Клеточные модели для отбора биологически активных соединений по кинетическим параметрам дыхания и сопряженных процессов окислительного метаболизма тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Романова, Вера Евгеньевна

• Романова, Вера Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Романова, Вера Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности работы дыхательной цепи в интактной клетке

1.2. Современные концепции регуляции дыхания в клетке

1.3. Оценка состояния различных участков дыхательной цепи в интактных клетках и тканях

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объект исследования

2.2. Реактивы и среда инкубации

2.3. Измерение скорости потребления кислорода кле- 39 точно-тканевыми препаратами

2 .4. Исследование динамики окислительно-восстановительных превращений в тканевых препаратах флуорометрическим методом

2.5. Выбор режима работы с тканевыми препаратами

2.5.1. Характеристика окислительного метаболизма тканевых препаратов в процессе их переживания

2.5.2. Влияние температурного режима на активность дыхательной цепи в тканевых препаратах

3. ДИНАМИЧЕСКАЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА

СОСТОЯНИЯ РАЗЛИЧНЫХ УЧАСТКОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ В

ТКАНЕВЫХ И КЛЕТОЧНЫХ ПРЕПАРАТАХ

3.1. Оценка интенсивности НАД-зависимого окисления в тканевых препаратах с помощью ингибиторного анализа

3.2. Особенности окисления сукцината в тканевых препаратах

3.3. Терминальный участок дыхательной цепи в тканевых препаратах.

3.4. Оценка относительной активности /^-К+-тран-спортной АТФазы в срезах мозга с помощью калиевой нагрузки

3.5. Оценка состояния и активности различных участков дыхательной цепи в изолированных клетках печени

4. ИНГИБИТОРНЫЙ АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ В

ТКАНЕВЫХ ПРЕПАРАТАХ ПРИ ИЗМЕНЕНИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО

СОСТОЯНИЯ ТКАНИ

4.1. Влияние температурного режима

4.2. "Возраст" тканевых препаратов

4.3. Модель "голодания" . ЮЗ

4.4. Особенности работы дыхательной цепи в тканевых препаратах мозга при сниженном значении р02. НО

5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПАРАМЕТРОВ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО МЕТАБОЛИЗМА

ДЛЯ ОТБОРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ТКАНЕВЫХ ПРЕПАРАТАХ . Ц

5.1. Проверка чувствительности параметров окислительного метаболизма тканевых препаратов к действию ХС-ингибиторов НАД-зависимого участка дыхательной цепи.

5.2. Прогнозирование общей токсичности ХС по их ингибирующему влиянию на тканевое дыхание.

5.3. Экспресс-тест для выявления на тканевых препаратах ХС, влияющих на /Уя-К+-транспортную АТФазу

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клеточные модели для отбора биологически активных соединений по кинетическим параметрам дыхания и сопряженных процессов окислительного метаболизма»

При массовых испытаниях химических соединений (ХС) с целью выявления биологически активных веществ (БАВ) принципиальными моментами становятся разработка биологических моделей и тест-систем, обеспечивающих максимальную эффективность скрининга. Последнее подразумевает высокую информативность используемых методов, их экспрессность, а также экономичность препаративного и измерительного этапов работы. Для этого необходимо создание совершенно новых методических подходов, включающих проведение испытаний не только на целом организме, но и в условиях in i/Ltio на биологических моделях с помощью многопараметрической регистрации и последующего автоматизированного анализа получаемых результатов. Все это в целом требует: I) наличия адекватных биологических моделей для тестирования ХС, достаточно удобных при использовании в условиях скригинга; 2) выбора в качестве тестируемых параметров таких, которые отражали бы состояние жизненно важных процессов организма; 2) использования высокочувствительных и высокоинформативных методов.

Возможным объектом для испытания ХС остаются изолированные митохондрии. Однако, на уровне первичных испытаний получение их-довольно трудоемкий процесс и, кроме того, следует помнить,что далеко не всегда изолированные субклеточные органеллы могут быть использованы для выяснения направленности действия и места приложения вещества в клетке. Это связано прежде всего с тем, что работа изолированного митохондриального аппарата, по-видимому, не полностью аналогична его работе в клетке. Имеется достаточно примеров, подтверждающих отсутствие идентичности различных функциональных параметров изолированных митохондрий сравнительно с клеточными системами in vivo и in Vitzo (18,23, 24, 26). Поэтому,с нашей точки зрения,остается задача поиска оптимального объекта исследования, который должен отвечать требованиям, касающимся достаточной простоты его получения с одной стороны, и сохранения специфических функционально-метаболических свойств -с другой.

Для экспресс-эксперимента в условиях in vitzo тканевые препараты (срезы) и изолированные клетки имеют серьезные преимущества перед субклеточными органеллами и целыми органами,так как сохраняют в течение нескольких часов многие свойства, присущие интактной ткани in Vivo (24, 68). Использование тканевых препаратов имеет и экономические преимущества, поскольку значительно упрощается подготовительно-препаративный этап работы в условиях массового испытания ХС и проведение самого эксперимента.

Тканевое" (клеточное) дыхание среди многих показателей функционального состояния является наиболее объемным и чувствительным метаболическим параметром, связанным с жизнедеятельностью организма. Оно отражает активность различных кислород-зависимых реакций, имеющих очень широкое представительство в клетке и занимающих благодаря этому центральное место в процессах биологического окисления (I, 24, 50). Практически любые внешние воздействия, в том числе и химические агенты, оказывают прямое или опосредованное влияние на разные звенья окислительного метаболизма, что в конечном итоге приводит к изменению утилизации кислорода клеткой. Поэтому "тканевое" дыхание широко используется в качестве интегрального показателя состояния объекта и его реактивности. Оценка влияния ХС на этот параметр может использоваться при определении безопасности применяемого агента на метаболические системы клетки. Особую значимость при этом имеет не столько общая оценка валового потребления кислорода, сколько вычленение отдельных звеньев этого процесса и определение вклада в дыхание различных кислородпотребляющих процессов, среди которых главное место занимают энергообразующие реакции клетки, связанные с работой митохондриальной дыхательной цепи. Применение таких высокочувствительных и высокоинформативных методов, как полярография и флуоресцентная регистрация степени восстановленности дыхательных переносчиков, значительно облегчает проведение подобных исследований. Однако, методология такого анализа с помощью тканевых и клеточных препаратов в настоящее время отсутствует, что определяет актуальность ее разработки.

В связи с этим целью настоящей работы являлось исследование возможности использования тканевых и клеточных препаратов в качестве биологических объектов для оценки действия ХС на энергетический аппарат клетки, а также создание на этой основе тест-систем экспресс-анализа параметров окислительного метаболизма, применимых при скрининге БАВ.

Задачи работы заключались в следующем:

1. Определить режим работы с тканевыми и клеточными препаратами, при котором максимально сохраняются их специфические функционально-метаболические свойства.

2. Разработать методологию комплексной прикизненой регистрации параметров окислительного метаболизма тканевых препаратов, характеризующих их энергетический статус и пригодных для последующей автоматизации процессов.

3. Разработать критерии оценки состояния энергетического аппарата (митохондриальной дыхательной цепи) в тканевых препаратах и создать с их помощью тест-системы для отбора ХС по параметрам окислительного метаболизма.

4. Использовать полученные данные для оценки состояния дыхательной цепи тканей и клеток, находящихся в различных функциональных состояниях.

- 9

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУШ

I.I. ОСОБЕННОСТИ РАБОТЫ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ В ИНТАКТНОЙ КЛЕТКЕ

Тканевое" (клеточное) дыхание является параметром, отражающим активность множественных кислородзависимых процессов. Основная его часть связана с работой митохондриальной редокс-цепи и ее энергообразующей функцией, сопряженной с энергопотреб-лягощими процессами. Последние, как известно, протекают преимущественно во внемитохондриальном пространстве. Увеличение потребности в АТФ при инициации этих процессов интенсифицирует работу митохондриальной дыхательной цепи и сопряженные с ней потребление кислорода и окислительное фосфорилирование, что, в конечном итоге, приводит к образованию АН, компенсирующему его расход.

Обширный экспериментальный и теоретический материал, накопленный в работе с изолированными митохондриями и касающийся особенностей регуляции работы дыхательной цепи, никогда не снимал с повестки дня вопрос о специфических особенностях ее поведения в интактной клетке, в условиях сохранения сложнейшей связи между отдельными внутриклеточными структурами и метаболическими процессами, протекающими в них. Во многих работах, посвященных этой проблеме, неоднократно делались попытки проведения аналогий между состоянием дыхательной цепи митохондрий in vitio и в интактных клеточных, либо даже органных системах (мышца, печень, сердце, асцитные клетки, нервная ткань). Эти исследования показали, что потенциальная окислительная способность клеточных препаратов соответствует тому, что известно для изолированных митохондрий (49,51,52-55,60,68,93,97,140).

Эффективность окислительного фосфорилирования в клеточных препаратах оценивается теми же параметрами, что и в изолированных митохондриях. Чансом были получены значения Р/0 для интакт-ных клеток асцитной опухоли Эрлиха, равные 0,9 на пункт фосфо-рилирования, что соответствует лучшим значениям, известным для изолированных митохондрий (52-55,97). Образование I моля АТФ на пункт фосфорилирования было подтверждено в серии исследований последних лет на самых разных клеточных объектах, органах и тканях: изолированных клетках печени, перфузируемых печени и сердце, у простейших одноклеточных, представителей разных классов (80,112,140,164).

Общая закономерность расположения дыхательных переносчиков в интактной клетке такая же, как и в изолированных митохондриях (52,65-67), то есть в условиях in vitio и in VlVo сохраняются общие принципы структурной организации дыхательной цепи.

Совокупность всех этих данных, полученных уже к началу 60-х годов, сделала оправданной попытку исследователей использовать методические приемы, успешно развиваемые применительно к изолированным митохондриям, для оценки состояния дыхательной цепи и изучения вопросов регуляции тканевого дыхания в интактной клетке.

Так, была рассмотрена возможность проявления в ней кинетического контроля дыхания по Чансу. При этом следует сразу же оговорить принципиальные и очевидные отличия, касающиеся стационарных метаболических состояний в условиях in vitto и in ViVo, Состояния I и 2 по Чансу в последнем случае, по-видимому, могут наблюдаться очень редко, потому что в клетке, как правило, имеется избыток эндогенных субстратов, АДШ и ф , Наиболее подходящими для аналогий являются состояния 3 и 4. Покоящаяся ткань более всего приближается к метаболическому состоянию 4, когда почти вся эндогенная АДФ фосформирована в АТФ. Усиление в клетке процессов, потребляющих АТФ, должно приводить к образованию эндогенной АДР, активации в связи с этим транспорта электронов в дыхательной цепи и сопряженного увеличения потребления кислорода (состояние 3). Рефосфорилирование АДФ до АТФ вновь приведет к торможению дыхания (возвращение к исходному состоянию 4). По аналогии с изолированными митохондриями в этом случае переход от состояния 3 к состоянию 4, сопрововдагащийся соответствующими редокс-изменениями дыхательных переносчиков, можно использовать в качестве кинетического контроля дыхания. Но именно в силу этого получение дыхательного контроля в интактной клетке в присутствии экзогенной Д1Р, как это принято для изолированных митохондрий, может быть сопряжено с определенными трудностями. Они вытекают преледе всего из того, что синтез и расход энергии в ней практически неразделимы и протекают одновременно. Поэтому, образующаяся АТФ может сразу же утилизироваться в других реакциях.

Как уже отмечалось, в большинстве тканей млекопитающих при физиологических условиях скорость дыхания вряд ли может лимитироваться концентрацией АДФ и Ф , так как существуют эндогенные источники, регулирующие их концентрацию в клетке. Кроме того, энергетическая регуляция в интактной клетке - сложный процесс, включающий работу различных внутриклеточных метаболических систем. Наконец, использование кислорода в клетке может быть связано не только с реакциями фосфорилирования. Поэтому, стремление получить дыхательный контроль в интактных клетках по аналогии с изолированными митохондриями, по-видимому, не оправдано. Это демонстрируется на целом ряде примеров.

Описывая переход от состояния 3 к состоянию 4 в присутствии экзогенного АДФ в изолированных клетках печени, йшихара (102) отмечал его "постепенность" в отличие от резкого "перегиба", наблюдаемого при дыхании изолированных митохондрий. Он связывал данное явление с проявлением АТФазной активности, гид-ролизующей АТФ, образованную в клетке и генерирующую некоторое количество ДЩБ. Это предположение подтверждается изменениями рН инкубационной среды, носящими колебательный характер. Более того, неоднократно отмечалось отсутствие стимулирующего действия АДр на дыхание срезов тканей (при температуре 37°) и проявление четкого тормозящего ее эффекта (19,21). Оценку дыхательного контроля в интактной клетке, видимо, нельзя рассматривать в отрыве от ее функциональной активности, так как именно усиление последней является главной причиной, стимулирующей образование энергии и определяющей ее поступление на нужды эндергонических реакций. Следовательно, условия проявления дыхательного контроля в различных тканях будут неодинаковыми.

В мышечных клетках, например, основной функцией является преобразование химической энергии в механическую работу, то есть сокращение. Первый исследователь особенностей регуляции тканевого дыхания в сердце in vitio Рамирес (144) изучал проявление метаболического контроля дыхания в кусочках желудочка сердца лягушки толщиной 1-1,5 мм. Такие препараты обладают спонтанной электрической активностью и сокращаются при электрической стимуляции. В последнем случае происходит активация дыхания и окисление НАД. Изменения обнаруживаются очень быстро и достигают полумаксимальных значений после 2-4 сокращений, то есть через 20-40 с. Однако их величина невелика и составляет всего 2-&?o от общей степени восстановленности пиридиннуклеоти-дов. Так как в присутствии АДФ в сарколеммах обнаруживаются изменения аналогичные тем, что наблюдаются при сокращении мышцы, делается вывод, что во время мышечной активности высвобождается АДФ. Это же подтвердилось в исследованиях на перфузируемом сердце млекопитающих (68,93). В сердечной мышце можно наблюдать метаболический контроль дыхания при переходе от состояния покоя к активности при сокращении (163).

Аналогичные результаты были получены на скелетных мышцах. Сокращение нервно-мышечного препарата в ответ на одиночное раздражение сопровождается фазными окислительно-восстановительными превращениями пиридиннуклеотидов и флавинов, также как и дыхательными изменениями. Они свидетельствуют об активации дыхательной цепи, сопутствующей мышечному сокращению, и интерпретируются как результат увеличения внутриклеточной концентрации АДФ, связанного с увеличением расхода АТФ (53,60,73,104, 106,109). Ответ пиридиннуклеотидов и цитохрома в, на сокращение становится более выраженным после предварительного восстановления этих компонентов в присутствии адекватных субстратов.

В нервной ткани большая часть образующейся энергии окислительного метаболизма тратится на функцию, сопряженную с транспортом катионов против электрохимического градиента. Формирование нервного импульса обеспечивается Ш- К+-АИазой, которая является пейсмекером 40-50$ клеточного дыхания в нейронах и периферических нервах (98,99,135,153). Стимулируемое высокими концентрациями калия дыхание срезов мозга является отражением активации Л/сМ{+-АТФазы (44,137,161). Энергозависимость этого процесса подтверждается подавлением его ингибиторами дыхательной цепи митохондрий (98,99). Активация работы дыхательной цепи калием сопровождается двухфазными редокс-изменениями дыхательных переносчиков.

Изолированная нервная ткань (срезы мозга) может отвечать на электрическое раздражение обратимой деполяризацией клеточных мембран, коррелирующей с усилением метаболической, в том числе дыхательной активности (126,137). Так же как LnvLvo , при этом увеличивается и интенсивность гликолиза в 2-10 раз (135). Эти изменения, специфичные для нервной ткани и не воспроизводящиеся на других невозбудимых тканях, например, печени (73), сопряжены с обратимым уменьшением креатинфосфата, АТФ, а также с изменениями ионного обмена, выражающимися в быстром выходе К+ из клеток и антипортном потоке (73,126). Одновременно наблюдаются фазные окислительно-восстановительные превращения пиридиннуклеотидов и цитохромов (44,45). Реакция цроисходит только в присутствии специфического для мозга субстрата - глюкозы.

Эти же изменения воспроизводятся на интактном мозге. Во время прямого электрического раздражения коры головного мозга в течение первых же секунд наблюдается окисление НАДН и цито-хрома аа3 (94,122,123). Окисление-восстановление пиридиннуклеотидов и цитохрома аа3, сопровождаемые усилением-торможением дыхания и соответствующими изменениями в концентрации К+ (73,122, 126,127), наблюдаются на фоне вызванных потенциалов, а также во время корковой распространяющейся депрессии (122,127,146). Эти изменения связываются с необходимостью восстановления внутриклеточной концентрации ионов после нейрональной активности не в глиальных клетках, а в нейронах, так как именно в последних обнаружена основная масса митохондрий (до 91%) (108).

Высокая сопряженность между электрофизиологическим ответом и окислительным метаболизмом используется в качестве характерного показателя при изучении действия различных агентов на энергопотребляющую систему мозга (89,123), для определения скорости превращения АТФ в АДФ через А/а+-К+-АТФазу (122,146).

В клетках печени скорость образования АТФ при обеспечении максимальной скорости глюконеогенеза из лактата и максимальной скорости синтеза мочевины составляет 72% от максимальной скорости образования АТФ за счет аэробного окисления, то есть сопряженного дыхания. При немаксимальной скорости окислительного фосфорилирования скорость обеспечения этих двух биосинтезов АТФ может становиться лимитирующим звеном процесса (116). Среди других АТФ-потребляющих процессов в гепатоцитах наибольшее значение имеет поддержание концентрационного градиента (клетка -внешняя среда) для неорганических ионов и легко диффундируемых низкомолекулярных веществ, например, аминокислот. Энергетическая потребность в активном транспорте не определена, однако известно, что в срезах печени до 40% дыхания связаны с натрий-калиевым обменом (41). Подтверждением этому является действие уабаина - ингибитора К+ - Л/а+-зависимой АТФ-азы, который подавляет дыхание изолированных гепатоцитов (104).

Все эти факты свидетельствуют о том, что реализация специфической функции клетки самым тесным образом коррелирует с дыханием и состоянием восстановленности дыхательных переносчиков. Поэтому, вполне возможно проведение некоторых аналогий, касающихся параметров окислительного метаболизма изолированных митохондрий и митохондрий в клеточных и тканевых препаратах.

В то же время можно привести достаточно примеров, свидетельствующих о существовании выраженных отличий в работе системы окислительного фосфорилирования в интактных клетках сравнительно с изолированными митоховдриями.

Согласно данным Уилсона (164), в условиях максимального окисления дыхательной цепи гепатоцитов цитохром с остается восстановленным на 10-30$ (в изолированных митохондриях - не более, чем на 14%); цитохром а восстановлен в среднем на 23% (в изолированных митохондриях не более, чем на 4%). Однако, редокс-пара НАД+/НАДН находится в гепатоцитах в гораздо более окисленном состоянии, чем в изолированных митохондриях. Джоунс и соавторы (НО) приводят несколько более низкие значения степени восстановленности дыхательных переносчиков в клетках печени в условиях максимальной их окисленности. Количественные различия в результатах, полученных в этих двух работах, могут быть связаны не только с неодинаковыми условиями выделения гепатоцитов, но и зависеть от исходного состояния животного. Так, Бюхер и Сис (48) показали на перфузируемой печени, что степень восстановленности дыхательных переносчиков в органе сытых животных в присутствии лактата и пирувата для цитохромов аа3 и ccj была сходна со значениями, известными для изолированных митохондрий в состоянии 4; для цитохрома в - несколько выше, чем в митохондриях; для флавопротеинов - ниже. В перфузируемой печени животных после 24 часов голодания восстановленность всех дыхательных переносчиков, кроме цитохрома аа3 и сср была примерно в 2 раза ниже, чем в изолированных митохондриях в состоянии 3.

Наибольшие различия с изолированными митохондриями обнаруживает цитохромоксидаза,ткани. При вдыхании животными атмосферного воздуха (нормоксия) цитохром аа3 в мозге восстановлен на

70-85% (против 1-4% в суспензии митохондрий), и поэтому аноксия может изменить его не более, чем на 15% (94). Эта исходно высокая степень восстановленности не связана с внутриклеточной гипоксией, так как in vivo ткань мозга в достаточной степени обеспечена кислородом (151). Максимальное окисление цитохрома аа3 не может быть достигнуто в обычных условиях даже в присутствии 100% кислорода. Оно имеет место лишь при вдыхании животными под высоким давлением (около 4 атмосфер) смеси, состоящей из 5% СО^ ии 95% Og. В этих условиях наблюдается лимит по субстратам, и митохондрии в клетке находятся в состоянии, близком ко 2-му по Чансу ("истощенные митохондрии") (107,108).

Высокий уровень восстановленности терминального участка дыхательной цепи, нехарактерный для изолированных митохондрий, показан для всех тканей, выполняющих транспортную функцию: слизистой желудка (96), кишки шелковичного червя (128), желудочка сердца жабы (144), сокращающегося сердца крысы (93), каротидного тела (136), сердца собаки in situ (153). Во всех этих органах и тканях увеличение активности, сопровождающееся усилением метаболизма, как и в мозге, протекало на фоне окисления цитохрома аа3. Исключение составляют сокращающаяся скелетная мышца жабы и лягушки, желудочек сердца лягушки и ductus Qzteziosus морской свинки (104,106,109), а также печень, у которой in situ степень окисленности цитохрома а равна 96%, а цитохрома а3 - 99% (105).

Направление редокс-изменений дыхательных переносчиков в условиях in Vivo при переходе от состояния 3 к состоянию 4 качественно может также не совпадать с тем, что известно для изолированных митохондрий. Например, во время активности коры головного мозга или спинного мозга цитохром aaQ не восстанавливается, а становится более окисленным (107, 108). Все это свидетельствует, с какой осторожностью следует проводить анализ активности дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования в интактной клетке.

Изменения окислительного метаболизма, связанные с восстановлением после нарушенной функции, еще более сложны. Например, во время корковой распространяющейся депрессии и судорожной активности пул пиридиннуклеотидов резко окисляется, что предполагает истощение энергетических ресурсов клетки. Но величина этой оксидации существенно больше, чем можно было бы ожидать из экстраполяции потерь внутриклеточного К+ и оксидации НАДН, вызванной электростимуляцией средней силы (126). Окислительно-восстановительные изменения цитохромов в этих же условиях значительно отличаются от реакции НАДН. Цитохромы .в,с, и аа3 окисляются при распространяющейся депрессии. Однако, при судорожной активности цитохром аад становится более восстановленным (107). Тем не менее, эта восстановленность только качественно совпадает с ответом изолированных митохондрий при переходе из стационарного состояния 4 к состоянию 3, так как объем ее значительно больше и свидетельствует о связи с другой причиной. Более того, окислительно-восстановительные ответы цитохро-ма аа3 могут меняться с возрастом животного (157). У молодых крыс (4-5 мес.) на фоне вызванных ответов и во время корковой распространяющейся депрессии происходит окисление цитохрома аа3. У старых же животных (24-25 мес.), имеющих такой же исходный уровень цитохрома аа3, вызванные ответы сопровождаются его окислением, а корковая распространяющаяся депрессия - восстановлением.

Одной из причин описываемых несоответствий со сложившимися представлениями о редокс-изменениях дыхательных переносчиков в изолированных митохондриях может быть компенсаторная смена метаболических потоков, питающих дыхательную цепь, которая возможна в клетке. Так, при длительном, (более 10 мин.) сокращении мышцы в условиях высокой частоты стимуляции (10 Гц) происходит, по-видимому, изменение путей обеспечения субстратами, регулятором чего является переход дыхательной системы митохондрий без снижения эффективности сокращения в новое стационарное состояние, характеризующееся более высокой степенью восстановленности пиридиннуклеотидов и флавопротеидов (4,5).

Смена метаболической регуляции может наблюдаться и в более узких временных интервалах. Так, если частота раздражения не превышает I Гц, мышца отвечает на него увеличением дыхания и медленными фазными переходами по Чансу (окисление - восстановление) дыхательных переносчиков . Однако, при увеличении частоты свыше 1,5 Гц появляется дополнительный быстрый сигнал (30 с) на включение раздражителя (торможение дыхания - восстановление НАД(Ф)Н)и на его выключение (усиление дыхания - окисление пиридиннуклеотидов).

Эти факты свидетельствуют о том, что в условиях реализации специфической функции в клетке может происходить быстрая мобилизация ее внутренних резервов по ходу деятельности, направленная на обеспечение и поддержание оптимального уровня функциональной активности.

Все это вместе взятое убедительно доказывает, что проблема регулирования энергетического обмена в интактной клетке не может решаться только по аналогии с изолированными митохондриями, а требует своего самостоятельного рассмотрения.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Романова, Вера Евгеньевна

- 148 -ВЫВОДЫ

1. Разработан оптимальный режим работы с тканевыми препаратами, используемыми в качестве модели для испытания ХС, учитывающий наличие переходного адаптационно-компенсаторного периода. Разработана методология исследования действия ХС на тканевых препаратах и клеточных системах in vitzo .

2. Установлено принципиальное сходство действия различных ингибиторов дыхательной цепи на окислительный метаболизм тканевых препаратов и изолированных митохондрий, позволяющее рекомендовать ингибиторный анализ для оценки состояния и активности различных участков дыхательной цепи на тканевых моделях, в том числе:

- относительного вклада НАД-зависимого и сукцинатзависимо-го окисления;

- направления и интенсивности метаболических потоков в клетке;

- транспорта ионов;

- соотношения митохондриального и немитохондриального дыхания.

3. Показано, что ингибиторный анализ, проводимый на тканевых препаратах, позволяет выявлять специфические изменения состояния различных участков дыхательной цепи при внешних воздействиях (модель гипотермии, голодание, гипоксия).

4. Впервые установлено, что в условиях сниженного р02 в тканевых препаратах мозга задолго до ингибирования цитохромок-сидазы происходит трансформация активности различных участков дыхательной цепи, выражающаяся в подавлении НАДН-оксидазной активности, компенсаторной активации сукцинатоксидазного окисле

- 149 ния и увеличении немитохондриальной компоненты дыхания.Степень этих изменений определяет индивидуальную чувствительность организма к кислородной недостаточности.

5. Показана возможность использования тканевых препаратов для оценки влияния ХС на НАДН-оксидазный и сукцинатоксидазный путь окисления и выявления количественных различий в этих эффектах.

6. Установлено наличие прямой зависимости между токсичностью ХС и степенью ингибирования ими дыхания, позволившее составить алгоритмы для прогнозирования и экспресс-оценки токсического действия ХС в условиях in vitw.

7. Разработаны алгоритмы для первичного скрининга ХС на тканевых препаратах (оценка безопасности ХС для энергопродуци-рующей системы, выявление ингибиторов НАДН-оксидазного и сукци-натоксидазного путей окисления) и углубленных испытаний (изучение действия ХС на функцию дыхательной цепи при изменении функционального состояния ткани, изучение влияния ХС на митохондри-ально-немитохондриальные взаимодействия).

- 144 -ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное исследование, осуществленное в соответствии с целью работы, сформулированной во введении, и вытекающими из нее практическими задачами, показало принципиально качественную однозначность в изменении параметров дыхания и редокс-превраще-ний дыхательных переносчиков в тканевых и клеточных препаратах и изолированных митохондриях. На основании впервые проведенного комплексного динамического исследования параметров окислительного метаболизма тканевых полосок и клеток (срезы мозга и печени, изолированные гепатоциты) показана возможность их применения в качестве биологических моделей для оценки состояния митохондриальной дыхательной цепи в условиях In vitto , а также определены условия оптимального режима их работы. Впервые продемонстрировано использование ингибиторного анализа на тканевых и клеточных препаратах для оценки электронтранспортной функции различных участков дыхательной цепи и относительного вклада метаболических потоков, обеспечивающих ее восстановительными эквивалентами. Установлено, что окислительная мощность различных участков дыхательной цепи, а также их относительная активность тесно сопряжены с функциональным состоянием ткани и отражают самые различные внешние воздействия. Таким образом, показано, что ингибиторный анализ является тонким инструментом для оценки внутриклеточной локализации наблюдаемых изменений, связанных с окислительным метаболизмом ткани. Практическое его применение в работе позволило установить ряд принципиально новых моментов:

I. Сохранение в тканевой (клеточной) системе регуляторных механизмов, обеспечивающих относительное восстановление и стабилизацию энергетического обмена в процессе переживания препаратов

- 145 -и при внешних воздействиях.

2. Трансформацию активности различных участков дыхательной цепи в условиях снижения рО^, которая проявляется задолго до ингибирования цитохромоксидазы и выражается в неспецифическом подавлении НАДН-оксидазной активности, компенсаторной активации сукцинатоксидазного пути окисления и увеличении немитохондриаль-ной компоненты дыхания.

3. Наличие индивидуальной чувствительности животных к кислородной недостаточности, определяемой инактивацией НАД-зависи-мого участка дыхательной цепи и компенсаторным усилением шунтирующих метаболических потоков, направленных на поддержание ее энергообразующей способности при низких рО^. Установленные особенности работы дыхательной цепи в условиях кислородной недостаточности являются основой для составления рекомендаций по оптимизации энергетического статуса клетки при гипоксии и поиска антигипоксантов.

Высокая чувствительность и информативность регистрируемых параметров, коррелирующих с функционально-метаболическим статусом клетки, позволяет искать подходы для их использования и практического применения при отборе веществ, обладающих биологической активностью.

Предложенная в работе методология исследования действия ХС на дыхательную цепь в тканевых и клеточных препаратах, а также разработанные критерии оценки состояния дыхательной цепи в них при различных функциональных состояниях, были положены в основу трех тест-систем для первичных и углубленных испытаний БАВ, а также прогноза их токсичности и безопасности в эксперименте 1Я Vit^D .

Первичные испытания ХС по параметрам окислительного метабо

- 146 лизма включают прогнозирование общей токсичности ХС на организм, а также установление их влияния на энергетический аппарат клетки, в том числе и возможность их неспецифического взаимодействия с начальным (субстратным) участком дыхательной цепи. Для всех этих случаев разработаны алгоритмы проведения экспресс-экспериментов, основанные на полярографическом измерении дыхания тканевых препаратов при титровании нарастающими концентрациями ХС. Наличие двухканальной полярографической установки, на которой одновременно производится регистрация дыхания тканевых препаратов, окисляющих НАД-зависимые субстраты и сукцинат, и действие на него испытываемых веществ, обеспечивает получение данных, необходимых для заключения о свойствах вещества в системе первичного отбора по параметрам окислительного метаболизма.

Высокая экономичность и продуктивность предлагаемых экспресс-тестов достигаются благодаря использованию одних и тех же параметров (дыхания) на одном и том же объекте (препарат мозга, 60 мин., 36,5°) и однозначной схемы последовательности проведения эксперимента. Первичные испытания, проводимые с помощью двухканальной полярографической измерительной системы, позволяют одному оператору обследовать в условиях скрининга более 1000 веществ в год. Так как используемый принцип потенциометрической регистрации дыхания основан на получении результирующего электрического сигнала, метод может быть введен в линию автоматического управления скрининга БАВ с обработкой сигнала на электронно-вычислительной машине. Очевидно, что с увеличением числа измерительных каналов производительность работы будет также увеличиваться. Один квалифицированный оператор может управлять четы-рехканальной системой.

Углубленные испытания ХС по параметрам окислительного мета

- 147 болизма включают: I) полную оценку влияния ХС на активность различных участков дыхательной цепи; 2) изучение тонких механизмов действия ХС на функцию дыхательной цепи; 3) изучение влияния ХС на немитохондриальные кислородзависимые процессы и их взаимодействие с основной дыхательной цепью. Они предполагают не только использование всего арсенала возможностей, которые заключает в себе ингибиторный анализ (подробно см.раздел 3), но и расширение методической базы сбора информации, необходимое для установления молекулярных механизмов действия ХС, прошедших первичные испытания, на окислительный метаболизм. Так, например, на уровне углубленных испытаний целесообразно иметь комплексную регистрацию параметров окислительного метаболизма (полярографическую регистрацию дыхания и флуоресцентную регистрацию редокс-изменений дыхательных переносчиков (ПНН и ФП) в тканевых препаратах). При поиске регуляторов того или иного метаболического процесса в качестве дополнительного приема возможно использование функциональных моделей, воспроизводящих, в том числе, и патологические состояния.

Система первичного отбора ХС и их углубленных испытаний шиv роко используется коллективом отдела функциональной биоэнергетики НИИ по БМХС для оценки безопасности ХС для ключевых процессов окислительного метаболизма, в том числе и энергетического аппарата и его регуляцию; при получении прогноза влияния ХС на метаболические потоки и их интенсивность; при поиске антигипоксантов и регуляторов энергетического обмена.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Романова, Вера Евгеньевна, 1984 год

1. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука,1975.

2. Дудченко A.M. Активность ферментов митохондрий и содержание метаболитов энергетического обмена в коре головного мозга крыс, обладающих различной чувствительностью к гипоксии. -Канд.дис., М., 1975, с.201.

3. Борзов Д.Б. Окисление и восстановление пиридиннуклеотидов митохондрий янтарной кислотой при торможении дыхательной цепи. Канд.дис., Пущино, 1978, 124 с.

4. За. Загоскин П.П., Хватова Е.М., Лукьянова Л.Д. Механизм действия нейролептиков фенотиазинового ряда на транспорт электронов и окислительное фосфорилирование в митохондриях. Химико-фармацевтический журнал, М.: Медицина, 1977, с.53-56.

5. Зинченко В.П. Изменение люминесценции пиридиннуклеотидов мышечной клетки в ответ на кратковременную стимуляцию.

6. В кн.: Биофизика живой клетки, т.З, Пущино: 1972, с.76-80.

7. Зинченко В.П. Прижизненное исследование пиридиннуклеотидов и флавопротеидов мышцы. Канд.дис., Пущино, 1975. 135 с.

8. Карнаухов В.Н. Люминесцентный спектральный анализ клетки. М.: Наука, 1978. 207 с.

9. Карнаухов В.Н., Зинченко В.П. Люминесцентные спектральные исследования путей терминального окисления при изменении функциональной активности одиночной мышечной клетки. "Цитология", 1971, т.13, с.1243-1249.

10. Карнаухов В.Н., Лукьянова Л.Д., Хаспеков Л.Г. и др. Динамика окислительно-восстановительных состояний срезов КГМ.

11. В кн.: Биофизика живой клетки, т.З, Пущино, 1973, с.118-123.- 151

12. Карнаухов В.Н., Кулаков В.И., Мельникова Е.В.,Яшин В.А. Микрофлуориметр на базе стандартных деталей и узлов. Цитология, 1968, т.10, № 5, с.675-694.

13. Колесова Г.М., Ягужинский Л.С. Ингибиторы начального участка дыхательной цепи. Взаимодействие ротенона с НАДН-дегидрогена зой митохондрий. В кн.: Митохондрии. М.: Наука, 1974, с.78-51.

14. Юа. Кометиани З.П. В сб.: Вопросы нейрохимии. Л., 1977.

15. Кондрашова М.Н. Метаболические состояния митохондрий и основные физиологические состояния живой ткани. В кн.: Свойства и функции макромолекул и макромолекулярных систем. М.Наука, 1969, с.135-139.

16. Кондрашова М.Н. Регуляция дыхания при усиливающемся воздействии на клетку. Биофизика, 1970, т.15, с.312-317.

17. Кондрашова М.Н. Градации метаболических состояний митохондрий и реактивность ткани. В кн.: Митохондрии. М.: Наука, 1971, с.24-40.

18. Кондрашова М.Н. Принципиальные преимущества полярографического изучения дыхания перед манометрическим. В кн.: Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом. Пущино, 1973, с.86-92.

19. Кондрашова М.Н. Основные понятия биоэнергетики, используемые в функциональных исследованиях. В кн.: Регуляция энергетического обмена и устойчивость организма. Пущино: 1975,с.67-82.

20. Кондрашова М.Н. Выясненные и наметившиеся вопросы на пути исследования регуляции физиологического состояния янтарной кислотой. В кн.: Терапевтическое действие янтарной кислоты, Пущино, 1976, с.8-30.- 152

21. Кондрашова М.Н., Маевский Е.И., Бабаян Г.В. и др. Адаптация к гипоксии посредством переключения метаболизма на превращение ЯК. В сб.: Митохондрии. Биохимия и структура. М., Наука, 1973, с.112-129.

22. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974. 957 с.

23. Лукьянова Л.Д. Окислительный метаболизм и реактивность нервной ткани в переживающих препаратах и в условиях целостного организма. Докт.дис., М., 1971. 365 с.

24. Лукьянова Л.Д. Закономерности регуляции окислительно-восстановительных превращений в тканях во время аноксии и в восстановительный после нее период. В кн.: Биохимия гипоксии, Горький: Мед.ин-т, 1975, с.22-26.

25. Лукьянова Л.Д., Попова О.А., Романова В.Е. и др. О факторах, влияющих на регуляцию процессов биологического окисления в тканевых препаратах. В кн.: Регуляция энергетического обмена и физиологическое состояния организма. М.: Наука, 1978,с.90-101.

26. Лукьянова Л.Д., Хаспеков Л.Г., Папулова Л.М. Дыхательные осцилляции и метаболизм изолированной нервной ткани в состоянии покоя и при электростимуляции. "Биофизика", 1971,т.65, с.872-877.

27. Лукьянова Л.Д., Балмуханов Б.С., Уголев А.Т. Кислород-зависимые процессы в клетке и ее функциональное состояние. М.:1. Наука, 1982.24а. Л абори А. Регуляция обменных процессов. М.: Медицина, 1970.

28. Михлин Д.М. Биологическое окисление. М., 1956.

29. Смирнова Е.Г., Ягужинский Л.С., Азаренкова Н.М. Гидрофобные ингибиторы дыхательной цепи митохондрий. В кн.: Митохондрии. М.: Наука, 1972, с.75-77.

30. Ягужинский Л.С. Изучение действия неспецифических ингибиторов на полиферментные системы. В кн.: Тканевое дыхание в норме и патологии. М.: Наука, 1978, с.47.

31. Ягужинский Л.С. Ингибиторный анализ на митохондриях -В кн.: Структура и функция ферментов. М.: Изд-во МГУ, 1973,с.106-132.

32. Ягужинский Л.С., Колесова Г.М., Ложкин Б.Г. Взаимосвязь между поверхностно-активными свойствами ароматических соединений и их способностью ингибировать электронный транспорт в митохондриях. Докл. АН СССР, 1972, т.205, № 5, с.1001-1004.

33. Ягужинский Л.С., Смирнова Е.Г., Ратникова Л.А. и др. Гидрофобные площадки ферментов начального участка электронно-транспортной системы митохондрий. Докл. АН СССР, 1972, т.205, № 3, с.734-737.

34. Berry M.N. Energy-dependent reduction of pyruvate to lactate by intact isolated parenchymal cells from rat liver. -Bich. Bioph. Res. Com., 1971, vol.44, p.1449-1456.

35. Berry M.N. Energy demand of endogenous metabolism and gluconeogenesis in liver cells from normal and hyperthyroid rats. Ins Regulation of hepatic metabolism / Eds. F.Lundquist et al. Munsgaard etc. Acad. Press, 1974, p.568-583.

36. Bohnensack R., Kuster U., letko G. Rate-controllingsteps of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. -Biochim. Biophys. Acta, 1982, vol.680, p.271-282.

37. J, Neurochem., 1973, vol.21, p.913-922.45« Bull R.J. Cytochrome redox potential dependence on substrate in rat cerebral cortex slices importance of cytoplasmic NAD(P)H and potassium. J. Neurochem., 1976, vol.26, p.149-156.- 157

38. Burgoa I., Readfearn E.R. The inhibition of mitochondrial reduced nicotinamide adenine dinucleotide oxidation by rotenone. - Biochim. et biophys. acta, 1965, vol.110, p.475-480.

39. Biicher Т., Klingenberg M. Wege des wasser stoffs in der Leben-digen Organisation. Angew. Chem., 1958, vol.70, p.552-570.

40. Bucher Т., Sies H. Metabolic interaction of mitochondrial and cytosolic system in rat liver. Ins Cell compartmentation and metabolic channeling / Eds. L.Nover et al. Amsterdam: Horth Holland Biomedical Press, 1980, p.279-302.

41. Chance B. Phosphorylation efficiency of the intact cell. III. Phosphorylation and dephosphorylation in yeast cells. J. Biol. Chem. 1959, vol.234, p.3041-3043.

42. Chance В., Cohen P., Jobsis F. Intracellular oxidation reduction states in vivo. Science, 1962, vol.137, p.499-508.

43. Chance В., Connelly C.M. A method for the estimation of the increase in concentration of adenosine diphosphate in muscle sarcosomes following a contraction. Nature, 1957, vol.179, p.1235-1237.

44. Chance В., Hess B. Metabolic control mechanisms. III. Kinetics of oxygen utilization in ascites tumor cells. In the same place, 1959b, p.2416-2420.- 158

45. Chance В., Hess В. Metabolic control mechanisms. IV. The effect of glucose upon the steady state of respiratory enzymes in the ascites cell. In same place, 1959c, p.2421-2427.

46. Chance В., Hollunger G. The Interaction of energy and Electron Transfer Reactions in Mitochondrie. VI. The efficiency of the reaction. J. Biol. Chem., 1961, vol.236, n 5, p.1577-1584.

47. Chance В., Hollunger G. Jngibition of electron and energy transfer in mitochondria. I. Effect of amytal, thiopental, rotenone, progesterone, and methylene glycol. J. Biol. Chem., 1963, vol.238, p.418-431.

48. Chance В., Hollunger G. Inhibition of electron and energy transfer in mitochondria. II. The site and the mechanism of quanidine action. J. Biol. Chem.,1963, vol.238, p.432-438.

49. Chance В., Hollunger G., Hagihara B. Inhibition of energy transfer at the pyridine mucleotide.- flavin site. Biochem. and Biophys. Res. Communs, 1962, vol.8, H 3, p.180.

50. Chance В., Mauriello F., Aubert X.M. ADP arrival at muscle mitochondrie following a twitch. Ins Muscle as a tissue /ed. K.Rodahl. New York; Londons McGraw-Hill, 1962, p.128-133.

51. Chance В., begallais V. Differential microfluorimetr for the localization of reduced pyridine nucleotide in living cells. -Rev. Sci. Instr.,1959, vol.30, p.732-735.

52. Chance В., Schoner В., Krejci R. Kinetics of fluorescence and metabolite changes in rat liver during a cycle of ischemia. -Bioch. Z., 1965, vol.341, p.325-333.

53. Chance В., Williams G. Respiratory Enzymes in Oxidative Phosphorylation. I. Kinetic of Oxygen Utilization. J. Biol. Chem., 1955, vol.217, p.383-393.- 159

54. Chance В., Williams G. Respiratory Enzymes in Oxidative Phosphorylation. J. Biol. Chem., 1955, vol.217, p.409-427.

55. Chance В., Williams G.R. A method for the localization of sites for oxidative phosphorylation. Nature, 1955a, vol.176, p.250-255.

56. Chance В., Williams G.R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. J. Biol. Chem., 1955b, vol.217, p.409-427.

57. Chance В., Williams G.R. The Respiratory Chain and Oxidative phosphorylation. Adv. Enzymol, 1956, vol.17, p.65-134.

58. Chance В., Williams G.R., Gamieson D. et al. Properties and kinetics of reduced pyridine nucleotide fluorescence of the isolated and in vivo rat heart-Biochem. Z., 1965, vol.341, p.357-377.

59. Chappell J.B. The effect of alkylguanidines on mitochondrial metabolism. J. Biol. Chem., 1963, vol.238, p.410-417.

60. Chappell J.B. The effect of 2,4-dinitrophenol on mitochondrial oxidations. Biochem. J., 1964, vol.90, p.237-248.

61. Cinti D.L., Ritchie A., Schenkman J.B. Kinetic parameters of2+drug metabolizing enzymes in Cu -sedimented micirocomes from rat liver. Biochem. Pharm., 1972, vol.21, p.3249-3256.

62. Cowger M.L., Lable R.P., Mackler B. Relation of barbiturate structure to DPNH-oxidase inhibition. Arch, biochem. and Biophys.,1962, vol.96, p.583-590.

63. Cummins G.T., Bull R. Spectrophotometric measurements of metabolic responses in isolated rat brain cortex. Biochim. Bio-phys Acta, 1971, vol.253, p.29-38.

64. Danielson L., Ernster L. Lack of relationship between mitochondrial oxidative phosphorylation and the dicoumarol-sensi-tive flavoenzime "DT-diaphoraseH or Vitamin К reductase. Nature, 1962, vol.194, p.155-157.

65. Davis E.J., Davis-van Thienen W.J.A. Control of mitochondrial metabolism by the ATP/ADP ratio. Bioch. Bioph. Res. Com., 1978, vol.83, p.1260-1266.

66. Davis E.J., Lumeng L., Bottons D. On the relation ships between the stoichiometry of oxidative phosphorilation and the phosphorilation potential of rat liver mitochondria as functions of respiratory state. PEBS Lett., 1974, vol.39, H 1, p.1-123.

67. Davis E.J., Lumeng L. Relationships between the Phosphorylation Potentials Generated by Liver Mitochondria and Respiratory State under Conditions of Adenosine Diphosphate Control. -J. Biolog. Chem. 1975, v.250, p.2275-2282.

68. De Duve C., Wattiaux R., Baudhuim P. Distribution of enzymes between subcellular fractions in animal tissues. Advances in Enzymology, 1962, vol.24, p.291-358.

69. Erecinska M., Davis J.S., Wilson D.F. Regulation of respiration in Paracoccus denitrificans: The dependence on redox state of cytochrome с and ATpJ /&DPj fpij • Arch. Bioch. Biophys., 1979, vol.197(2), p.463-469.

70. Erecinska M., Kula Т., Wilson D.F. Regulation of energy metabolism. Evidence against a primary role of adenine nucleotide translocase. PEBS Letters 1978, vol.87, p.139-144.

71. Erecinska M., Stubbs M., Miyata Y. et al. Regulation of metabolism by intracellular phosphate. Bioch. Biophys. Acta, 1977, vol.462, p.20-35.

72. Erecinska M.t Wilson D. On the mechanism of regulation of collular respiration. The dependence of respiration on the cytosolic concentration ATP, ADP, Pi. Adv. exper. med. biol., 1978, vol.94, p.271-278.

73. Ernster L., Dallner G., Azzone G.P. Comparison of the effect of rotenone and amytal on mitochondrial electrone and energy transfer and titration of the respiratory chain with rotenone. Biochem. and Biophys. Res. Commun, 1963, vol.10, p.1-23.

74. Ernster L., Dallner G., Azzone G.P. Differential effects of rotenone and amytal on mitochondrial electron and energo transport. J. Biol. Chem., 1963, vol.238, N 3, p.1124.

75. Ernster L., Jailing 0., Low H. et al. Alternative pathways of mitochondrial DPNH oxidation, studied with amytal. -Exper. cell Res. Suppl., 1955, vol.3, p.124-132.

76. Freeman K.B., Haldar D. The inhibition of HADH oxidation in mammalian mitochondria by chloramphenical. Biochem. and Biophys. Res. Commun, 1967, vol.28, p.8-12.

77. Gellerich F.H., Bohnensack R., Kunz W. Control of mitochondrial respiratory. Biochim. Biophys. Acta, 1983, vol.722, p.381-391*

78. Graholm L., Lukjanova b., Siesjo B.K. The effect of masked hyperventilation upon tissue levels of NADH, lactate, pyruvate, phosphocreatine and adenosine phosphates of rat brain. -Acta physiol. Scand., 1969, vol.77, p.179-190.

79. Groen A.K., Van der Meer R., Westerhoff H.V. et al. Control of metabolic fluxes. In: Metabolic compartmentation / Ed. H.Sies, London: Acad. Press, 1982, p.9-37.

80. Groen A.K., Wanders R.J.A., Westerhoff H.V. et al. Quatification of the cpntribution of various steps of the control of mitochondrial respiratory. J. Biol. Chem., 1982, vol.257,p.2754-2757.- 162

81. Gutman M., Kearney E.B., Singler T.P. Multiple control mechanisms for succinate dehydrogenase in mitochondria. Biochem. Biophys. Res. Com., 1971, vol.44, N 3, p.526-532.

82. Hassinen L.E., Hiltunen K. Respiratory control in isolated perfused rat heart. Biochim. Biophis. Acta 1975, vol.408, p.319-330.

83. Hempel F.G., Jobsis F.F., Manna Y.L. et al. Oxidation of cerebral cytochrome AA^ by oxygen plus CO at hyperbaric pressures. J. Appl. Physiol., 1977, vol.43, p.873-879.

84. Hems R., Stubbs M., Krebs H.A. Restricted permeability , of rat liver for glutamate and succinate. Biochem. J., 1968,vol.107, p.87-815»

85. Hersey S.Y. Interactions between oxidative metabolism and acid secretion in gastric mucosa. Biochim. Bioph. Acta, 1974, vol.344, p.157-203.

86. Hess В., Chance B. Phosphorylation efficiency of the intact cell. I. Glucose-oxygen titration in ascites tumor cells. -J. Biol. Chem., 1959, vol.234, II, p.3031-3035.

87. Hodgkin A.L., Keynes R.D. Active transport of cations in giant axons from Sepia and Loligo. J. Physiol., 1955, vol.128, p.28-33.

88. Hokin L.E. The sodium potassium adenosinetriphospha-tase. - Metabolic transport, 1972, vol.6, p.270-317.

89. Holton F.A., Hulsmann W.C., Mgerls D.K. et al. A comparison of the properties of mitochondria isolated from liver and heart. Biochem. J., 1957, vol.67, p.579-594.

90. Horgan D.G., Singer T.P. Characteristics of the binding of rotenone in the respiratory chain and the inchibition sites of amytal and piericidin A. Biochem. J., 1967, vol.104, p.1102,50c.- 163

91. Ishinara A., Tanika H., Takeda J. Respiratory control of dispersed rat-liver cells. Biochim. Biophis acta 1965, vol.97, p.1-15.

92. Jailing 0., Lindberg 0., Ernster Li. On the effect of Substituted Barbiturates on Mitochondrial Respiration. Acta Chem. Scand., 1955» vol.9, p.198-199.

93. Jobsis P.P. Spectrophotometrie studies on intact muscle. -J. Gen. Physiol., 1963a, vol.46, p.905-928.

94. Jobsis P.P. What is a molecular sensor? In: Tissue hypoxia and ischemia / Ed. M.Reivich etc., New York; London: Plenum Press, 1977, p.3-18.

95. Jobsis P.P. Duffield Y.C. Oxidative and glycolytic recovery metabolism in muscle. J. Gen. Physiol., 1967, vol.50,p.1009-1047.

96. Jobsis P.P., Rosental M. Behaviour of the mitochondrial respiratory chain in vivo. Ins Ciba Foundation Symposium, 56, Amsterdam; Oxford; New Yorks Elsevier-Excerpta Medica - North -Holland, 1978, p.149-167.

97. Jobsis P.P., Rosental M. Cerebral energy consumption and provisions The pedominance of neuronal oxidative metabolic processes. In: The same place, p.129-144.

98. Jobsis P.P., Stainsby W.N. Oxidation of NADH during Contractions of circulated mammalian skeletal muscle. Resp. Physiol., 1968, vol.4, p.292-300.

99. Jones D.P., Mason H.S. Gradients of Og concentration in Hepatocytes. J. Biol. Chem., 1978, vol.253, p.4874-4880.

100. Kean E.A. Rheins An inhibitor of mitochondrial oxidations. Arch. Biochem. and Biophys., 1968, vol.127, p.528-533.

101. Kilpatrick L., Krecinska M. Mitochondrial respiratory chain of tetrahymena pyriformis. Bioch. Biophys. Acta, 1977, vol.460, p.346-363.

102. Klingenberg I.M., Hafen H. Wege des Wasserstoffs in Mito-chondrien. I. Die Wasserstoffubertragung von Succinat zu Aceto-acetat. Biochem. L.,1963, vol.337, p.120-145.

103. Kohen E. Pyridine nucleotide compartmentalization in glass-grown ascites cell. Exp. Cell Res., 1966, vol.35, p.303-316.

104. Krebs H.A., Cornell N.W., bund P. et al. Isolated liver cells in experimental material. Ins Regulation of hepatic metabolism / Eds. F.Iundquist et al. Munksgaard etc.s Acad. Press, 1974, p.724-750.

105. Krebs H.A., Cornell N.W., Lund P. et al. Some aspects of hepatic energy metabolism. In the same place, p.549-567.

106. Krebs H.A., Eggleston L.V., D'alessandro A. The effect of cuccinate and amytal on the reduction of acetoacetate in animal tissue. Biochem. J., 1961, vol.79, p.537-549.

107. Krebs H.A., Lowenstein J.M. The tricarboxylic acid cycle. Ins Metabolic Pathways,1960, vol.1, p.129-203.

108. Kunz W., Bohmensack R., Bohme G. et al. Relations between extramitochondrial and intramitochondrial adenine nucleotide systems. Arch. Bioch. Bioph.,1981, vol.209, p.219-229.

109. Kuster V., Bohmensack R., Kunz W. Control of oxidative phosphorylation by the extramitochondrial ATP/ADP ratio. Bio-chim. Biophys. Acta, 1976, v.440, p.391-402.

110. Lubbers D.W., Kessler M., Sholz R. et al. Cytochrome reflection spectra and fluorescence of the isolated, perfused, hemoglobin free rat liver during a cycle of anoxia. - Biochem. L., 1965, v.341, p.346-350.

111. Lothman E., La Manna J.C., Cordingley G. et al. Responses of electrical potential, potassium levels and oxidative metabolic activity of the cerebral neocortex of cats. Brain Res., 1975, vol.88, p.15-36.

112. Lukjanova L., Bures I. Changes in pOg due to spreading depression of the rat. PhysiJl. Bohemoslovenica, 1967, vol.16, p.449-454.

113. Mandel I.J,, Moffet D.P., Jobsis P.P. Redox state of respiratory chain enxymes and potassium transport in silkwormmid-gut. Biochim. Biophys. Acta, 1975, vol.408, p.123-134.

114. Mapes J.P., Harris R.A. On the oxidation of succinate by parenchymal cell isolated from rat liver. PEBS Lett., 1975, vol.51, N 1, p.80-83.- 166

115. Margreth A., Azzone G.F. A study of respiration in fluo-roacetate-poisened muscle preparation. Biochem. J., 1964, vol.92, p.73-81.

116. Martins C. Alternative pathways of electron transport. -In; Civa Pondat. Sympos. Regulat. Cell Metabolism. London, 1955, 194.

117. Mastubara Т., Tochino Y. Inhibitory action of cyanide on aniline hydroxylase system. PEBS Lett., 1975, vol.52, p.77.

118. Mastubara Т., Tochino Y. Modification by cyanide on the aniline-binding reaction with cytochrome P-450. Arch. Biochem. and Biophys., 1976, vol.172, p.696-705.

119. Mcllwain H. Membrane functioning in preparations from the mammalian brain. Bioch. Brit. Med. Bull., 1968, vol.24, p.174-179.

120. Mcllwain H., Bachelard H.S. Biochemistry and the central nervous system. London: Churchill-Livingstone,1971, p.280.

121. Mills E., Jobsis P.P. Mitochondrial respiratory chain of carotid body and chemoreceptor changes in oxygen tension. -J. Neurophysiol. 1972, vol.35, p.405-428.

122. Minakami S., Kakinuma K., Yoshikawa H. The control of respiration in brain slices. Bioch. Bioph. Acta, 1963, vol.78, p.808-811.

123. Misra M.P., Pridovich I. The univalent reduction of oxygen by reduced flavins and quinones. J. Biol. Chem., 1972, vol.247, p.188-192.

124. Moldeus P., Grundin R., Vadi H. et al. A study of drug metabolism linked to cytochrome P-450 in isolated rat-liver cells.-Eur. J. Biochem., 1974, vol.46, p.351-360.

125. Nishiki K., Erecinska M., Wilson D. Energy relation between cytosolic metabolism and mitochondrial respiration in isolated perfused rat heart under various work leads. Am. J. Physiol., 1978, vol.234, p.C73-C81.- 167

126. Nishiki K.N., Erecinska M., Wilson D.F. Effect of amytal on metabolism of perfused rat heart. Am. J. Physiol., 1979, vol.6(3), p.C221-C230.

127. Pumphrey, Readfearn E.R. Inhibition of succinate oxidation by barbiturates in tightly coupled mitochondria. Biochim. et biophys. acta, 1963, vol.74, К 3, p.317-327.

128. Purshottam Т., Chosh N. Effect of acetazolamide (Diamox) at different dose levels on survival time of rats on survival time of rats under acute hypoxia and on HA+-K+ ATPase activity ofrat tissues microsomes. Aerospace Med., 1972, vol.43, N 6, p.610.

129. Ramirez J. Oxidation-reduction changes of cytochromes following stimulation of amphibian cardiac muscle. J. Physiol., 1959, vol.147, p.14-19.

130. Rasmussen V.E. The energy requirement for activation of succinate metabolism.in intact heart mitochondria. FEBS Lett., 1972, vol.21, p.173-178.

131. Rosenthal M., La Manna J.C. Effect of ouabain and phe-barbital on kinetics of cortical metabolic transient associated with evoked potentials. J. Neurochem., 1975, vol.24, p.111-116.

132. Seglen P.O. Preparation of isolated rat liver cells. -In: Methods cells biology, 1976, vol.13, p.29-83.

133. Scholz R., Thurman R.G., Williamson J.R. et al. Flavin and pyridine nucleotide oxidation-reduction changes in perfused rat liver. J. Biol. Chem., 1969, vol.244, p.2317-2324.- 168

134. Siekevitz P., Low H., Ernster L., Lindberg 0. On a possible mechanism of the adenosine triphosphatase of liver mitochondria. Biochem. and biophys. acta, 1958, vol.29, p.378-380.151• Siesjo Bo K. Brain Energy metabolism. 1978.

135. Siess E.A., Wieland O.H. Phosphorylation state of cyto-solic and mitochondrial adenine nucleotides and of pyruvate de-hudrogenase in isolated rat liver cells. Bioch. J., 1976, vol.156, p.91-102.

136. Snow T.R., Wechsler A.S., Jobsis P.P., et al. Response of cytochrome a-a^ in the in situ canine heart. Fed. Proc., 1977, vol.36, p.518.

137. Soboll S., Scholz R., Heldt W. Subcellular metabolite concentrations Dependence of mitochondrial and cytosolic ATP- Systems on the metabolic state of perfused rat liver. Eur. J. Biochem., 1978, vol.87, p.377-390.

138. Stubbs M., Veech R.L., Krebs H.A. Control of the redox state of the nicotinamide-adenine dinucleotide couple in rat liver cytoplasm. Biochem. J., 1972, vol.126, p.59-65.

139. Stubbs M., Vignais P.V., Krebs H.A. Is the adenine nucleotide translocator rate-limiting for oxydative phosphorylation? Biochem. J., 1978, vol.172, p.333-342.

140. Sylvia A.L., Rosenthal M. Age-dependent differences in cytochrome a, a^ redox activities associated with evoked potential and spreading cortical depression. Physiologist, 1978, vol.20, p.93-97.

141. Tager J.M., Wanders R.J.A., Groen A.K. et al. Control of mitochondrial respiration. PEBS, 1983, vol.151, p.1-9.

142. Tischler H.E., Fridrichs D., Coll K. et al. Pyridine nucleotide distributions and enzime mass action ratious hepatocytes from fed and starved rats. Arch. Biochem. and Biophys., 1977, vol.184, p.222-236.

143. Veech R.L., Raijman L., Krebs H.A. Equilibrium relations between the cytoplasmic adeninnucleotides system and nicotinamide-adenine nucleotide system in rat liver. Biochem. J., 1970, vol.117, p.499-503»

144. Van Rossum G.S. Observation on respiratory pigments in slices of avian salt gland. Bioch. Bioph. Acta, 1965, vol.110, p.221-236.

145. Van Rossum G.D.V. Observation on respiratory pigments in slices of avian salt gland and rat livers. II. Evidence for reverse of electron transfer. Bioch. Bioph. Acta, 1965, vol.110, p.237-248.

146. Whitmer J.Т., Idell-Wenger J.A., Rovetto M.J. et al. Control of fatty acid metabolism in ischemic and hypoxic hearts.-J. Biol. Chem., 1978, vol.253, p.4305-4309.

147. Wilson D,F., Stubbs P., Veech R. et al. Equilibrium relations between the oxidation reduction reactions and the adenosine triphosphate synthesis in suspensions of isolated liver cells. Biochem. J., 1974, vol.140, p.57-64.

148. Wilson D.F., Stubbs M., Oshino N. et al. Thermodynamic relationship between mitochondrial oxidation reduction reactions and cellular ATF levels in ascites tumor cell and perfused rat liver. - Biochemistry, 1974, v.13, p.5305-5311.

149. Wittam R., Blond D.M. Respiratory control by an adenosine triphosphatase level in active transport in brain cortex. -Biochem.,J,,1964, vol.92, p.147-160.