Кинетическое моделирование центрального метаболизма Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.28, кандидат биологических наук Песков, Кирилл Витальевич

• Песков, Кирилл Витальевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Песков, Кирилл Витальевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Центральный метаболизм Е. coli. Строение и принципы регуляции.

1.1.1. Фосфотрансферазная система.

1.1.2. Гликолиз.

1.1.3. Пентозомонофосфатный шунт и путь Энтнера-Дудорова.

1.1.4. Цикл трикарбоновых кислот и глиоксилатный шунт.

1.1.5. Глюконеогенез.

1.1.6. Дыхательная цепь.

1.2 . Моделирование центрального метаболизма Е. coli.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Методы кинетического моделирования биохимических путей.

2.2. Методы математического описания функционирования отдельных ферментов.

2.3. Методы и уровни детализации математического описания систем генной регуляции.

2.4. Верификация модели экспериментальными данными.

2.5. Методы анализа поведения кинетических моделей.

Глава 3. Кинетическое моделирование отдельных ферментов центрального метаболизма Е. coli.

3.1. Кинетичсекая модель фосфофруктокиназы-1 (PfkA).

3.2. Кинетичсекая модель фосфофруктокиназы-1 (PfkA).

3.3. Сравнение профилей активности двух изозимов фосфофруктокиназной реакции.

Глава 4. Построение и исследование метаболической модели центрального метаболизма Е. coli.

4.1. Построение метаболической модели.

4.2. Верификация метаболичское модели экспериментальными данными по фалксомике и протеомике.

4.3. Предсказания метаболической модели.

Глава 5 Кинетическое моделирование элементов генетической регуляции центрального метаболизма Е. coli.

5.1. Кинетическая модель регуляции транскрипции при помощи АМР-зависимого репрессора/индуктора (Сгр).

5.2. Кинетическая модель регуляции транскрипции при помощи репрессора фруктозного оперона FruR.

5.3. Кинетическая модель регуляции транскрипции при помощи репрессора асе оперона IclR.

5.4. Предсказание уровней стационарной экспрессии генов асе оперона.

Глава 6. Кинетическая модель центрального метаболизма Е. coli.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетическое моделирование центрального метаболизма Escherichia coli»

Актуальность проблемы. Кишечная палочка (Escherichia coli) на настоящий момент является одной из самых изученных бактерий. Столь высокий интерес к этому микроорганизму можно объяснить, исходя из следующих причин. Во-первых, кишечная палочка достаточно легко культивируется на всех основных углеродных субстратах (как в аэробных, так и в анаэробных условиях). Во-вторых, геном Е. coli полностью известен, при этом считается, что для 80% генов прослежены их основные функции в метаболизме клетки [1]. В-третьих, эта бактерия очень часто используется в биоинженерных исследованиях, а также в качестве основного компонента значительного числа биотехнологических реакторов. Не удивительно, что столь существенное внимание к этому микроорганизму позволяет сегодня использовать его в качестве модели для изучения одной из важнейших в биохимии и микробиологии проблем — исследования жизнедеятельности и развития единичной клетки. Одним из основных аспектов этой проблемы можно считать исследование путей обмена веществ в клетке, или клеточного метаболизма. За более чем пятидесятилетнюю историю изучения метаболизма Е. coli исследователям удалось собрать значительное количество информации [2]. Более того, с развитием в XXI-ом веке таких экспериментальных методик, как метаболомика, транскриптомика, протеомика и флаксомика удалось накопить немало информации и о функционировании метаболизма в целом как единой комплексной системы. На сегодняшний день одним из сдерживающих факторов в исследовании данной проблемы можно считать недостаточное развитие теоретических подходов для анализа и интерпретации подобных экспериментальных данных. Именно эту задачу и призвано решать кинетическое моделирование биохимических путей как наиболее перспективный подход метаболического моделирования. Дествительно, кинетические модели способны не только описывать большинство типов биохимических данных, используя всю информацию о структуре, стехиометрии и регуляции, реализуемой в системе, но и получать предсказания, характеризующие функционирование метаболических путей. Создание подобной модели центрального метаболизма Е. coli, которая, с одной стороны, способна выступить в роли депозитария максимально возможного количества биологической информации о свойствах исследуемой системы, а с другой, может быть применена для получения достоверных предсказаний о ее функционировании, является на сегодняшний день одним из важнейших направлений в системной биологии. Кроме того, данная модель будет полезна не только в фундаментальных исследованиях отдельных проблем метаболизма, но и в ряде прикладных разработок, таких как культивирование бактериальных штаммов или оптимизация штаммов-продуцентов, что наделяет представляемую кинетическую модель центрального метаболизма Е. coli дополнительной инновационной составляющей.

Цель данной работы состояла в создании кинетической модели, содержащей в себе максимально возможное количество биологической информации о структуре, стехиометрии, регуляции и других биохимических свойствах центрального метаболизма Е. coli, и применении данной модели для нахождения основных регуляторных механизмов, лежащих в основе согласованного ответа генетической и метаболической регуляторных систем.

Для достижения поставленной цели в ходе работы решались следующие задачи:

1. Реконструкция путей центрального метаболизма Е. coli, а также сетей его метаболической и генетической регуляции.

2. Построение кинетических моделей отдельных ферментов и элементов генной регуляции, составляющих пути центрального метаболизма Е. coli. Верификация данных моделей при помощи различных типов in vitro экспериментальных данных.

3. Построение кинетических моделей центрального метаболизма Е. coli, описывающих регуляцию как на метаболическом, так и генном уровне. Верификация данных моделей при помощи различных типов in vivo данных.

4. Анализ поведения модели и соотношения потоков между различными анаплеротическими реакциями при культивировании Е. coli в проточном ферментере и лимитированном росте на глюкозе.

5. Предсказание роли регуляторных механизмов, лежащих в основе функционирования центрального метаболизма Е. coli, таких как дублирование ряда реакций изозимами ферментов, а также нахождение новых регуляторных взаимодействий, оказывающих существенное влияние на поведение центрального метаболизма Е. coli.

Научная новизна. В отличие от большинства существующих математических моделей метаболических путей, модель, разработанная в процессе нашей работы, не имеет на сегодняшний день аналогов по уровню детализации и верификации экспериментальными данными, а следовательно, и по уровню предсказательной способности и достоверности. В частности, на настоящий момент при создании кинетических моделей бактериального метаболизма не предпринималось попыток, описания столь крупных систем, когда помимо гликолиза и пентозомонофосфатного шунта в единой системе детально учитываются' цикл Кребса, глиоксилатный шунт и глюконеогенез,- а также подробным образом отражается регуляторная нагрузка, на уровне как метаболической; так и генной регуляции. Кроме того, только в разработанной нами модели приняты в рассмотрение такие аспекты функционирования метаболизма, как дублирование реакций изозимами, детальное описание аллостерических свойств ферментов, влияние на скорости реакций таких биохимических факторов, как рН и внутриклеточная концентрация ионов магния и марганца. Построенная модель также не имеет аналогов по степени верифицирования экспериментальными данными, т. к. в процессе ее построения мы использовали in vitro данные о свойствах ферментов и элементов генной регуляции центрального метаболизма, а также in vivo данные по транскриптомике, протеомике, метаболомике и флаксомике системы. При помощи кинетической модели, разработанной в ходе данного исследования, сделан ряд предсказаний о функции изозимов и ряда анаплеротических реакций центрального метаболизма Е. coli.

Практическое значение. В ходе работы при помощи разработанной модели центрального метаболизма было предложено объяснение проблемы разного метаболического поведения К и В штаммов Е. coli, когда при одинаковых условиях культивирования бактерии разных штаммов по-разному потребляют и метаболизируют основные углеродные субстраты (глюкоза, ацетат). На базе данной модели показан путь создания единого депозитария биохимической информации метаболической системы, содержащего, как in vivo, так и in vitro экспериментальные данные. Разработан ряд методик для анализа и интерпретации при помощи кинетических моделей экспериментальных данных по метаболомике и флаксомике. Разработанная кинетическая модель центрального метаболизма Е. coli может быть использована для решения широкого спектра биоинженерных задач, таких как оптимизация штаммов-продуцентов и условий культивирования микроорганизмов, что позволит существенным образом сократить объем средств и времени, затрачиваемых на проведение подобных исследований.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 12-ой и 15-ой международных конференциях «Математика. Компьютер. Образование» (Пущино, 2005 год; Дубна, 2008); на конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» (Москва, 2005); на 12-ой международной конференции по биотермокинетике (Тракай, 2006); на седьмой международной конференции по системной биологии (Йокогама, 2006); на третьей международной конференции по системной биологии Е. coli (о. Джеджу, 2006); на конференции молодых ученых «Перспективы развития инноваций в биологии» (Москва, 2007); на российско-немецком симпозиуме по системной биологии (Москва, 2008).

Публикации. По материалам работы опубликовано 13 научных работ в отечественных и зарубежных научных журналах, в том числе 2 статьи в рецензируемых научных журналах, 2 статьи в сборниках статей и 9 публикаций в сборниках научных конференций.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, шести глав исследований, заключения, списка литературы и приложения. Работа представляет собой рукопись на 181 странице, включая 38 рисунков и 39 таблиц. Список литературы содержит 285 работ.

Заключение диссертации по теме «Биоинформатика», Песков, Кирилл Витальевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенного в данной работе исследования были сформулированы следующие выводы:

1. Реконструированы пути центрального метаболизма Е. coli, а также сети метаболической и генетической регуляции этой бактерии.

2. Построены и верифицированы in vitro экспериментальными данными кинетические модели отдельных ферментов и элементов генетической регуляции центрального метаболизма.

3. Построены и верифицированы in vivo экспериментальными данными различных типов (метаболомики, транскриптомики, протеомики, флаксомики и др.) метаболическая кинетическая модель, которая способна описывать процессы, протекающие в проточном ферментере, и полная кинетическая модель, способная описывать процессы, протекающие в периодических ферментерах.

4. Основываясь на анализе поведения модели, мы оценили соотношение потоков между различными анаплеротическими реакциями при культивировании Е. coli в проточном ферментере и лимитированном росте на глюкозе.

5. Сделан ряд предсказаний о регуляторных свойствах исследуемой системы. В частности показано, что в условиях аэробного лимитированного роста на глюкозе в проточном ферментере функционирует только один из изозимов фосфофруктокиназы - PfkA, тогда как между изозимами пируваткиназы происходит разделение потоков, при этом более активной является РукА. Кроме того, при помощи модели нам удалось предсказать новую регуляторную связь — ингибирование фосфоглюконат дегидроганазы (Gnd) при помощи фосфоенолпирувата.

БЛАГОДАРНОСТИ

В заключение, я хотел бы поблагодарить всех тех, кто оказывал мне помощь и поддержку при выполнении представляемой работы. В первую очередь мне хотелось бы выразить сердечную благодарность Олегу Владимировичу Дёмину за неоценимый вклад как в научную составляющую работы, так и в саму возможность ее осуществления. Также мне хотелось бы поблагодарить всех сотрудников нашей лаборатории Екатерину Могилевскую, Наиля Гиззаткулова, Татьяну Плюснину, Артема Демиденко, Сергея Пушкина, Татьяну Карелину, Юрия Коссинского, Евгения Метелкина, Сергея Смирнова, Екатерину Горячеву, Наталью Багрову и Александра Дороднова за помощь в создании отдельных элементов модели и плодотворное обсуждение результатов.

Отдельно мне хотелось бы сказать слова благодарности научному руководителю представляемой работы Юрию Георгиевичу Каминскому за оказанную мне поддержку при выполнении работы и подготовки ее к защите.

Самые теплые слова благодарности мне хотелось бы посвятить моей большой и дружной семье и в особенности моей маме Марии Всеволодовне Песковой и жене Наталии Шкуриной.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Песков К. Демин О. Кинетическая модель фруктозобисфосфатазы из клеток печени быка. // «Математика, Компьютер, Образование». Труды XII международной конференции. - Пущино (Россия). — 2005. — Т. 3. — с. 203.

2. Песков К., Демин О. Кинетическая модель фруктозобисфосфатазы из клеток Escherichia coli. II Тезисы конференции «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» - Москва (Россия). - 2005. - с. 57.

3. Peskov К., Demin О. Acetate operon expression in Escherichia coli cells. Kinetic modeling of genetic regulation. // The 12th Meeting of the BioThermoKinetics: Systems Biology: redefining BioThermoKinetics. — Trakai (Lithuania). - 2006. — p. 61-64.

4. Demin O., Dorodnov A., Peskov K., Karelina Т., Gizzatkulov N., Metelkin E., Moglevskaya E., Kosinsky Y., Plusnina Т., Dubinsky A. Development of large-scale kinetic models on the basis of enzyme structural and functional information: progress and problems. Kinetic modeling of genetic regulation. // The 12th Meeting of the BioThermoKinetics: Systems Biology: redefining BioThermoKinetics. — Trakai (Lithuania): — 2006. - p. 25-26.

5. Peskov K., Demin O. Kinetic Modeling of Gene Expression. Study of ace Operon Genetic Regulation in Escherichia coli cells. // The Seventh International Conference on Systems Biology (ISCB). - Yokohama (Japan). - 2006. - p. 105.

6. Peskov K, Demin O. Kinetic modeling of ace Operon Genetic Regulation in Escherichia coli cells. // The third IECA Conference on Systems Biology of Escherichia coli. - Jeju Island (Republic of Korea). - 2006. - p. 149.

7. Песков K.B. Построение математических моделей основных путей бактериального метаболизма и их применение для разработки нового подхода к оптимизации штаммов-продуцентов. // Тезисы 1-ой научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» — Москва (Россия). — 2007. — с. 112.

8. Песков К.В, Демин О.В. Кинетическая модель фосфофруктокиназы-2 из клеток Escherichia coli. II «Математика, Компьютер, Образование». Труды XV международной конференции. — Дубна (Россия). - 2008. — Т. 3. — с. 202.

9. Peskov К., Demin О: Kinetic modeling , of Escherichia coli central carbon; metabolism // Helmholtz German-Russian Workshop on Systems Biology. — Moscow (Russia). — 2008. - p. 5810. Peskov K. V.,.Goryanin I. I., Demin O.V. Kinetic Model of Phosphofructokinase-1 from

Escherichia coli. II Journal of Bioinformatics and Computational Biology. - 2008. - V. 6. № 4.-p. 843-867.

11. Peskov К. V., Goryanin I. I., Prank K., Tobin F., Demin O.V. Kinetic model of ace operon genetic regulation of E. coli. II Journal of Bioinformatics and Computational Biology. -2008. - V. 6. № 5. - p. 933-959.

12. Mogilevskaya E., Peskov K., Metelkin E., Plyusnina Т., Lebedeva G., Goryanin I., Demin O. Kinetic Modeling of E. coli Enzymes: Integration of in vitro Experimental Data. // Systems Biology and Biotechnology of E. coli. (Отв. ред. Sang Yup Lee) - 2009. - p. 177-207.

13. Mogilevskaya E., Bagrova N., Plyusnina Т., Gizzatkulov N. Metelkin E., Goryacheva E., Smirnov S., Kosinsky Y., Dorodnov A., Peskov K., Karelina Т., Lebedeva G., Goryanin I. and Demin O. Kinetic modeling as a tool to integrate multilevel dynamic experimental data. // Methods Mol. Biol. - 2009. - 563. - p. 197-218.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Песков, Кирилл Витальевич, 2009 год

1. Nelson D.L. and Cox M.M. Lehninger. Principles of Biochemistry. 4th edition. //. New York: W.H.Freeman and Company. 2005. - 1120.

2. Krebs H.A. and Johnson W.A. The role of citric acid in intermediate metabolism in animal tissues. // Enzymologia. 1937. - V. 4. - p. 148-156.

3. Krebs H.A. The Croonian Lecture, 1963. Gluconeogenesis. // Proc. R. Soc. Lond. В Biol. Sci. 1964. - V. 159. - p. 545-564.

4. Buchholz A., Hurlebaus J., Wandrey C., and Takors R. Metabolomics: quantification of intracellular metabolite dynamics. // Biomol. Eng. — 2002. — V. 19. p. 5-15.

5. Danchin A. and Secowska A. Expression profiling in reference bacteria: dreams and reality. // Genome Biology. 2000. - V. 1. - p. 1024.1-1024.5.

6. Phelps T.J., Palumbo A.V., and Beliaev A.S. Metabolomics and microarrays for improved understanding of phenotypic characteristics controlled by both genomics and environmental constraints. // Curr. Op. Biotech. 2002. - V. 13. - p. 20-24.

7. Han M.-J. and Lee S.Y. Proteome profiling and its use in metabolic and cellular engineering. // Proteomics. 2003. - V. 3. - p. 2317-2324.

8. Han M.-J. and Lee S.Y. The Escherichia coli Proteome: Past, Present, and Future Prospects. // Microbiol. Mob Biol'. Rev. 2006. - V. 70. - p. 362^139:.

9. Nobeli I. and Thornton J.M. A bioinformatician's view of the metabolome. // BioEssays. — 2006.-V. 28.-p. 534-545.

10. Mori H. and Begley T. Metabolomic analysis of microorganisms-. // Mol. BioSyst. — 2008. -V. 4.-p. 108-109.

11. Holms H. Flux analysis and control of the central metabolic pathways in Escherichia coli. // FEMS Microbiol. Rev. 1996. -V. 19. - p. 85-116.

12. Siebold C., Flukiger K., Beutler R., and Erni B. Carbohydrate transporters of the bacterial phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase system (PTS). // FEBS Lett. — 2001. V. 504.-p. 104-111.

13. Kundig W., Gosh S., and Roseman S. Phosphate bound to histidine in a protein as an intermediate in a novel phosphotransferase system. // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1964. V. 52. -p. 1067-1074.

14. Plumbridge J. Regulation of gene expression in the PTS in Escherichia coli: the role and interactions of Mlc. // Curr. Op. Microbiol. 2002. - V. 5. - p. 187-193.

15. Rye S., Ramseier T.M., Michotey V., SaierJr. M.H., and Garges S. Effect of the FruR regulator on transcription of the pts operon in Escherichia coli. II J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - p. 2489-2496.

16. Saier M.H. Jr. and Ramseier T.M. The catabolite repressor/activator (Cra) protein of enteric bacteria. // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - p. 3411-3417.

17. Ferenci T. Adaptation to life at micromolar nutrient levels: the regulation of Escherichia coli glucose transport by endoinduction and cAMP. // FEMS Microbiol. Rev. 1996. - V. 18. -p. 301-317.

18. Death A. and Ferenci T. The importance of the binding-protein-dependent Mgl system to the transport of glucose in Escherichia coli growing on low sugar concentrations. // Res. Microbiol. 1993.-V. 144.-p. 529-537.

19. Bettenbrock K., Fischer S., Kremling A., Jahreis K., Sauter Т., and Gilles E.-D. A Quantitative Approach to Catabolite Repression in Escherichia coli. // J. Biol. Chem. — 2006. -V.281.-p. 2578-2584.

20. Peng L. and Shimizu K. Global metabolic regulation analysis for Escherichia coli K12 based on protein expression by 2-dimensional electrophoresis and enzyme activity measurement. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V. 61. - p. 163-178.

21. Schreyer R. and Bock A. Phosphoglueose Isomerase from Escherischia coli KI2: Purification, Properties and Formation under Aerobicand Anaerobic Condition. // Arch. Microbiol. 1980. - V. 127. - p. 289-298.

22. Ogawa Т., Mori H., Tomita M., and Yoshino M. Inhibitory effect of phosphoenolpyruvate on glycolytic enzymes in Escherichia coli. // Res. Microbiol. 2007. - V. 158. - p. 159-163.

23. Kotlarz D. and Buc H. Two Escherichia coli fructode-6-phosphate kinases. Preparative purification, oligomeric structure and immunological studies. // Biochim. Biophys. Acta -1977.-V. 484.-p. 35-48.

24. Vinopal R.T. and Fraenkel F.G. Phenotypic suppression of phosphofructokinase mutations in Escherichia coli by constitutive expression of the glyoxylate shunt. // J. Bacteriol. 1974. -V. 118.-p. 1090-1100.

25. Vinopal R.T. and Fraenkel F.G. PflcB and pfkC loci of Escherichia coli. И J. Bacteriol. -1975. V. 122. - p. 1153-1161.

26. Daldal F. Molecular cloning of the gene for phosphofructokinase-2 of Escherichia coli and the nature of a mutation, pfkBl, causing a high level of the enzyme. // J. Mol. Biol. 1983. -V. 168.-p. 285-305.

27. Daldal F. Nucleotide sequence of gene pfkB encoding the minor phosphofructokinase of Escherichia coli K-12. // Gene. 1984. - V. 28. - p. 337-342.

28. Bork P., Sander C., and Valencia A. Convergent evolution of similar enzymatic function on different protein folds: The hexokinase, ribokinase, and galactokinase families of sugar kinases. // Protein Sci. 1993. - V. 2. - p. 32-40.

29. Babul J. Phosphofructokinases from Escherichia coli. И J. Biol. Chem. — 1978. — V. 253. — p. 4350-4355.

30. Kotlarz D. and Buc H. Phosphofructokinases from Escherichia coli. II Methods Enzymol. -1982.-V. 90.-p. 60-70.

31. Ausat I., Bras G.L., and Garel J.-R. Allosteric activation increases the maximum velocity of E.coli phosphofructokinase. // J. Mol. Biol. 1997. - V: 267. - p. 476-480. ,

32. Kotlarz D. and Buc H. Regulatory properties of Phosphofructokinase-2 from Escherichia coli. II Eur. J. Biochem. 1981. - V. 117. - p. 569-574.

33. Guixe V. and Babul J. Effect of ATP on phosphofructokinase-2 from Escherichia coli. II J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - p. 11001-11005.

34. Blangy D., Buc H., and Monod J. Kinetic of the allosteric interactions of phosphofructokinase from Escherichia coli. II J. Mol. Biol. 1968. — V. 31. - p. 13-35.

35. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. //. Москва: Наука. 1978. - с. 230.

36. Szwergold B.S., Ugurbil К., and Brown T.R. Properties of fructose- 1,6-bisphosphate aldolase from Escherichia coli: an NMR analysis. // Arch. Biochem. Biophys. 1995. - V. 317.-p. 244-252.

37. Baldwin S.A., Perham R.N., and Stribling D. Purification and Characterization of the Class-Il D-Fructose-l,6-Bisphosphate Aldolase from Escherichia coli (Crookes1 Strain). // Biochem. J.- 1978.-V. 169.-p. 633-641.

38. Plater A.R., Zgiby S.M., Thomson G.J., Qamar S., Wharton C.W., and Berry A. Conserved Residues in the Mechanism of the E. coli Class II FBP-aldolase. // J. Mol. Biol. 1999. - V. 285.-p. 843-855.

39. Mathur D., Malik G., and Garg L.C. Biochemical and functional characterization of triosephosphate isomerase from Mycobacterium tuberculosis H37Rv. // FEMS Microbiol. Lett. 2006. - V. 263. - p. 229-235.

40. D'Alessio G. and Josse J. Glyceraldehyde Phosphate Dehydrogenase of Escherichia coli. Structural and catalytic properties. // J. Biol. Chem. 1971. - V. 246. - p. 4326-4333.

41. Hidalgo E., Limon A., and Aguilar J. A second Escherichia coli gene with similarity to,gapA. // Microbiologia. 1996. - V. 12. - p. 99-106.