Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических и неорганических субстратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Фирсова, Юлия Николаевна

• Фирсова, Юлия Николаевна
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Фирсова, Юлия Николаевна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ГЛЮКОЗООКСИДАЗА: СТРУКТУРА, СВОЙСТВА, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ

1.1.1 Глюкозооксидаза как окислитель глюкозы

1.1.2 Физические свойства

1.1.3 Структура

1.1.4 Стабильность

1.1.5 Ингибиторы

1.1.6 Восстанавливающие субстраты

1.1.7 Механизм реакции окисления Б-глюкозы

1.1.8 Влияние рН на механизм реакции

1.1.9 Практическое применение _

1.2 ОРГАНИЧЕСКИЕ, НЕОРГАНИЧЕСКИЕ И МЕТАЛЛООРГАНИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ КАК МЕДИАТОРЫ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА В БИОСИСТЕМАХ

1.2.1 Дикислород, как окисляющий субстрат глюкозооксидазы

1.2.2 Органические субстраты глюкозооксидазы

1.2.3 Неорганические субстраты глюкозооксидазы

1.2.4 Металлоорганические соединения как медиаторы электронного транспорта

1.2.5 Способы модификации фермента, поверхности электрода и медиаторов электронного транспорта

ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ

Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 .ПРИБОРЫ И РЕАГЕНТЫ

2.2 МЕТОДЫ

2.2.1 Синтез солей феррициния

2.2.2 Кинетические исследования реакции окисления В-глюкозы солями феррициния, катализируемое глюкозооксидазой

2.2.3 Ингибирование ферроценкарбоновой кислотой реакции глюкозоокси-дазного восстановления Рс+РРб в присутствии Б-глюкозы

2.2.4 Определение активности глюкозооксидазы

2.2.5 Влияние этанола на каталитическую активность фермента

2.2.6 Влияние рН на кинетику глюкозооксидазного восстановления Рс+РРб"

под действием Б-глюкозы

2.2.7 Приготовление растворов феррициния для изучения эффекта катионных, анионных и неионогенных ПАВ на каталитическую активность фермента. Кинетические измерения

2.2.8 Приготовление растворов н-бутилферрициния, содержащих тритон X-

100 и ДСН. Кинетические измерения

2.2.9 Приготовление растворов н-бутилферрициния в присутствии ЦТАБ

2.2.10 Влияние различных ПАВ на скорость поглощения дикислорода

2.2.11 Приготовление растворов катионов Я-, 8- энантиомеров 2-метилферроценкарбоновой кислоты и спектрофотометрические измерения

2.2.12 Приготовление растворов комплексов 08(111) и Яи(Ш). проведение спектрофотометрических измерений

2.2.13 Влияние гистидина и глутаминовой кислоты на скорость глюкозооксидазного восстановления [Оэ^^-МегЬру^СЩО под действием Э-глюкозы

2.2.14 Эффект пиридина на пероксидазное восстановление комплекса Цифруюсь под действием Н2О2

2.2.15 Получение апо-пероксидазы

2.2.16 Встраивание модифицированного гемина в апо-пероксидазу (метод А)

2.2.17 Встраивание модифицированного гемина в апо-пероксидазу (метод Б)

Глава 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 ИССЛЕДОВАНИЕ КИНЕТИКИ И МЕХАНИЗМА ОКИСЛЕНИЯ Б-

ГЛЮКОЗЫ ИОНАМИ ФЕРРИЦИНИЯ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКО-

ЗООКСИДАЗОЙ

3.1.1 Формальная кинетика и механизм реакции

3.1.2 Поведение замещенных солей феррициния

3.1.3 Ингибирование ферроценкарбоновой кислотой

3.1.4 Влияние этанола на каталитическую активность глюкозооксидазы 5

3.1.5 Влияние рН на кинетику глюкозооксидазного восстановления НГс+РГб"

3.1.6 Обсуждение результатов на основании модели "шар-воронка"

3.1.7 Энантиоселективное восстановление ионов феррициния, катализируемое глюкозооксидазой

3.2 РЕГУЛЯТОРНАЯ РОЛЬ ПАВ В КИНЕТИКЕ КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКОЗООКСИДАЗНОГО ОКИСЛЕНИЯ Б- ГЛЮКОЗЫ ИОНАМИ ФЕРРИЦИНИЯ И Н-БУТИЛФЕРРИЦИНИЯ

3.2.1 Влияние ПАВ на скорость ферментативного поглащения кислорода

3.2.2 Влияние концентрации феррициния на скорость его ферментативного восстановления в присутствии ПАВ

3.2.3 Влияние ПАВ на кинетику глюкозооксидазного восстановления катиона феррициния под действием Б-глюкозы

3.2.4 Влияние ПАВ на кинетику глюкозооксидазного восстановления катиона н-бутилферрициния под действием Б-глюкозы

3.3 СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ОКИСЛЕНИЯ Б-ГЛЮКОЗЫ КОМПЛЕКСАМИ [МШ (Ш)2С12]+, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ГЛЮКОЗООКСИДАЗОЙ ( М=Об, Ыи, 1Х=2,2'-БИПИРИДИН И 1,10-ФЕНАНТРОЛИН)

3.3.1 Определение стехиометрии и кинетических порядков реакции глюкозооксидазного восстановления комплексов осмия, рутения по разным реагентам

3.3.2 Влияние рН на скорость реакции окисления Б-глюкозы, катализируемого глюкозооксидазой в присутствии комплексов [08(р11еп)2С12]С1

3.3.3 Эффект ПАВ на кинетику восстановления [ОэСрЬеп^СуС! под действием Б-глюкозы

3.3.4 Влияние ¿-аминокислот на скорость реакции ферментативного восстановления комплекса [Оз(4,7-Ме2Ьру)2С12]С1

3.3.5 Эффекты аскорбиновой и глюконовой кислот на глюкозооксидазное восстановление комплексов Оэ111 под действием Б-глюкозы

3.3.6 Сравнение реакционной способности комплексов и ИРс в реакции окисления Б-глюкозы, катализируемой глюкозооксидазой

3.4 ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ПЕРОКСИДАЗНОЙ РЕАКЦИИ ОКИСЛЕНИЯ КОМПЛЕКСОВ RU(II) ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА

3.4.1 Изучение кинетики пероксидазного окисления Ru(bpy)2Cl2 и Ru(phen)2Cl2 под действием пероксида водорода

3.4.2 Эффект хлорид ионов на реакцию пероксидазного окисления Ru(bpy)2Cl2 под действием пероксида водорода

3.4.3 Эффект пиридина на кинетику реакции пероксидазного окисления Ru(bpy)2Cl2 под действием пероксида водорода

3.5 ПЕРОКСИДАЗА ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ГЕМИНОМ В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФАД - флавинадениндинуклеотид ФАМ - флавинаденинмононуклеотид

ФАДН2 - восстановленная форма флавинадениндинуклеотида

ФАДФ - флавинадениндинуклеотидфосфат

ГО - глюкозооксидаза

Gl - глюкоза

HFc+ - соли феррициния

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ДСН - додецилсульфат натрия

ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид

ABTS - 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония MES - 4-морфолинэтансульфоновая кислота ПХ - пероксидаза из корней хрена

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетика и механизм действия оксидоредуктаз в присутствии искусственных металлоорганических и неорганических субстратов»

ВВЕДЕНИЕ

В последнее время для решения практических и фундаментальных задач широко изучается участие искусственных субстратов в ферментативных окислительно-восстановительных процессах. Особую роль в этих превращениях начали играть ме-таллоорганические и неорганические субстраты оксидоредуктаз, так как именно эти молекулы представляются сегодня особо перспективными при создании амперометри-ческих биосенсоров с медиаторным транспортом электронов. Выбор нужных субстратов с заданными гидрофобными, стерическими и электронными характеристиками целесообразно искать на основе широкого спектра кинетических данных, касающихся взаимодействия металлоорганических и неорганических молекул с оксидоредуктазами. В связи с этим в данной работе выполнено детальное изучение кинетики и механизма восстановления металлоорганических и неорганических субстратов под действием Б-глюкозы, катализируемого глюкозооксидазой и окисления неорганических субстратов пероксидом водорода, катализируемого пероксидазой из корней хрена.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Фирсова, Юлия Николаевна

выводы

1) Детальное изучение кинетики окисления Б-глюкозы, катализируемого глюкозоок-сидазой под действием ионов феррициния, показало, что последние являются реак-ционоспособными субстратами глюкозооксидазы, с помощью которых можно непосредственно спектрофотометрически следить за изменением активности фермента.

2) Реакцию окисления Б-глюкозы в б-глюконолактон в присутствии ионов феррициния можно описать механизмом типа "пинг-понг", в рамках которого были рассчитаны истинные константы скорости к2 и кц, соответствующие взаимодействию глюкозооксидазы с Б-глюкозой и с катионом феррициния равные 570 с"1 и 1.6x104 с"1 соответственно.

3) Катализируемое глюкозооксидазой восстановление 5- и 7?-энантиомерных катионов 2-метилферроценкарбоновой кислоты является энантиоселективным, и 5-энантиомер в 1.5 раза реакционноспособнее Я-энантиомера. Таким образом, перенос электрона между глюкозооксидазой и металлоорганическими веществами, обладающими элементами планарной хиральности, может происходить стереоселективно.

4) Стационарная кинетика глюкозооксидазного восстановления катионов феррициния и н-бутилферрициния под действием Б-глюкозы изучена в мицеллах тритона Х-100, ЦТАБ и ДСН. "Мицеллярная" регуляция ферментативной активности становится возможной при гидрофобизации катиона за счет перехода от незамещенного феррициния к н-бутилферрицинию. Максимальная активность наблюдается в положительных мицеллах ЦТАБ и практически нет активности в отрицательных мицеллах ДСН. Восстановление протекает исключительно в водной фазе и константа скорости кв равна 4x103 М4 с'1

5) Катализируемое глюкозооксидазой восстановление цис-[МШ(1Х)2С12]+ (М = Оэ и Яи) под действием Б-глюкозы в цис-[М1[(ЬЬ)2С12] (IX -лиганды типа Ьру и рЬеп) имеет первый кинетический порядок по комплексу и глюкозооксидазе, но михаэлисовскую зависимость по глюкозе. Реакционная способность убывает в ряду [Ки(Ьру)2С12]+ > [08(рЬеп)2С12]+ > [08(4,4'-Ме2Ьру)2С12]+ > [08(4,7-Ме2рЬеп)2С12]+. Важный вывод состоит в том, что комплекс Яи более активен по сравнению с соединениями Оэ.

6) Изучение кинетики пероксидазного окисления комплексов Яи11 под действием перекиси водорода показало, что данная реакция имеет первый порядок по рутению и первый порядок по ферменту. Константы скорости второго порядка, равные (1.5±04)х105

М" с" и (2.8±0.1)х104 М"1 с*1 для цис-[RuCphenhCh] и цис-[Ru(bpy)2Cl2] соответственно, сравнимы с аналогичными константами, полученными для ферроцена и его производных.

7) Разработан подход к созданию модифицированной пероксидазы, в активном центре которой находится гемин с координированным цис-[Ru(phen)2Cl2]. Модифицированный двумя способами фермент проявлял 80% каталитической активности по отношению к ABTS по сравнению с нативной пероксидазой.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Фирсова, Юлия Николаевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Olsson L., Mandenius C. F., Vole J. Determination of monosaccharides in cellulosic hydrolysates using immobilized pyranose oxidase in a continuous amperometric analyzer. Anal. Chem., 1990,62,2688-1691.

2. Coulthard C., Michaelis R., Short W., Skrimshire G., Standfast A., Birkishaw J. & Raistrick H. Notatin: an antibacteria glucose aerohydrogenes from Pénicillium notatum. Biochem., 1945,39,24-36.

3. Bourdillon C., Bourgeois J. P. & Thomas D. Covalent linkage of glucose oxidase on modifided glassy carbon electrode. Kinetic Phenomena, 1980,102,4231-4235.

4. Swoboda B. E. P. & Massey V. Purification and properties of glucose oxidase from Aspergillus niger. Biol. Chem., 1965,240, 2209-2215.

5. Tsuge H., Natsaki O., Ohashi K. Purification, properties and molecular features of glucose oxidase from Aspergillus niger. J. Biochem., 1975, 78, 835-843

6. Hayashi S., Nakamura S. Multiple forms of glucose oxidase with different carbohydrate compositions. Biochim. Biophys. Acta, 657, 40-51.

7. Hecht H., Kalisz H., Hendle J., Schmid R., Schombury D. Crystal structure of glucose oxidase from Aspergillus niger refined at 2.3 Â resolution. Mol. Biol, 1993, 229, 153-172.

8. Wilson R. & Turner A. Glucose oxidase: an ideal enzyme. Biosensor & Bioelectrons., 1992, 7, 165-185.

9. O'Malley J. & Weaver J. Subunit structure of glucose oxidase from Aspergillus niger. Biochemistry, 1972,11, 3527-3532.

10. Pazur J. H., Kleppe K. & Ball E. M. The glycoprotein nature of some fungal carbohydrases. Arch. Biochem., 1963,103, 513-516.

11. Nakamura T. & Ogura Y. Kinetic studies on the action of glucose oxidase. Biochem. Biophys. Acta, 1976, 445,294-308.

12. Frederick K., Tung J., Emerick R., Masiarz F., Chamderlin S., Vasavada A. & Massey V. Glucose oxidase from Aspergillus niger. J. Biol. Chem., 1990,265, 3793-3802.

13. Degani Y. & Heller A. Direct electrical communication between chemically modified enzyme and metal electrodes. 2. Methods for bonding electron-transfer relays to glucose oxidase and amino-acid oxidase. J. Am. Chem. Soc., 1988,110, 2615-2620.

14. James T., Edmonson D. & Husain M. Glucose oxidase contains a disubstituted phosphorus residue: phosphorus-31 nuclear magnetic resonance studies on the flavin and non-flavin phosphate residues. Biochemistry, 1981, 20, 617-620.

15. Morris D., Ellis P., Carrio R., Yeager F., Shroeder H., Albarella J., Boguslasky R., Hornby W & Rawson D. Flavin adenine dinucleotide as a label in homogeno colorimetric immunoassays. Anal. Chem., 1986, 50, 658-665.

16. Nakanishi Y., Ohashi K. & Tsuge H. Essential histidyl residues in glucose oxidase: modification of histidyl residues with diethylpyrocarbonate. Biochem. Biophys. Acta., 1976, 445, 294-308.

17. Kelin D. & Hartee E. Specificity of glucose oxidase (notatin). Biochem., 1952, 50, 331341.

18. Tsuge H.,Suzuki M. & Aoki K. Inactivation of glucose oxidase by the cationic detergent hexadecyltrimethylammonium bromide. Agric. Biol. Chem., 1984, 48, 19-48.

19. Jones M. N., Manley P. & Wilkinson A. The dissociation of glucose oxidase by sodium n-dodecyl sulphate. Biochem. J., 1982, 203, 285-291.

20. Ye W. N., Combes D. & Monsan P. Influence of additives on the thermostability of glucose oxidase. Enz. Microb. Technol., 1988,10,498-502.

21. Nakamura T. & Ogura Y. Kinetic studies on the action of glucose oxidase. J. Biochem., 1962,52,214-220.

22. Torren e., & Burger F. Trace determination of metal ion inhibition of the glucose oxidase system. Mikrochim. Acta, 1968, 538-545.

23. Liu C. C., Fryburg F. M. & Chen A. K. Electrochemical studies of metal ion inhibition of polyacrylamide gel immobilized glucose oxidase. Bioelectrochem. Bioenerg., 1981, 8, 703-708.

24. Weibel M. K. & Bright H. J. The glucose oxidase mechanism: interpretation of the pH dependence. J. Biol. Chem., 1971, 246, 2734-2744.

25. Voet J. & Andersen E. C. Electrostatic control of enzyme reactions: mechanism of inhibition of glucose oxidase by putrescine. Biochem. Biophys. Acta, 1884, 233, 88-92.

26. Adams E. C., Mast R. L. & Free A. H. Specificity of glucose oxidase^rc/z. Biochem. Biophys., 1960, 91, 230-234.

27. Dixon M. & Webb E. C. Enzymes. Longmans Green, London, 1964,253-254.

28. Chan T. W. & Bruice T. C. One and two electron transfer reactions of glucose oxidase. J. Am. Chem. Soc., 1977, 99, 2387.

29. Swoboda B. E. P. & Massey V. Unknown constituents of glucose oxidase from Aspergillus niger. Flavins and Flavoproteins, 1966, ed. E. C. Slater. Elsevier, Amsterdam, 263-82.

30. Wellner D. Flavoproteins. Annu. Rev. Biochem., 1967, 36, 669-690.

31. McCormick D., Koster J. & Veeger C. On the mechanism of photochemical reductions of FAD and FAD-dependent flavoproteins. Eur. J. Biochem., 1967,2, 387-391.

32. Janik B. & Elving P. Polarigraphic behaviour of nucleosides and nucleotides of purines, pirimidines, and flavins. Chem. Rev., 1968, 68, 295-319.

33. Swoboda B. E. P. & Massey V. On the reaction of glucose oxidase from Aspergillus niger with bisulphite. Biol. Chem., 1961,241,3409-3416.

34. Gibson Q. H., Swoboda B. E. P. & Massey V. Kinetics and mechanism of action of glucose oxidase. J. Biol. Chem., 1964,239, 3927-3934.

35. Nakamura S., Hayashi S. & Koga K. Effect of periodate on the structure and properties of glucose oxidase. Biochem. Biophys. Acta., 1976, 445, 294-308.

36. Nilsson H., Akerlund. A. & Mosbach K. Determination of glucose, urea and penicillin using enzyme pH electrodes. Biochim. Biophys. Acta, 1973,320, 529-534.

37. Trettnak W., Leiner M. J. P. & Wolfbeis O. S. Fibre-optic glucose sensor with pH optrode as the transducer. Biosensors, 1988, 4, 15-26.

38. Bentley R. Glucose oxidase. Enzymes, 1963, 7, 567-586.

39. Bright H. J. & Gibson Q. H. The oxidation of 1-deuterated glucose by glucose oxidase. J. Biol. Chem., 1967, 242,994-1003.

40. Anderson R. F., Massey V. & Schopfer L. M. Puis radiolysis studies on the formation and dicay of the flavin 4a-hydroperoxide species of glucose oxidase. Flavins and Flavoproteins, Amsterdam, 57-60.

41. Kulys J. & Cenas N. Oxidation of glucose oxidase from penicillium vitate by one- and two-electron acceptors. Biochem. Biophys. Acta., 1983, 744, 57.

42. Wiseman A. Handbook of Enzyme Biotechnology. Wiley, London, 1975,122.

43. Cardosi M. F. & Turner A. P. F. Recent advances in enzyme based electrochemical glucose sensors. The Diabetes Annual, 1990, 5, 254-272.

44. Будников Г. К., Медянцева Э. П., Бабкина С. С. Амперометрические датчики на основе иммобилизованных ферментов. Успехи химии, 1991, 60(4), 881-910.

45. Gorton L. A carbon electrode Sputtered with palladium and gold for amperometric detection of hydrogen peroxide. Anal. Chem. Acta., 1985,178, 247-253

46. Schepartz A. I. & Subers M. H. Glucose oxidase of Honey. Biochem. Biophys. Acta., 1964, 85,228-237.

47. Bourdillon C., Thomas V. & Thomas D. Electrochemical study of D-glucose oxidase autoinactivation. Enz. Microb. Technol., 1982, 4, 175-180.

48. Updike S. J. & Hicks G. P. The Enzyme electrode, Nature, 1967,214, 986-988.

49. Turner A. P. F., Karube I. & Wilson G. S. Biosensors: Fundamentals Applications. Oxford 1989.

50. Saunders В. C. Holmes A. G. & Stark B. P. Peroxidase, 1964, Dutterworths, London.

51. Кулис Ю. Ю., Разумас В. Й. Биоамперометрш, Вильнюс: Мокслас, 1986.

52. Кулис Ю. Ю., Ченас Н.К. Ферментативный перенос электрона. Вильнюс: Моклас, 1988.

53. Kulys J., Buch-Rasmussen Т., Bechgard К., Razymas V., Kazlauskaite J., Marcinkeviciene J., Christensen J., Hansen H. Study of the new electron transfer mediators in glucose oxidase catalysis. Molec. Catalysis, 1994,91,407-420.

54. Fräser D. Biphenol as an electron transfer mediator for glucose oxidase. Anal. Letters, 1994, 27(11), 1039-1053.

55. Crumbliss A., Allen H., Hill O., Page D., The electrochemistry of hexacyanoruthenate at carbon electrodes and the use of ruthenium compounds as mediators in the glucose/glucose oxidase system. Electroanal. Chem., 1986,206, 327-331.

56. Cotton Т., Kaddi D., Iorga D. Surface-enhanced Raman scattering study of bipyridil-modifaied Ag electrodes. J. Am. Chem. Soc., 1993,105(25), 7462-7464.

57. Zakeeruddin S., Fräser D., Nazeeruddin M., Grätzel M. Towards mediator desing: characterization of /rä-(4,4'-substituted-2,2'-bipyridine) complexes of iron(II), ruthenium(II) and osmium(II) as mediators for glucose oxidase of Aspergillus niger and other redox proteins. Electoanal. Chem., 1992,337, 253-283.

58. Fräser D., Zakeeruddin S., Grätzel M. Towards mediator desing II. Optimization of mediator global charge for the mediation of glucose oxidase of Aspergillus niger. Electoanal. Chem., 1993,359, 125-139.

59. Рябов А. Д. Биоштурм металлоорганических соединений. Природа, 1997,4, 9-15.

60. Cass A., Davis G., Francis G., Hill O. Ferrocene-mediated enzyme electrode for amperometric determination of glucose. Am. Chem. Soc., 1984,56, 667-671

61. Fishman M. M. Enzymes in analytical chemistry. Anal. Chem., 1980, 53, 185-191.

62. Dicks J. M., Aston W. J., Davis G., Turner A. P. F. Mediated amperometric biosensors for D-galactose glycolate and L-amino acids based on a ferrocene-mediatied carbon paste electrode. Anal. Chim. Acta, 1986,182,103-112.

63. Кулис Ю. Ю., Кинетика и механизм переноса в белках. Yen. Химии, 1986,55(10), 1721-1741.

64. Albery W. J., Bartlett P. M., Cass A. E. G., Craston D. H., Haggett B. G. D. Electrochemical sensors: theory and experiment. J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1986,82, 1033-1038.

65. Koryta J. Electrochemical sensors based on biological principles. Electrochim. Acta. 1986,31,515-520.

66. Rapicault S., Limoges В., Degrand C. Renewable perfluorosulfonated ionomer carbon paste electrode for competitive homogeneous electrochemical immunoassays using a redox cationic labeled hapten. Anal. Chem., 1996,68, 930-935.

67. Mottola H. A. Automation in analytical laboratory. Analyst, 1987,112,719-726.

68. Frew J. E., Hill H. A. O. Electrochemical biosensors. Anal. Chem., 1987,59,933-340.

69. Green M., Hill O. Amperometric enzyme electrodes. Am. Soc. Faradey Trans. 1986, 82, 1237-1243.

70. Wellner I., Katz E., Willner B., Blonder R., Helegshabtai V., Buckmann A. F. Assembly of functionalized monolayers of redox proteins on electrode surfaces: novel bioelectronic and optobioelectronic systems. Biosensors & Bioelectron., 1997,12(4), 337-356.

71. Katz E., Helegshabtai V., Willner B., Wellner I., Buckmann A. F. Electrical contact of redox enzames with electrodes: novel approaches for amperometric biosensors. Bioelectrochem. Bioenerg., 1997, 42(1), 95-104.

72. Salle A. L. G., Limoges B., Rapicault S., Degrand C., Brossier P. New immunoassay techniques using nafion-modified electrodes and cationic redox labels or enzyme labels. Anal. Chim. Acta, 1995,3, 301-308.

73. Ryabov A. D., Amon A., Gorbatova R. K., Ryabova E. S. & Gnedenko B. B. Mechanism of a «Jamping off» ferricenium in glucose oxidase-D-glucose-ferrocene micellar electrochemical systems./ Phys. Chem., 1995,99,14072-14076.

74. Loffer U., Wiemhofer H., Gopel W. Biosensors & Bioelectron., 1991, 6, 343-350.

75. Fujihira Y., & Kuwana T. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974, 61(2), 538-5424.

76. Yeh P. & Kuwana T. Electrochem. Soc, 1976,123(9), 1334-1339.

77. Degani Y. & Heller A. Direct electrical communication between chemically modified enzyme and metal electrodes. 1. Electron transfer from glucose oxidase to metal electrodes via electron relays, bound covalently to the enzyme. J. Phys. Chem., 1987, 91, 1285-1289.

78. Badia A., Carlini R., Fernandez A., Battaglini F., Mikkelsen S., English A. Intramolecular electron-transfer rates in ferrocene-derivatized glucose oxidase. J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 7053-7059.

79. Riklin A., Katz E., Willner I., Stocker A., Buckmann A. F. Impruving enzyme-electrode contacts by modification of cofactors. Nature, 1995,376,672-675.

80. Miyawaky O. & Wingrad L. B. Electrochemical and enzymatic activity of flavin adenine dinucleotide and glucose oxidase immobilized by adsorption jn carbon. Biotechnol. Bloeng., 1984,26,1364-1371.

81. Turner A. Amperometric biosensors based on mediator-modified electrodes. Metods in Enzymology, 1988,137, 90-103.

82. Umana M. & Waller J. Protein-modified electrodes. The glucose oxidase/polypyrrol system. Anal. Chem., 1986, 58, 2979.

83. Schumann W., Ohara T., Schmidt H., Heller A. Electron transfer between glucose oxidase and electrodes via redox mediators bound with flexible chains to the enzyme surface. J. Am. Chem. Soc., 1991,113, 1394-1397.

84. Bartlett P., Booth S., Caruana D., Kilbum J., Santamaria C. Modification of glucose oxidase by covalent attachment of a tetrathiafulvalene derivative. Anal. Chem. 1997, 69, 734-742.

85. Willner I., Blonder R., Katz E., Stocker A. & Buckmann A. Reconstitution of apo-glucose oxidase nitrospiropyran-modified FAD cofactor yields a photoswitchable biocatalyst for amperometric transduction of recorded optical signals. J. Am. Chem. Soc., 1996,118, 5310-5311.

86. Hale P., Boguslavsky L., Inagaki T., Karan H., Lee H. S., Skotheim T., Okamoto Y. Amperometric glucose biosensors based on redox polymer-mediated electron transfer. Anal. Chem., 1991, 63, 677-682.

87. Haouz A., Twist C., Zentz C., Tanc P., Alper B. Dynamic and structural properties of glucose oxidase enzyme. Eur. BiophisicsJ. Biophys Lett., 1998, 27(1), 19-25.

88. Kunugi S., Murakami Y., Ikeda K., ItonN. Int. J. Biol. Macromol., 1992,14, 21089. Xie В., Khayyami M., Nwosu Т., Larson P-O., Danielsson B. Ferrocene-mediated therminal biosensor. Analyst, 1993,118, 845-848.

90. Suzawa Т., Ikariama Y., Aizawa M. Multiabeling og ferrocenes to a glucose oxidase-dioxin conjugate for the development of homogenious electroenzymatic immunoassay. Anal. Chem., 1994, 66, 3889-3894.

91. Sokolov V. I., Troitskaya L. L. & Reutov O. A. J. Organomet. Chem.,\919,182, 537-542.

92. Kober E., Casper J., Sullivan В., Meyer T. Synthetic routes to new polypyridil complexes of osmium(II). Inorg. Chem., 1988, 27, 4587-4598.

93. Lay P. A., Sanderson A. M. & Taube H Cw-to(2,2'-bipyridine-N,N') complexes of ruthenium(III)/(II) and osmium (III)/(II). Inorg. Synth., 1986, 24, 291-295.

94. Lehman T. & Thorpe C. Alternate electron acceptors for medium-chain acyl-CoA dehydrogenaseA use of ferricenium salts. Biochem., 1990, 29,10594-10600.

95. Ryabov A. D. & Goral V. N. Steady-state kinetics, micellar effects, and the mechanism of peroxidase-catalyzed oxidation of n-alkylferrocenes by hydrogen peroxide. J. Biol. Inorg. Chem., 1997,2,182-190.

96. Teale F. W. J. Clevage of the haem-protein link by acid methylethylketone. Biochim. Biophys. Acta. 1959,35, 543-552.

97. Рябов А. Д. Металлоорганическая энзимология, Металлоорганическая химия, 1990, 3(3), 489-502.

98. Bourdillon С., Demaille С., Moiroux J. & Savent J. M. New insights into the enzymatic catalysis of the oxidation of glucose by native and recombinant glucose oxidase mediated by electrochemically generated one-electron redox cosubstrates. J. Am. Chem. Soc., 1993, 115(1), 2-8.

99. Gorren A. C. F., Chan M. L., Crouse B. R. & Scott R. A. Synthesis and characterization of singly modified cytochrom с derivatives. Bioconjugate Chem, 1992,3(4), 291-297.

100. Atanasov P., Kaisheva A., Gamburzev S., Iliev I. & Bobrin S. Nickelocene - mediated glucose oxidase electrode. Electroanalysis, 1993, 5(1), 91-95.

101. Tegoulia V., Gnedenko В. B. & Ryabov A. D. Ferricenium salte intead of dioxygen in glucose oxidase catalysis. A direct interaction and analytical implications., Biochem. Molec. Biol., 1993,31, 769-775.

102. Goral V. N., Nelen' M. I. & Ryabov A. D. Ferrocene and ferricenium ion as versatile photometric titrants of H2O2 and D-glucose in the presence of peroxidase and glucose oxidase. A ferrocene-peroxidase stairway. Anal. Lett., 1995, 28,2139-2149.

103. Рябов А. Д. Ферментативная атака на металлоорганические соединения. Росс. Хим. Журнал, 1995, 39(11), 139-146.

104. Келети Т Основы ферментативной кинетики. М: Мир, 1990.

105. John Н., Keith В., Shisman L. Anal. Biochem., 1993, 212, 269-267.

106. Березин И. В., Мартинек К. Основы физической химии ферментативного катализа. М: Высшая школа, 1977.

107. Voet J., Сое J., Epstein J., Matossian V., Shipley T. Electrostatic control of enzyme reactions: effect of ionic strength on the pKa of an essential acidic group on glucose oxidase. Biochem., 1981,20, 7182-7190.

108. Ohsawa Y & Aoyagui S. A correlation between the half-wave potential and micelle-solubilization equilibrium of ferrocene in cationic micellar solutions. Electroanal. Chem., 1982,136, 353-359.

109. Миттел К. Мицеллообразование, солюбилизация и микроэмульсии. М: Мир, 1980.

110. Березин И. В., Мартинек К., Яцимирский А. К. Физико-химические основы ми-целлярного катализа. Yen. Химии, 1973, 42(10), 1729-1756.

111. Creagh A., Prausnitz J., Blanch H. The effect of aqueous surfactant solutions on alcohol dehydrogenase. Biotechnol. Bioeng., 1993, 41, 156-163.

112. Ohara T. J. Osmium bipyridyl redox polymers used in enzyme electrodes. Metals Rev., 1995,39, 54-62.

113. Gregg B. A., Heller A. Cross-linked redox gels containing glucose oxidase for amperometric biosensor applications. Anal. Chem., 1990,62, 258-263.

114. Gregg B. A., Heller A. J. Phys. Chem., 1991, 95, 5976-5980.

115. Heller A. Electrical connection of enzyme redox centers to electrodes. J. Phys. Chem., 1992, 96(9), 3579-3587.

116. Ohara T. J., Rajagopalan R., Heller A. «Wired» enzyme electrode for amperometric determination of glucose or lactate in the presence of interfering substances. Anal. Chem., 1994, 66(15), 2451-2457.

117. Shklover V., Zakeeruddin S. M., Nesper R., Fraser D. Tris(4,4'-dimethoxy-2,2'-bipy) Os (II) amperometric properties and crystal structure. Inorg. Chem. Acta., 1998, 274(1), 6472.

118. Медянцева E. П., Вертлиб M. Г., Будников Г. К. Ионы металлов как эффекторы ферментов. Yen. Химии., 1998, 67(3), 252-260.

119. Cusanelli A., Frey U., Richens D., Merbach A. The slowest water exchange ata homoleptic mononuclear metal center: variable-temperature and variable-pressure 17ONHR study on [Ir(H20)6]3+. J. Am. Chem. Soc., 1996,118, 5265-5271.

120. Wuttke D. S., Bjerrum M. J., Winkler J. R., Gray H. B. Electron - tunneling pathways in cytochrome c. Science, 1992,256, 1007-1009.

121. Mines G. A., Bjerrum M. J., Hill M. G., Casimiro D. R., Chan I-J., Winkler J. R., Gray H. B. Rates of heme oxidation and rudaction in Ru(His 33) cytochrome с at very high driving forces. J. Am. Chem. Soc., 1996,118,1961-1965.

122. Sigfridsson K., Sundahl M., Bjerrum M. J., Hansson O. J. Biol. Inorg. Chem., 1996,1, 405-414.

123. Bjerrum M. J., Casimiro D. R., Chan I-J., Di Bilo A. J., Gray H. В., Hill M., Langen R., Mines G. A., Skov L. K., Winkler J. R., Wuttke D. S. Electron transfer in ruthenium-modified proteins. J. Bioenerg. Biomem., 1995,27,295-302.

124. Ryabova E. S., Goral V. N. Csoregi E., Mattisson B. & Ryabov A. D. Coordinative approach to mediated electron transfer: ruthenium complexed to native glucose oxidase. Angew. Chem., 1999,38, 804-807.

125. Dwyer F., Goodwin H., Gyarfas E. Mono- and bis-(2,2'-bipyridine) and -(1,10-phenenthroline) chelates of ruthenium and osmium. Aust. J. Chem., 1963,16, 544-548.

126. Davis N. R. Mullins T. L Substitution reactions of some bis(2,2'-bipyridine) and mixed 2,2'-bipyridine, 2,2',2"-terpyridine complexes of ruthenium (II). Aus. J. Chem., 1967, 20(4), 657-668.

127. Davis N. R. Mullins T. L Substitution reactions of some bis(2,2'-bipyridine) and mixed 2,2'-bipyridine, 2,2',2"-terpyridine complexes of ruthenium (II) II. The kinetics of substitution of nitrite and other nucleophiles Aus. J. Chem., 1968,21(4), 915-925.

128. Johnson E. S., Sullivan B. P. Salmon D. J. Adeyemi S. A. & Meyer T J. Synthesis and properties of chloro-bringed dimer [(bpy)2RuCl]2+ and transient 3+ mixed-valence ion. Inorg. Chem., 1976,17(8), 2211-2215.

129. Allen L.R. Craft P. P. Durham B. & Walsh J. Substitution reactions of ruthenium(II) complexes containing 2,2'-bipyridine and 1,10-phenantroline. Inorg. Chem., 1987,26(1), 53-56.

130. Takashi Y., Akita M., Hikichi S., Moro-oka Y. Synthesis of variours cationic Ru aqua complexes with hydrotris-(3,5-diisopropyl pyrozolyl)borate ligand. Inorg. Chem., 1998, 37(13), 3186-3194.

131. Lever A. B. P. Electrochemical parametrization of metal complex redox potentials, using the ruthenium (III)/ruthenium (II) couple to generate a ligand electrochemical series. Inorg. Chem., 1990,29,1271-1285.

132. Hamachi I., Tanaka S., Tsukiji S., Shinkai S., Oishi S. Design and semisynthesis of photoactive myoglobin bearing Ru tris bpy using cofactor-reconstitution. Inorg. Chem., 1998, 37(13), 4380-4388.

133. Band L. Structure properties of peroxidase. Biotechnology., 1997,53(2-3), 253-263.

134. Takashi H., Takimura T., Aoyama Y., Hitomi Y., Suzuki A., Ogoshi H. Structure and reactivity of reconstituted myoglobins: interaction between protein and polar chain of chemically modifaed hemin. Inorg. Chem. Acta, 1998,275-276,159-167.

135. Ryabov A. D., Goral V. N., Gorton L. & Csoregi E. Electrochemically and catalytically active reconstituted horseradish peroxidase with ferrocene-modified hemin and artificial binding site. Chem. Eur. J., 1999, 5(3), 961-967.

Структурные формулы и сокращения для некоторых окисляющих субстратов глюкозооксидазы

О

Те

Ре

1Д'-

Диметиламиноме- „ ,

, Диметилферроцен

тил ферроцен ^ ^

Винилферроцен

1,1'-

Ферроцендикарбо-новая кислота

н3с

\

Ы-

/

н,с

1 -(Ы,1М-диметриламин) 4-(4-морфолин)бензол

(К>

/ \ N О

1,4-ди(4-морфолин)бензол

Н3С ' \ СН3

Н3С ^—и сн3 1 .4-диГ>Ш-диметиламин»бензол 1,4-ди(1-пиперидин)бензол

000

1 -(1 -пиперидин)-4(4-морфолин)бензол

9,10-фенантренхинон

О

фенотиазин

О

О

хинон

1,2-нафтохинон

тетрабромо-1,4-бензохинон

О

2-метил-1,4-бензохинон

Б"

I

1,2-дитиапирен

феноксазин

О

,Вг

О

2-бромо-1,4-бензохинон

4,4' дифенокси-2,2' -бипиридин (БРО-Ьру)

Метиленовый голубой

4,7-дигидрокси-1,10-фенантролин (DOH-phen)

-N

N-

4,4' -диэтиламино-2,2 ' -бипиридин (DEA-bpy)

N

4,4 ' -(пиридинметил)-2,2 ' -бипиридин (DNM-bpy)

H

Н3С-N

NH—СН3

\ А

/ \

N N=

4,4 ' -диметиламино-2,2 ' -бипиридин (DMA-bpy)

Н3С-О

О-СИ,

\_r<J>

^-N

4,4 ' - диметокси-2,2 ' -бипиридин (DMO-

Ьру)

НЯС

СН,

4,4 ' -диметил-2,2 ' -бипиридин (dm-bpy)

Í

НЯС

Л

СНЯ

\ // 4 —N

/ \

N-

4,4' -диэтокси-2,2' -бипиридин (DEO-Ьру)

H,N

NH,

\ К

/ \

N N=

4,4'-диамино-2,2'-бипиридин (DA-bpy)

Вывод уравнения 3.1.1

Из схемы 3.1.1, применяя стационарное приближение по отношению ко всем промежуточным продуктам фермента, т. е. по комплексу {ГО, Б-глкжоза} (ЕС), по восстановленной форме ГО (Ег) и по комплексу (ГО(восст.), Рс} (Ег, Рс) можно записать уравнения для скоростей каждой стадии этой реакции: 4Е0]

4ЕГ] 4ЕгРс]

[Е][й]- к4 [Ей]- &2[ЕО] = 0 (1)

= к2 [ЕС ] + к_3[Е г Р с] - к3 [Е г Р с] = 0 (2)

= к3 [Ег Рс]- к4[Ег¥с]-к_3 [ЕгРс] = 0 (3)

Л

где [Ев] и [ЕгРс] - концентрации фермент-субстратных комплексов с глюкозой и фер-рицинием соответственно, а [в], [Рс], [Е], [Ег]- концентрации глюкозы, феррициния, глюкозооксидазы в окисленной и восстановленной формах соответственно. Из уравнения материального баланса по ферменту:

[Е]0=[Е]+[ЕО]+[Ег]+[ЕгРс] (4)

можно выразить [Е,Рс], тогда выражение для начальной скорости реакции можно записать как:

У0=к4[ЪЩ=к4( [Е]о - [Е] - [ЕС] - [Ег]) (5)

Из уравнения 1 можно выразить [Ей], а из уравнения 2 и 3 [Ег]. Полученные выражения подставляем в выражение 5.

Го =М[Е]0 -[Е]--(6)

кл + к 2 [Р с]& 5 к4 (+ к 2)

Подставляя в уравнение материального баланса (4) приведенные выражения для [Ев], [Ег] и [ЕгРс], полученного из системы уравнений 2,3, после некоторых преобразований получаем следующее выражение для ¥о'.

V =к ГЕ1 /_Ьк&фсЫОЪ_

0 п +^)[Рс]0 + *;МДО]0[Рс]0 + к1к2к3[¥с]0[О]0 + к1к2(к4 + к_3)[О]0

ге-1 /-_к1к2к3[¥с]0[О]0_

Л 1оКк3к4(к-1 + к2)[¥с]0 + к,к3(к4 + к2)[в]0[¥с]0 + к;к2(к4+к_3)[ О]/

Нетрудно заметить, что выражение 7 легко приводится к уравнению 3.1.1:

Уп =

А:2^[Е]0[Рс]0[о]0

0 к4К^[¥с]0+к2К^[О]0+(к4 +*,)[О]0[Рс]0

гттг у а - Кис_к-*+к*

где Км -— , Км -

к1 к

з

Расчет константы равновесия К], используя спектральные данные рис. 3.4.6.

Для расчета К\ была использована следующая система уравнений, связывающих оптическую плотность (А), общую концентрацию Яи11 ([Яи]о), константу равновесия К\ и общую концентрацию пиридина ([Ру]о):

А = £"3а[3а] + £за'[3а'] (А1)

[Яи] = [За] + [За'] (А2)

К, = [За']/[За][Ру] (АЗ)

[Ру] = [Ру]о-[За'] (А4)

Концентрации [За] и [За'] были рассчитаны из уравнений А1 и А2 при [Яи]о =1.7x1О"4 М с использованием Еза =7196 и £3а = 5341 М"1 см"1, найденных при [Ру]о = 0 и °о соответственно. Комбинация уравнений АЗ и А4 приводит к конечному уравнению 3.4.2, которое описывается прямой в координатах [Ру]о/[За'] от 1/[За]. Тангенс угла наклона данной прямой равен 1/К\.

Расчет константы равновесия К], используя кинетические данные рис. 3.4.7

Уравнение 3.4.3. должно использоваться вместе с уравнениями А1-А4чтобы рассчитать равновесные концентрации [За] и [За'], которые затем используются в уравнении 3.4.2. для рассчета К\. Так как К\ не могла быть прямо рассчитана из кинетических данных, то была построена зависимость [Ру]о/[За'] от 1/[За], которая представляла собой прямую с тангенсом утла наклона равным МК\.