Клиническое значение мониторинга минимальной остаточной болезни при хроническом миелолейкозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.29, кандидат медицинских наук Челышева, Екатерина Юрьевна

• Челышева, Екатерина Юрьевна
• кандидат медицинских наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Челышева, Екатерина Юрьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Цитогенетическая и молекулярная характеристика хронического миелолейкоза.

1.1.1.Структура химерного гена BCR-ABL и его роль в развитии хронического миелолейкоза. Клиническое значение типов мРНК.

1.2. Клинические особенности хронического миелолейкоза.

1.3. Терапия хронического миелолейкоза: способы достижения гематологической и цитогенетической ремиссии.

1.4. Мониторинг минимальной остаточной болезни при хроническом миелолейкозе.

1.4.1 Цитогенетические и молекулярные методы мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом.

1.4.2 Количественные молекулярные методы мониторинга минимальной остаточной болезни при хроническом миелолейкозе.

1.4.3 Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом после аллогенной трансплантации костного мозга.

1.4.4 Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа.

1.4.5 Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию иматинибом.

1.4.6 Персистирование минимальной остаточной болезни при хроническом миелолейкозе. 1.5 Вопросы стандартизации метода количественной Real-time полимеразной цепной реакции.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Характеристика больных.

2.2 Принципы терапии.

2.2.1 Терапия интерфероном-альфа

2.2.2 Терапия иматинибом

2.2.3 Комбинированная терапия.

2.2.4 Оценка эффективности терапии 2.2.5. Статистическая обработка данных

2.3. Методы исследования.

2.3.1 Выделение РНК из клеток периферической крови или костного мозга.

2.3.2 Реакция обратной транскрипции.

2.3.3 Качественная полимеразная цепная реакция.

2.3.4 Количественная (Real-time) полимеразная цепная реакция.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Характеристика цитогенетического ответа при разных видах терапии.

3.1.1 Цитогенетический ответ у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа.

3.1.2 Цитогенетический ответ у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию иматинибом в качестве второй линии терапии после неудачи лечения интерферонам альфа.

3.1.3 Цитогенетический ответ у больных хроническим миелолейкозом, получающих комбинированную терапию.

3.1.4 Сопоставление цитогенетических ответов в трех клинических группах больных хроническим миелолейкозом.

-43.2. Изучение минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с помощью молекулярно-биологических методов.

3.2.1. Начальный базальный уровень экспрессии BCR-ABL.

3.2.2. Соотношение уровня экспрессии BCR-ABL в периферической крови и костном мозге.

3.2.3. Соотношение данных цито генетического и молекулярного исследования у больных хроническим миелолейкозом.

3.2.4.Сопоставление результатов количественной Real-time полимеразной цепной реакции в референс-лаборатории.

3.2.5. Анализ отрицательных результатов количественной Real-time полимеразной цепной реакции с помощью более чувствительных методов.

3.3 Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с помощью качественной двухстадийной (nested) ПЦР.

3.3.1.Мониторинг минимальной остаточной болезни с помощью качественной (nested) полимеразной цепной реакции у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа.

3.4 Мониторинг минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с помощью количественной Real-time полимеразной цепной реакции.

3.4.1. Мониторинг минимальной остаточной болезни с помощью количественной Real-time полимеразной цепной реакции у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа.

3.4.2. Мониторинг минимальной остаточной болезни с помощью количественной Real-time полимеразной цепной реакции у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию иматинибом в качестве II линии терапии.

-53.4.3. Мониторинг минимальной остаточной болезни с помощью количественной Real-time полимеразной цепной реакции у больных хроническим миелолейкозом, получающих комбинированную терапию.

3.5. Обсуждение результатов по молекулярному мониторингу в трех клинических группах.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клиническое значение мониторинга минимальной остаточной болезни при хроническом миелолейкозе»

Актуальность темы исследования.

Хронический миелолейкоз (XMJI) - клональное миелопролиферативное заболевание, для которого характерна специфическая приобретенная генетическая аномалия - «филадельфийская хромосома», РЬ'хромосома (в результате реципрокной транслокации между 9 и 22 хромосомами образуется химерный онкоген BCR-ABL). На момент установления диагноза XMJ1 в костном мозге при кариологическом анализе выявляется 95-100% РЬ'-положительных клеток.

Современная терапия препаратами интерферона-альфа (ИФН-альфа) и ингибитором BCR-ABL тирозинкиназы (иматиниб мезилат) позволяет добиться значительного подавления опухолевого клона и восстановления нормального кроветворения, что приводит к увеличению выживаемости больных. Полный цитогенетический ответ (ПЦО), при котором у пациентов определяется восстановление нормального кариотипа и не выявляется РЬ'хромосома, является стандартным критерием эффективности терапии у больных XMJ1.

При лечении иматинибом получение ПЦО через 5 лет терапии отмечено у 87% больных в поздней хронической фазе XMJ1 и у 96% больных в ранней хронической фазе XMJI (А.Ю. Зарицкий, Е.Г. Ломаиа, 2007) [94]. При терапии ИФН-альфа получение ПЦО через 1 год терапии отмечено у 14% больных в хронической фазе ХМЛ (международное исследование IRIS)[76], через 2 года терапи - у 20% (Faderl S., 1999)[101].

Однако у больных с достигнутым ПЦО оказалось возможным обнаружить BCR-ABL положительные клетки при применении более чувствительного молекулярно-биологического метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Стало очевидно, что данных стандартного цитогенетического исследования (чувствительность 1:10" клеток) может быть недостаточно для суждения о степени полноты ответа на терапию, особенно у пациентов, достигших не только полной клинико-гематологической ремиссии, но и ПЦО. Поэтому для детекции химерного гена BCR-ABL и мониторинга минимальной остаточной болезни (МОБ) при XMJI целесообразным является использование метода ПЦР. Изучение МОБ у больных XMJI дает основания определять новые критерии полноты достигнутой ремиссии, распознавать наиболее ранние признаки рецидива заболевания и разрабатывать терапевтические подходы при персистировании остаточной популяции опухолевых клеток.

Поэтому вопрос количественной оценки остаточной опухолевой массы и мониторинга МОБ у больных XMJI является актуальным.

Использование метода ПЦР в реальном времени {Real-time ПЦР) с чувствительностью 10"4-10"5 дает возможность количественно охарактеризовать остаточную опухолевую массу у больных XMJI по уровню экспрессии гена BCR-ABL и проводить мониторинг МОБ. Метод двухстадийной ПЦР обладает большей чувствительностью (1:10 6клеток) по сравнению с Real-time ПЦР, но является только качественным и не позволяет оценить объем опухолевой массы.

В настоящей работе представлены данные, полученные при использовании методов качественной и количественной ПЦР у больных XMJI, у которых было достигнуто значительное подавление Ph'-положительного опухолевого клона.

Цель исследования:

Оценить клиническую значимость молекулярно-биологических методов детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом.

Задачи исследования:

1. Оценить информативность количественного метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом при разных видах терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия).

2. Сравнить уровень экспрессии гена BCR-ABL в костном мозге и периферической крови для решения вопроса о возможности использования периферической крови при мониторинге минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом.

3. Определить взаимосвязь цитогенетических рецидивов и уровня экспрессии гена BCR-ABL по данным полимеразной цепной реакции в реальном времени у больных хроническим миелолейкозом при терапии иматинибом.

4. Оценить взаимосвязь режима терапии и стабильности достигнутого цитогенетического и молекулярного ответа у больных хроническим миелолейкозом при терапии интерфероном-альфа, иматинибом и комбинированной терапии (иматиниб, интерферон-альфа и курсы малых доз цитозара).

5. Оценить частоту выявления остаточного опухолевого клона с помощью наиболее чувствительного метода двухстадийной ПЦР у больных с полным молекулярным ответом по данным количественного метода ПЦР в реальном времени.

Научная новизна:

На основе данных молекулярно-биологических методов исследования и данных кариологического исследования костного мозга произведена характеристика минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом, получающих терапию интерфероном-альфа, терапию иматинибом и комбинированную терапию (иматиниб, интерферон-альфа, курсы малых доз цитозара). Установлено, что при динамическом исследовании экспрессии гена BCR-ABL с помощью метода количественной Real-time ГИДР у большинства (90,4%) больных с полной клинико-гематологической ремиссией и полным цитогенетическим ответом определяется персистирование остаточного опухолевого клона, что диктует необходимость продолжения терапии.

Практическая ценность:

Установлено, что метод количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени является информативным для детекции и мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом. На основании сопоставления данных цитогенетического исследования и количественного метода Real-time ПЦР установлен уровень экспрессии гена BCR-ABL, прогностически значимый для возникновения цитогенетического рецидива и уровень экспрессии, ассоциированный со стабильным полным цитогенетическим ответом. Установлена возможность исследования периферической крови для мониторинга минимальной остаточной болезни, что позволяет оценивать стабильность полученного молекулярного ответа в динамике без применения повторных стернальных пункций. Определена схема обследования больных хроническим миелолейкозом при использовании молекулярно-биологических методов исследования.

Основные положения данной работы с 2004 г. внедрены в работу отделения химиотерапии лейкозов и патологии эритрона Гематологического научного центра Российской академии медицинских наук (далее - ГНЦ РАМН): настоящая работа является фрагментом темы, выполняемой по плану НИР ГНЦ РАМН «Разработка стратегии терапии хронического миелолейкоза» (2003-2007 гг.) №01200301557. Результаты исследований явились основанием для внедрения иматиниба в клиническую практику лечения больных XMJI. Полученные в ходе исследования заключения включены в практическое пособие для врачей и методические рекомендации по обследованию и лечению больных XMJT.

- 12

Заключение диссертации по теме «Гематология и переливание крови», Челышева, Екатерина Юрьевна

ВЫВОДЫ:

1. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени является информативным методом для характеристики минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом на фоне проведения направленной терапии (иматиниб мезилат, интерферон-альфа). Установлено, что при динамическом наблюдении у 90,4% больных с полным цитогенетическим ответом отмечается персистирование минимальной остаточной болезни.

2. Выявлена корреляция уровня экспрессии гена BCR-ABL в периферической крови и костном мозге (коэффициент корреляции 0,9), что позволяет рекомендовать к использованию периферическую кровь для мониторинга минимальной остаточной болезни у больных хроническим миелолейкозом в процессе терапии.

3. Установлено, что у больных ХМЛ, получающих терапию иматинибом, высокие уровни экспрессии гена BCR-ABL, соответствующие снижению менее, чем на 1,9 lg по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы с возникновением цитогенетического рецидива. Полный молекулярный ответ и низкие уровни экспрессии гена BCR-ABL, соответствующие снижению более, чем на 3 lg по отношению к начальному базальному уровню, ассоциированы со стабильным полным цитогенетическим ответом.

4. Больным хроническим миелолейкозом с полным цитогенетическим ответом показана непрерывная постоянная терапия (иматиниб мезилат, интерферон-альфа, комбинированная терапия), поскольку при отмене лечения отмечается потеря достигнутого ответа и увеличение процента Ph'-положительных клеток в костном мозге.

5. Исследование с помощью метода двухстадийной полимеразной цепной реакции с чувствительностью до 10"6 позволяет выявить минимальную остаточную болезнь в 55% случаев полного молекулярного ответа, что свидетельствует о возможности персистирования остаточного опухолевого клона и необходимости проведения постоянной терапии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные достижения в терапии ХМЛ позволяют не только получить полную клинико-гематологическую ремиссию у больных ХМЛ, но и добиться значительного подавления Ph'-положительного опухолевого клона. Важность достижения ПЦО как фактора увеличения продолжительности жизни у больных ХМЛ подтверждена во многих исследованиях [36-39].

Терапия ИФН-альфа и иматинибом (специфический ингибитор BCR-ABL-зависимой тирозинкиназы) уже доказали свою ценность и значимость использования в качестве «золотого стандарта» в лечении больных с хронической фазой ХМЛ. Однако точного ответа на вопрос о том, возможно ли полное искоренение опухолевого клона на фоне проводимой консервативной терапии, а также на вопрос о том, как долго должна продолжаться эта специфическая терапия у больных с полной цитогенетической ремиссией, на сегодняшний день еще нет. Единственным методом полного уничтожения опухолевого клона при ХМЛ в настоящее время признана аллогенная трансплантация костного мозга.

В связи с этим возрастает важность оценки МОБ у каждого больного ХМЛ, достигшего ПЦО на фоне консервативной терапии. Традиционно использующиеся в гематологии цитогенетические методы не всегда позволяют это сделать из-за их относительно низкой чувствительности. Молекулярные методы (качественная nested ПЦР и количественная Real-time ПЦР), чувствительность которых находится в пределах Ю^-Ю"6, позволяют более детально изучить остаточный опухолевый клон при ХМЛ.

В нашем исследовании представлена характеристика МОБ у 83 больных (39 мужчин и 44 женщин в возрасте от 16 до 70 лет) с ХФ Ph'-позитивного ХМЛ, получающих терапию ИФН-альфа, иматинибом и комбинированную терапию. Медиана наблюдения в группе больных, получавших терапию ИФН -альфа, составила 66 мес.(6-108 мес.); в группе больных, получавших терапию иматинибом - 48 мес. (6-60 мес.); в группе больных, получавших комбинированную терапию - 36 мес. (24-36 мес.). В группе больных, получавших терапию ИФН-альфа и в группе больных, получавших комбинированную терапию, все пациенты находились в ранней ХФ. В группе больных, получавших терапию иматинибом 67.9% пациентов были в поздней ХФ, 32,1% - в ранней ХФ.

В указанных трех клинических группах пациентов регулярно проводился цитогенетический мониторинг. Мониторинг МОБ производили у 19 больных с помощью метода качественной nested ПЦР и у 74 больных - с помощью количественного метода Real-time ПЦР.

Для проведения анализа выделяли РНК из клеток костного мозга или периферической крови, выполняли реакцию обратной транскрипции с целью получения комплементарной ДНК.

Для проведения качественной двухстадийной (nested) ПЦР проводили амплификацию на приборе "PCR sprint thermal cycler" фирмы Hybaid и визуализировали ПЦР-продукт с помощью электрофореза в 6% полиакриламидном геле.

Количественную Real-time ПЦР проводили при помощи прибора ICycler IQ (фирмы BioRad) с использованием технологии TaqMan. Количество копий транскрипта гена BCR-ABL и гена [32-микроглобулина (выбранного в качестве контрольного гена) определяли относительно стандартной калибровочной кривой, представляющей собой серию разведений плазмиды, содержащей известное количество копий. Окончательный результат у выражали в виде соотношения: число копий BCR-ABL х 10 /число копий [32-микроглобулина.

Для оценки динамики МОБ определяли десятичный логарифм снижения уровня транскрипта BCR-ABL относительно НБУ по формуле: log 10 НБУ-loglO результат {BCR-ABL х 107/р2-микроглобулин). За величину начального базального уровня (НБУ) была принята медиана уровня экспрессии гена BCR-ABL, полученная при диагностическом анализе 35 пациентов с впервые выявленным XMJI. Этот уровень (НБУ) составил 11245 {BCR-ABL х 107 /[32-микроглобулин) копий; lg НБУ = 4,05.

При анализе ЦО выяснилось, что наиболее раннее получение БЦО и ПЦО (к 3 мес. терапии) и наибольшее число стабильных ПЦО (63,6%) было отмечено среди пациентов, получающих комбинированную терапию, наиболее позднее (до 48 мес.) и наименьшая стабильность ПЦО (5,3%) - в группе больных, получающих терапию ИФН-альфа. Частота возникновения ЦР была выше в группе больных, получающих лечение ИФН-альфа (36,8%). Снижение стандартных доз и перерывы в терапии могли быть ассоциированы с возникновением ЦР во всех трех клинических группах.

При анализе с помощью качественной ПЦР в группе больных, получающих терапию ИФН-альфа, было установлено, что частота ПМО возрастает при увеличении срока терапии, однако полученный ПМО не был стабильным. Положительные результаты качественной ПЦР свидетельствовали о сохранении МОБ даже на поздних сроках терапии ИФН-альфа. Развитию цитогенетической нестабильности могли предшествовать как положительные, так и отрицательные результаты качественной ПЦР.

На фоне снижения доз ИФН-альфа или перерывов в терапии была возможна потеря ПМО и ПЦО, а при коррекции терапии - их восстановление. Учитывая нестабильность полученных ПМО, и возможность их потери при прерывании лечения, отрицательный результат качественной ПЦР не может являться показанием к прекращению терапии ИФН-альфа.

Таким образом, качественный метод двухстадийной nested ПЦР позволил охарактеризовать МОБ у больных ХМЛ, получающих специфическую терапию, однако более полную информацию удалось получить с помощью количественного метода Real-time ПЦР.

Среди всех проанализированных с помощью количественного метода Real-time ПЦР 250 образцов 91 были отрицательными, 149 положительными.

Была выявлена высокая корреляция уровня экспрессии BCR-ABL в периферической крови и костном мозге при одновременном анализе 20 пар образцов крови и костного мозга. Коэффициент корреляции составил 0.9. Подобные данные были также получены в других исследованиях [76, 77], что послужило основанием рекомендовать использовать для анализа периферическую кровь.

Цитогенетически не имеющие различий пациенты имели разный уровень МОБ по данным молекулярного исследования.

Для большинства (83,3%) пациентов с ЦР было свойственно снижение уровня BCR-ABL транскрипта менее, чем на 1 lg. На момент ЧЦО снижение уровня транскрипта менее, чем на 1 lg по сравнению с НБУ определялось в 43,8% случаев, на 1-2 lg - в 37,5% случаев.

Похожие данные были получены в исследовании T.Bumm с соавторами [73], по данным которого БЦО не всегда был ассоциирован со снижением уровня транскрипта BCR-ABL более чем в 10 раз.

Среди пациентов с ПЦО отмечался наибольший диапазон экспрессии BCR-ABL. В большинстве случаев (43,5%) при ПЦО отмечалось снижение уровня экспрессии BCR-ABL на 2-3 lg по сравнению с НБУ. Снижение уровня транскрипта на 3 lg и более по сравнению с НБУ (БМО) отмечалось в 24,4% проанализированных образцов у больных с ПЦО. Подобные данные были получены также в исследовании итальянских авторов [75], в котором все случаи стабильного ПЦО были ассоциированы со снижением уровня экспрессии BCR-ABL более, чем на 2 lg.,

По данным нашего исследования, медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ПЦО среди всех больных составила 2,42 lg (-0,4 - 4,03 lg) снижения по отношению к НБУ. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ЧЦО составила 1,18 lg (0,13-2,43 lg) снижения по отношению к НБУ. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL на момент ЦР составила 0,62 lg снижения по отношению к НБУ(-0,42 -1,18 lg).

По данным исследования T.Bumm с соавторами [73], все отрицательные результаты Real-time ПЦР были положительными при проверке стандартной двухстадийной ПЦР. В нашей работе при анализе 37 из 91 отрицательных по данным количественного метода Real-time ПЦР образцов крови и костного мозга с помощью более чувствительных методов (качественной nested ПЦР с чувствительностью до 10'6) BCR-ABL транскрипт удалось выявить в 20 (55%) из 37 образцов. Выявление МОБ в меньшем проценте случаев в нашем исследовании может быть обусловлено тем фактом, что медиана наблюдения была больше, чем в исследовании T.Bumm с соавторами, соответственно, степень подавления остаточного опухолевого клона также могла быть более выраженной при более длительном сроке терапии и мониторинге. Этот анализ продемонстрировал возможность сохранения МОБ на крайне низких уровнях, которые могут остаются за пределами чувствительности применяемого нами количественного метода. Клиническая значимость этих данных заключается в том, что отрицательный результат Real-time ПЦР у больных ХМЛ, получающих консервативную терапию, может не означать полного отсутствия болезни и окончательного искоренения BCR-ABL-позитивного клона.

В группе пациентов, получающих терапию ИФН-альфа, молекулярный анализ с помощью количественного метода Real-time ПЦР показал сохранение МОБ и нестабильность полученного ПМО у всех пациентов. Медиана уровня экспрессии BCR-ABL у пациентов с сохраняющимся ПЦО на этой терапии составляла 2,41 lg снижения по сравнению с НБУ. В 3 случаях была отмечена возможность сохранения полной клинико-гематологической ремиссии и ПЦО (в 1 случае - стабильного, в 2 случаях - нестабильного) во время длительных (12-36 мес.) перерывов в терапии у пациентов на поздних сроках терапии ИФН-альфа.

В группе пациентов, получающих терапию иматинибом были отдельно проанализированы больные со стабильным ПЦО, нестабильным ПЦО и ЦР. У пациентов со стабильным и нестабильным ПЦО медианы уровня экспрессии BCR-ABL на момент ПЦО не различались и составили 2,56 и 2,57 lg снижения по сравнению с НБУ. Уровень экспрессии BCR-ABL на момент ЧЦО был выше, чем при ПЦО: медиана 1,41 lg снижения по сравнению с НБУ.

Наиболее высокие уровни экспрессии BCR-ABL среди пациентов на терапии иматинибом были выявлены в момент развития ЦР (медиана 0,62 lg снижения по сравнению с НБУ). При проведенном в 6 случаях молекулярном анализе за 6-12 мес. до возникновения ЦР также отмечалось появление высоких уровней экспрессии BCR-ABL: медиана 0,86 lg снижения по сравнению с НБУ при сохраняющемся ПЦО и 0,89 lg снижения по сравнению с НБУ при сохраняющемся ЧЦО.

Снижение уровня экспрессии BCR-ABL на 1-1,99 lg по отношению к НБУ было характерно как для пациентов с ПЦО, так и для пациентов с ЧЦО и могло предшествовать развитию ЦР.

Низкие уровни экспрессии BCR-ABL (более 3 lg снижения по сравнению с НБУ) и отрицательные результаты Real-time ПЦР у больных ХМЛ на терапии иматинибом были ассоциированы с сохраняющимся ПЦО. Именно при таком уровне редукции уровня экспрессии BCR-ABL в течение 12 месяцев терапии иматинибом дальнейшая выживаемость без признаков прогрессии составила 100% по данным Hudges с соавторами [76] в рамках исследования IRIS. Подобные данные были получены также и в нашей работе.

В группе пациентов, получающих комбинированную терапию, на момент ПЦО медиана уровня экспрессии BCR-ABL была на 2,4 lg ниже НБУ; медиана уровня экспрессии BCR-ABL была на 0,9 lg ниже НБУ при сохраняющемся ЧЦО. Высокие уровни экспрессии BCR-ABL (менее 1,99 и менее 1 lg снижения по отношению к НБУ) и повышение уровня транскрипта в динамике могли предшествовать развитию ЦР, а также выявляться при цитогенетической резистентности. Выявление этих относительно высоких уровней также было отмечено на ранних (менее 3 мес.) сроках терапии при достижении ЧЦО. Снижении уровня экспрессии BCR-ABL на 1,5-1,9 lg также наблюдалось за 3-6 мес. до развития ЦР. Уровни экспрессии BCR-ABL, соответствующее более, чем 2 lg снижения по сравнению с НБУ, и отрицательные результаты у больных ХМЛ, получающих комбинированную терапию, были ассоциированы с сохраняющимся ПЦО. При длительных перерывах в лечении (3-4 мес.) на 1-2 году комбинированной терапии в 2 случаях отмечалось развитие ЦР.

Возможность получения отрицательных результатов Real-time ПЦР была отмечена у 72,8% пациентов на терапии иматинибом, 72,7% пациентов на комбинированной терапии и у 80% больных, длительно получающих терапию ИФН-альфа. По сведениям литературы (Lin с соавторами [78]) было установлено, что на терапии иматинибом что повторные отрицательные результаты Real-time ПЦР (стабильный ПМО) наблюдается редко. Данные нашего исследования подтверждают этот факт: стабильные ПМО при терапии иматинибом были отмечены только у 5 (9,4%) из 53 больных. При этом достоверно большая (р<0,05) частота достижения ПМО (72,8%) была выявлена у пациентов со стабильным ПЦО по сравнению с таковой у больных с нестабильным ПЦО (31,3%). Стабильные ПМО были отмечены также у 3 (27,3%) из 11 больных на комбинированной терапии.

С помощью клинических примеров на разных видах терапии (ИФН-альфа, иматиниб, комбинированная терапия) было продемонстрировано влияние изменения схемы и доз применяемой терапии, а также перерывов в терапии, на полноту и стабильность достигнутых цитогенетических и молекулярных ремиссий. Была показана динамика МОБ у отдельных пациентов и взаимосвязь роли цитогенетического и молекулярного мониторинга.

Учитывая длительное, хроническое течение заболевания у больных с хронической фазой XMJI, для мониторинга МОБ в динамике оптимально производить исследование с помощью Real-time ПЦР 1 раз в 3 мес., чтобы вовремя обнаружить тенденцию к изменению экспрессии BCR-ABL, выявить уровень экспрессии, ассоциированный с возникновением цитогенетического рецидива. Наиболее информативен для определения динамики изменения экспрессии гена BCR-ABL молекулярный мониторинг у больных с ПЦО. Возможность исследования периферической крови для мониторинга МОБ позволяет оценить стабильность полученного молекулярного ответа и избежать повторных стернальных пункций.

Таким образом, количественный метод Real-time ПЦР является важным в анализе МОБ при XMJT. Анализ с помощью этого метода позволяет определить относительно безопасные уровни МОБ, ассоциированные с сохраняющимся ПЦО, а также своевременно выявить ранние признаки развития рецидива.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Челышева, Екатерина Юрьевна, 0 год

1. Kurzrock R., Gutterman J., Talpaz M. The molecular genetic of Philadelphia chromosome-positive leukemia // N Engl J Med. -1988.- Oct 13;319(15).- p.990-998.

2. Ogawa H.,Sugiyama H., Soma Т., Masooke Т., Kishimoto S. No correlation between location of bcr breakpoints and clinical statas in Ph'-positive CML patients// Leukemia. 1989. - v3. - p. 492-496.

3. Воробьев А.И. Руководство по гематологии. Москва. Изд-во «Ньюдиамед»- 2003. -том №1.

4. Gale R.P. Chronic myelogenous leukemia: molecule to man // Henry Ford HospMed J. 1991.-396.-p. 108-111,

5. Nowell P.C., Hungerford D.A. A minute chromosome in human chronic granulocytic leukemia.// Jonfl of the National Cancer Institute. -I960.- N25.- p.85-109.

6. Rowley J.D. A new consistent chromosomal abnomality in chronic myelogenous leukemia giemsa starting // Nature. 1973. - v243. - p. 290303.

7. Fujii H., Yashige H., Misawa S., Tanaka S., Urata Y., Matuyama F. Ph chromosome in patients with non-leukemic non-Hodgkin B- cell lymphoma // Am J Hematol. 1990. - Nov 35 (3).- p. 213- 215.

8. Mariat P., Meccuci C., Nizet Y., Stul M., Philippe M., Cassiman J.J., Van den Berghe H., Sokal G. p210 BCR/ABL transcript in case of Philadelphia positive multiple myeloma.// Leukemia. 1990. - №4 - p. 751.

9. Melo J.V., Myint H., Galton D.A., Goldman J.M. // PI90 BCR-ABL chronic myeloid leukemia: the missing link with chronic myelomonocytic leukemia?// Leukemia.- 1994. Oct 8 (10)- p. 1795-1796.

10. Soekerman D., van Denderen, Hoefsloot L., Moret M., Meeuwsen Т., van Baal J., Hagemeijer G., Grosveld G. A novel variant of bcr-abl fusion product in Philadelphia chromosome-positive lymphoblastic leukemia// Leukemia.- 1990.- 4 -p.397.

11. Iwata S, Mizutani S, Nakazawa S, Yata J. Heterogenety of the breakpoint in the ABL gene in cases with BCR/ABL transcript lacking ABL exon a2.il Leukemia.-1994- 8-p. 1696.

12. Teysser J.R., Bartram C.R., Deville J., Pigeon F. c-abl Oncogene and chromosome 22 "bcr" juxtaposition in chronic myelogenous leukemia// New England Jornal of Medicine.-1985.- v 312.-p. 1393-1394.

13. Bartram C.R., Bross Bach U., Schmidi H., Waller H.D. Philadelphia-positive chronic myelogenous leukemia with breakpoint 5'of the breakpoint claster region but within bcr gene. // Blut 1987.- 55- p. 505.

14. Negrini M., Tallarico A., Pazzi I., Castagnoli I., Guneo A, Castoldi GL. A new chromosomal breakpoint in positive, bcr negative chronic myelogenous leukemia. Report of case.// Cancer Genet Cytogenet -1992.- 61- p. 11.

15. Prabhu M., Kochupillai V., Sharma S. Prognostic assessment of various parameters in chronic myelogenous leukemia// Cancer.- 1986.- 58-p.1357-1369.

16. Biernaux C., Loos M, Sels A, Huer G, and Stryckmans P. Detection of Major bcr-abl Gene Expression at a Very Low Level in Blood Cells of Some Healthy Individuals// Blood.- 1995.- V. 86.- N 8.- p. 3118-3122.

17. Архипова H.B. Клиническая и молекулярно-биологическая характеристика хронического миелолейкоза с анализом прогностических факторов заболевания. Автореф. дисс. канд. мед.наук Москва, 1996 г.

18. Kanellos G.P. Chronic granulocytic leukemia. // Med Clin North Am. -1988.- 60-P.1001.

19. Golde D.W.,Champlin R.E. Chronic myelogenous leukemia: Resent edvances// Blood.-1985.-V.65.- p.1039-1047.- 13228. Goldman J.M., Grosveld G., Baltimore D., Gale R.P. Chronic myelogenous leukemia-The unfolding saga.// Leukemia.-1990- 4- p. 163-167.

20. Kantarjian H.M., Talpaz M., Gatterman J.U. Chronic myelogenous leukemia-past, present and future// Hematol Patology.-1989.- v. 2.- 91.- p.210.

21. Allan N.C., Shepherd P.C., Brackenridge I., Suffolk R. United Kingdom Medical Research Council randomized trial of interferon-alfa in chronic-phase chronic myelogenous leukemia. // Semin Hematol.-1993.-Jul 30 (3 suppl 3).-p.20-21.

22. Hehlmann R., Heimpel H., Hasford G. с соавторами. Randomized comparison of interferon-alfa with busulfan and Hydroxyurea in chronic myelogenous leukemia// Blood.- 1994.- V. 84.- N 12.-p. 4064-4077.

23. The Italian Cooperative Study Group on Chronic Myelogenous Leukemia. Interferon Alfa-2a as compared with conventional chemotherapy for the treatment of chronic myeloid leukemia // New England Journal of Medicine.- 1994.- v. 330.-p. 820-825.

24. The Benelux CML Study Group: Randomized study on hydroxyurea alone versus hydroxyurea combined with low-dose interferon-2b for chronic myeloid leukemia.// Blood.-1998,-v. 91.-p.2713.

25. Druker BJ, Nicolas L. J Clin Ivest.- 2000; 105: 3-7.

26. Туркина А.Г. Ингибитор сигнальных путей STI 571 (Signal Transductor Inhibitor) новое направление в лечении хронического миелолейкоза. // Современная онкология.-2001.- т.З,- №2.-с. 46-48.

27. Kolb H.J., Mitterm&uumller J., Clemm С., Holler е., Ledderose G., Brehm J., Heim M., Williams W. Donor leucocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myeloid leukemia in marrow transplant patients. // Blood.-1990.-v.76.-p.2462.

28. Hughes T.P., Morgan G.J., Martiat P., Goldman J.M. Detection of residual leukemia after bone marrow transplant for chronic myeloid leukemia. Role of polymerase chain reaction in predicting relapse.// Blood.-1991.-v.77.-p.874.

29. Birnie G.D., MacKenzie E.D., Goyns M.H., Pollock A. Sequestration of Philadelphia chromosome-positive cells in the bone marrow of a chronic myeloid leukemia patient in very prolonged remission. // Leukemia.-1990.- 4- p.452.

30. Uhr J.U., Scheuermann R.H., Street N. с соавторами. Cancer dormancy. Opportunities for new therapeutic approaches. //Nat Med.-1997.- 3.- p.505.

31. Kolb H.J., Mitterm&uumlller J., Clemm C., Holler E., Ledderose G., Brehm G., Heim M., Wilmanns W. Donor leukocyte transfusions for treatment of recurrent chronic myelogenous leukemia in marrow transplant patients. // Blood,-1990,-v. 76.-p.2462.

32. Sacchi S., Kantarjian H,, Cohen P., Pierce S., Talpaz M. Immune-mediated and unusual complications during alpha-interferon therapy in chronic myelogenous leukemia.//J Clin Oncol.-l995.-v. 13-p.2401.

33. Thompson J.D., Brodsky I., Yunis J.J. Molecular quantification of residual disease in chronic myelogenous leukemia after bone marrow transplantation. // Blood.-1992,-v. 79.-p.1629.

34. Lin F., van R.F., Goldman J.M., Cross N.C. Kinetics of increasing BCR-ABL transcript numbers in chronic myeloid leukemia patients who relapse after bone marrow transplantation. // Blood,-1996.- v.87.-p.4473.

35. Hochhaus A., Reiter A., Skladny H., Reichert A., Saussele S., Hehlmann R. Molecular monitoring of residual disease in chronic myelogenous leukemia patients after therapy. // Recent Results Cancer Res.-1998.- 144- p.36.

36. Lion Т., Gaiger A., Henn Т., Horth E., Haas O.A., Geissler K., Gadner H. Use of quantitative polymerase chain reaction to monitor residual disease in chronic myelogenous leukemia during treatment with interferon. // Leukemia.-1995.-9-p.1353.

37. Cross N.C.P., Melo J.V., Feng L., Goldman J.M. An optimized multiplex polymerase chain reaction (PCR) for detection of BCR-ABL fusion mRNAs in haematological disorders. //Leukemia.-1994.- 8-p.l86.

38. Radich J.P., Gooley Т., Bryant E. с соавторами. The significance of bcr-abl molecular detection in chronic myeloid leukemia patients «late», 18 months or more after transplantation. //Blood.-2001.-vol 98. num.6.-p.l701-1707.

39. Moravkova J. с соавторами. Polymerase Chain Reaction Analyses Should Be Used as a Basis for Clinical Decision Making in Patients With Chronic Myelogenous Leukemia // Blood.-1999.-Vol. 94.- No. lO.-p. 3609-3611.

40. Kurzrock R., Estrov Z., Kantarjian H., Talpaz M. Conversion of interferon-induced, long-term cytogenetic remissions in chronic myelogenous leukemia to polymerase chain reaction negativity. // Journal of Clinical Oncoly.-1998.- v. 16-p.1526-1531.

41. Pasternak G., Pasternak L. Persistence of bcr-abl mRNA-expressing cells in long-term cultures established from chronic myeloid leukemic bone marrow or blood. // Annals of Hematology.-1984- v.68-№l.-p.9-14.

42. Lin F., Drummond M., О Brien S., Cervantes F., Goldman J., Kaeda J, Molecular monitoring in chronic myeloid leukemia patients who achieve complete cytogenetic remission on imatinib. // Blood.- 2003.- v.l02.-№3.- p.l 143.

43. Jackson P. Baltimore D. N-teriminal mutation activate the leukemogenic potential of the myristoylated form of c-abl.// EMBO Journal. -1989.- Feb.8(2).-p.449-456.

44. Konopka J.B., Witte O.N. Activation of the abl oncogene in murine and human leukemias//Biochimica et Biophysica Acta.-1985.-v. 823.-p. 1-17.

45. Collins S., Coleman H. & Groudine M. Expression of bcr and bcr-abl fusion transcripts in normal and leukemic cells // Molecular and Cellular Biology,-1987.-v.7.-p. 2870-2876.

46. Shtivelman E., Lifshitz В., Gale R. Alternative splicing of RNAs transcribed from human abl gene and from the bcr/abl fused gene // Cell.-1986.-47: p.277-284.

47. Daley G.Q., Van Etten R.A., Baltimore D. Introduction of chronic myelogenous leukemia in mice by the p210 bcr-abl gene of the Philadelphia chromosome. //Science.- 1990.-v.247.-p.824-830.

48. Rosenberg N. Murine models for human chronic myelogenous leukemia.// Cancer Cell.-1990.- v.2-p.284-286.

49. Daley G.Q. Animal models of BCR/ABL-induced leukemias. // Leukemia & Lymphoma.-1993.-v. 1 l.-suppl.l.-p.57-60.

50. McGahon A., Bissinnete В., Schmitt M., Cotter K., Green D., Cotter Th. BCR-ABL Maintains Resistance of Chronic Myeloid Leukemia Cells to Apoptosis Cells Death // Blood.-1984,-v. 83.-p. 1179-1187.

51. Lin F., van Rhee F., Goldman J.M., Cross N.C.P. Kinetics of increasing BCR-ABL transcript numbers in chronic myeloid leukemia patients who relapse after bone marrow transplantation. //Blood.-1996,-v. 87.-p.4473-4478.

52. Hughes Т., Branford S. Molecular monitoring of BCR-ABL as a guide to clinical management in chronic myeloid leukaemia // Blood Reviews.-2006.- v.20-p. 29-41.

53. Kim Y-J., Kim D-W., Lee S. с соавторами. Monitoring of BCR-ABL transcript levels after discontinuation of imatinib therapy in chronic myelogenousleukemia patients achieving complete cytogenetic response. // Blood. -2004.-v.104- p.255.

54. Burchert A., Wolfl S., Schmidt M. с соавторами. Interferon-alpha, but not the ABL-kinase inhibitor imatinib (STI571), induces expression of myeloblastin and a specific T-cell response in chronic myeloid leukemia. // Blood.- 2003-v.l01.-p.259-264.

55. Graham S.M., Jorgensen H.G., Allan E. с соавторами. Primitive, quiescent, Philadelphia-positive stem cells from patients with chronic myeloid leukemia are insensitive to STI571 in vitro. // Blood. -2002.-v.99.-p.319-325.

56. Deininger M., Buchdunger E., Druker В J. The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia. // Blood.- 2005.-v.105.-p.2640-2653.

57. Merx K, Muller MC, Kreil S с соавторами. Early reduction of BCR-ABL mRNA transcript levels predicts cytogenetic response in chronic phase CML patients treated with imatinib after failure of interferon alpha. // Leukemia.- 2002.-v.l6.-p.l579-83.

58. Fader 1 S, Talpaz M, Estrov Z, O'Brien S, Kurzrock R. The biology of chronic myeloid leukemia. //New Engl Journal Medicine.- 1999.- 341.- p. 164-172.

59. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

60. А.Г. Туркина, Е.Ю. Челышева. Цитогенетический и молекулярный ответ ранние маркеры эффективности терапии Гливеком больных Ph+ хроническим миелолейкозом // Фарматека. - 2004. - №18 (95).

61. Е.Ю.Челышева, А.Г.Туркина, А.В.Мисюрин, А.В.Захарова. Раннее выявление цитогенетического рецидива при динамическом исследовании уровня BCR-ABL транскрипта у больного хроническим миелолейкозом // Гематология и трансфузиология. 2007.-т.52-№2.- С.50-51.