиазинон или плацебо

3.5. Клиническое исследование фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона

у добровольцев

3.5.1. Исследование фармакокинетики фтортиазинона у добровольцев

3.5.2. Исследование фармакокинетики глюкуронида фтортиазинона у добровольцев

3.6. Исследование метаболизма фтортиазинона у добровольцев

3.7. Межвидовая экстраполяция фармакокинетических параметров фтортиазинона

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Разработка и валидация методики определения концентрации

фтортиазинона в биологических образцах (кровь, гомогенат печени и легких, моча) крыс

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. Метаболомное исследование

ПРИЛОЖЕНИЕ В. Разработка и валидация методики определения концентрации

фтортиазинона в цельной крови и моче человека

ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Критерии включения и невключения добровольцев в исследование

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клинико-экспериментальная фармакокинетика нового антибактериального средства Фтортиазинон»

Актуальность темы исследования

Снижение чувствительности бактерий к антибиотикам повышает риски, связанные с получением медицинской помощи, и коморбидность пациентов с хроническими заболеваниями, что снижает эффективность лечения и увеличивает затраты системы здравоохранения [1, 2]. Терапия инфекций, вызванных устойчивыми штаммами, включает использование антибиотиков и антибактериальных средств, которые оказывают селективное воздействие на бактериальную популяцию и стимулируют появление новых антибиотикорезистентных штаммов, поэтому существует потребность в новых лекарственных средствах с иным механизмом воздействия [3, 4].

В Федеральном государственном бюджетном учреждении «Национальном исследовательском центре эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России был разработан инновационный лекарственный препарат фтортиазинон (ФТ), низкомолекулярный ингибитор системы секреции III типа, фактора вирулентности многих грамотрицательных бактерий, и жгутиковой подвижности. Благодаря ингибированию факторов вирулетности, бактерии теряют способность оказывать токсическое влияние на организм хозяина. Несмотря на то что при таком воздействии не происходит полное уничтожение патогена, подавление факторов вирулентности блокирует токсическое влияние патогена, а также препятствует развитию резистентных инфекций и снижает вероятность передачи механизмов резистентности [5, 6].

Исследования показали, что субстанция ФТ подавляет острые и хронические инфекции, вызванные Chlamydia trachomatis, Salmonella enterica, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii и Escherichia coli in vivo [7, 8, 9, 10, 11, 12]. Введение ФТ увеличивает выживаемость лабораторных животных, обеспечивает эрадикацию возбудителя из крови и органов, снижает проявление патоморфологических нарушений и иммунодефицита, а также ограничивает развитие патологического воспалительного ответа в исследованных моделях.

Важным этапом разработки инновационного лекарственного средства является изучение его экспериментальной и клинической фармакокинетики. Исследование всасывания, распределения, метаболизма и выведения нового лекарственного средства необходимо для разработки схемы лечения, выбора дозы, а также установления взаимосвязей между вводимой дозировкой, концентрацией лекарственного средства и оказываемым терапевтическим

эффектом. Чтобы успешно перенести терапевтические эффекты фтортиазинона с лабораторных животных на человека, необходимо изучить его клинико-экспериментальную фармакокинетику.

Для фармакокинетических исследований необходим надежный аналитический метод, который позволит провести точное и достоверное определение концентрации исследуемого препарата в сложных биологических матрицах. Разработка новых аналитических методик является приоритетной задачей развития фармацевтической отрасли Российской Федерации.

Степень разработанности темы исследования

Химическая структура Фтортиазинона была получена в результате компьютерного моделирования, направленного синтеза и последующей химической оптимизации ингибиторов системы секреции 3 типа [13]. Терапевтическая активность соединения была изучена in vitro и in vivo в отношении ряда бактериальных патогенов, характеризующихся устойчивостью к антибиотикам, например, Chlamydia spp., Salmonella enterica, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Klebsiella pneumonia [7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15].

Исследования показали, что введение ФТ статистически значимо уменьшает количество бактериальных колониеобразующих единиц в крови и органах животных, увеличивает выживаемость модельных организмов и обеспечивает эрадикацию бактерий из организма. Также были проведены пилотные эксперименты по оценке фармакокинетики изучаемой субстанции [12, 15]. Имеющиеся результаты доклинического исследования фармакодинамики фтортиазинона доказали перспективность соединения, вследствие чего была разработана лекарственная форма препарата «Фтортиазинон, таблетки» [16].

Цель и задачи исследования

Разработать методику количественного определения фтортиазинона и его метаболита методом высокоэффективном жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием (ВЭЖХ-МС/МС) и провести клинико-экспериментальное изучение фармакокинетики нового оригинального антибактериального средства Фтортиазинон.

Для достижения цели данного исследования были поставлены следующие задачи: 1. Разработать и валидировать методику количественного определения фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона в биологических матрицах для проведения фармакокинетического анализа методом ВЭЖХ-МС/МС.

2. Изучить фармакокинетику фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона у кроликов при пероральном введении препарата: оценить абсолютную и относительную биодоступность и экскрецию с мочой и калом.

3. Исследовать фармакокинетику фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона у крыс после перорального введения препарата в различных дозировках: проверить гипотезу линейности, изучить накопление в органах.

4. Провести оценку фармакокинетики фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона у мышей с острой пневмонией, вызванной Pseudomonas aeruginosa, в сравнении с не зараженными животными в крови и органах. Выявить особенности действия фтортиазинона на сигнальные молекулы quorum sensing и его влияние на организм животных при помощи целевых метаболомных методов.

5. Исследовать фармакокинетику фтортиазинона и глюкуронида фтортиазинона у здоровых добровольцев при однократном, суточном и курсовом применении препарата.

6. Провести изучение биологической трансформации лекарственного препарата Фтортиазинон у здоровых добровольцев после перорального применения.

7. Изучить межвидовые различия в фармакокинетике фтортиазинона у мышей, крыс, кроликов и людей, провести экстраполяцию фармакокинетических параметров вещества с модельных организмов на человека.

Научная новизна

Разработана и валидирована методика количественной оценки вещества фтортиазинон и его метаболита глюкуронида фтортиазинона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, сопряженной с тандемным масс-спектрометрическим детектированием, позволяющая определять концентрацию препарата в биологических образцах лабораторных животных и человека. Изучена абсолютная и относительная биодоступность лекарственного препарата «Фтортиазинон, таблетки, 300 мг» у кроликов. Исследована фармакокинетика фтортиазинона и распределение по органам у крыс в широком диапазоне доз.

Впервые исследованы изменения фармакокинетики, тканевой доступности и метаболизма фтортиазинона при наличии острой легочной инфекции, вызванной синегнойной палочкой. Показано влияние препарата на сигнальные молекулы quorum sensing и метаболизм обмена триптофана. Впервые изучены всасывание, распределение и метаболизм фтортиазинона у здоровых добровольцев при однократном, двукратном и курсовом приеме препарата. Установлены общие закономерности и отличия фармакокинетики фтортиазинона у

лабораторных животных и человека, осуществлен перенос фармакокинетических показателей с животных на человека.

Теоретическая и практическая значимость работы

Представлен методический подход для количественного определения фтортиазинона и его глюкуронида в биологических матрицах животных и человека. В результате комплексного фармакокинетического исследования были установлены ключевые фармакокинетические параметры у наиболее распространенных видов лабораторных животных (мыши, крысы, кролики). При изучении межвидовых различий показано, что использование крыс наиболее достоверно позволяет прогнозировать фармакокинетические параметры ФТ у человека. Более того, оценка сравнительной фармакокинетики фтортиазинона при наличии бактериального воспаления указывает направление изменений в фармакокинетике препарата могут проявиться при назначении фтортиазинона пациентам.

Разработанная лекарственная форма фтортиазинона (таблетки) показала свою эффективность для достижения целевых концентраций препарата в крови и органах.

Результаты исследования фармакокинетики препарата у здоровых добровольцев были использованы для разработки режима дозирования и организации исследований по установлению зависимости «доза-концентрация-эффект» у целевой популяции пациентов.

Методология и методы исследования

В основе методологии настоящего исследования лежит комплексный принцип исследования фармакокинетики для изучения основных фармакокинетических параметров, режимов дозирования и комбинаций совместного приема препарата «Фтортиазинон». С целью получения концентраций препарата в исследованных биологических матрицах был использован аналитический метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием.

Для поиска метаболитов был выбран метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором высокого разрешения. Для расчета фармакокинетических параметров был проведен некомпартментный метод анализа данных концентраций препарата. В работе также были использованы методы математической статистики.

Личный вклад автора

Автор самостоятельно проводил поиск и анализ литературных данных по вопросам антивирулентных средств, механизмов и роли фармакокинетики новых лекарственных средств. Автор лично разработал и провел валидацию аналитической методики определения действующего вещества фтортиазинона и его основного метаболита в биологических матрицах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектором.

Роль автора в выполнении исследований фармакокинетики фтортиазинона у мышей, крыс, кроликов заключалась в планировании эксперимента, подготовки биологических образцов к анализу, проведению инструментального анализа, обработке результатов, выборе и применении методов статистического анализа данных и последующей интерпретации результатов. Автор провел клиническое исследование фармакокинетики препарата Фтортиазинон у здоровых добровольцев, изучил пути биологической трансформации действующего вещества в организме человека. Вклад автора сыграл решающую роль на каждом этапе исследования от постановки цели и задач исследования до оценки полученных результатов, формулирования положений и выводов и подготовки результатов экспериментов к публикации.

Положения, выносимые на защиту

1. Аналитическая методика высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием пригодна для количественного определения фтортиазинона. Валидационные показатели разработанной аналитической методики количественного определения фтортиазинона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием соответствуют валидационным характеристикам, установленными требованиями Евразийского экономического союза (ЕАЭС), Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (US Food and Drug Administration, FDA) и Европейского агентства лекарственных средств (European Medicines Agency, EMA).

2. Пероральный прием таблетированной формы фтортиазинона показал умеренный уровень биодоступности у кроликов. Установлено, что основной вид экскреции фтортиазинона - через кишечник.

3. Увеличение вводимой дозы приводит к линейному увеличению фармакокинетических параметров фтортиазинона у крыс. Однократное пероральное применение препарата создает высокие концентрации действующего вещества в органах.

4. Легочная синегнойная инфекция приводит к изменению фармакокинетики фтортиазинона за счет увеличения абсорбции и снижения метаболизма препарата. Фтортиазинон снижает уровень сигнальных молекул quorum sensing синегнойной палочки, отвечающих за вирулентность патогена, и увеличивает концентрации метаболитов кинуренинового и индолового путей обмена триптофана.

5. После однократного приема фтортиазинон создает низкие концентрации в крови и длительно выводится. Двукратный прием препарата кратно увеличивает период полувыведения.

6. Основной путь биотрансформации фтортиазинона у человека заключается в образовании конъюгатов с глюкуроновой кислотой.

7. Фармакокинетические показатели фтортиазинона демонстрировали межвидовое сходство. Данные, полученные у крыс, позволили наиболее точно экстраполировать период полувыведения препарата человека.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Настоящая научно-квалификация работа соответствует следующим пунктам специальности 3.3.6. Фармакология, клиническая фармакология: исследование механизмов действия фармакологических веществ в экспериментах на животных, на изолированных органах и тканях, а также на культурах клеток (п.5); изучение фармакодинамики, фармакокинетики и метаболизма лекарственных средств. Установление связей между дозами, концентрациями и эффективностью лекарственных средств. Экстраполяция полученных данных с биологических моделей на человека (п.6); и пункту 4 специальности 3.4.2. Фармацевтическая химия, фармакогнозия - разработка методов анализа лекарственных веществ и их метаболитов в биологических объектах для фармакокинетических исследований.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Достоверность результатов подтверждается тем, что каждый эксперимент исследования был выполнен на надлежащем экспериментальном материале с использованием адекватных методов оценки на поверенном оборудовании. Для оценки различий полученных данных были выбраны соответствующие методы статистической обработки. Организация исследований и расчеты были выполнены в соответствии с требованиями «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [17], РФ ГОСТ Р 52379-2005 «Надлежащая клиническая практика» и РФ ГОСТ Р 33647-2015 «Надлежащая лабораторная практика».

Результаты диссертационной работы представлены на III Китайско-Российском международном форуме (Москва, Харбин, 2022); на международной научно-практической конференции молодых ученых «Фармация. Вызовы времени» (Москва, Витебск, 2022); на I международной Российско-Сербской конференции молодых ученых памяти академика А.П. Арзамасцева (Москва, Крагуевац, 2023); на IV всероссийской конференции по аналитической спектроскопии с международным участием (Краснодар, 2023).

Апробация результатов диссертационного исследования состоялась на заседании научно-методической конференции кафедры фармакологии Института фармации имени А. П. Нелюбина, кафедры фармацевтической и токсикологической химии имени А.П. Арзамасцева Института фармации имени А.П. Нелюбина, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней, Института клинической медицины имени Н.В. Склифосовского, кафедры фармакологии Института цифрового биодизайна и моделирования живых систем Научно-технологического парка биомедицины, Центра биофармацевтического анализа и метаболомных исследований Института трансляционной медицины и биотехнологии ФГАОУ ВО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), протокол № 12 от «22» мая 2024 г.

Публикации по теме диссертации

По результатам исследования автором опубликовано 6 работ, в том числе 1 научная статья в журнале, включенном в Перечень рецензируемых научных изданий Сеченовского Университета и/или Перечень Высшей аттестационной комиссии при Минобрнауки России, в котором должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук; 3 статьи в изданиях, индексируемых в международных базах Web of Science, Scopus, PubMed, MathSciNet, zbMATH, Chemical Abstracts, Springer), 2 иные публикации по результатам исследования.

Внедрение результатов исследования

Основные научные положения, выводы и рекомендации настоящей кандидатской диссертации были внедрены в учебный процесс кафедры фармакологии Института фармации имени А.П. Нелюбина при изучении дисциплины «Фармакология» для студентов по направлению подготовки (специальности) «33.05.01 Фармация» (акт № 391 от 18 марта 2024 г.).

Результаты диссертационной работы внедрены в научно-исследовательский процесс Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский

центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, вошли в состав отчета о научно-исследовательской работе, который, в свою очередь, был включен в пакет документов, представленных в Министерство здравоохранения Российской Федерации в рамках процедуры регистрации лекарственного препарата (акт б/н от 27 марта 2024 г.).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 227 страницах печатного текста, содержит 63 рисунка, 81 таблицу, 4 приложения. Диссертационное исследование включает в себя введение, обзор литературы, описание материалов и методов, результатов, содержит обсуждение, заключение и выводы. Список литературы включает 148 литературных источника, из которых 19 отечественных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антибиотикорезистентность. Распространенность и подходы к ее преодолению

Применение антибактериальных средств (АБС) стало необходимым инструментом в современной системе здравоохранения. Лечение и предотвращение инфекционных заболеваний было бы невозможным без их использования [18]. АБС позволяют увеличить ожидаемую продолжительность жизни, снизить заболеваемость и смертность. При профилактическом использовании они также уменьшают риски осложнений сложных медицинских вмешательств и обеспечивают безопасность терапии химиотерапевтическими и иммунносупрессивными препаратами [19, 20]. Однако дальнейшее использование антибиотиков находится под угрозой из-за увеличения частоты антибиотикорезистентности возбудителей.

Под антибиотикорезистентностью бактерий понимают снижение чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам. В связи с растущей устойчивостью бактерий к антибиотикам, лечение заболеваний, вызванных резистентными микроорганизмами, затрудняется из-за ухудшающейся эффективности терапии, что проводит к увеличению рисков неблагоприятных исходов [21, 22, 23]. Антибиотикорезистентность особенно опасна в стационаре, делая медицинскую помощь источником бактериального заражения, что критично для пациентов с иммунодефицитами, муковисцидозом, а также для пациентов с коморбидностью (диабет, сердечно-сосудистые заболевания и др.) [24].

Резистентность к антибиотикам влияет на клинические исходы. Если в 2019 году антибиотикорезистентность стала причиной 1,2 млн смертей по всему миру, то к 2050 году прогнозируют, что это число может увеличиться до 10 млн в год [25]. Снижение эффективности лечения предполагает назначение более дорогих лекарственных средств, дополнительных обследований и процедур и увеличение времени пребывания в стационаре, что увеличивает затраты системы здравоохранения. В России суммарные затраты на лечение инфекций, вызванных антибиотикорезистентными штаммами, оценивают в более 13,7 млрд руб ежегодно [26]. В странах Европы, США и Канаде расходы на лечение антибиотикорезистентной инфекции составляют суммарно свыше 50 млрд долларов в год [27].

Растущая угроза устойчивости микроорганизмов к антибактериальной терапии также отмечается Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) - в 2015 году была запущена программа Global Antimicrobial Resistance and Use Surveillance (сокращ. GLASS, англ. «Глобальная система по надзору за устойчивостью к противомикробным препаратам и их использованием»), направленная на мониторинг антибиотикорезистентности [28]. Также в 2017 году был опубликован список ESKAPE, который включил наиболее опасных с точки зрения

резистентности патогенов: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanii, Pseudomonas aeruginosa и род Enterobacteriaceae [29]. ВОЗ отмечает, что против этих возбудителей срочно требуется разработка новых препаратов. В России реализуется «Программа Стратегия контроля антимикробной терапии (СКАТ) при оказании стационарной медицинской помощи», направленная на совершенствование применения АБС в условиях стационаров и контроль антибиотикорезистентности [30]. Программа регламентирует организацию работы отделов стационара, в частности, отдела клинической фармакологии, а также порядок использования АБС для снижения рисков формирования резистентных штаммов возбудителей.

Сложность контроля антибиотикорезистентности также заключается в разнообразии механизмов ее проявления. Основные механизмы антибиотикорезистентности - это деактивация антибиотика бактериальными ферментами, изменение проницаемости бактериальной мембраны, структурная модификация мишени и усиление вывода препарата [31, 32]. Выделение бактериального фермента - это наиболее распространенный механизм резистентности, который заключается в образовании ферментов, разрушающих молекулу антибиотика, например, ß-лактамаз, ацилаз или эстераз [33].

ß-Лактамазы разрушают ß-лактамную связь молекулы ß-лактамных антибиотиков (пенициллинов и цефалоспоринов), что приводит к гидролизу молекулы и образованию кислотных производных, не обладающих антибактериальными свойствами [34]. Поскольку ß-лактамазы стали ведущей причиной резистентности к антибиотикам из группы ß-лактамов, были разработаны стратегии по преодолению их действия: были разработаны ингибиторы ß-лактамаз (клавулановая кислота, сульбактам, авибактам), которые комбинируют с классическими ß-лактамными антибиотиками для повышения эффективности терапии. Химическая модификация ß-лактамного кольца позволила получить новые антибактериальные средства, устойчивые к действию разрушающих ферментов, - метициллин, нафциллин и оксациллин [35]. Разработанные стратегии позволили первоначально снизить резистентность определенных патогенов, однако устойчивость к этим средствам не заставила себя ждать - наблюдается формирование метициллин-резистентных штаммов и секреции ß-лактамаз расширенного спектра

[36]. По результатам исследования «Марафон 2013-2014» нозокомиальные штаммы Staphylococcus aureus характеризуются высоким уровнем резистентности к большому кругу АБС

[37].

Другим распространенным механизмом антибиотикорезистентности считается изменение проницаемости бактериальной мембраны. Белки-порины на поверхности мембраны грамотрицательных бактерий образуют каналы, которые обеспечивают обмен питательных компонентов и других соединений между периплазмой бактерий и внешней средой. Способность

антибактериальных средств проходить через мембрану зависит от строения антибиотика, размеров молекулы и ее заряда [38]. В ответ на воздействие АБС бактерии могут изменять размер пор каналов и экспрессию генов, связанных с синтезом мембранных каналов, чтобы регулировать поступление вещества в клетку. Например, Escherichia coli снижают число каналов OmpF, что ограничивает проникновение ß-лактамных антибиотиков внутрь клеток, становясь более устойчивыми; размер молекулы гликопептида ванкомицина является препятствием для проникновения препарата внутрь клетки P. aeruginosa, размер пор которой крайне мал [39].

Другой подход реализации резистентности - это структурная модификация мишени антибиотика. При таком механизме точка приложения антибиотика подвергается изменению, делая невозможным взаимодействие вещества со структурной единицей бактерии. Яркий пример механизма модификации - это метилирование аденина в субъединице 23S рибосомной рибонуклеиновой кислоты (РНК), в результате чего макролиды и линкозамиды, мишенью которых является данная субъединица, теряют свою эффективность [40]. АБС из группы хинолонов воздействуют на ферменты гиразы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) бактерий - их эффективность значительно снижается, когда бактерии изменяют субъединицы А фермента

[41].

Усиленный вывод препарата позволяет бактериям провести элиминацию антибиотика из периплазмы после его введения. Вывод АБС осуществляется при помощи эффлюксных насосов, транспортных белков на мембране бактерии, которые также используются бактериями для выделения в окружающую среду токсинов, сигнальных молекул чувства кворума и бактериальных эффекторов [42]. Эффлюксные насосы играют значительную роль в резистентности к ß-лактамным антибиотикам [43].

Сниженная или отсутствующая чувствительность бактерии к АБС может возникать в результате природных или экзогенных причин. Природная резистентность - это антибиотикорезистентность, предопределенная естественными признаками конкретного вида. Например, известно, что дикие штаммы P. aeruginosa могут обладать природной резистентностью к ампициллину, амоксициллину, некоторым цефалоспоринам I и II поколения, цефотаксиму, клиндамицину, цефтриаксону и др. [44]. Генетические обусловленные особенности строения патогена не позволяют указанным антимикробным средствам проявить свою активность.

Экзогенная, или приобретенная, резистентность развивается в результате контакта патогена с безопасной для бактерии концентрацией антимикробного средства. Избыточное и нерациональное использования антибиотиков в медицине, сельском хозяйстве, ветеринарии и пищевой промышленности [45] ведет к попаданию в окружающую среду антибиотиков в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Савицкий Марк Владиславович, 2024 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dadgostar, P. Antimicrobial Resistance: Implications and Costs / P. Dadgostar // Infection and Drug Resistance. - 2019. - Vol. 12. - P. 3903-3910.

2. Enumerating the economic cost of antimicrobial resistance per antibiotic consumed to inform the evaluation of interventions affecting their use / P. Shrestha, B.S. Cooper, J. Coast, [et al.] // Antimicrobial Resistance & Infection Control. - 2018. - № 1 (7). - P. 98.

3. Diabetes-associated infections: development of antimicrobial resistance and possible treatment strategies / M.S.H. Akash, K. Rehman, F. Fiayyaz, [et al.] // Archives of Microbiology. -2020. - № 5 (202). - P. 953-965.

4. Pfeifer, Y. Resistance to cephalosporins and carbapenems in Gram-negative bacterial pathogens / Y. Pfeifer, A. Cullik, W. Witte // International Journal of Medical Microbiology. - 2010. - № 6 (300). - P. 371-379.

5. Rasko, D.A. Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease / D.A. Rasko, V. Sperandio // Nature Reviews Drug Discovery. - 2010. - № 2 (9). - P. 117-128.

6. Rello, J. Pseudomonas aeruginosa ventilator-associated pneumonia management / J. Rello, S. Ramirez Estrada, B. Borgatta // Infection and Drug Resistance. - 2016. - P. 7.

7. Preventative treatment with Fluorothiazinon suppressed Acinetobacter baumannii-associated septicemia in mice / N.E. Bondareva, A.V. Soloveva, A.B. Sheremet, [et al.] // The Journal of Antibiotics. - 2022. - № 3 (75). - P. 155-163.

8. Fluorothiazinon inhibits the virulence factors of uropathogenic Escherichia coli involved in the development of urinary tract infection / E.A. Koroleva, A.V. Soloveva, E.Y. Morgunova, [et al.] // The Journal of Antibiotics. - 2023. - Vol. 76. - P. 279-290.

9. Small Molecule Inhibitor of Type Three Secretion System Belonging to a Class 2,4-disubstituted-4H-[1,3,4]-thiadiazine-5-ones Improves Survival and Decreases Bacterial Loads in an Airway Pseudomonas aeruginosa Infection in Mice / A.B. Sheremet, N.A. Zigangirova, E.S. Zayakin, [et al.] // BioMed Research International. - 2018. - Vol. 2018. - P. 1-13.

10. A novel antivirulent compound fluorothiazinone inhibits Klebsiella pneumoniae biofilm in vitro and suppresses model pneumonia / S.V. Tsarenko, N.A. Zigangirova, A.V. Soloveva, [et al.] // The Journal of Antibiotics. - 2023. - № 76. - P. 397-405.

11. A small-molecule compound belonging to a class of 2,4-disubstituted 1,3,4-thiadiazine-5-ones inhibits intracellular growth and persistence of Chlamydia trachomatis / N.A. Zigangirova, E.A. Kost, L.V. Didenko, [et al.] // Journal of Medical Microbiology. - 2016. - № 1 (65). - P. 91-98.

12. Fluorothiazinon, a small-molecular inhibitor of T3SS, suppresses salmonella oral infection in mice / N.A. Zigangirova, L.N. Nesterenko, A.B. Sheremet, [et al.] // The Journal of Antibiotics. - 2021. - № 4 (74). - P. 244-254.

13. Development of Chlamydial Type III Secretion System Inhibitors for Suppression of Acute and Chronic Forms of Chlamydial Infection / N.A. Zigangirova, E.S. Zayakin, L.N. Kapotina, [et al.] // Acta Naturae. - 2012. - № 2 (4). - P. 87-97.

14. Small Molecule Inhibitor of Type Three Secretion Suppresses Acute and Chronic Chlamydia trachomatis Infection in a Novel Urogenital Chlamydia Model / E.A. Koroleva, N.V. Kobets, E.S. Zayakin, [et al.] // BioMed Research International. - 2015. - Vol. 2015. - P. 1-7.

15. A small-molecule compound belonging to a class of 2,4-disubstituted 1,3,4-thiadiazine-5-ones suppresses Salmonella infection in vivo / L.N. Nesterenko, N.A. Zigangirova, E.S. Zayakin, [et al.] // The Journal of Antibiotics. - 2016. - № 6 (69). - P. 422-427.

16. Патент N RU2743927C1 Российская Федерация, МПК A61K 31/549, A61K 47/30, A61P 31/04. Твердая дисперсия 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4Н-[1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамида для изготовления лекарственной формы и способ лечения хронических инфекционных заболеваний: N 2020121790 : заявл. 10.07.2020 : опубл. 01.03.2020 / Зигангирова Н.А., Лубенец Н.Л., Золотов С.А. [и др.] // Google Patents. URL: https://patents.google.com/patent/RU2743927C1/ru (дата обращения 10.04.2024).

17. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - Москва : Гриф и К, 2012. - 944 с. - Текст: непосредственный

18. Hutchings, M.I. Antibiotics: past, present and future / M.I. Hutchings, A.W. Truman, B. Wilkinson // Current Opinion in Microbiology. - 2019. - Vol. 51. - P. 72-80.

19. Antimicrobial stewardship for surgical antibiotic prophylaxis and surgical site infections: a systematic review / J.V. Martinez-Sobalvarro, A.A.P. Junior, L.B. Pereira, [et al.] // International Journal of Clinical Pharmacy. - 2022. - № 2 (44). - P. 301-319.

20. Enzler, M.J. Antimicrobial Prophylaxis in Adults / M.J. Enzler, E. Berbari, D.R. Osmon // Mayo Clinic Proceedings. - 2011. - № 7 (86). - P. 686-701.

21. Antibiotic resistance—the need for global solutions / R. Laxminarayan, A. Duse, C. Wattal // The Lancet Infectious Diseases. - 2013. - № 12 (13). - P. 1057-1098.

22. Lewis, K. The Science of Antibiotic Discovery / K. Lewis // Cell. - 2020. - № 1 (181). - P. 29-45.

23. Разработка и валидация метода количественного определения фтортиазинона в плазме крови человека / С.Н. Басханова, М.В. Савицкий, Н.Е. Москалева [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 2023. - № 11 (57). - C. 53-59.

24. Antibiotic Resistance in Patients with Cystic Fibrosis: Past, Present, and Future / E. P. Perikleous, D. Gkentzi, A Bertzouanis, [et al.] // Antibiotics. - 2023. - № 2 (12). - P. 217.

25. Government of the United Kingdom. Tackling Drug-resistant Infections Globally: Final Report and Recommendations Review on Antimicrobial Resistance. - London : Wellcome Trust, 2016. - 80 p. URL: https://apo.org.au/node/63983 (дата обращения 11.04.2024).

26. Burden of resistant infections caused by S. aureus, E. coli, K. pneumoniae in Russian Federation / Y.M. Gomon, Y.S. Svetlichnaya, A.S. Kolbin, [et al.] // Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy. - 2018. - № 4 (20). - P. 310-318.

27. Securing Medical Supply Chains in a Post-Pandemic World / OECD. - Paris : OECD Publishing, 2024. - 145 p. - ISBN 978-92-64-43168-3. - Текст : непосредственный.

28. Global antimicrobial resistance and use surveillance system (GLASS) report: 2022 / World Health Organization; Geneva : World Health Organization Publishing, 2022. - 82 p. - ISBN 978-92-4006270-2. - Текст : непосредственный.

29. Discovery, research, and development of new antibiotics: the WHO priority list of antibiotic-resistant bacteria and tuberculosis / E. Tacconelli, E. Carrara, A. Savoldi, [et al.] // The Lancet Infectious Diseases. - 2018. - № 3 (18). - P. 318-327.

30. Программа СКАТ (Стратегия Контроля Антимикробной Терапии) при оказании стационарной медицинской помощи. Российские клинические рекомендации / под ред. С. В. Яковлева, Н. И. Брико, С. В. Сидоренко, Д. Н. Проценко, - Москва : Перо, 2018. - 156 c. - Текст : непосредственный

31. The mechanisms of antibiotic resistance in major pathogens of purulent-inflammatory complications in cancer patients / O.E. Kokhlova. I.A. Larionova, O.V. Perianova, [et al.] // Russian Journal of Infection and Immunity. - 2020. - № 2 (11). - P. 324-336.

32. Current Treatment Strategies Against Multidrug-Resistant Bacteria: A Review / A. Parmanik, S. Das, B. Kar, [et al.] // Current Microbiology. - 2022. - № 12 (79). - C. 388.

33. Dever, L.A. Mechanisms of Bacterial Resistance to Antibiotics / L.A. Dever // Archives of Internal Medicine. - 1991. - № 5 (151). - P. 886.

34. Bonomo, R.A. ß-Lactamases: A Focus on Current Challenges / R.A. Bonomo // Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. - 2017. - № 1 (7). - P. a025239.

35. Jacobs, L. M. C. Drug Discovery in the Field of ß-Lactams: An Academic Perspective / L.M.C. Jacobs, P. Consol, Y. Chen // Antibiotics. - 2024. - № 1 (13). - P. 59.

36. Castanheira, M. Extended-spectrum ß -lactamases: an update on their characteristics, epidemiology and detection / M. Castanheira, P.J. Simner, P.A. Bradford // JAC-Antimicrobial Resistance. - 2021. - № 3 (3). - P. dlab092.

37. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Staphylococcus aureus в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования «МАРАФОН» 2013-2014 / А.В. Романов, А.В. Дехнич, М.В. Сухорукова [и др.] // Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. - 2017. - № 1 (19). - C. 57-62.

38. O'Shea, R. Physicochemical Properties of Antibacterial Compounds: Implications for Drug Discovery / R. O'Shea, HE. Moser // Journal of Medicinal Chemistry. - 2008. - № 10 (51). - P. 28712878.

39. Choi, U. Distinct Roles of Outer Membrane Porins in Antibiotic Resistance and Membrane Integrity in Escherichia coli / U. Choi, C.-R. Lee // Frontiers in Microbiology. - 2019. - Vol .10. - P. 953.

40. Methylation of 23S rRNA Nucleotide G748 by RlmA II Methyltransferase Renders Streptococcus pneumoniae Telithromycin Susceptible / A. Takaya, Y. Sato, T. Shoji, T. Yamamoto // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2013. - № 8 (57). - P. 3789-3796.

41. Pourahmad Jaktaji, R. Study of Mutations in the DNA gyrase gyrA Gene of Escherichia coli / R. Pourahmad Jaktaji, E. Mohiti // Iranian journal of pharmaceutical research. - 2010. - № 1 (9). - P. 43-48.

42. Role of bacterial efflux pumps in antibiotic resistance, virulence, and strategies to discover novel efflux pump inhibitors / A. Gaurav, P. Bakht, M. Saini, [et al.] // Microbiology. - 2023. - № 5 (169). - P.001333

43. Efflux Pump, the Masked Side of ß-Lactam Resistance in Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates / J.M. Pages, J.P. Lavigne, V. Leflon-Guibout, [et al.] // PLoS ONE. - 2009. - № 3 (4). - P. e4817.

44. Чеботарь, И.В. Механизмы резистентности Pseudomonas aeruginosa к антибиотикам и их регуляция / И.В. Чеботарь, Ю.А. Бочарова, Н.А. Маянский // Клиническая Микробиология и Антимикробная Химиотерапия. - 2017. - № 4 (19). - C. 308-319.

45. Endale, H. Potential Causes of Spread of Antimicrobial Resistance and Preventive Measures in One Health Perspective-A Review / H. Endale, M. Mathewos, D. Abdeta // Infection and Drug Resistance. - 2023. - Vol. 16. - P. 7515-7545.

46. Castañeda-Barba, S. Plasmids, a molecular cornerstone of antimicrobial resistance in the One Health era / S. Castañeda-Barba, E M. Top, T. Stalder // Nature Reviews Microbiology. - 2024. - № 1 (22). - P. 18-32.

47. Extended-Spectrum ß-Lactamases (ESBL): Challenges and Opportunities / A. Husna, M.M. Rahman, A T M. Badruzzaman, [et al.] // Biomedicines. - 2023. - № 11 (11). - P. 2937.

48. Martinez, J. L. Mutation Frequencies and Antibiotic Resistance / J.L. Martinez, F. Baquero // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2000. - № 7 (44). - P. 1771-1777.

49. Методические рекомендации «Диагностика и антимикробная терапия инфекций, вызванных полирезистентными штаммами микроорганизмов» (обновление 2022 г.) / В. Б. Белобородов, О.В. Голощапов, В.Г. Гусаров [и др.] // Альянс клинических химиотерапевтов и микробиологов. URL: https://antimicrob.net/1231241-2/. Дата публикации: 05.04.2022.

50. Bacterial Virulence Factors: Secreted for Survival / A.K. Sharma, N. Dhasmana, N. Dubey, [et al.] // Indian Journal of Microbiology. - 2017. - № 1 (57). - P. 1-10.

51. Byrne, G.I. Chlamydia trachomatis Strains and Virulence: Rethinking Links to Infection Prevalence and Disease Severity / G.I. Byrne // The Journal of Infectious Diseases. - 2010. - № S2 (201). - P. 126-133.

52. Effect of the Lower Molecular Capsule Released from the Cell Surface of Bacillus anthracis on the Pathogenesis of Anthrax / S. Makino, M. Watarai, H. Cheun, [et al.] // The Journal of Infectious Diseases. - 2002. - № 2 (186). - C. 227-233.

53. Bertani, B., Function and Biogenesis of Lipopolysaccharides / B. Bertani, M. Ruiz // EcoSal Plus. - 2018. - № 1 (8). - P. 10.1128/ecosalplus.ESP-0001-2018.

54. Sastalla, I. Editorial: Bacterial Exotoxins: How Bacteria Fight the Immune System / I. Sastalla, D.M. Monack, K.F. Kubatzky // Frontiers in Immunology. - 2016. - № 7.

55. Pathogenicity and virulence of Clostridium botulinum / A.M. Rawson, A.W. Dempster, C.M. Humphreys, N.P. Minton // Virulence. - 2023. - № 1 (14). - P. 2205251.

56. Green, E.R. Bacterial Secretion Systems: An Overview / E.R. Green, J. Mecsas // Microbiology Spectrum. - 2016. - № 1 (4). - P. 4.1.13.

57. Depluverez, S. The Role of Bacterial Secretion Systems in the Virulence of Gram-Negative Airway Pathogens Associated with Cystic Fibrosis / S. Depluverez, S. Devos, B. Devreese // Frontiers in Microbiology. - 2016. - Vol. 7. - P. 1336.

58. Holden, V. I. Diverging roles of bacterial siderophores during infection / V.I. Holden, M.A. Bachman // Metallomics. - 2015. - № 6 (7). - P. 986-995.

59. The bacterial siderophore enterobactin confers survival advantage to Salmonella in macrophages / P. Saha, X. Xiao, B S. Yeoh, [et al.] // Gut Microbes. - 2019. - № 3 (10). - P. 412-423.

60. Deep, A. Quorum sensing and Bacterial Pathogenicity: From Molecules to Disease / A. Deep, U. Chaudhary, V. Gupta // Journal of Laboratory Physicians. - 2011. - № 01 (3). - P. 004-011.

61. Rutherford, S.T. Bacterial Quorum Sensing: Its Role in Virulence and Possibilities for Its Control / S.T. Rutherford, B.L.B. Bassler // Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. - 2012. - № 11 (2). - P. a012427-a012427.

62. Papenfort, K. Quorum sensing signal-response systems in Gram-negative bacteria / K. Papenfort, B.L. Bassler // Nature Reviews Microbiology. - 2016. - № 9 (14). - P. 576-588.

63. Pseudomonas aeruginosa Quorum Sensing Advances in Experimental Medicine and Biology / S.W. Miranda, K.L. Asfahl, A.A. Dandekar, E.P. Greenberg ; New York : Springer, Cham, 2022. - 452 p. - ISBN 978-3-031-08491-1. - Текст: непосредственный.

64. Hotinger, J.A. Molecular Targets and Strategies for Inhibition of the Bacterial Type III Secretion System (T3SS); Inhibitors Directly Binding to T3SS Components / J.A. Hotinger, H.A. Pendergrass, A.E. May // Biomolecules. - 2021. - № 2 (11). - P. 316.

65. Muhlen, S. Anti-virulence Strategies to Target Bacterial Infections Current Topics in Microbiology and Immunology / S. Mühlen, P.A. Dersch. - Cham ; Springer Nature, 2016. - 475 p. -ISBN 978-3-319-49284-1. - Текст : непосредственный.

66. Overcoming antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms using glycopeptide dendrimers / G. Michaud, R. Visini, M. Bergmann, [et al.] // Chemical Science. - 2016. - № 1 (7). - P. 166-182.

67. Combining antibiotics with antivirulence compounds can have synergistic effects and reverse selection for antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa / C. Rezzoagli, M. Archetti, I. Mignot, M. Baumgartner, R. Kummerli // PLOS Biology. - 2020. - № 8 (18). - P. e3000805.

68. Maura, D. Considerations and caveats in anti-virulence drug development / D. Maura, A.E. Ballok, L.G. Rahme // Current Opinion in Microbiology. - 2016. - Vol. 33. - P. 41-46.

69. Human gut microbiota in health and disease: Unveiling the relationship / M. Afzaal, F. Saeed, Y.A. Shah, [et al.] // Frontiers in Microbiology. - 2022. - Vol. 13. - P. 999001.

70. Pheromone killing of multidrug-resistant Enterococcus faecalis V583 by native commensal strains / M.S. Gilmore, M. Rauch, M. M. Ramsey, [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2015. - № 23 (112). - P. 7273-7278.

71. Dehbanipour, R. Anti-virulence therapeutic strategies against bacterial infections: recent advances / R. Dehbanipour, Z. Ghalavand // Germs. - 2022. - № 2 (12). - P. 262-275.

72. Sorting out the Superbugs: Potential of Sortase A Inhibitors among Other Antimicrobial Strategies to Tackle the Problem of Antibiotic Resistance / N. Zrelovs, V. Kurbatska, Z. Rudevica, [et al.] // Antibiotics. - 2021. - № 2 (10). - C. 164.

73. Antibiofilm and Antivirulence Properties of 6-Polyaminosteroid Derivatives against Antibiotic-Resistant Bacteria / D. Vergoz, H. Le, B. Bernay, [et al.] // Antibiotics. - 2023. - № 1 (13). - P. 8.

74. Dickey, S.W. Different drugs for bad bugs: antivirulence strategies in the age of antibiotic resistance / S.W. Dickey, G.Y.C. Cheung, M. Otto // Nature Reviews Drug Discovery. - 2017. - № 7 (16). - P. 457-471.

75. Safety and tolerability of a single administration of AR-301, a human monoclonal antibody, in ICU patients with severe pneumonia caused by Staphylococcus aureus: first-in-human trial / B. Francois, E. Mercier, C. Gonzalez, [et al.] // Intensive Care Medicine. - 2018. - № 11 (44). - P. 1787-1796.

76. Baron, C. Antivirulence drugs to target bacterial secretion systems / C. Baron // Current Opinion in Microbiology. - 2010. - № 1 (13). - P. 100-105.

77. Assembly, structure, function and regulation of type III secretion systems / W. Deng, N.C. Marshall, J.L. Rowland, [et al.] // Nature Reviews Microbiology. - 2017. - № 6 (15). - P. 323-337.

78. BspR/BtrA, an Anti-o Factor, Regulates the Ability of Bordetella bronchiseptica To Cause Cough in Rats / K. Nakamura, N. Shinoda, Y. Hiramatsu, [et al.] // mSphere. - 2019. - № 2 (4). - P. e00093-19.

79. Type Three Secretion System-Dependent Microvascular Thrombosis and Ischemic Enteritis in Human Gut Xenografts Infected with Enteropathogenic Escherichia coli / E. Nissim-Eliraz, E. Nir, I. Shoval, [et al.] // Infection and Immunity. - 2017. - № 11 (85). - P. e00558-17.

80. Targeting bacterial pathogenesis by inhibiting virulence-associated Type III and Type IV secretion systems / N. Blasey, D. Rehrmann, A.K. Riebisch, S. Muhlen // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. - 2023. - Vol. 12. - P. 1065561.

81. Bassler, B. L. Bacterially Speaking / B. L. Bassler, R. Losick // Cell. - 2006. - № 2 (125). -P. 237-246.

82. A cell-cell communication signal integrates quorum sensing and stress response / J. Lee, J. Wu, Y. Deng, [et al.] // Nature Chemical Biology. - 2013. - № 5 (9). - P. 339-343.

83. Novel Strategies for the Treatment of Pseudomonas aeruginosa Infections / S. Wagner, R. Sommer, S. Hinsberger, [et al.] // Journal of Medicinal Chemistry. - 2016. - № 13 (59). - P. 5929-5969.

84. The flavanone naringenin reduces the production of quorum sensing-controlled virulence factors in Pseudomonas aeruginosa PAO1 / O. Vandeputte, M. Kiendrebeogo, T. Rasamiravaka, [et al.] // Microbiology. - 2011. - № 7 (157). - P. 2120-2132.

85. Identification of chlamydial T3SS inhibitors through virtual screening against T3SS ATPase / A.V. Grishin, S.I. Luyksaar, L.N. Kapotina, [et al.] // Chemical Biology & Drug Design. - 2018. - № 3 (91). - P. 717-727.

86. Исследование фармакокинетики твердодисперсной и кристаллической форм антивирулентного средства Фтортиазинон у крыс / В.М. Самойлов, М.В. Савицкий, А.Г. Ромашкина, [и др.] // Медико-фармацевтический журнал Пульс. - 2023. - Т.25. - №7. - С. 57-62.

87. Савицкий, М. В. Исследование фармакокинетики и тканевой доступности нового антибактериального средства Фтортиазинон / М.В. Савицкий, С.Н. Басханова. - Текст : непосредственный // Гуманитарные и естественнонаучные исследования как фактор научно-технического прогресса: сборник научных трудов по материалам международной научно-

практической конференции / Общество с ограниченной ответственностью «Агентство перспективных научных исследований». - Белгород: 2022. - C. 9-12.

88. Experimental Pharmacokinetics, Metabolism and Tissue Distribution Studies Fluorothiazinon, a of Novel Antivirulence Drug / M.V. Savitskii, N.E. Moskaleva, N.A. Zigangirova, [et al.] // Journal Biomed. - 2023. - № 1 (19). - P. 73-84.

89. Fundamentals of Analytical Toxicology: Clinical and Forensic / R. J. Flanagan, E. Cuypers, H. H. Maurer, [et al.] - Hoboken : John Wiley & Sons, 2020 - 656 p. - ISBN 9-7811191-2235-7. -Текст : непосредственный.

90. Overview of organic anion transporters and organic anion transporter polypeptides and their roles in the liver / T.T. Li, J.X. An, J.Y. Xu, B.G. Tuo // World Journal of Clinical Cases. - 2019. - № 23 (7). - P. 3915-3933.

91. Pizzagalli, M.D. A guide to plasma membrane solute carrier proteins / M.D. Pizzagalli, A. Bensimon, G. Superti-Furga // The FEBS Journal. - 2021. - № 9 (288). - P. 2784-2835.

92. Ye, Z. The impact of ATP-binding cassette transporters on metabolic diseases / Z. Ye, Y. Lu, T. Wu // Nutrition & Metabolism. - 2020. - № 1 (17). - P. 61.

93. P-glycoprotein: new insights into structure, physiological function, regulation and alterations in disease / I.I.A. Juvale, A.A.A. Hamid, K.B.A. Halim, A.T.C. Has // Heliyon. - 2022. - № 6 (8). - P. e09777.

94. Ion-Trapping, Microsomal Binding, and Unbound Drug Distribution in the Hepatic Retention of Basic Drugs / G.A. Siebert, D.Y. Hung, P. Chang, M. Robers // Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. - 2004. - № 1 (308). - P. 228-235.

95. Wanat, K. Biological barriers, and the influence of protein binding on the passage of drugs across them / K. Wanat // Molecular Biology Reports. - 2020. - № 4 (47). - P. 3221-3231.

96. Bauman, J.L. The role of pharmacokinetics, drug interactions and pharmacogenetics in the acquired long QT syndrome / J.L. Bauman // European Heart Journal Supplements. - 2001. - Vol. 3. -P. K93-K100.

97. An overview of the clinical pharmacology of enalapril / R.O. Davies, H.J. Gomez, J.D. Irvin, J.F. Walker // British Journal of Clinical Pharmacology. - 1984. - № S2 (18) - P. 215S-229S.

98. Coleman, M. D. Human Drug Metabolism: An Introduction / M. D. Coleman; - Hoboken : John Wiley & Sons, 2010. - 639 P.; ISBN 978-1-11945-860-9. - Текст: непосредственный.

99. Маркин, П. А. Методология фармакометаболомного подхода в исследовании фармакологических эффектов физиологически активных веществ на модели Danio rerio : специальность 14.03.06 «Фармакология, клиническая фармакология» : диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук / Маркин Павел Александрович ; ФГАОУ ВО

Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова МЗ РФ (Сеченовский Университет). - Москва, 2021. - 207 с.

100. Клиническая фармакология и фармакотерапия: учебник. - 4-е изд. / под ред. В. Г. Кукеса, А. К. Стародубцева. - Москва : ГЭОТАР-Медиа, 2021 - 880 с. - ISBN 978-5-9704-18390. - Текст: непосредственный.

101. Johansen, K. B. Tinzaparin and other low-molecular-weight heparins: what is the evidence for differential dependence on renal clearance? / K.B. Johansen, T. Balchen // Experimental Hematology & Oncology. - 2013. - № 1 (2). - P. 21.

102. Zoccali, C. Pharmacokinetic relevance of glomerular hyperfiltration for drug dosing / C. Zoccali, F. Mallamaci, R. De Caterina // Clinical Kidney Journal. - 2023. - № 10 (16). - P. 1580-1586.

104. Rollins, D.E. Biliary Excretion of Drugs in Man / D.E. Rollins, C.D. Klaassen // Clinical Pharmacokinetics. - 1979. - № 5 (4). - P. 368-379.

105. Раскин, С. Ю. Клинико-экспериментальная фармакокинетика нового дипептидного анксиолитика ГБ-115 : специальность 14.03.06 «Фармакология, клиническая фармакология»: диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Раскин Сергей Юрьевич ; ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова». - 2019. -136 с.

106. Яновская, Е. А. Фармакокинетика 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (Экспериментальное исследование) : специальность 14.03.06 «Фармакология, клиническая фармакология» : диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук / Яновская Елена Анатольевна ; ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга». - Томск, 2016. - 189 с.

107. Ibarra, M. Enteric reabsorption processes and their impact on drug pharmacokinetics / M. Ibarra, I F. Troconiz, P. Fagiolino // Scientific Reports. - 2021. - № 1 (11). - P. 5794.

108. Talevi, A. Enterohepatic Recycling / A. Taveli ; Cham : Springer International Publishing, 2021. - P. 1-9. - ISBN 978-3-030-51519-5. - Текст : непосредственный.

109. Mycophenolic Acid and Its Metabolites in Kidney Transplant Recipients: A Semimechanistic Enterohepatic Circulation Model to Improve Estimating Exposure / M. Okour, P.A. Jacobson, M.A. Ahmed, [et al.] // The Journal of Clinical Pharmacology. - 2018. - № 5 (58). - P. 628-639.

110. Boer, F. Drug handling by the lungs / F. Boer // British Journal of Anaesthesia. - 2003. - № 1 (91). - P. 50-60.

111. Drug metabolism in the lungs: opportunities for optimising inhaled medicines / Z. Emlo-Scott, E. Backstrom, I. Mudway, B. Forbes // Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. -2021. - № 5 (17). - P. 611-625.

112. Pulmonary Drug Metabolism, Clearance, and Absorption / B. Olsson, E. Bondesson, L. Borgstrom, [et al.]; - Cham ; Springer Nature, 2016. - 545 p. - ISBN 978-1-4419-9744-9. - Текст : непосредственный.

113. Inflammation is a major regulator of drug metabolizing enzymes and transporters: Consequences for the personalization of drug treatment / F. Stanke-Labesque, E. Gautier-Veyret, S. Chhun, [et al.] // Pharmacology & Therapeutics. - 2020. - Vol. 215. - P. 107627.

114. Unraveling the Effects of Acute Inflammation on Pharmacokinetics: A Model-Based Analysis Focusing on Renal Glomerular Filtration Rate and Cytochrome P450 3A4-Mediated Metabolism / F. Liu, L.B.S. Aulin, M.L. Manson, [et al.] // European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. - 2023. - № 6 (48). - P. 623-631.

115. Sanz Codina, M. Biomarkers Predicting Tissue Pharmacokinetics of Antimicrobials in Sepsis: A Review / M. Sanz Codina, M. Zeitlinger // Clinical Pharmacokinetics. - 2022. - № 5 (61). - P. 593617.

116. Патент N RU0002737087 Российская Федерация, МПК А61К 31/54, C07D 285/16, A61P 31/04. Фармацевтическая композиция 4-(3-этокси-4-гидроксибензил)-5-оксо-5,6-дигидро-4^ [1,3,4]-тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)"карбоксамид в кристаллической форме, и ее применение в качестве антибактериального препарата для лечения острых, рецидивирующих и хронических инфекций: N 2020111713 : заявл. 20.03.2020 : опубл. 24.11.2020 / Зигангирова Н.А., Лубенец Н.Л., Заявкин Е.С. [и др.] // Google Patents. URL: https://patents.google.com/patent/RU2737087C1/ru?oq=RU2737087C1 (дата обращения 10.04.2024).

117. Шестакова, К. М. Разработка биоаналитических методик для исследования фармакокинетики, метаболизма и фармакометаболомики инновационных лекарственных средств на основе натуральных простагландинов : специальность 3.4.2 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия» : диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук / Шестакова Ксения Михайловна ; ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова МЗ РФ (Сеченовский Университет). - Москва, 2022. - 166 с.

118. Судебно-химическое и химико-токсикологическое исследование методом ВЭЖХ-МС/МС при отравлении рицином / Р.А. Калекин, А.А. Волкова, А.М. Орлова, [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. - 2023. - Т.66. - №3. - P.34.

119. LC-MS/MS determination of GTS-201, a dipeptide mimetic of the brain-derived neurotrophic factor, and neurotransmitter metabolites with application to a pharmacokinetic study in rats / P.A. Markin, N.E. Moskaleva, S.A. Lebedeva, [et al.] // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2023. - Vol. 223. - P. 115125.

120. The United States. Food and Drug Administration. Guidance for Industry. 2018. Bioanalytical Method Validation : 2018 // U.S. Department of Health and Human Services : URL: https://www.fda.gov/files/drugs/published/Bioanalytical-Method-Validation-Guidance-for-Industry.pdf (дата обращения 10.04.2024).

121. European Medicines Agency. ICH guideline M10 on bioanalytical method validation and study sample analysis: 2023 // European Union : URL: https://www.ema.europa.eu/en/ich-m10-bioanalytical-method-validation-scientific-guideline (дата обращения 11.04.2024).

122. Pharmacokinetics, tissue distribution, bioavailability and excretion of the anti-virulence drug Fluorothiazinon in rats and rabbits / M.V. Savitskii, N.E. Moskaleva, A. Brito, [et al.] // The Journal of Antibiotics. - 2024. - № 77. - P. 382-388

123. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics / S. Qin, W. Xiao, C. Zhou, [et al.] // Signal Transduction and Targeted Therapy. - 2022. - № 1 (7). - P. 199.

124. Palmer, G.C. The role of two Pseudomonas aeruginosa anthranilate synthases in tryptophan and quorum signal production / G.C. Palmer, P.A. Jorth, M. Whiteley // Microbiology. - 2013. - № 5 (159). - P. 959-969.

125. Target Metabolome Profiling-Based Machine Learning as a Diagnostic Approach for Cardiovascular Diseases in Adults / N.E. Moskaleva, K.M. Shestakova, A.V. Kukharenko, [et al.] // Metabolites. - 2022. - № 12 (12). - P. 1185.

126. Targeted metabolomic profiling as a tool for diagnostics of patients with non-small-cell lung cancer / K.M. Shestakova, N.E. Moskaleva, A.A. Boldin, [et al.] // Scientific Reports. - 2023. - № 1 (13). - P. 11072.

127. Alkylresorcinols as New Modulators of the Metabolic Activity of the Gut Microbiota / A. Zabolotneva, A. Gaponov, S. Roumiantsev, [et al.] // International Journal of Molecular Sciences. -2023. - № 18 (24). - C. 14206.

128. Савицкий, М. В. Доклинические и клинические исследования фармакокинетики антивирулентного средства фтортиазинон / М.В. Савицкий, Е.В. Серюков. - Текст : непосредственный // Современная парадигма развития науки, технологий и образования: сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции / Общество с ограниченной ответственностью «Агентство перспективных научных исследований». - Белгород: 2024. - C. 9-12.

129. Межвидовая фармакокинетика. 1. Межвидовые зависимости фармакокинетических параметров лекарственных средств (обзор) / О.В. Полехина, Н.В. Образцов, В.А. Петрунин, Т.А. Высоцкая // Химико-фармацевтический журнал. - 2014. - № 7 (48). - C. 7-15.

130. Межвидовая фармакокинетика. 2. Анализ структуры межвидовых зависимостей фармакокинетических параметров лекарственных веществ / О.В. Полехина, Н.В. Образцов, В.А. Петрунин, Т.А. Высоцкая // Химико-фармацевтический журнал. - 2014. - № 10 (48). - C. 3-7.

131. The United States. Food and Drug Administration. Guidance for industry: estimating the maximum safe starting dose in adult healthy volunteer : 2005 // US Department of Health and Human Services : URL: https://www.fda.gov/media/72309/download (дата обращения 18.03.2024).

132. Huang, Q. The application of allometric scaling principles to predict pharmacokinetic parameters across species / Q. Huang, J.E. Riviere // Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology.

- 2014. - № 9 (10). - P. 1241-1253.

133. Dedrick, R. L. Animal scale-up / R.L. Dedrick // Journal of Pharmacokinetics and Biopharmaceutics. - 1973. - № 5 (1). - P. 435-461.

134. Dedrick, R. Interspecies correlation of plasma concentration history of methotrexate (NSC-740) / R. Dedrick, K.B. Bischoff, D.S. Zaharko // Cancer Chemotherapy Reports. - 1970. - № 2 (54). -P. 95-101.

135. The mechanisms of pharmacokinetic food-drug interactions - A perspective from the UNGAP group / M. Koziolek, S. Alcaro, P. Augustijns, [et al.] // European Journal of Pharmaceutical Sciences. - 2019. - Vol. 134. - P. 31-59.

136. Wagenlehner, F.M.E. Pharmacokinetic Characteristics of Antimicrobials and Optimal Treatment of Urosepsis / F.M.E. Wagenlehner, W. Weidner, K.G. Naber // Clinical Pharmacokinetics.

- 2007. - № 4 (46). - P. 291-305.

137. Systematic Evaluation of Dose Proportionality Studies in Clinical Pharmacokinetics / Y. Sheng, Y. He, X. Huang, [et al.] // Current Drug Metabolism. - 2010. - № 6 (11). - P. 526-537.

138. Exploratory assessment of dose proportionality: review of current approaches and proposal for a practical criterion / J. Hummel, S. McKendrick, C. Brindley, R. French // Pharmaceutical Statistics.

- 2009. - № 1 (8). - P. 38-49.

139. Antibiotic exposure at the site of infection: principles and assessment of tissue penetration / N.G.L. Jager, R.M. van Hest, J. Lipman, [et al.] // Expert Review of Clinical Pharmacology. - 2019. -№ 7 (12). - P. 623-634.

140. Liu, P. Rational dosing of antibiotics: the use of plasma concentrations versus tissue concentrations / P. Liu, M. Müller, H. Derendorf // International Journal of Antimicrobial Agents. -2002. - № 4 (19). - P. 285-290.

141. The ADME Encyclopedia: A Comprehensive Guide on Biopharmacy and Pharmacokinetics / A. Talevi; Cham : Springer International Publishing, 2022. - 1209 p. - ISBN 978-3-030-84859-0. -Текст : непосредственный.

142. The Impact of Infection and Inflammation on Drug Metabolism, Active Transport, and Systemic Drug Concentrations in Veterinary Species / M.N. Martinez, J. Greene, L. Kenna, [et al.] // Drug Metabolism and Disposition. - 2020. - № 8 (48). - P. 631-644.

143. Impact of Inflammation on Cytochromes P450 Activity in Pediatrics: A Systematic Review / C. Lenoir, F. Rodieux, J.A. Desmeules, [et al.] // Clinical Pharmacokinetics. - 2021. - № 12 (60). - P. 1537-1555.

144. A cross-sectional study of inflammatory markers as determinants of circulating kynurenines in the Lung Cancer Cohort Consortium / O. Midttun, A. Ulvik, K. Meyer, [et al.] // Scientific Reports. - 2023. - № 1 (13). - P. 1011.

145. Anthranilate Acts as a Signal to Modulate Biofilm Formation, Virulence, and Antibiotic Tolerance of Pseudomonas aeruginosa and Surrounding Bacteria / H.-J. Hwang, X.H. Li, S.K. Kim, JH. Lee // Microbiology Spectrum. - 2022. - № 1 (10). - P. e01463-21.

146. The Gut-Lung Axis in Health and Respiratory Diseases: A Place for Inter-Organ and Inter-Kingdom Crosstalks / R. Enaud, R. Prevel, E. Clairo, [et al.] // Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. - 2020. - Vol. 10. - P. 9.

147. Adaptation of the human aryl hydrocarbon receptor to sense mi crob iota-derived indoles / T.D. Hubbard, I.A. Murray, W.H. Bisson, [et al.] // Scientific Reports. - 2015. - № 1 (5). - P. 12689.

148. Dikme, O. Serum Cortisol as a Predictor of Major Adverse Pulmonary Event in Emergency Department Acutely Dyspneic Patients / O. Dikme, O. Dikme // Emergency Medicine International. -2018. - Vol. 2018. - P. 1-5.

ПРИЛОЖЕНИЕ А. Разработка и валидация методики определения концентрации фтортиазинона в биологических образцах (кровь, гомогенат печени и легких, моча) крыс

1. Краткая характеристика разработанной биоаналитической методики

Проведена разработка и валидация биоаналитической методики определения концентрации фтортиазинона в образцах крови, гомогената печени, гомогената легких и моче крыс. Краткая характеристика разработанной методики представлена в Таблице А. 1. Разработанная методика основана на количественном определении исследуемого аналита в биологической матрице методом жидкостной хроматографии с применением тандемного масс-селективного детектирования (ВЭЖХ-МС/МС).

Для исследования используется цельная кровь с натрия цитратом в качестве стабилизатора. Для определения фтортиазинона к 100 мкл крови добавляют 100 мкл 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2, инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, далее добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС.

Для оценки степени глюкуронирования проводят ВЭЖХ-МС\МС анализ проб крови после прибавления ß-глюкуронидазы. Для этого к 100 мкл крови прибавляют 100 мкл раствора ß-глюкуронидазы (E. Coli) в 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2. Пробирку инкубируют при 37°С 4 ч. Далее добавляют добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС.

В случае, если пробы не будут исследованы сразу же, их будут замораживать при температуре -70 градусов. Замораживание допустимо однократно, т.к. нет сведений о том, как на пробы влияет повторное замораживание.

При исследовании органов извлеченный орган промывают от крови в физиологическом растворе 0,9% и просушивают бумажной салфеткой. Навеску органа (0,7г) вносят в пробирку для гомогенизации с бусами. К навеске органа добавляют 0,7 мл физиологического раствора 0,9% и гомогенизируют.

Для определения фтортиазинона к 100 мкл гомогената добавляют 100 мкл 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2, инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, далее добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС.

Для оценки степени глюкуронирования проводят ВЭЖХ-МС\МС анализ проб гомогената после прибавления Р-глюкоронидазы. Для этого к 100 мкл крови прибавляют 100 мкл раствора Р-глюкоронидазы (E. Coli) в 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2. Пробирку инкубируют при 37°С

4 ч. Далее добавляют добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС.

В случае, если пробы не будут исследованы сразу же, их будут замораживать при температуре -70 градусов. Замораживание допустимо однократно, т.к. нет сведений о том, как на пробы влияет повторное замораживание.

Для определения фтортиазинона в моче крыс к 100 мкл мочи добавляют 100 мкл 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2, инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, далее добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение

5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС.

Для оценки степени глюкуронирования проводят ВЭЖХ-МС\МС анализ проб мочи после прибавления Р-глюкоронидазы. Для этого к 100 мкл мочи прибавляют 100 мкл раствора Р-глюкоронидазы (E. Coli) в 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2. Пробирку инкубируют при 37°С 4 ч. Далее добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС.

2. Методика определения фтортиазинона и его метаболитов

Анализ будет проводиться методом ВЭЖХ-МС/МС. Количественное определение основано на методе соотношения площади пика аналита и внутреннего стандарта.

Внутренний стандарт: CL-130.

Исходные данные будут собраны и обработаны с помощью компьютерного программного обеспечения MassHunter. Все полученные по данному методу калибровочные кривые будут соответствовать критериям точности и прецизионности во всем тестируемом диапазоне: 1 -2000 нг/г. Проведенные экспериментальные исследования позволят установить зависимость концентрации от откликов. Исходя из калибровочных кривых, будут рассчитаны концентрации веществ в анализуемых образцах. Концентрацию исследуемого аналита в биологической матрице определяли по калибровочным графикам, построенным с использованием метода взвешенной линейной регрессии (weighted linear regression). Для приготовления калибровочных стандартов (калибраторов) использовали холостые образцы крови с добавлением к ним известных количеств исследуемого аналита.

Таблица А.1 - Краткая характеристика разработанной биоаналитической методики

Наименование методики Разработка и валидация методики определения концентрации фтортиазинона в крови, гомогенате печени и легких, моче крыс

Тип методики Биоаналитическая методика

Исследуемый аналит Фтортиазинон

Объект исследования Кровь, гомогенат печени, гомогенат легких и моча крыс

Стандартный образец Фтортиазинон

Внутренний стандарт CL-130

Пробоподготовка Осаждение белков органическим растворителем без использования процедуры экстракции исследуемого аналита

Инструментальный метод Высокоэффективная жидкостная хроматография с применением тандемного масс-селективного детектирования (ВЭЖХ-МС/МС)

Место разработки и валидации методики ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет). Институт трансляционной медицины и биотехнологии. Лаборатория фармакокинетики и метаболомного анализа

3. Оценка пригодности разработанной методики

Разработанная биоаналитическая методика была валидирована с целью оценки ее пригодности для определения концентрации фтортиазинона в образцах крови, гомогената печени, гомогената легких и моче крыс. Валидационные характеристики разработанной методики представлены в Таблице А.2. По результатам валидации установлено, что разработанная методика может быть использована для проведения доклинических исследований препаратов фтортиазинона.

Таблица А.2 - Валидационные характеристики разработанной биоаналитической методики

Характеристика Результаты оценки

Селективность В холостых образцах биологической матрицы не выявлено наличия существенных интерферирующих пиков с временем удерживания, соответствующим исследуемому аналиту. Сигналы интерферирующих пиков не превышают 20 % от нижнего предела количественного определения (НПКО) для исследуемого аналита.

Калибровочная кривая Линейный диапазон: 0,2 - 5000 нг/мл

Я2 для цикла 1 0,9994

Я2 для цикла 2 0,9992

Я2 для цикла 3 0,9991

Обратно рассчитанные концентрации калибровочных стандартов (калибраторов) во всех аналитических циклах находятся в пределах ± 15 % (или ± 20 % для НПКО) от их номинального значения.

Нижний предел количественного определения (НПКО) НПКО 0,2 нг/мл

Внутрисерийная прецизионность 6,50 %

Внутрисерийная правильность 84,35 - 102,0 %

Межсерийная прецизионность 8,08 %

Межсерийная правильность 95,62 %

Эффект переноса Перенос в холостом образце биологической матрицы не превышает 20 % от сигнала исследуемого аналита на уровне НПКО.

Правильность Внутрисерийная LLOQ QC 102,28 - 107,06 %

LQC 100,4 - 102,88%

MQC 100,44 - 102,79%

ЩС 98,43 - 103,46%

Межсерийная LLOQ QC 105,41 %

LQC 102,06%

MQC 101,25%

ЩС 100,14%

Прецизионность Внутрисерийная LLOQ QC 4,70%

LQC 4,72%

MQC 1,51%

ЩС 2,20%

Межсерийная LLOQ QC 5,15 %

LQC 2,80%

MQC 2,63%

HQC 5,75%

Эффект матрицы MF RSD LQC 6,96%

MF RSD HQC 2,21%

Стабильность аналита В рабочих растворах 0 ч при комнатной Т 98,13 - 104,57%

6 ч при комнатной Т 100,08 - 100,56%

В биологической матрице 6 ч при комнатной Т 99,20 - 99,50%

24 ч при хранении в автосамплере при 10°С 87,86 - 97,52%

После 3 циклов заморозки разморозки 86,55 - 95,03%

При длительной заморозке 94,91 - 112,18%

Продолжение Таблицы А.2

Характеристика Результаты оценки

Влияние ферментативного гидролиза В биологической матрице LQC 94,21 - 104,71%

^С 85,21 - 111,47%

4. Методика определения концентрации иссследуемого аналита в биологической

матрице 4.1.Материалы и методы

Стандартный образец. В качестве стандартного образца (референсного образца) использовали фтортиазинон СЬ-55 4-(3 -этокси-4-гидроксибензил)-5 -оксо-5,6-дигидро-4Н- [1,3,4] -тиадиазин-2-(2,4-дифторфенил)-карбоксамид (рабочий стандарт с чистотой 99,9% по данным ВЭЖХ), синтезированный в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава РФ. Структурная формула фтортиазинона представлена на Рисунке А. 1.

А В

Рисунок А.1 - Структурная формула фтортиазинона (А) и СЬ-130 (В), используемого в качестве внутреннего стандарта.

Краткая характеристика стандартного образца (образца-свидетеля) представлена в Таблице А.3.

Таблица А. 3 - Краткая характеристика стандартного образца

Наименование Брутто-формула Молекулярная масса Лот Срок годности Чистота

Фтортиазинон (СЬ-55) Cl9Hl7F2NзO4S 421,43 г/моль - - 99,87

Химические реактивы, средства измерения, вспомогательные устройства и расходные материалы представлены в Таблицах А.4 - А.6, соответственно.

Таблица А.4 - Список химических реактивов

Наименование Марка Производитель

Ацетат аммония ACS (> 97 %) Sigma Aldrich, Германия

Муравьиная кислота ACS (88 - 91 %) Sigma Aldrich, Германия

Ацетонитрил LC-MS CHROMASOLV Reidel-DE Haen, Германия

Метанол FOR HPLC (> 99,9 %) Sigma Aldrich, Германия

Вода деионизованная 18,2 МОм/см —

b-Glucuronidase from E. coli 12867522 Roche Diagnostics

Калия дигидрофосфат (KH2PO3) ч.д.а. —

Натрия фосфат двухосновный дигидрат (Na2HPO4*2H2O) ч.д.а. ---

Таблица А.5 - Список средств измерений

Наименование Модель Производитель

Жидкостной хроматограф высокого давления Agilent 1200 Agilent Corporation, США

Тандемный квадрупольный масс-спектрометрический детектор Agilent 6490 Agilent Corporation, США

Весы лабораторные аналитические неавтоматического действия Adventurer AR 1530 Ohaus Corporation, Швейцария

Одноканальные механические дозаторы переменного объема Reference Eppendorf AG, Германия

Колбы мерные класса А Вместимостью 1, 5, 10, 50, 100, 500 и 1000 мл Duran SHOTT, Германия

Таблица А.6 - Список вспомогательных устройств и расходных материалов

Наименование Марка Производитель

Виалы из боросиликатного прозрачного стекла в комплекте с металлическими крышками и силиконовыми вставками 1,5 мл Macherey-Nagel, Германия

Пластиковые одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема — Axygen, США

Пробирки с крышкой одноразовые пластиковые 5,0 мл Eppendorf AG, Германия

Установка для получения деионизованной воды Millipore Direct Q-3 UV Merck KGaA, Германия

Центрифуга многофункциональная вентилируемая SL 16 Thermo Fisher Scientific, США

Шейкер с функцией нагрева для микропробирок TS-100C SIA Biosan, Латвия

4.2.Приготовление растворов и буферов

Приготовление растворов стандартного образца. Концентрированные растворы стандартного образца (образца-свидетеля) готовили путем растворения точной навески стандартного образца в ацетонитриле для хроматографии. Рабочие растворы образца-свидетеля готовили разведением концентрированных растворов до получения необходимой концентрации. В качестве растворителя использовали ацетонитрил для хроматографии. Приготовленные концентрированные и рабочие растворы маркировали и хранили при температуре +4°С - +8°С не более 6-ти (шести) часов [99]. Схема приготовления рабочих растворов стандартного образца (образца-свидетеля) исследуемого аналита приведена в Таблице А.7.

Таблица А.7 - Схема приготовления рабочих растворов стандартного образца-свидетеля

№ рабочего раствора Концентрация конц. раствора Объем конц. раствора Объем растворителя Конечная концентрация аналита в рабочем растворе Конечный объем рабочего раствора

(нг/мл) (мкл) (мкл) (нг/мл) (мкл)

1 10000.00 0.50 4999.50 1.00 5000.00

2 10000.00 2.50 4997.50 5.00 5000.00

3 10000.00 5.00 4995.00 10.00 5000.00

4 10000.00 25.00 4975.00 50.00 5000.00

5 10000.00 50.00 4950.00 100.00 5000.00

6 10000.00 250.00 4750.00 500.00 5000.00

7 10000.00 500.00 4500.00 1000.00 5000.00

8 10000.00 1250.00 3750.00 2500.00 5000.00

9 10000.00 2500.00 2500.00 5000.00 5000.00

10 100000.00 500.00 4500.00 10000.00 5000.00

11 100000.00 1250.00 3750.00 25000.00 5000.00

12 100000.00 2500.00 2500.00 50000.00 5000.00

Приготовление калибровочных стандартов (калибраторов). Для приготовления калибровочных стандартов (калибраторов) использовали холостые образцы крови крыс, к которым добавляли известное количество рабочих растворов исследуемого аналита. Приготовленные калибраторы маркировали и хранили при температуре +4°С - +8°С не более 6-ти (шести) часов. Схема приготовления калибраторов приведена в Таблице А. 8.

Таблица А. 8 - Схема приготовления калибровочных стандартов (калибраторов)

№ калибратора Концентрация рабочего раствора Объем рабочего раствора Объем холостого образца Конечная концентрация аналита в калибраторе Конечный объем калибратора

(нг/мл) (мкл) (мкл) (нг/мл) (мкл)

1 1.00 10.00 90.00 0.10 100.00

2 5.00 10.00 90.00 0.50 100.00

3 10.00 10.00 90.00 1.00 100.00

4 50.00 10.00 90.00 5.00 100.00

5 100.00 10.00 90.00 10.00 100.00

6 500.00 10.00 90.00 50.00 100.00

7 1000.00 10.00 90.00 100.00 100.00

8 2500.00 10.00 90.00 250.00 100.00

9 5000.00 10.00 90.00 500.00 100.00

10 10000.00 10.00 90.00 1000.00 100.00

11 25000.00 10.00 90.00 2500.00 100.00

12 50000.00 10.00 90.00 5000.00 100.00

Приготовление образцов контроля качества (образцов QC). Для приготовления образцов контроля качества (образцов QC) использовали холостые образцы крови крыс, к которым добавляли известное количество рабочих растворов исследуемого аналита. Образцы контроля качества готовили независимо от калибраторов (калибровочных стандартов), используя для этого отдельно приготовленные рабочие растворы исследуемого аналита. Образцы контроля качества готовили на 4-х (четырех) уровнях концентрации [117]. Схема приготовления образцов контроля качества представлена в Таблице А.9.

Таблица А.9 - Схема приготовления образцов контроля качества (образцов QC)

Образец ОС Концентрация рабочего раствора Объем рабочего раствора Объем холостого образца Конечная концентрация аналита в образце QC Конечный объем образца ОС

(нг/мл) (мкл) (мкл) (нг/мл) (мкл)

LLOQ ОС 1.00 10.00 90.00 0.10 100.00

LQC 6.00 10.00 90.00 0.60 100.00

мое 25000.00 10.00 90.00 2500.00 100.00

нос 40000.00 10.00 90.00 4000.00 100.00

Приготовление 0,1 Ммуравьиной кислоты в воде - подвижной фазы для хроматографии. К 1 л воды деионизованной добавить 1 мл муравьиной кислоты.

Приготовление буферного раствора для гидролиза. Взвесить в мерном стакане 54 г Na2HPO4*2H2O и 68 г KH2PO4, довести объем деионизованной водой до 1000 мл, растворить при интенсивном перемешивании в ультразвуковой бане. РН полученного раствора довести до 6,26,5 и добавить 30 мл раствора глюкуронидазы.

Подготовка объектов исследования (пробоподготовка). Подготовку объектов исследования (биологических образцов) к инструментальному анализу осуществляли путем осаждения белков плазмы крови органическим растворителем без последующей процедурыэкстракции исследуемого аналита.

Для исследования используется цельная кровь с натрия цитратом в качестве стабилизатора. Для определения фтортиазинона к 100 мкл крови добавляют 100 мкл 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2, инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, далее добавляют 10 мкл раствора GL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС [23].

Для оценки степени глюкуронирования проводят ВЭЖХ-МС\МС анализ проб крови после прибавления ß-глюкоронидазы. Для этого к 100 мкл крови прибавляют 100 мкл раствора ß-глюкоронидазы (E. Coli) в 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2. Пробирку инкубируют при 37°С 4 ч. Далее добавляют добавляют 10 мкл раствора GL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС [23].

В случае, если пробы не будут исследованы сразу же, их будут замораживать при температуре -70 градусов. Замораживание допустимо однократно, т.к. нет сведений о том, как на пробы влияет повторное замораживание.

При исследовании органов извлеченный орган промывают от крови в физиологическом растворе 0,9% и просушивают бумажной салфеткой. Навеску органа (0,7г) вносят в пробирку для гомогенизации с бусами. К навеске органа добавляют 0,7 мл физиологического раствора 0,9% и гомогенизируют.

Для определения фтортиазинона к 100 мкл гомогената добавляют 100 мкл 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2, инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, далее добавляют 10 мкл раствора GL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл

ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС [23].

Для оценки степени глюкуронирования проводят ВЭЖХ-МС\МС анализ проб гомогената после прибавления ß-глюкоронидазы. Для этого к 100 мкл крови прибавляют 100 мкл раствора ß-глюкоронидазы (E. Coli) в 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2. Пробирку инкубируют при 37°С

4 ч. Далее добавляют добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила для осаждения белка. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС [23].

В случае, если пробы не будут исследованы сразу же, их будут замораживать при температуре -70 градусов. Замораживание допустимо однократно, т.к. нет сведений о том, как на пробы влияет повторное замораживание.

Для определения фтортиазинона в моче крыс к 100 мкл мочи добавляют 100 мкл 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2, инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре, далее добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение

5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС [23].

Для оценки степени глюкуронирования проводят ВЭЖХ-МС\МС анализ проб мочи после прибавления ß-глюкоронидазы. Для этого к 100 мкл мочи прибавляют 100 мкл раствора ß-глюкоронидазы (E. Coli) в 0,1М фосфатного буфера с рН 6.2. Пробирку инкубируют при 37°С 4 ч. Далее добавляют 10 мкл раствора CL-130 в ацетонитриле с концентрацией 1000 нг/мл и 400 мкл ацетонитрила. Пробу перемешивают на Вортекс и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 5 мин. Прозрачный супернатант анализируют методом ВЭЖХ-МС\МС [23].

Все емкости, имевшие контакт с биологическими образцами, помещали в пакеты для биологических отходов класса Б и утилизировали.

4.3.Параметры инструментального анализа

Таблица А.10 - Параметры инструментального анализа

ПАРАМЕТРЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ЖИДКОСТНОГО ХРОМАТОГРАФА

Аналитическая колонка Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 мм; 1,7 мкм) фирмы Waters Corporation, США

Преданалитическая колонка Acquity UPLC BEH C18 (2,1 x 50 мм; 1,7 мкм) фирмы Waters Corporation, США

Термостатирование аналитической колонки 40°С

Скорость потока подвижной фазы 0,4 мл/мин

Состав подвижной фазы Фаза А - 0,1% раствор муравьиной кислоты в воде; Фаза B - 100 % ацетонитрил для хроматографии

Программа градиентного элюирования _ Кол-во фазыА, Кол-во фазыБ, Время, мин „Т „7 % % 0 90 10 3 55 45 4 55 45 4,1 10 90 5 10 90 5,1 90 10 7 90 10

Объем вводимой пробы 5 мкл

Общее время анализа 7,0 мин

ПАРАМЕТРЫ ТАНДЕМНОГО КВАДРУПОЛЬНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО ДЕТЕКТОРА

Тип ионизации Электрораспыление с нагреваемым потоком распыляющего газа

Gas Temp 300°С

Sheath Gas Heater 300 °С

Sheath Gas Flow 10 л/мин

Gas Flow 8 л/мин

Nebulizer 20 psi

Transition Dwell Time 0,05 сек

Capillary Voltage 3.5 кВ

Mode of Analysis MRM, positive ion

4.4.Обработка данных

Исходные хромато-масс-спектрометрические данные обрабатывали с использованием программного комплекса МаБвНи^ег фирмы А§ПепЮогрогайоп, США. Интегрирование хроматографических пиков осуществляли в автоматическом режиме. Результаты количественного определения исследуемого аналита получали с использованием программного

комплекса MassHunterB электронно-цифровом формате PDF (Portable Document Format), защищенном от несанкционированного внесения изменений в исходные данные.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с использованием программных комплексов Microsoft Excel 2007 фирмы Microsoft Corporation, США и Minitab 16 фирмы Minitab Inc., Великобритания.

Иллюстрированный материал представлен с использованием программных комплексов Microsoft Excel 2007 фирмы Microsoft Corporation, США; Minitab 16 фирмы Minitablnc., Великобритания и MassHunter фирмы AgilentCorporation, США.

5. Валидация методики определения концентрации исследуемого аналита в биологической матрице

5.1.Введение

Валидацию разработанной биоаналитической методики проводили с целью демонстрации ее пригодности для определения концентрации фтортиазинона в биологических объектах. Пригодность разработанной методики оценивали на основании следующих валидационных характеристик:

• селективность;

• калибровочная кривая;

• нижний предел количественного определения;

• эффект переноса;

• правильность и прецизионность (внутрисерийная и межсерийная);

• эффект матрицы;

• стабильность исследуемого аналита.

Валидационные характеристики разработанной методики определяли в соответствии с рекомендациями:

1. Bioanalytical Method Validation. Guidance for Industry. September 2013. Revision 1. U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration.

2. Guideline on Bioanalytical Method Validation. 01 February 2012. EMEA/CHMP/EWH/192217/2009/Rev. 1 Corr. 2. European Medicines Agency.

3. Требования к валидации биоаналитических методик испытаний и анализу исследуемых биологических образцов. Приложение № 6. К Правилам проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза.

4. Решение № 85 от 03.11.2016 г. «Об утверждении Правил проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза».Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. - М.: Гриф и К, 2013. - 328 с.

В случае расхождения в требованиях, предъявляемых вышеуказанными документами к характеристикам биоаналитической методики, применяли наиболее строгие критерии из рекомендуемых.

5.2.Критерии идентификации исследуемого аналита

Идентификацию исследуемого аналита осуществляли методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС). В качестве критериев идентификации были приняты: время удерживания; расхождение в значениях относительных интенсивностей ионов в регистрируемом диапазоне масс между масс-спектрами исследуемого аналита и его стандартного образца.

Идентификацию признавали положительной, если:

1. отличие времени удерживания исследуемого аналита от времени удерживания его стандартного образца не превышало ± 0,15 мин;

2. масс-спектр исследуемого аналита содержал, как минимум, два характеристичных фрагмента в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

В процессе разработки методики количественного определения исследуемого аналита в биологической матрице были установлены: время удерживания и масс-спектр фтортиазинона. Масс-спектр получали в режиме полного сканирования фрагментарных ионов в диапазоне отношений массы к заряду от 50 m/z до 450 m/z. На основании полученных данных были определены характеристичные ионные переходы (характеристичные фрагменты) для исследуемого аналита. Критерии идентификации исследуемого аналита приведены в Таблице А.11. Масс-хроматограмма и масс-спектр стандартногораствора исследуемого аналита представлены на Рисунке А.2 и Рисунке А.3.

Таблица А.11 - Критерии идентификации исследуемого аналита

Исследуемый аналит Время удерживания Ион прекурсор Дочерний ион Энергия коллизии

Фтортиазинон 4,3 мин 422.2m/z 151.1m/z 15эВ

422.2m/z 123.1m/z 30эВ

GL-130 4,4 мин 440.2m/z 151.1m/z 15эВ

x10 3

2.8 2.6 2.4 2.2 2 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2

0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5

Counts vs. Acquisition Time (min)

Рисунок А.2 - Масс-хроматограмма фтортиазинона

x10 3 2.6 2.4 2.2

1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0-

Рисунок А.3 -

5.3.Селективность

124 126 128 130 132 134 136 138 140 142 144 146 148 150 152 154 156 158

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

Масс-спектр фтортиазинона

НПКО). Для оценки селективности использовали 6 (шесть) холостых образцов биологической матрицы, полученных от независимых источников. Селективность разработанной методики считали приемлемой для дифференцированной оценки исследуемого аналита в присутствии эндогенных компонентов биологической матрицы и/или других компонентов исследуемых биологических образцов, в том случае, если в исследуемых холостых образцах биологической матрицы, полученных от независимых источников, отсутствовали интерферирующие пики с временем удерживания характерным для исследуемого аналита. В холостых образцах допускалось наличие незначительной интерференции, при условии, что сигнал интерферирующего пика составлял не более 20 % от нижнего предела количественного определения (уровень НПКО) для исследуемого аналита [99].

Вывод

Анализ данных, полученных в результате оценки холостых образцов биологической матрицы, не выявил наличия существенных интерферирующих пиков с временем удерживания, соответствующим исследуемому аналиту [23]. Сигналы интерферирующих пиков не превышали 20 % от нижнего предела количественного определения (уровень НПКО) для исследуемого аналита [99]. Результаты оценки селективности разработанной методики представлены в Таблице А.12. Отчет хромато-масс-спектрометрического анализа образцов, полученных в эксперименте по оценке селективности разработанной методики, приведен на Рисунке А.4.

Таблица А.12 - Оценка селективности разработанной биоаналитической методики

Номер Площадь хроматографического пика % интерференции в Критерий

образца в холостом образце в контрольном образце холостом образце приемлемости

1 0 108 0,00 Одобрено

2 0 122 0,00 Одобрено

3 0 133 0,00 Одобрено

4 0 119 0,00 Одобрено

5 0 109 0,00 Одобрено

6 0 105 0,00 Одобрено

Mean 0,00 116.00 0,00 ---

SD 0,00 10.66 0,00 ---

RSD --- 9.19 --- ---

Quantifier Data File

CL55-Blank-l.d CL55-Blank-2.d CL55-Blank-3.d CL55-Blank-4.d C155-Blank-5.d CL55-Blank-6.d

Sample Name