Кинетика восстановления солей тетразолия суспензированными в физиологическом растворе бактериями-органотрофами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Гурский Николай Васильевич

• Гурский Николай Васильевич
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Гурский Николай Васильевич

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Соли тетразолия. Строение, свойства, применение

1.2. Формазаны. Строение, свойства, применение

1.3. Применение тетразолиевых индикаторных систем в биологических 34 исследованиях

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Используемые приборы

2.2. Материалы и объекты исследования

2.2.1. Материалы исследования

2.2.2. Скрининг бактерий для кинетических исследований

2.2.3. Краткая характеристика выбранных тест-организмов

2.2.4. Подготовка посуды и суточных культур бактерий

2.3. Методика проведения кинетических исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Кинетика восстановления йоднитротетразолия хлорида бактериальными клетками, суспензированными в физиологическом растворе. Влияние видовых и морфологических различий бактерий на скорость восстановления

3.2. Тетразолиевый метод определения константы конкурентного обратимого ингибирования нативной сукцинатдегидрогеназы

3.3. Влияние природы соли тетразолия на эффективные кинетические параметры восстановления суспензированными в физиологическом растворе бактериями

3.4. Обсуждение результатов 95 ВЫВОДЫ 102 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат;

БФСТ - 2-(2-бензотиазолил)-3-(4-фтальгидразидил)-5-стирил-2Н-тетразолия хлорид;

ВЗМО - высшая занятая молекулярная орбиталь;

ИМФ - йодмоноформазан (1-(4-йодфенил)-5-(4-нитрофенил)-3-фенилформазан);

ИНТ - йоднитротетазолий (2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенил-2Н-

тетразолия хлорид);

КОЕ - колониеобразующие единицы;

МК - малоновая кислота;

МПА - мясопептонный агар;

МСТ - мультисубстратное тестирование;

МТТ - метилтиазолилтетразолий (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия бромид);

МТФ - метилтиазолилформазан (1-(4,5-диметил-2-тиазолил)-3,5-дифенилформазан);

НАДН - никотинамидадениндинуклеотид; НСМО - низшая свободная молекулярная орбиталь;

НСТ - нитросиний тетразолий (3,3'-(3,3'-диметокси-4,4'-бифенилилен)-бис-(2-и-нитрофенил-5-фенил-2Н-тетразолия хлорид));

НТ - неотетразолий (3,3'-(4,4'-бифенилилен)-бис-(2,5-дифенил)-2Н-тетразолия хлорид);

ПАВ - поверхностно активное вещество; ПТГ - паратиреоидный гормон;

СТ - синий тетразолий (3,3'-(3,3'-диметокси-4,4'-бифенилилен)-бис-(2,5-дифенил-2Н-тетразолия хлорид));

ТНСТ - тетранитросиний тетразолий (3,3'-(3,3'-диметокси-4,4'-бифенилилен)-бис-(2,5-и-нитрофенил-2Н-тетразолия хлорид));

ТФ - тетразолий фиолетовый (2,5-дифенил-3-(1-нафтил)-тетразолия хлорид);

ТФТ - трифенилтетразолий (2,3,5-трифенилтетразолия хлорид); ТФФ - трифенилформазан (1,3,5-трифенилформазан); ФАД - флавинадениндинуклеотид; ФМН - флавинаденинмононуклеотид;

ФТМФТ - 2-фенил-3-(2-тиазолил)-5-(4-метоксифенил)-тетразолия бромид;

ФТНФТ - 2-фенил-3-(2-тиазолил)-5-(4-нитрофенил)-тетразолия бромид;

ЦПЭ - цепь переноса электронов;

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

2-F-Py - 2-фторпиридин;

CTC - 5-циано-2,3-дитолилтетразолия хлорид;

DCM - дихлорметан;

DT-D - менадионредуктаза;

GPO - глицерол-3-фосфатоксидаза;

ICC - внутриклассовый коэффициент корреляции;

POD - пероксидаза;

SRB - сульфородамин B (2-(3-диэтиламино-6-диэтилазанамилиден-ксантен-9-ил) -5-сульфобензолсульфонат);

WST-1 - водорастворимая соль тетразолия 1 (5-(2,4-дисульфофенил)-2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-2H-тетразолий);

WST-8 - водорастворимая соль тетразолия 8 (5-(2,4-дисульфофенил)-3-(2-

метокси-4-нитрофенил)-2-(4-нитрофенил)-2H-тетразолий);

XTT - 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2Н-тетразолий-5-

карбоксанилид.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетика восстановления солей тетразолия суспензированными в физиологическом растворе бактериями-органотрофами»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Использование солей тетразолия в научных и практических целях основано на их способности к восстановлению с образованием окрашенных формазанов [1, 2]. Впервые возможность применения этих солей для выявления жизнеспособности клеток была продемонстрирована в работах, датируемых первой половиной прошлого столетия [3]. Однако до настоящего времени происходит постоянное совершенствование методик использования солей тетразолия как неселективных индикаторов жизнеспособности клеток и расширение областей их применения [4-28]. Тетразолиевые индикаторы получили распространение в цитологии [10], биохимии [4, 12], медицине [11, 13], агрокультуре [14] и особенно в экологии [1828], что связано с необходимостью постоянного мониторинга состояния воды, почвы, в том числе, после негативных воздействий на окружающую среду техногенных катастроф и природных катаклизмов.

В настоящее время достигнуты определенные успехи в раскрытии взаимосвязи между химией солей тетразолия и основными принципами жизнедеятельности микроорганизмов [6, 7, 21, 29-47]. Однако практическое использование тетразолиевых индикаторов сводится, как правило, к качественному выявлению наличия отклика колоний микроорганизмов или отдельных клеток на индикаторную соль тетразолия [14-24]. Низкая восстановительная способность отдельных микроорганизмов по отношению к солям тетразолия и отсутствие этому достоверных объяснений является сдерживающим фактором для дальнейшего развития тетразолиевых методов анализа жизнеспособности клеток.

Ранее группой исследователей кафедры «Нанотехнологии и биотехнологии» НГТУ им. Р.Е. Алексеева было показано, что методы химической кинетики могут быть успешно использованы для выявления возможных причин различного отклика микроорганизмов на тетразолиевые индикаторы [6, 7, 43, 44]. Было установлено, что эффективная константа скорости кэф восстановления

йоднитротетразолия хлорида (ИНТ) грамположительными бактериями Bacillus subtilis, суспензированными в физиологическом растворе, существенно превышает соответствующие значения, определенные при использовании грамотрицательных бактерий [7, 43]. Был сделан вывод, что определяющим в различиях восстановительной способности бактерий является транспорт соли тетразолия к мембранным сайтам восстановления, которая зависит от строения клеточной стенки [7, 43, 44]. Вместе с тем природное многообразие бактерий-органотрофов, различающихся по морфологии, имеющих особенности в организации электронно-транспортной цепи, требует дополнительных количественных данных для выявления общих закономерностей взаимодействия солей тетразолия с клеточными компонентами бактерий.

Цель работы. Выявление влияния морфологических и видовых различий бактерий, их дыхательной активности, строения тетразолиевого индикатора на эффективные кинетические параметры восстановления солей тетразолия мембранными компонентами суспензированных в физиологическом растворе бактерий.

Для достижения поставленной цели необходимо решение следующих задач:

- скрининг бактерий из числа наиболее распространенных в природе для проведения кинетических исследований;

- выявление влияния формы бактерий на скорость восстановления йоднитротетразолия хлорида;

- установление кинетических различий восстановления ИНТ в ряду бактерий одного рода;

- определение восстановительной способности мембранных компонентов бактерий, суспензированных в физиологическом растворе, по отношению к различным солям тетразолия: 2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенилтетразолия хлорид (ИНТ), 2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТФТ), 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-тетразолия бромид (МТТ);

- выявление роли мембранной электронной транспортной системы бактерий в восстановлении солей тетразолия через ингибирование ключевого фермента -сукцинатдегидрогеназы и количественное определение константы обратимого конкурентного ингибирования нативной сукцинатдегидрогеназы бактерий малоновой кислотой по кинетическим характеристикам восстановления ИНТ.

Научная новизна работы:

- впервые методами химической кинетики показано, что на восстановление ИНТ оказывают влияние морфологические признаки бактерий и видовые особенности в ряду одного рода;

- количественно установлено, что бактерии, суспензированные в физиологическом растворе, обладают различной восстановительной способностью к солям тетразолия в зависимости от природы заместителей в пятичленном цикле;

- впервые определены константы обратимого конкурентного ингибирования малоновой кислотой нативной сукцинатдегидрогеназы бактерий по зависимости обратной начальной скорости восстановления ИНТ от концентрации ингибитора (координаты Диксона).

Теоретическая и практическая значимость работы состоит в количественной оценке влияния природы жизнеспособных бактерий на скорость восстановления различных тетразолиевых индикаторов. Это дает возможность повысить точность и объективность индикаторных тетразолиевых методов.

Методология и методы исследования. Методология исследований основана на фундаментальных понятиях химической кинетики с учетом принципов жизнедеятельности бактерий. В качестве источников информации использованы научные публикации, монографии, справочная литература. Кинетические характеристики получены спектрофотометрическим методом (спектрофотометр - 2802 UV/Vis Unico).

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Определение дифференциальным методом по начальным скоростям общего порядка восстановления ИНТ суспензированными в физиологическом

растворе бактериями сферической формы (Staphylococcus aureus и Staphylococcus xylosus); установление интегральной формы кинетического уравнения, расчет эффективных констант скорости.

2. Выявление кинетических различий восстановления ИНТ суспензированными в физиологическом растворе бактериями рода Bacillus различных видов.

3. Кинетические характеристики восстановления суспензированными в физиологическом растворе бактериями солей тетразолия с различной восстановительной способностью и адсорбционным взаимодействием формазанов с клеточными компонентами бактерий: МТТ, ТФТ.

4. Константы обратимого конкурентного ингибирования нативной сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой в качестве ингибитора.

5. Кинетическая схема ингибирования нативной сукцинатдегидрогеназы, согласующаяся с экспериментальными данными.

Степень достоверности результатов проведенных исследований. Достоверность полученных в работе данных обеспечивается высоким теоретическим и экспериментальным уровнем исследований, воспроизводимостью результатов, их согласованностью с основами жизнедеятельности бактерий, соответствием экспериментальных данных предложенным кинетическим схемам.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы представлены на: Международной молодежной научно-технической конференции «Будущее технической науки» (Н. Новгород, 2017 г., 2019 г.), IX Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2017 г.), LIV Международной научно-практической конференции «Химия, физика, биология, математика: теоретические и прикладные исследования» (Москва, 2021 г.), XIV Всероссийской научно-практической конференции «Наука молодых» (Арзамас, 2021 г.), Международная научно-практическая конференция Общества Науки и Творчества (Казань, 2021 г.).

Личный вклад автора. Автор проводил скрининг бактерий для кинетических исследований, синтез моноформазанов для построения калибровочных зависимостей, кинетические эксперименты и математическую обработку полученных результатов; принимал участие в обсуждении экспериментальных данных, в том числе на конференциях различного уровня, в подготовке к публикации научных статей.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 10 научных работах, из них 4 статьи в журналах из перечня рецензируемых научных журналов по специальности (ВАК, Web of Science и Scopus) и 6 тезисов докладов.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Первые сведения о химии солей тетразолия и формазанов появились почти полтора века назад, когда в 1875 г. Фрис провел реакцию нитрата бензолдиазония с нитрометаном. При этом был получен продукт вишнево-красного цвета «Neue Verbindung» - первый формазан [цит. по 1]. Девятнадцать лет спустя фон Пехманн и Рунге окислили формазан и впервые получили соль тетразолия [48]. В последующие годы были синтезированы и исследованы различные структуры солей тетразолия и формазанов [2, 4, 5, 49-67].

1.1. Соли тетразолия. Строение, свойства, применение

Соли тетразолия представляют собой органические соединения, которые можно рассматривать как кватернизованный тетразол, то есть молекулу тетразола, содержащую четвертичную иминную группу (= N ^ ). Большинство известных солей тетразолия являются производными 2Н-тетразола (1), 1Н-изомеры (2, 3) встречаются реже, что связано с неэквивалентным синтезом этих форм [55, 58, 67, 68]:

N-

7/ 1

r5—сч

N— R2

©

N—R

R

N /©

N

или

/ w \

C J

3

^ ^N— R3

N^ 3

R

N //©

N

'/ W I

;-C

\ ^N— R3 ^ 3

1

2Н-тетразолиевая соль

2 3

1Н-тетразолиевая соль

Пятичленное кольцо в солях 2Н-тетразолия заряжено положительно и содержит один атом углерода и четыре атома азота. Таким образом, данные соединения обладают свойствами солей. Было сделано предположение, что двойная связь тетразолиевого кольца не является строго локализованной, что впоследствии подтвердилось в работе Найнхема [69]. Формально заряд

расположен на атомах азота, хотя структура молекулы является ароматической, а заряд делокализован [69]. Была предложена структура резонансного гибрида (6) крайних форм (4) и (5) [69]:

4 5 6

Позднее Шиле и его коллеги [70] пришли к выводу, что тетразолиевые соли не могут быть резонансными гибридами двух эквивалентных структур, и предложили определенную структуру тетразолиевого кольца с фиксированными связями, обладающей стереоизомерией [70], как, например структура (7):

7

Нумерация атомов солей тетразолия производится согласно правилу, по которому гетероатомы (такие как N и заряд в кольце должны иметь наименьшее возможное число [55]. Так, если R1, R2 и R3 представляет собой 4-нитрофенил, 2-бензотизолил и фенил, как в структуре (7), молекула называется 2-(2-бензотиазолил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенилтетразолий.

Следует отметить, что в большинстве применяемых солей тетразолия заместители в положениях N и N в основном имеют гетероциклическую или ароматическую природу, например, арил, азофенилалилин, тиазолил, имидазолил

и др. [2]. Заместители в положении С5 более разнообразны и могут содержать группы алифатической природы: -ОН, ^СН3, -СН3, -NO2, -CN и т.д. [2].

Соли тетразолия обычно представляют собой бесцветные или бледно-желтые кристаллические соединения, реже оранжевые [2]. Они, как правило, стабильны в твердом состоянии. Хлориды тетразолия обычно растворимы в воде и дают растворы с нейтральным рН, тогда как растворимость бромидов и йодидов ниже [55, 69]. При температуре 180-220°С [71, 72] или под воздействием прямых солнечных лучей [73-75] тетразолиевые соли разлагаются. В слабощелочных растворах со значением рН около 10 образуют формазаны, при этом тетразольное кольцо исходной соли расщепляется по N [73-75].

Известны структуры монотетразолиевых солей, имеющих одно тетразольное кольцо:

8

2-(4-иодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-фенилтетразолия хлорид (ИНТ)

9

2,3,5-трифенилтетразолия хлорид (ТФТ)

10

3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолия бромид (МТТ)

11

2,5-дифенил-3-(1-нафтил)-тетразолия хлорид (тетразолий фиолетовый, ТФ)

12

2-(2,-бензотиазолил)-3-(4,-фталгидразидил)-5-стерилтетразолия хлорид

(БФСТ)

Монотетразолиевые соли в растворе обычно почти бесцветны в видимой области спектра. Они показывают широкие максимумы поглощения в УФ-

диапазоне от 240 до 300 нм из-за их химической структуры, включающей сопряженную систему двойных связей [29, 55, 69]. Несмотря на большой интерес ученых в исследованиях солей тетразолия, их ЯМР и ИК-спектры были изучены недостаточно полно.

Помимо монотетразолиевых солей существуют дитетразолиевые, тритетразолиевые и политетразолиевые соли [63, 76], связь между тетразольными кольцами которых может реализовываться между атомами углерода, т.н. С-С'-соли, например:

К,—N—N N—N—К,

К3—N—N к—N—

23Г

13

у=

// \

// \_/ ^

// ^

Или атомами азота (Ы-М-соли):

\\ /

14

3,3'-(3,3'-диметокси-4,4'-бифенилилен)-бис-(2-и-нитрофенил-5-фенилтетразолия

хлорид) (НСТ)

15

3,3'-(3,3' - диметокси-4,4'-бифенилилен)-бис-(2,5-и-нитро фенилтетразолия хлорид)

(ТНСТ)

16

3,3'-(4,4'-бифенилилен)-бис-(2,5-дифенилтетразолия хлорид) (НТ)

17

3,3'-(3,3,-диметокси-4,4'-бифенилилен)-бис-(2,5-дифенилтетразолия хлорид) (СТ)

Политетразолиевые соли встречаются очень редко [63, 76]:

—сн2—сн—

18

-Гте—У— ГЗ—¿X-

—' п

21

I

те—с—те

I

те

19

к

20

п

У=

// \\

-СНт

ъ=

// \\// \\

// \\ // \

к

= соль тетразо.тня

Соли тетразолия исторически получали окислением соответствующих

формазанов [69]:

м ¡т [О] I

нм^ - Vм

I *

22 23

В 1994 году Абу Элениен [77] установил, что формазаны окисляются одноступенчато с переносом двух электронов и последующим депротонированием с образованием соответствующего тетразолиевого катиона. Однако позднее при восстановлении солей тетразолия с помощью супероксид-ионов наблюдался один перенос электрона при -0,20 В (Ag / AgQ) и один перенос 1е- / 1И+ при -0,40 В ^ / А^).

В последующие десятилетия были разработаны методы получения тетразолиев с более высоким уровнем синтетической гибкости. Наиболее распространенным является алкилирование предварительно сформированных

Тем не менее, подобный метод синтеза тетразолиев имеет проблемы региоселективности [51].

Другой подход к получению 1,4,5-замещенных солей тетразолия основывается на синтезе тетразолиевого ядра посредством (3 + 2) циклоприсоединения между ионами нитрилия (27) и азидами (28). Об этом методе

27 29

Однако в этом методе требуется выделение промежуточной соли нитрилия в качестве реагента, что значительно сузило область применения метода.

Относительно новый способ получения тетразолиевых солей предложили авторы работы [51]. Их метод получения основан на хемо- и региоселективном синтезе тетразолиевых солей посредством формального (3 + 2) циклоприсоединения с использованием в качестве исходных материалов вторичных амидов (30) и алкилазидами (31), где ион нитрилия образуется in situ в результате активации амида ангидридом трифторметансульфоновой кислоты [51]:

2-F-Py (2 equiv) О TfjO (1 equiv) R3N R3 N ITU

J]^ R2 _^ _4 N

ff ■ 31 >=N4

H

DCM 0 °C to 40 °C

R2

30 32

Ключевым свойством тетразолиевых солей, обусловливающее их широкое использование в различных областях науки, является их способность к раскрытию тетразольного кольца в мягких условиях с образованием интенсивно окрашенных продуктов - формазанов. Восстановление тетразолиевых солей до формазанов протекает в несколько стадий. При переносе одного электрона на молекулу соли образуется интермедиат, представляющий собой свободный незаряженный

радикал - тетразолинил (34), структура которого была установлена посредством ЭПР [2, 80]:

N—N—«2

-сч' +

\ V N—N—Из

33

соль тетразолия

К-С^

N—N— Я-»

+е~

N—N—Кз

34

тетразолинил

N—N

/ ' Ч

N—14'

35

формазан

Было показано, что структура тетразолинила стабилизируется мезомерным эффектом «-заместителей в ^фенильном кольце. Максимальное поглощение тетразолинилом в видимом диапазоне достигается при длине волны 600-700 нм [2].

Тетразолинил способен вступать в реакцию диспропорционирования, в результате которой при окислении одной его молекулы происходит восстановление другой с образованием соли тетразолия и формазана [80].

Подобная схема реализуется и в случае с образованием диформазанов. Исследования Умемото [81] показали, что соли дитетразолия восстанавливаются как до моно-, так и до диформазанов за счет переноса одного электрона, приводящего к образованию монотетразолинила. В его работе утверждалось, что ключевой реакцией, ведущей к одновременному образованию моно- и диформазанов, является диспропорционирование. При полярографическом исследовании формазанов наблюдались два необратимых процесса, контролируемых диффузией, каждый из которых сопровождался переносом одного электрона [81].

Таким образом, полное восстановление солей дитетразолиев протекает постадийно через образование монотетразолинила, а, затем, дитетразолинила [2, 80]. Монотетразолинил в данном случае представляет собой стабильный интермедиат, состоящий из одного фрагмента, содержащего тетразольное кольцо, и восстановившийся до формазана второй фрагмент. На данном этапе такое

18

соединение также может диспропорционировать до соли тетразолия и формазана, что, в целом, определяет множество путей восстановления дитетразолиевых солей [82]:

гл

D

У

+е\

*ts-ts*

▼ +е' TS-TS

TS-TS

Di

♦ . +e' F-TS -

F-F

V

u

F-TS

(TS-TS - соль дитетразолия, TS^ - тетразолинил-радикал, F-TS полуформазан, F-F - диформазан, D - дисмутация).

Способность к восстановлению тетразолиевых солей характеризуется окислительно-восстановительным потенциалом. Его значения для каждой соли могут быть с высокой точностью определены, применяя потенциометрические или полярографические методы [1, 2]. Окислительно-восстановительные потенциалы могут меняться в зависимости от молекулярного строения соли, рН и концентрации ее раствора, состояния восстановительной системы. Одним из методов установления окислительно-восстановительных свойств тетразолиевых солей является определение потенциала полуволны (E1/2) (табл. 1.1) [1, 2].

Соли тетразолия, имеющие более положительные значения потенциала полуволны, обладают большей восстановительной способностью. Так, например, согласно данным таблицы 1.1, соли ИНТ и МТТ будут обладать сходной способностью к восстановлению, но более высокой, чем у ТФТ.

Следует отметить, что в биологических исследованиях широко используются тетразолиевые соли, чьи значения потенциалов полуволны (E1/2) располагаются выше минус 170 мВ [2].

Таблица 1.1. Потенциалы полуволн ф^) и диапазоны рН восстановления солей тетразолия аскорбиновой кислотой [1]

Соль тетразолия Е1/2, мВ (рН = 7,2) Минимальное значение рН восстановления аскорбиновой кислотой

ТНСТ -50 5,5

НСТ -50 5,5-6,8

ИНТ -90 5,0

МТТ -110 5,0-5,5

СТ -160 10,0-10,5

НТ -170 9,4-9,7

НСТ -176 7,1

ТФТ -490 11,0

Интенсивная смена окраски реакционной системы при восстановлении солей тетразолия позволяет использовать их в качестве аналитических индикаторов окислительно-восстановительных реакций [56, 74]. Кроме этого, тетразолиевые индикаторы нашли широкое применение и для решения множества других задач [4-28, 52].

Так, например авторами [8] был разработан сверхчувствительный электрохимический иммуносенсор для обнаружения паратиреоидного гормона (ПТГ) в сыворотке крови, основанном на катализируемом DT-диафоразой фТ-О) образовании и электрохимическом окислении органического осадка. Было обнаружено, что DT-D можно использовать в качестве каталитической метки в аффинных биосенсорах на основе осаждения, поскольку DT-D катализирует быстрое восстановление МТТ до его формазана, который в последствии осаждается. Во время электрорастворения формазана наблюдался высокий электрохимический сигнал при низких потенциалах. При использовании разработанного иммуносенсора ПТГ был идентифицирован в широком диапазоне концентраций с очень низким пределом обнаружения (~ 1 пг/мл) в искусственной сыворотке крови. Концентрации ПТГ в клинических образцах сыворотки показали высокую сходимость с результатами, полученными с использованием специализированных приборов [8].

В работе [9] с использованием МТТ проводилось электрохимическое определение жизнеспособных бактериальных клеток, способных восстанавливать МТТ до нерастворимого формазана. Электрод из оксида индия и олова вносили в микробную суспензию, инкубированную с МТТ и нагретую до высыхания для экстракции и адсорбции формазана. Сушка привела к появлению характерного пика вольтамперометрического окисления при +0,1 В по сравнению с Ag / AgCl, величина которого коррелировала с количеством жизнеспособных микробов в суспензии. Таким образом, электрохимическое обнаружение формазана эффективно сочетается с термическим лизисом микробов. Показанный метод способен обнаруживать клетки в разведении более 2,8-Ю1 КОЕ/мл, в течение лишь 1 ч инкубации. Результаты исследования показали, что чувствительность данного метода до 104 раз выше, чем у колориметрического метода [9].

Соли тетразолия активно используются в определении цитотоксичности. В работе [10] для оценки цитотоксического действия тайского растения на культивируемые клетки фибробластов мышей (L929) использовался колориметрический анализ с тетразолиевой солью МТТ, основанный на восстановлении сукцинатдегидрогеназой МТТ до нерастворимого формазана. Полученные результаты сравнивались с проводимым параллельно стандартным колориметрическим анализом сульфородамина B (SRB), основанном на способности красителя SRB связывать основные аминокислотные остатки белков. Оба метода сравнивали с использованием коэффициента корреляции внутри класса (ICC). Результаты не выявили значительных различий между двумя методами анализа цитотоксичности (p > 0,05), демонстрируя корреляцию от умеренной до отличной [10].

Восстановления тетразолиевых солей также является одним из основных методов, используемых при разработке химиотерапевтических препаратов для борьбы с различными типами рака [11]. Путем восстановления МТТ была проведена стандартизация электромагнитного спектра, а также установлена дозировка этанольного экстракта кожуры бразильского кариокара при анализе жизнеспособности и токсичности клеток остеосаркомы собак. Было установлено,

что длина волны 532 нм является оптимальной для колориметрического анализа клеточного метаболизма. Более того, посредством восстановления МТТ было обнаружено, что этанольный экстракт кожуры бразильского кариокара в клетках остеосаркомы собак показал статистически равный эффект однократного и повторного введения дозы [11].

Тетразолиевые системы применяются для количественного выявления биологически активных веществ. Авторы [12] разработали метод анализа триглицеридов на основе водорастворимого тетразолия 8 ^БТ-8) взамен широко используемого хромогенного метода глицерин-3-фосфата-пероксидазы (ОРО-POD). Хорошо известно, что на активность пероксидазы влияют различные восстановители и, учитывая, что в самом методе GPO-POD используется ряд ферментов, высока вероятность протекания неспецифической реакции, что снижает объективность метода. Согласно предложенному методу триглицериды гидролизовались до глицерина и жирных кислот липопротеинлипазой с последующим окислением глицерина до дигидроксиацетона и одновременным образованием НАДН глицериндегидрогеназой. В реакционную среду вводился водорастворимый тетразолий 8 для окисления НАДН и осуществления полного превращение глицерина в дигидроксиацетон под действием глицериндегидрогеназы. Данная реакция сопровождалась образованием эквивалентного количества формазана [12]. Авторы работы отмечают простоту, высокую чувствительность и точность представленного метода для количественного анализа триглицеридов.

В исследовании [4] был показан метод определения а-токоферола в различных фармацевтических препаратах, фруктах, злаках, орехах и образцах молока с помощью вновь синтезированных тетразолиевых реагентов 2-фенил-3-(2-тиазолил)-5-(4-метоксифенил)-тетразолия бромид (ФТМФТ) и 2-фенил-3-(2-тиазолил)-5-(4-нитрофенил)-тетразолия бромид (ФТНФТ). Результаты количественного определения а-токоферола показали высокую корреляцию с другими методами [4].

В работе [13] авторы представили простой и доступный метод, для оценки жизнеспособности Schistosoma mansoni - паразита-трематода, вызывающего шистосомоз. Было показано, что интенсивность восстановления водорастворимой соли тетразолия XTT до формазана отражает количество и жизнеспособность паразитов. Данный анализ жизнеспособности был использован для высокопроизводительного скрининга препаратов в шистосомулах (личиночной стадии шистосомы), а также подбора дозировки. Авторы пришли к выводу, что анализ жизнеспособности с применением XTT может быть использован для скрининга больших библиотек лекарственных соединений в S. mansoni, а также ускорения идентификации новых антишистосомных препаратов [13].

Тетразоливые соли могут применяться в агрокультуре как индикаторы степени прорастания семян. В работе [14] показано, что количественное определение всхожести, можно оценить путем измерения оптической плотности окрашенного формазана с помощью спектроскопии. По мере прорастания семени оптическое поглощение окрашенного раствора увеличивается, а после достижения максимума начинает снижаться из-за ухудшения качества семени. Значение абсорбции дает индекс всхожести образцов семян. Был сделан вывод, что показанный метод определения всхожести семян обладает хорошей чувствительностью и отличается от других методов дешевизной и простотой выполнения [14].

Несмотря на большой спектр применений, традиционно соли тетразолия используются в качестве индикаторов клеточного метаболизма, функционируя как искусственные акцепторы электронов и, таким образом, определяя активность дегидрогеназ [30, 32, 42, 47, 83-87]. Обзор актуальных исследований и рассмотрение основных аспектов применения тетразолиевых индикаторов в микробиологических исследованиях будут представлены в разделе 1.3.

1.2. Формазаны. Строение, свойства, применение

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гурский Николай Васильевич, 2022 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Altman, F.P. Tetrazolium salts and formazans / F.P. Altman - ISBN 3-43710453- 5. Gustav Fisher Verlag. Stuttgart. 1976. 51 p.

2. Seidler, E. The Tetrazolium-Fonnazan System: Design and Histochemistry / E. Seidler - ISBN 3-437-11366-6. New York: G.Fischer. Stuttgart. 1991. 79 p.

3. Kuhn, R. Reduktion von Tetrazoliumsalzen durch Bakterier, gärende Hefe und keimende Samen / R. Kuhn, D. Jerchel // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1941. V. 74. P. 949952.

4. Kumar, A. Colorimetric quantification of a-tocopherol (vitamin E) in pure form and different comestible samples by using newly synthesized tetrazolium salts / A. Kumar, M. Kamboj // Journal of the Iranian Chemical Society. 2021. V. 18. № 2. P. 429-443.

5. Ahmed, H.A. Preparation, Characterization, Antibacterial Study, Toxicity Study of New Phenylene diamine-Formazan Derivatives / H.A. Ahmed, N.M. Aljamali // Indian Journal of Forensic Medicine & Toxicology. 2021. V. 15. № 2. P. 3102-3112.

6. Радостин, С.Ю. Кинетика восстановления иоднитротетразолия хлорида в индуцированной биотрансформации кислорода в коррозионно-активные формы: дис. ... канд. хим. наук: 02.00.04 / Радостин Станислав Юрьевич - Н. Новгород. 2015. 104 с.

7. Македошин, А.С. Кинетические характеристики восстановления иоднитротетразолия хлорида как индикатора диффузии реагента в бактериальные клетки: дис. ... канд. хим. наук: 02.00.04, 03.02.08 / Македошин Александр Сергеевич - Н. Новгород. 2018. 105 с.

8. Haque, A.M.J. Diaphorase-catalyzed formation of a formazan precipitate and its electrodissolution for sensitive affinity biosensors / A.M.J. Haque, P. Nandhakumar, G. Kim, S. Park // Anal. Chem. 2020. V. 92. № 5. P. 3932-3939.

9. Ishiki, K. Electrochemical detection of viable bacterial cells using a tetrazolium salt / K. Ishiki, D.Q. Nguyen, A. Morishita, H. Shiigi, T. Nagaoka // Anal. Chem. 2018. V. 90. № 18. P. 10903-10909.

10. Vajrabhaya, L. Cytotoxicity evaluation of a Thai herb using tetrazolium (MTT) and sulforhodamine B (SRB) assays / L. Vajrabhaya, S. Korsuwannawong // Journal of Analytical Science and Technology. 2018. V. 9. №. 1. P. 1-6.

11. Nepomuceno, L. In vitro methodological standardization of MTT colorimetric assay for evaluation of formazan activity and drug dosage / L. Nepomuceno, L.S. de Carvalho, N.P. Soares // PREPRINT (Version 1). 2020. P. 16. https://doi.org/10.21203/rs.2.20775/v1.

12. Kawano, M. A novel assay for triglycerides using glycerol dehydrogenase and a water-soluble formazan dye, WST-8 / M. Kawano, E. Hokazono, S. Osawa // Annals of Clinical Biochemistry. 2019. V. 56. № 4. P. 442-449.

13. Aguiar, P.H.N. A high-throughput colorimetric assay for detection of Schistosoma mansoni viability based on the tetrazolium salt XTT / P.H.N. Aguiar, N.M.G.S. Fernandes, C.L. Zani // Parasites & Vectors. 2017. V. 10. № 1. 10 p.

14. Kamboj, M. Novel colorimetric method to measure aliveness of seed samples via tetrazolium salt as analytical reagent / M. Kamboj, D.S. Chauhan, R. Kumar // Curr. Rese. Agri. Far. 2020. V. 1. № 1. P. 15-20.

15. Villegas-Mendoza, J. The chemical transformation of the cellular toxin INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(phenyl) tetrazolium chloride) as an indicator of prior respiratory activity in aquatic bacteria / J. Villegas-Mendoza, R. Cajal-Medrano, H. Maske // International Journal of Molecular Sciences. 2019. V. 20. № 3. P. 782.

16. Datar, R. Automated antimicrobial susceptibility testing of slow-growing Pseudomonas aeruginosa strains in the presence of tetrazolium salt WST-1 / R. Datar, G. Perrin, V. Chalansonnet, A. Perry // Journal of Microbiological Methods. 2021. V. 186. P. 106252.

17. Jung, M.Y. Applicability of a colorimetric method for evaluation of lactic acid bacteria with probiotic properties / M.Y. Jung, J. Lee, B. Park, H. Hwang // Food microbiology. 2017. V. 64. P. 33-38.

18. Testolin, R.C. Comparing different methods for fast screening of microbiological quality of beach sand aimed at rapid-response remediation / R.C. Testolin et al. // Mar. Pollut. Bull. 2017. V. 118. № 1-2. P. 206-212.

19. Круглов, Ю.В. Микробное сообщество почвы: физиологическое разнообразие и методы исследования (обзор) / Ю.В. Круглов // Сельскохозяйственная биология. 2016. Т. 51. №1. С. 46-59.

20. Способ мультисубстратного тестирования микробных сообществ и его применение: пат. 2335543 Рос. Федерация: МПК C12Q1/02 / Горленко М.В., Кожевин П.А., Терехов А.С.; заявитель и патентообладатель ООО «Экологический центр «Эко-терра». - № 2006124312/13; заявл. 07.07.06.

21. Горленко, М.В. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ [Текст] / М.В. Горленко, П.А. Кожевин. - М.: МАКС Пресс, 2005. - 88 с.

22. Беленева, И.А. Применение метода мультисубстратного тестирования состояния морских поверхностных вод / И.А. Беленева, У.В. Харченко // Биология моря. 2018. Т. 44. № 3. С. 172-178.

23. Хомутова, Т.Э. Сукцессия микробного сообщества серой лесной почвы при разложении различных органических соединений / Т.Э. Хомутова, К.С. Дущанова, В.Э. Смирнов, А.В. Борисов // Почвоведение. 2019. № 8. С. 966-973.

24. Лаптева, Е.М. Функциональное разнообразие микробных сообществ в мерзлых торфяных почвах бугристых болот лесотундры / Е.М. Лаптева, Ю.А. Виноградова, М.В. Горленко // Известия Самарского Научного Центра РАН. 2018. Т. 2. № 85. С. 364-372.

25. Patel, N. Use of the tetrazolium salt MTT to measure cell viability effects of the bacterial antagonist Lysobacter enzymogenes on the filamentous fungus Cryphonectria parasitica / N. Patel et al. // Antonie van Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mol. Microbiol. 2013. V. 103. № 6. P. 1271-1280.

26. Clausen, C.A. Colorimetric micro-assay for accelerated screening of mould inhibitors / C.A. Clausen, V.W. Yang // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2013. V. 77. P. 6871.

27. Isa, H.W.M. Development of a bacterial-based tetrazolium dye (MTT) assay for monitoring of heavy metals / H.W.M. Isa et al. // Int. J. Agric. Biol. 2014. V. 16. № 6. P. 1123-1128.

28. Плакунов, В.К. Универсальный метод количественной характеристики роста и метаболической активности микробных биоплШок в статических моделях / В.К. Плакунов, С.В. Мартьянов, Н.А. Тетенева, М.В. Журина // Микробиология. 2016. Т. 85. № 4. С. 484-489.

29. §enoz, H. The Chemistry of Formazans and Tetrazolium Salts / H. §enoz // Hacettepe J. Biol. & Chem. 2012. V. 40. № 3. P. 293-301.

30. Smith, J.J. Mechanisms of INT (2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium chloride), and CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) reduction in Escherichia coli K-12 / J.J. Smith, G.A. McFeters // Journal of Microbiological Methods. 1997. V. 29. P. 161-175.

31. Relexans, J.C. Measurement of the respiratory electron transport system (ETS) activity in marine sediments: state-of-the-art and interpretation. II. Significance of ETS activity data / J.C. Relexans // Marine Ecology Progress Series. 1996. V. 136. P. 289-301.

32. Kamenskikh, K.A. Reactions of NADH oxidation by tetrazolium and ubiquinone catalyzed by yeast alcohol dehydrogenase / K.A. Kamenskikh, N.L. Vekshin // Appl. Biochem. Microbiol. 2018. V. 54. P. 316-319.

33. Benov, L. Effect of growth media on the MTT colorimetric assay in bacteria / L. Benov // PLoS One. 2019. V. 14. № 8. P. 15 p.

34. Ping, L. The asymmetric flagellar distribution and motility of Escherichia coli / L. Ping // J. Mol. Biol. 2010. V. 397. № 4. P. 906-916.

35. Ping, L. Vital dye reaction and granule localization in periplasm of Escherichia coli / L. Ping et al. // PLoS One. 2012. V. 7. № 6. 10 p.

36. Thorm, S.M. Factors affecting the selection and use of tetrazolium salts as cytochemical indicators of microbial viability and activity / S.M. Thorm, R.W. Horobin, E. Seidler, M.R. Barer // Journal of Applied Bacteriology. 1993. V. 74. № 4. P. 433 -443.

37. O'Connor, K. Increased expression of Mg transport proteins enhances the survival of Salmonella enterica at high temperature / K. O'Connor, S.A. Fletcher, L.N. Csonka // PNAS. 2009. № 106. 187 p.

38. Tachon, S. Experimental conditions affect the site of tetrazolium violet reduction in the electron transport chain of Lactococcus lactis / S. Tachon, D. Michelon,

E. Chambellon, M. Cantonnet, C. Mezange, L. Henno, C. Remy, M. Yvon // Microbiology. 2009. № 155. P. 2941-2948.

39. Junillon, T. Simplified detection of food-borne pathogens: an in situ high affinity capture and staining concept / T. Junillon, A. Vimont, D. Mosticone, B. Mallen,

F. Baril, C. Rozand, J.P. Flandrois // J. Microbiol. Methods. 2012. V. 91. P. 501-505.

40. Junillon, T. Diminution of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride toxicity on Listeria monocytogenes growth by iron source addition to the culture medium / T. Junillon, J.P. Flandrois // Food Microbiol. 2014. V. 38. P. 1-5.

41. Junillon, T. Enhanced tetrazolium violet reduction of Salmonella spp. by magnesium addition to the culture media / T. Junillon, L. Morand, J.P. Flandrois // Food Microbiol. 2014. V. 42. P. 132-135.

42. Калинина, А.А. Ингибирование внутриклеточной сукцинатдегидрогеназы бактерий Bacillus subtilis как критерий участия фермента в восстановлении йоднитротетразолия хлорида - индикатора жизнеспособности клеток / А.А. Калинина, Н.В. Гурский, С.С. Сычев, Т.Н. Соколова // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 2021. Т. 62. № 2. С. 139-144.

43. Калинина, А.А. Применение методов химической кинетики в изучении восстановления йоднитротетразолия хлорида в присутствии клеток бактерий Bacillus subtilis / А.А. Калинина, А.С. Македошин, С.Ю. Радостин, Н.В. Гурский, Т.Н. Соколова, В.Р. Карташов // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. 2018. Т. 60. № 1. С. 27-33.

44. Калинина, А.А. Кинетическое исследование восстановления йоднитротетразолия хлорида суспензией в физиологическом растворе грамотрицательных бактерий Pseudomonas aeruginosa и Escherichia coli / А.А. Калинина, А.С. Македошин, Н.В. Гурский, Т.Н. Соколова, В.Ф. Смирнов // Теоретическая и прикладная экология. 2018. № 1. С. 25-32.

45. Калинина, А.А. Влияние видовых различий бактерий рода Bacillus и рода Pseudomonas, суспензированных в физиологическом растворе на скорость

восстановления йоднитротетразолия хлорида / А.А. Калинина, Н.В. Гурский, Т.Н. Соколова, О.В. Кузина, В.Ф. Смирнов // Теоретическая и прикладная экология. 2022. № 1. С. 28-34.

46. Радостин, С.Ю. Восстановление иоднитротетразолия клетками бактерий как метод оценки их коррозионной активности / С.Ю. Радостин, А.А. Калинина, А.С. Македошин, Т.Н. Соколова, О.В. Кузина, В.Р. Карташов // Коррозия: материалы, защита. 2015. № 11. С. 45-48.

47. Nakae, Y. Histochemical modification of the active site of succinate dehydrogenase with N-acetylimidazole / Y. Nakae, M. Shono // Histochem J. 1986. V. 18. № 4. P. 169-174.

48. Pechmann, H.V. Oxidation der Formazyl-verbindungen II / H.V. Pechmann, P. Runge // Ber. Deutsch. Chem. Ges. 1894. V. 27. 2920 p.

49. Gundogdu Hizliates, C. Discovery of Novel D-A and D-n-A Structured Carbazole-Based Formazan Dyes: Synthesis, Characterization, and Spectroscopic Studies / C. Gundogdu Hizliates // J. Heterocyclic Chem. 2019. V. 56. № 7. P. 2017-2026.

50. Gilroy, J.B. Formazanate coordination compounds: synthesis, reactivity, and applications / J.B. Gilroy, E. Otten // Chem. Soc. Rev. 2020. V. 49. № 1, P. 85-113.

51. Tona, V. Direct Regioselective Synthesis of Tetrazolium Salts by Activation of Secondary Amides under Mild Conditions / V. Tona, B. Maryasin, A. de la Torre, J. Sprachmann, L. González, N. Maulide // Org. Lett. 2017. V. 19. № 10. P. 2662-2665.

52. Shawali, A.S. Functionalized formazans: A review on recent / A.S. Shawali, N.A. Samy // Journal of Advanced Research. 2015. V. 6. № 3. P. 241-254.

53. Aljamali, N.M. New Formazan Compounds (Synthesis, Identification, Physical Properties) / N.M. Aljamali, D. Rahi // Journal of Chemical and Pharmaceutical Sciences. 2017. V. 10. № 3. P. 1461-1472.

54. Aldifar, H.A. Preparation and Characterization of Some of Formazan Derivatives / H.A. Aldifar, M.F. Ali, M.K. Abdulrahim // Research & Reviews: A Journal of Pharmacology. 2017. V. 7. № 1. P. 1-4.

55. Bedada, T.G. Characterization of Tetrazolium Salts and Formazans using Computational Chemistry for Radiochromic Dosimetry / T.G. Bedada // Electronic Thesis and Dissertation Repository. 2019.

56. Al-Araji, Y.H. Chemistry of formazan / Y.H. Al-Araji, J.K. Shneine, A.A. Ahmed // International Journal of Research in Pharmacy and Chemistry. 2015. V. 5. № 1. P. 41-76.

57. Sabnis, R.W. Handbook of Biological Dyes and Stains Synthesis and Industrial applications / R.W. Sabnis - ISBN: 978-0-470-40753-0. John Wiley & Sons Inc. 2010. 521 p.

58. Бузыкин, Б.И. Прогресс в химии формазанов. Синтез-свойства-применение / Б.И. Бузыкин и др. - М.: Научный мир, 2009. - 295 с.

59. Lewis, J.W. Infrared absorption and resonance Raman scattering of Photochromic triphenylformazans / J.W. Lewis, C. Sandfory // J. Chem. 1983. V. 61. P. 809-816.

60. Ibrahim, Y.A. New synthesis of macrocyclic crown-formazans from pyruvic acid derivatives / Y.A. Ibrahim, Ahmed H.M. Elwahy, A.A. Abbas // Tetrahedron. 1994. V. 50. № 39. P. 11489-11498.

61. Tezcan, H. Substituent effects on the spectral properties of some 3-substituted Formazans / H. Tezcan, N. Özkan // Dyes and Pigments. 2003. V. 56. P. 159-166.

62. Frolova, N.A. New C-arylation reaction found during a study on the interaction of aldo hydrazones and arenediazonium chlorides / N.A. Frolova, S.Z. Vatsadze, N.Y. Vetokhina, V.E. Zavodnik, N.V. Zyk // Mendeleev Commun. 2006. V. 16. P. 251-254.

63. Tezcan, H. The synthesis and spectral properties determination of 1,3-substituted phenyl-5-phenylformazans / H. Tezcan, E. Uzluk // Dyes and Pigments. 2007. V. 75. P. 633-640.

64. Raval, J.P. Synthesis, characeterization and in vitro antibacterial activity of novel 3-(4-methoxyphenyl)-1-isonicotinoyl-5-(substituted phenyl)-formazans / J.P. Raval, P.R. Patel, N.H. Patel, P.S. Patel // Inter. J. of ChemTech Res. 2009. V. 1. № 3. P. 610-615.

65. Babu, A.N. Synthesis of some new quinazolinone formazans as anti-Inflammatory and anthelmintic agents / A.N. Babu, R.R. Nadendla // J. of Pharm. Res. 2011. V. 4. P. 983-985.

66. Mady, V.Z. Transformation of aldose formazans, Novel synthesis of 2-acetamido-2-deoxypentonolactones and a new pent-2-enose formazan / V.Z. Mady, I. Pinter, M.P. Kajtar, A. Perczel // Carbohydrate Research. 2011. V. 346. P. 1534-1540.

67. Войтехович, С.В. Синтез, свойства и строение тетразолов: некоторые достижения и перспективы / С.В. Войтехович, О.А. Ивашкевич, П.Н. Гапоник // Журнал органической химии. 2013. Т. 49. № 5. С. 655-673.

68. Hunig, S. Beitrage zur Substituentenwirkung / S. Hunig, O. Boes // Liebigs Ann. Chem. 1953. V. 28.579 p.

69. Nineham, A.W. The chemistry of formazans and tetrazolium salts / A.W. Nineham // Chern. Rev. 1955. V.55. P. 355-483.

70. Schiele, C. Zur Struktur von Formazanen / C. Schiele et al. // Tetrahedron. 1967. V. 23. P. 2693-2699.

71. Kostova, S. Extraction-radiochemical study of the ion-association complex of antimony (V) with tetrazolium violet and its termal behavior / S. Kostova, B.J. Boyanov // Radioanal. Nucl. Chem., Lett. 1995. V. 200. 427 p.

72. Dimitrov, A.N. Investigation of the extraction equilibrium of ion-association complexes of molybdenum (VI) with some polyphenols and thiazolil blue. Extraction-spectrophotometric determination of molybdenum / A.N. Dimitrov, V.D. Lekova, K.B. Gavazov, B.S. Boyanov // Cent. Eur. J. Chem. 2005. V. 3. 747 p.

73. Alexandrov, A. Tertazolium Salts for Solvent Extraction of Elements as Ion Association Complexes. Review / A. Alexandrov // Universität des Saarlandes, Saarbrücken. 1984.

74. Alexandrov, A. The Application of Tetrazolium Salts in Analytical Chemistry. Review / A. Alexandrov // Universität des Saarlandes, Saarbrücken. 1984.

75. Altman, F.P. Studies on reduction of tetrazolium salts. I. The isolation and characterization of a half-formazan intermediate product during the reduction of

neotetrazolium chloride / F.P. Altman, R.G. Butcher // Histochemie. 1973. V. 37. P. 333-350.

76. Tezcan, H. Synthesis and spectral properties of some bis-substituted formazans / H. Tezcan // Spectrochim. Acta. A Mol. Biomol. Spectrosc. 2008. V. 69. P. 971-979.

77. Abou-Elenien, G.M. Redox characteristics of some substituted formazans in aqueous media / G.M. Abou-Elenien // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1994. V. 375. № 1-2. P. 301-305.

78. Klapötke, T.M. Energetic Salts of Low-Symmetry Methylated 5-Aminotetrazoles / T.M. Klapötke, C. Miró Sabaté, A. Penger, M. Rusan, J.M. Welch // Eur. J. Inorg. Chem. 2009. V. 2009. № 7. P. 880-896.

79. Quast, H. Tetrazoliumsalze durch cycloaddition von alkylaziden an nitriliumsalze / H. Quast, L. Bieber // Tetrahedron Letters. 1976. V. 17. № 18. P. 1485 -1486.

80. Neugbauer, F.A. Hydrazidinyl-Radikale: 1,2,4,5-Tetraazapentenyle, Verdazyle und Tetrazolinyle / F.A. Neugbauer // Angew. Chern. 1973. V. 85. P. 485493.

81. Umemoto, K. Reduction mechanism of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride and 1,3,5-triphenylformazan / K. Umemoto // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1985. V.58. № 7. P. 2051-2055.

82. Seidler, E. Zum Mechanismus der Tetrazoliumsalzreduktion und Wirkungsweise des Phenazinmethosulfates / E. Seidler // Acta histochem. 1979. V. 65. P. 209-218.

83. Pearse, A.G. Substantivity and other factors responsible for formazan patterns in dehydrogenase histochemistry / A.G. Pearse et al. / Experientia (Basel). 1961. V. 17. P. 136-141.

84. Raap, A.K. Studies on the phenazine methosulphate-tetrazolium salt capture reaction in NAD (Pt-dependent dehydrogenase cytochemistry. III. The role of superoxide in tetrazolium reduction) / A.K. Raap // Histochem. 1983. V. 15. P. 977-986.

85. Chieco, P. Improvement in soluble dehydrogenase histochemistry by nitroblue tetrazolium preuptake in sections: a qualitative and quantitative study / P. Chieco et al. // Stain Technol. 1984. V. 59. P. 201-211.

86. Kalina, M. Nonosmiophilic tetrazolium salts that yield osmiophilic, lipophobic formazans for ultrastructural localization of dehydrogenase activity / M. Kalina, R.E. Plapinger, Y. Hoshino, A.M. Seligman // Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 1972. V. 20. №. 9. P. 685-695.

87. Zeylemaker, W.P. The inhibition of succinate dehydrogenase by oxaloacetate / W.P. Zeylemaker, E.C. Slater // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Enzymology. 1967. V. 132. № 1. P. 210-212.

88. Tezcan, H. Electrochemical properties of 1-(o,m,p-nitrophenyl)-3-(m-nitrophenyl)-5-phenylformazans and their nickel complexes / H. Tezcan, M.L. Aksu // Turk. J. Chem. 2010. V. 34. P. 465-479.

89. Mariappan, G. Synthesis and biological evaluation of formazan derivatives / G. Mariappan, R. Korim et al. // J. Adv. Pharm. Tecn. & Res. 2010. V. 1. P. 396-400.

90. Beilstein, F.K. Handbook of Organic Chemistry / F.K. Beilstein. 1933. V. 17.

91. Sigeikin, G.I. Formazans and their metal complexes / G.I. Sigeikin, G.N. Lipunova, I.G. Pervova // Russ. Chem. Rev. 2006. V. 75. № 10. P. 885-900.

92. Buemi, G. Ab initio study of formazan and 3-nitroformazan / G. Buemi, F. Zuccarello, P. Venuvanalingam, M. Ramalingam, S.S. Ammal // J. Chem. Soc., Faraday Trans. 1998. V. 94. P. 3313-3319.

93. Hausser, I. The red-yellow rearrangement of formazans by light / I. Hausser, D. Jerchel, R. Kuhn // Chem. Ber. 1949. V. 82. 515 p.

94. Gilroy, J.P. The design, synthesis, and Chemistry of stable verdazyl radicals and their precursors / J.P. Gilroy // Thesis of doctor of philosophy, University of Victoria. 2008.

95. Hunter, L. The associating effect of the hydrogen atom. IX. The N-H bond. Virtual tautomerism of the formazyl compounds / L. Hunter, C.B. Roberts // J. Chem. Soc. 1941. P. 820-823.

96. Tezcan, H. The synthesis of some bis-substituted formazans and the investigation of the effect of the substituent upon their UV-VIS absorption Xmax values / H. Tezcan, N. Özbek // Commun Fac. Sci. Univ. Ank. B. 2005. V. 51. № 1. P. 13-28.

97. Abbas, A.A. Synthesis of spirolinked macrocyclic crown formazans and a bis (crown formazan) / A.A. Abbas, Ahmed H.M. Elwahy // Arkivoc. 2009. P. 65-70.

98. Neugebauer, F.A. tert.-Butyl-bis-benzolazo-methan / F.A. Neugebauer, H. Trischmann // Justus Liebigs Annalen der Chemie. 1967. V. 706. № 1. P. 107-111.

99. Gilroy, J.B. Synthesis and Characterization of 3-Cyano- and 3-Nitroformazans, Nitrogen-Rich Analogues of ß-Diketimine Ligands / J.B. Gilroy, P.O. Otieno, M.J. Ferguson, R. McDonald, R.G. Hicks // Inorganic chemistry. 2008. V. 47. № 4. P. 1279-1286.

100. Mahmoud, H. K. Nano-sized formazan analogues: Synthesis, structure elucidation, antimicrobial activity and docking study for COVID-19 / H.K. Mahmoud, B.H. Asghar, M.F. Harras, T.A. Farghaly // Bioorganic Chemistry. 2020. V. 105. P. 104354.

101. Findlay, G.H. The value of some tetrazolium salts as histochemical reagents for sulphydryl groups / G.H. Findlay // J. Histochem. Cytochem. 1955. V. 3. P. 331338.

102. Reid, W. Formazane und Tetrazoliumsalze, ihre Synthesen und ihre Bedeutung als Reduktionsindikatoren und Vitalfarbstoffe / W. Reid // Angew. Chem. 1951. V. 64. P. 391-415.

103. Plumb, J.A. Effects of the pH Dependence of 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide-Formazan / J.A. Plumb, R. Milroy, S.B. Kaye // Cancer Res. 1989. V. 49. P. 4435-4440.

104. Horobin, R.W. Selection of optimum tetrazolium salts for use in histochemistry: the value of structurestaining correlations / R.W. Horobin // The Histochemical Journal. 1982. V. 14. №. 2. P. 301-310.

105. Fischer, P.B. Untersuchungen tiber die Struktur von Formazanen. I. 15N-H-Kopplung des Chelatwasserstoffes / P.B. Fischer et al. // Helv. chim. Acta. 1968. V. 51.

P. 1449-1451.

106. Seidler, E. Nichtenzymatische Modelle der histochemischen Tetrazoliumreduktion / E. Seidler // Acta histochem. 1982. V. 70. P. 228-243.

107. Шлегель, Г. Общая микробиология / Г. Шлегель; пер. с нем. Л.В. Алексеевой, Г.А. Куреллы, Н.Ю. Несытовой. - М.: Мир, 1987. - 567 с.

108. Mitchell, P. Possible Molecular Mechanisms of the Protowotive Function of Cytochrome Systems / P. Mitchell // J. theor. Biol. 1976. V. 62. P. 327-367.

109. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рем; пер. с англ. Т.П. Мосоловой. - 6-е изд. - М.: Лаборатория знаний, 2019. - 509 с.

110. Hatzinger, P.B. Applicability of tetrazolium salts for the measurement of respiratory activity and viability of groundwater bacteria / P.B. Hatzinger, Р. Palmer, R.L. Smith, C.T. Penarrieta, T. Yoshinari // Journal of Microbiological Methods. 2003. V. 52. № 1. P. 47-58.

111. Nishikimi, M. The occurrence of superoxide anion in the reaction of reduced phenazine methosulfate and molecular oxygen / M. Nishikimi // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. V. 46. P. 849-853.

112. Lederberg, J. Detection of fermentative variants with tetrazolium / J. Lederberg // J. Bacteriol. 1948. V. 56. № 5. 695 p.

113. Sabaeifard, P. Optimization of tetrazolium salt assay for Pseudomonas aeruginosa biofilm using microtiter plate method / P. Sabaeifard, A. Abdi-Ali, M. Reza Soudi, K. Dinarvand // Journal of Microbiological Methods. 2014. V. 105. P. 134-140.

114. Rodriguez, G.G. Use of a fluorescent redox probe for direct visualization of actively respiring bacteria / G.G. Rodriguez // Applied Environmental Microbiology. 1992. V. 58. № 6. P. 1801-1808.

115. Stepanovic, S. A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation / S. Stepanovic, D. Vukovic, I. Dakic, B. Savic, M. Svabic-Vlahovic // J. Microbiol. Methods. 2000. № 40. P. 175-179.

116. ГОСТ 9.048-89 ЕСЗКС. Изделия технические. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов. - М.: Госстандарт. 1989. 22 с.

117. Fairbridge, R.A. The direct colorimetric estimation of reducing sugars and other reducing substances with tetrazolium salts / R.A. Fairbridge, K.J. Willis, R.G. Booth // Biochem. J. 1951. V. 49. № 4. P. 423-427.

118. Беккер, Х. Органикум. Практикум по органической химии: в 2-х т. / Х. Беккер, Г. Домшке, Э. Фангхенель, М. Фишер и др.; пер. с нем. В.М. Потаповой, С.В. Пономарувой. - М.: Мир, 1979. - Т. 1. - 456 с.

119. Левинсон, У. Медицинская микробиология и иммунология [Текст] / У. Левинсон; пер. с англ. под ред. В.Б. Белобородова. - М.: БИНОМ. Лаб. знаний, 2015. - 1181 с.

120. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т. / Пер. с англ. под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. - Т. 1. -432 с.

121. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т. / Пер. с англ. под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса. - М.: Мир, 1997. - Т. 2. -368 с.

122. Лабинская, А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований / А.С. Лабинская. - М.: Медицина, 1978. - 394 с.

123. ГОСТ 9.082-77 Единая система защиты от коррозии и старения. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию бактерий. - М.: Стандартинформ. 2006. 27 с.