Кинетический метод оценки антиоксидантной активности и безреагентный медиаторный биосенсор тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат химических наук Вохмянина, Дарья Владимировна

• Вохмянина, Дарья Владимировна
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Вохмянина, Дарья Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Модифицированные электроды

1Л. Способы модификации электродов

1.2. Модифицированные электроды для определения пероксида водорода..

Глава 2. Антиоксидантная активность

2.1. Антиоксиданти, входящие в состав крови человека

2.1. Методы определения антиоксидантной активности

Глава 3. Биосенсоры

3.1. Основные определения

3.2. Классификация биосенсоров

Глава 4. Иммобилизация ферментов при конструировании сенсоров

4.1. Использование ионообменных полиэлектролитов для иммобилизации фермента

4.2. Использование сред с высоким содержанием органического растворителя

Глава 5. Экспериментальная часть

5.1. Материалы

5.2. Оборудование

5.3. Методы

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 6. Безреагентный биосенсор на основе глюкозооксидазы и

медиатора, иммобилизованных в мембрану полиэлектролита

6.1. Выбор медиатора

6.2. Гомогенная кинетика взаимодействия азинов с восстановленным активным центром глюкозооксидазы

6.3. Иммобилизация азинов в мембраны нафиона методом «вымачивания»

6.4. Формирование мембран нафиона с иммобилизованным азином путем совместного нанесения из раствора

6.5. Совместная иммобилизация азинов и глюкозооксидазы для разработки биосенсоров второго поколения

6.6. Выбор потенциала и медиатора для определения глюкозы

6.7. Каталитические свойства ферментного электрода

6.8. Определение глюкозы в проточно-инжекционном режиме биосенсором на основе фенотиазина

6.9. Стабильность глкжозного биосенсора второго поколения на основе фенотиазина

6.10. Определение глюкозы в цельной крови

Глава 7. Конструирование электроаналитической системы для

определения глюкозы в цельной крови

7.1. Оптимизация концентрации ПАВ для гидрофилизации верхнего слоя пластика капилляра

7.2. Электрохимические измерения для биосенсора в системе с капилляром

7.3. Определение глюкозы биосенсорами на основе фенотиазина в системе с капилляром

Глава 8. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов по кинетическим параметрам реакции разложения в них пероксида водорода

8.1. Оценка антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода в растворе антиоксидантов

8.2. Оценка антиоксидантной активности в экстрактах

8.4. Выражение антиоксидантной активности через количество эквивалентов тролокса

8.5. Определение антиоксидантной активности методом, основанным на спектрофотометрической регистрации максимума спектра поглощения тиобарбитурат-активных продуктов ПОЛ

8.6. Антиоксидантная активность соков

Глава 9. Оценка антиоксидантной активности сыворотки крови

9.1. Адаптация условий проведения измерений

9.2. Аналитические характеристики сенсора на пероксид водорода

9.3. Оценка антиоксидантной активности сыворотки крови спортсменов до и после нагрузки по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода

Глава 10. Определение антиоксидантной активности в коллоидных

растворах диоксида церия

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АОА антиоксидантная активность

АФК активные формы кислорода

БЛ берлинская лазурь

год глюкозооксидаза

КВВ конденсат выдыхаемого воздуха

МДА малоновый диальдегид

ПОЛ перекисное окисление липидов

пэ планарный электрод

пэм просвечивающая электронная микроскопия

ПФС перфторсульфонированный полимер

СРО свободнорадикальное окисление

СУЭ стеклоуглеродный электрод

ТБК тиобарбитуровая кислота

ЦВА циклическая вольтамперограмма

АВТ8 2,2'-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота)

БРРН 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил

00532 оптическая плотность при длине волны 532 нм

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетический метод оценки антиоксидантной активности и безреагентный медиаторный биосенсор»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Электрохимические методы как нельзя лучше удовлетворяют требованиям современного анализа, таким как чувствительность, избирательность, экспрессность, простота и невысокая стоимость проведения анализа. По сравнению с другими аналитическими методами они просты и удобны в применении, не требуют пробоподготовки, а также позволяют осуществлять непрерывный мониторинг анализируемого вещества. Эти преимущества обеспечивают широкое применение электрохимических сенсоров в клинической диагностике, пищевой промышленности и контроле состояния окружающей среды.

Сахарный диабет является тяжелым заболеванием, которым страдает не менее 10% населения Земли. Общепризнанным является тот факт, что самостоятельное определение концентрации глюкозы является ключевым аспектом в контроле диабета [1]. За год проводится более 6 миллиардов определений глюкозы в крови человека: фактически, определение глюкозы -это самый распространенный и часто используемый химический анализ.

В большинстве производимых тест-систем используются электрохимические биосенсоры на основе фермента (глюкозооксидазы или глюкозодегидрогеназы) и медиаторов (как правило, металлорганических соединений или комплексов переходных металлов). Медиатор -низкомолекулярное редокс-активное соединение, переносящее электроны от активного центра фермента к поверхности индикаторного электрода.

К недостаткам медиаторных биосенсоров можно отнести то, что они не являются безреагентными. Это не позволяет использовать их для многоразового анализа или для постоянного мониторинга концентрации аналита (анализ on-line и in-line). Для создания безреагентного медиаторного биосенсора необходимо иммобилизовать на поверхности электрода как фермент, так и медиатор. При этом, чтобы медиатор не утратил свою функцию «электронного шаттла», он должен оставаться диффузионно-подвижным, будучи иммобилизованным в мембране.

Большое внимание в клинической химии уделяется проблеме окислительного стресса, являющегося одним из главных факторов риска при развитии некоторых серьезных заболеваний, таких как атеросклероз, почечная недостаточность, старение, рак и других [2-6]. Окислительный стресс возникает при нарушении в организме окислительно-восстановительного баланса. Этот факт вызывает огромный интерес к антиоксидантам - веществам, способным снизить скорость окислительных реакций и, как следствие, восстановить этот баланс.

Современные методы оценки антиоксидантной активности можно разделить на две группы. Первая группа методов основана на детекции окисляемого продукта, например, продукта окисления липидов. Однако такие методы требуют больших временных затрат и использования биологических тканей. Поэтому большой интерес вызывают методы, основанные на генерации радикалов в образце и изучении их дальнейшего разложения. Большинство современных методик анализа использует в качестве оксидантов различные радикалы. Но время жизни природных радикалов (таких, как супероксид-радикал и гидроксид-радикал) пренебрежимо мало, что не позволяет полностью проследить за кинетикой их разложения. Основным недостатком использования стабильных искусственных радикалов (АВТ8-радикал и ОР Р Н-рад и кал) и окислителей (СЬ, Вг2, Ь, комплексы трехвалентного железа, бихромат-анион) является то, что таких окислителей нет в человеческом организме. Единственным достаточно сильным и стабильным природным окислителем является пероксид водорода. Ранее в лаборатории электрохимических методов МГУ имени М.В.Ломоносова был разработан сенсор на пероксид водорода на основе берлинской лазури - самого эффективного электрокатализатора восстановления пероксида водорода [7], с помощью которого возможно осуществлять постоянный мониторинг концентрации Н202. Для оценки антиоксидантной активности предлагается использовать реакцию разложения пероксида водорода под действием антиоксидантов после его инжекции в образец.

Цель работы состояла в разработке амперометрических биосенсоров на основе фермента (глюкозооксидазы) и медиаторов (азиновых красителей) для определения глюкозы в цельной крови, а также в разработке кинетического метода оценки антиоксидантной активности в растворах физиологически-активных веществ и наночастиц, а также в биологических жидкостях.

Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих

задач:

^ выбор оптимального медиатора для фермента глюкозооксидазы по кинетическим параметрам взаимодействия с активным центром фермента, электрохимической активности и способности удерживаться в мембране полиэлектролита; ^ осуществление совместной иммобилизации глюкозооксидазы и медиатора в мембрану перфторсульфонированного полимера на поверхности электрода; ^ интеграция полученного биосенсора с тонкослойной ячейкой для создания системы электроанализа малых (1-1.5 мкл) объемов образца;

разработка способа оценки антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода с использованием электрохимического сенсора на основе берлинской лазури для контроля концентрации Н202; ^ оценка антиоксидантной активности в реальных объектах: коллоидных растворах наночастиц диоксида церия и сыворотке крови спортсменов.

Научная новизна. Разработан новый способ совместной иммобилизации фермента и медиатора из водно-органических сред с высоким содержанием спиртов в мембрану на поверхности электрода. Осуществлена совместная иммобилизация фермента и медиаторов в мембрану полиэлектролита без ковалентного сшивания. Найден новый медиатор для фермента глюкозооксидазы - фенотиазин, способный эффективно осуществлять

транспорт электронов между активным центром фермента и электродом. Показано сохранение диффузионной подвижности медиатора после иммобилизации в ферментсодержащую мембрану.

Разработан амперометрический биосенсор на основе глюкозооксидази: и фенотиазина, иммобилизованных в мембрану перфторсульфонированного полимера без образования ковалентной связи. Биосенсор интегрирован в тонкослойную ячейку для анализа малых объемов (1-1.5 мкл) анализируемого образца.

Предложен новый способ оценки антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода. Возможность применения нового способа оценки антиоксидантной активности в водных растворах антиоксидантов доказана сравнением с классическим методом, основанным на регистрации максимума спектра поглощения ти о барбитурат-активных продуктов перекисного окисления липидов, на примере биологических добавок. Впервые оценена антиоксидантная активность наночастиц Се02. Показано, что антиоксидантная активность наночастиц зависит от условий их синтеза. Показано, что антиоксидантная активность сыворотки крови спортсменов значимо меняется в процессе физической нагрузки, что открывает перспективы применения способа для оценки состояния гипоксии в клинической диагностике.

Практическая значимость. Разработан безреагентный медиаторный биосенсор на глюкозу, обладающий следующими аналитическими характеристиками в проточно-инжекционном режиме: диапазон определяемых концентраций глюкозы 0.5 - 20 мМ, коэффициент чувствительности (1.34±0.06) мА-М"' см"2. Биосенсор интегрирован в тонкослойную ячейку для минимизации объема пробы, полученная система применима для анализа цельной крови. Разработанный способ оценки антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода применим для оценки антиоксидантной активности пищевых продуктов и сыворотки крови в целях

клинической диагностики. Кинетический способ оценки антиоксидантной активности позволяет определять активность коллоидных растворов наночастиц, что невозможно сделать другими методами.

Положения, выносимые на защиту:

1. Новый способ совместной иммобилизации фермента и медиатора в мембрану без использования ковалентного связывания.

2. Фенотиазин - новый медиатор для фермента глюкозооксидазы.

3. Создание безреагентного медиаторного глюкозного биосенсора с диапазоном определяемых концентраций глюкозы 0.5 - 20 мМ и коэффициентом чувствительности (1.34±0.06) мАМ"'см"2 путём совместной иммобилизации глюкозооксидазы и медиатора на поверхности электрода.

4. Создание системы для анализа малых объемов (1-1.5 мкл) анализируемого образца путем интеграции биосенсора с тонкослойной ячейкой.

5. Новый способ оценки общей антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода под действием антиоксидантов.

6. Возможность оценки антиоксидантной активности наночастиц способом, основанным на изучении реакции разложения Н202. Зависимость антиоксидантной активности наночастиц от условий их синтеза.

7. Способ оценки общего антиоксидантного статуса сыворотки крови на основе определения кинетических параметров реакции разложения пероксида водорода. Значимое возрастание антиоксидантной активности сыворотки крови спортсменов после физической нагрузки.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были опубликованы в 2 статьях в зарубежных реферируемых научных

журналах и тезисах 9 докладов, представленных на всероссийских и международных научных конференциях:

> Съезд аналитиков России и Школа молодых ученых «Аналитическая химия - новые методы и возможности» (пансионат «Клязьма», 2010);

> Симпозиум «Second Regional Symposium on Electrochemistry: South-East Europe» (Belgrade, 2010);

> Третий международный конкурс научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 2010);

> Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2011);

> V Всероссийская конференция студентов и аспирантов «Химия в современном мире» (Санкт-Петербург, 2011);

> Третья выставка инновационных проектов, посвященная 300-летию М.В.Ломоносова (Москва, 2011);

XI конференция молодых ученых "Актуальные проблемы неорганической химии: наноматериалы, их исследование и модификация при помощи синхротронного излучения" (Звенигород, 2011);

> VIII Всероссийская конференция по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2012» (Уфа-Абзаково, 2012);

> Конференция «63 Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry» (Прага, 2012).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Модифицированные электроды

До середины 70-х годов XX века в качестве индикаторных электродов в электроаналитической химии в основном применяли электроды из ртути и углеродных материалов, а также благородных металлов (Аи, Ag, металлы платиновой группы). Однако на поверхности таких электродов электрохимические реакции часто протекают необратимо и требуют приложения значительного перенапряжения. Кроме того, многие электроды имеют недостаточную коррозионную стойкость и селективность, т.е. не позволяют определять вещества, имеющие близкие потенциалы окисления (восстановления). Все эти проблемы можно решить при использовании модифицированных электродов. Понятие «модифицированный электрод» относят к любому электроду, поверхность которого обработана таким образом, что характер электрохимического отклика меняется [8]. При модификации на поверхность электрода наносят (физическими или химическими методами) химические соединения или полимерные пленки, которые обеспечивают протекание процесса переноса электронов с высокой скоростью и при малом перенапряжении.

1.1. Способы модификации электродов

Существуют разные способы модификации электродов, среди которых можно выделить несколько основных групп [9]:

• необратимая адсорбция на поверхности электрода;

• фиксация модификатора через образование ковалентных связей;

• включение в полимерную или неорганическую пленку;

• введение в материал электрода (например, графитовую пасту);

• электрохимический синтез модификатора.

Оптимальный способ модификации выбирают исходя из свойств подложки и модификатора; при этом должна обеспечиваться прочная связь

между модификатором и поверхностью электрода и высокая скорость обмена электронами между подложкой и электроактивным веществом в растворе или на поверхности электрода.

Наиболее простым методом модификации поверхности является адсорбция модификатора. К преимуществам данного метода следует отнести то, что он не требует специальных реагентов для присоединения модификатора к электроду, к недостаткам - возможность десорбции модификатора.

При использовании ковалентного сшивания молекул модификатора с поверхностью электрода получают более стабильные системы. Чаще всего используют кислородсодержащие соединения с окси-, гидрокси- или карбокси-группами. Преимуществом ковалентного связывания является отсутствие утечки модификатора с поверхности электрода. В то же время, при образовании ковалентной связи существует вероятность повреждения электроактивных функциональных групп модификатора и, как следствие, потеря активности.

Изготовление электродов с полимерным покрытием - более простой способ закрепления модификатора, чем получение ковалентно связанных монослоев, т.к. полимерные пленки гораздо проще закрепить на поверхности электрода. Увеличение толщины пленки приводит к увеличению ее прочности, однако при слишком большой толщине пленки может наблюдаться неполное участие редокс-центров в переносе заряда и ухудшение электропроводности пленки. Электропроводящие пленки полимеров наносят на поверхность осаждением мономера из раствора и его последующей полимеризацией под действием тлеющего разряда, радиации, света или протекания электрического тока. Преимуществами электрохимической полимеризации являются получение электропроводящих пленок полимера, локализованных на поверхности электрода, и осуществление контроля над свойствами покрытия в процессе его получения. Для получения пленок электропроводящих полимеров чаще всего используют пиррол, анилин, тиофен, фенилен и их замещенные аналоги. Так, модификация поверхности электрода полианилином позволяет преодолеть порог чувствительности потенциометрического рН трансдьсера, составляющий

59 мВ/рН. Использование в качестве рН-трансдыосера пленок полианилина, допированного камфорсульфоновой кислотой, позволило получить потенциометрический датчик с коэффициентом чувствительности 90 мВ/рН в диапазоне шести единиц рН (от рН 3 до рН 9) [10]. Часто для получения необходимых характеристик электрода (проводимость, селективность) используют сополимеризацию различных мономеров.

В качестве модификаторов также применяют неорганические вещества: цеолиты, глины, оксиды металлов, силикаты и др. При использовании глин и цеолитов появляется возможность избирательного концентрирования определяемых веществ на поверхности электрода в зависимости от сорбционных свойств модификатора и размера его пор. Но вследствие малой электропроводности таких материалов их иммобилизацию проводят за счет включения в пленку электропроводящего полимера или в состав угольной пасты самого электрода. Электроды, модифицированные оксидами переходных металлов, катализируют многие редокс-процессы вследствие переноса кислорода в оксидных пленках.

Включение модификатора в полимерную пленку позволяет решить сразу несколько задач: механическая изоляция поверхности электрода от воздействия электролитов; повышение селективности за счет дискриминации веществ по заряду, размеру, полярности и т.д.; удерживание модификатора на поверхности электрода; механическая защита от повреждений. Полимерные пленки используют как матрицу для инкапсулирования модификатора или как защитную (и часто избирательно проницаемую) пленку на поверхности модифицированного электрода.

1.2. Модифицированные электроды для определения пероксида водорода

Определение пероксида водорода является важной аналитической задачей для клинической диагностики, контроля состояния окружающей среды и в различных областях промышленности. Около 50% мирового производства пероксида водорода используется для изготовления целлюлозы и отбеливания бумаги [11]. В пищевой промышленности растворы пероксида водорода

применяются для дезинфекции поверхностей технологического оборудования и упаковки (технология «Tetra Рак»), непосредственно соприкасающихся с продукцией [12]. Возникает необходимость определения пероксида водорода в грунтовых водах и атмосферных осадках, куда он попадает в результате промышленных выбросов [13,14].

Благодаря высокой растворимости и стабильности, содержание пероксида водорода может быть определено в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) [15]. У здоровых людей содержание пероксида водорода в КВВ не зависит от возраста, пола и легочной функции [16]. В то же время было показано, что концентрация пероксида водорода повышена в КВВ у больных бронхиальной астмой [16-18]. Определение концентрации пероксида водорода в КВВ можно использовать для выявления субъектов с более высоким риском развития болезней легких, связанных с курением [19,20].

Таким образом, пероксид водорода является потенциальным маркером воспаления и оксидативного стресса в легких. Анализ КВВ является ценным неинвазивным методом диагностики различных легочных заболеваний и степени их тяжести, а также может быть использован для определения эффективности лечения.

Показано, что пероксид водорода играет важную роль в иммунной системе. Повреждение тканей хвостового плавника рыбки Данио Рерио приводит к генерации пероксида водорода, который, как полагают, вызывает движение лейкоцитов к ране, активируя тем самым процесс заживления [21]. Блокирование способности продуцировать пероксид водорода подавляет процесс накопления лейкоцитов в месте повреждения. В работе [22] выдвинуто предположение, что в легких больных бронхиальной астмой повышенное содержание пероксида водорода (по сравнению со здоровыми людьми) также связано с высоким содержанием лейкоцитов.

К современным методам анализа Н202 предъявляются следующие требования: они должны быть малоинвазивными и иметь возможность непрерывного определения концентрации в зависимости от времени. Как

нельзя лучше этим требованиям удовлетворяют электрохимические методы. По сравнению с другими методами анализа (спектрофотометрия, флуориметрия и люминесцентные методы), применение электрохимических сенсоров обладает рядом преимуществ, таких как дешевизна и простота в использовании, отсутствие необходимости в пробоподготовке, а также возможность непрерывного мониторинга пероксида водорода непосредственно в исследуемом образце.

Определение пероксида водорода на платиновых электродах требует использования высоких потенциалов (0.6 В, здесь и далее в тексте потенциал указан относительно электрода сравнения в 1М КС1) и представляет

собой необратимый двухэлектронный процесс окисления Н202 [23]. При этом константа скорости окисления Н202 составляет порядка 10~6 см/с, а диапазон определяемых концентраций пероксида водорода - от МО"7 до 1-Ю"4 М [24]. Однако при разработке сенсоров для определения пероксида водорода важнейшим требованием, обуславливающим применимость сенсоров в медицинских целях, является возможность осуществления низкопотенциального определения, поскольку в биологических жидкостях присутствуют легко восстанавливающиеся вещества, мешающие определению. Уменьшить мешающее действие восстановителей можно, в первую очередь, понижая потенциал индикаторного электрода. Этого можно добиться путем модификации электродов различными веществами.

1.2.1. Электроды, модифицированные металлооргаиическими

медиаторами, оксидами и гидроксидами переходных металлов

В целях снижения окислительного потенциала при электрокаталитическом определении пероксида водорода с 90-х годов прошлого столетия исследуются многие металлоорганические медиаторы, в частности класса фталоцианинов и порфиринов. В общем случае медиатор -это молекула, способная эффективно переносить электроны от молекулы субстрата (или фермента) на электрод. По данным [25], где авторы модифицировали соответствующими медиаторами графитовые печатные

электроды, лучшие среди прочих свойства продемонстрировали фталоцианины кобальта (СоРс) и железа (РеРс). Однако, потенциал амперометрического определения пероксида водорода по-прежнему высок: 0.6 В для СоРс, 0.45 В для СоРс(ОЕ08 [26] и 0.27 В для РеРс [25].

02 04 06

Рис. 1. Зависимость перенапряжения выделения кислорода от энтальпии перехода ДНЬ кДж/моль от оксида с более высокой степенью окисления металла к оксиду с более низкой степенью окисления: 1) РЬ02; 2) №203; 3) РЮ2; 4) Мп02; 5) 11и02; 6) 1Ю2; 7) и 8) Со30„; 9) и 10) РезОф (9) и 10) - в расчете для шпинелей) [27].

Большое количество работ посвящено исследованию оксидных катализаторов в целях создания сенсоров на пероксид водорода. Направленный поиск оксидных материалов связан с возможностью сопоставления эффективности катализа редокс-реакций с участием кислорода и энтальпий перехода от оксида с более низкой степенью окисления металла к оксиду с более высокой степенью окисления, ДНЬ кДж/моль. На рис. 1 представлена зависимость перенапряжения выделения кислорода от ДНЬ кДж/моль. Зависимость имеет вулканоподобный вид. Ее объяснение основывается на предположении, что значение перенапряжения может определяться не только адсорбцией реакционноспособных частиц, но и удалением прореагировавших частиц с поверхности электрода (подтверждается независимыми электрохимическими экспериментами) [27].

5 1

- : 6. -о , . -

- Ч -7 ^ 4 2/ -Тч / \ 4 х 1 1 ч

10

/1

( / \ 1 >

о Лоо Зоо Зоо

_\н;7и тоГ'

Также подтверждением предложенной интерпретации зависимости является увеличение перенапряжения выделения кислорода с увеличением времени эксплуатации оксидных электродов. Действительно, для оксидов, расположенных с левой стороны вулканоподобной кривой, характерно наличие вакансий в подрешетке кислорода. Уменьшение их количества (количества катионов металла низкой валентности) приведет к уменьшению теплоты адсорбции интермедиата и увеличению кислородного перенапряжения. Для нисходящей ветви характерно наличие вакансий в подрешетке металла. Уменьшение их числа приведет к увеличению теплоты адсорбции и увеличению перенапряжения выделения кислорода [28].

Так, в работе [29] в качестве электрокатализатора восстановления пероксида водорода предлагается использовать наночастицы СиО, образующиеся на поверхности медного электрода в процессе гидротермального синтеза. Линейный диапазон определяемых концентраций описанного в работе [29] сенсора - от 42.5 мкМ до 40 мМ, коэффициент чувствительности - 88.4 мА-М''-см"2.

Очевидно, наиболее перспективные с точки зрения электрокатализа оксиды следует искать среди расположенных на вершине вулканоподобной кривой. Неудивительно, что большое количество работ, посвященных исследованию оксидных катализаторов в целях создания сенсоров для определения пероксида водорода, связано с использованием различных форм оксида марганца (IV) [30,31].

В некоторых работах в качестве сенсора на пероксид водорода используют гидроксиды переходных металлов. Авторы [32] предлагают использовать для определения пероксида водорода электрод на основе кремниевых нанотрубок, модифицированных гидроксидом никеля. В работе [33] с той же целыо предлагается использовать стеклоуглеродные электроды, модифицированные слоями двойных гидроксидов №-А1 и Со-А1. В первом случае диапазон определяемых концентраций составил от 36 до 175 мкМ пероксида водорода, во втором - от 0.2 до 674 мМ [33].

1.2.2. Биосенсоры на основе пероксидаз

До недавнего времени единственной системой, в которой осуществлялось селективное восстановление пероксида водорода в присутствии кислорода при низком потенциале (0, -50 мВ), был биосенсор на основе пероксидазы [34]. В настоящее время разрабатываются пероксидазные электроды, реализующие как медиаторный, так и прямой перенос электронов между ферментом и электродом [35-39]. Чувствительность анализа, а также соотношение между количеством фермента, включенным в прямой и медиаторный перенос зависят от источника фермента. Например, чувствительность анализа при использовании пероксидазы сладкого картофеля при прочих равных условиях

(вращающийся дисковый графитовый электрод, прямой перенос) в четыре раза

1 • -

превосходит таковую для пероксидазы табака и составляет 0.82 А-М" см"" [38].

8 6

Линейный диапазон определяемых концентраций Н202 - от 4 10" М до 7 -10" М.

В последнее время в качестве модификатора поверхности электрода все чаще используют различные наночастицы (в частности, наночастицы золота с медиатором - тионином [40] - и без медиатора, с прямым биоэлектрокатализом [41]) или нанотрубки (многостенные углеродные нанотрубки с использованием толуидинового голубого в качестве медиатора [42]). Для защиты полученных систем часто используют полимеры, такие как хитозан [40, 42]. В частности, подход, описанный в [40], позволил значительно увеличить верхний предел диапазона определяемых концентраций пероксида водорода (до 110"4 М) при некотором ухудшении нижнего предела, который составил 1 • 10"7.

К недостаткам ферментных систем можно отнести невозможность обеспечивать долговременную стабильность ввиду склонности фермента к денатурации, а также узкий линейный диапазон определяемых концентраций Н202 и низкий верхний предел определяемых концентраций (порядка ~ 10"3 М). К недостаткам пероксидазных электродов можно также отнести низкую специфичность; так как некоторые из восстановителей, присутствующих в

реальных объектах, являются субстратами фермента пероксидазы; такой ферментный электрод не позволяет избежать их мешающего действия.

1.2.3. Электроды, модифицированные гексацианоферратами переходных металлов

Возможность избирательного определения пероксида водорода по реакции его восстановления в присутствии кислорода на электродах, модифицированных гексацианоферратом железа (берлинской лазурыо, БЛ) при нулевом потенциале и рН, близких к нейтральным, в широком диапазоне концентраций Н202, впервые была продемонстрирована в 1994 г. в нашей лаборатории [43]. Регистрация пероксида водорода по его восстановлению позволяет понизить потенциал и достичь максимальной селективности сенсора.

-1С0 О 100 200

1:., мВ

Рис. 2. Вольтамперограмма электрода, модифицированного берлинской лазурыо; □ - фоновый ток восстановления кислорода воздуха, В - ток восстановления 0.1 мМ ЬЬОг, ♦ - 10 мкМ Н202 [7].

В результате оптимизации процедуры осаждения пленок БЛ на электродах удалось синтезировать селективный в широком диапазоне потенциалов электрокатализатор восстановления Н202 [7]. Видно, что при нулевом потенциале ток восстановления пероксида водорода в сотни раз превосходит таковой для кислорода (рис. 2). Использование низкого потенциала определения позволяет устранить шумовой ток легко восстанавливающихся веществ.

Таблица 1. Сравнение электрокаталитических свойств существующих систем для определения Н2О2

Сенсор Селективность, ](Н202)/](02) Электрохимическая константа, см/с ссылка

Платиновый электрод 0.1 4-Ю"6 [25]

Пероксидазный электрод 30-40 110° [35]

Электрод на основе БЛ 400-600 1-Ю"2 [44]

Табл. 1 обобщает сведения об электрокаталитических характеристиках основных существующих на данный момент систем для определения пероксида водорода. Видно, что электроды на основе БЛ превосходят платиновые электроды на три порядка как по электрохимической константе, так и по селективности определения пероксида водорода в присутствии кислорода. В то же время стоимость катализатора, синтезируемого из неорганических солей железа, на три порядка ниже, чем платинового. Кроме того, электроды, модифицированные БЛ, в отличие от платины не подвержены отравлению низкомолекулярными соединениями (такими как тиолы, сульфиды и др.), а возможность использования низких потенциалов при определении Н202 позволяет избежать мешающего влияния восстановителей, присутствующих в системе (урат, аскорбат, парацетамол). Все это позволяет значительно расширить область применения датчиков на основе БЛ.

Основными преимуществами сенсоров на основе БЛ по сравнению с пероксидазными сенсорами является их стабильность, широкий диапазон определяемых концентраций и высокая селективность как по кислороду, так и по ряду восстановителей, которые также являю тся субстратами пероксидаз.

В нашей лаборатории был разработан сенсор на пероксид водорода на основе БЛ с рекордными аналитическими характеристиками [45]. Диапазон определяемых концентраций сенсора охватывает семь порядков по

9 2

концентрации (1-10" - 1-10" М), коэффициент чувствительности составил 0.7 А-М"'-см"2.

Несмотря на достаточно высокую операционную стабильность, позволяющую проводить более 2000 измерений в проточно-инжекционном режиме, одним из недостатков БЛ была ее недостаточная стабильность при длительном контакте с высокими концентрациями ггероксида водорода, что не позволяло осуществлять непрерывный мониторинг его концентрации в системе, что является принципиальным для ряда приложений. Для решения этой проблемы в нашей лаборатории была предложена послойная модификация электродов слоями Б Л и гексоцианоферрата никеля, что позволило достигнуть 100% стабильности в течение 2 часов под действием 1 мМ пероксида водорода [46].

* * *

Таким образом можно заключить, что наиболее эффективным электрокатализатором для определения пероксида водорода на настоящий момент является БЛ. В нашей лаборатории разработан стабильный сенсор на пероксид водорода на основе БЛ, обладающий широким диапазоном определяемых концентраций и высокой чувствительностью и позволяющий проводить непрерывный контроль концентрации Н202 в течение нескольких часов. В частности, такой датчик мог бы предоставить возможность изучить кинетические характеристики реакции разложения пероксида водорода под действием антиоксидантов для измерения общей антиоксидантной активности.

Глава 2. Антиоксидантная активность

Большое внимание в клинической химии уделяется проблеме оксидативного стресса, являющегося одним из главных факторов риска при развитии некоторых серьезных заболеваний, таких как атеросклероз, почечная недостаточность, старение, рак и других [2-6]. Оксидативный стресс возникает при нарушении в организме окислительно-восстановительного баланса. Этот

факт вызывает огромный интерес к антиоксидантам - веществам, способным снизить скорость окислительных реакций и, как следствие, восстановить этот баланс.

2.1. Антиоксиданты, входящие в состав крови человека

Антиоксидантная система человека имеет сложный состав и включает различные по своей природе соединения. Основные классы этих соединений приведены ниже.

Фенольные антиоксиданты. Многие антиоксиданты содержат в своей основе фенольные соединения (рис. 3). Самая обширная группа среди них -флавоноиды.

1аоП = '/спеа Ріг»эпопее

.С.

.. О: .і

XX

с

Т " I Л Л г Т

JaiC.it: Л 7.- -Зп з і Сг і

'Зс ІІ'ЇІҐ! ; -С - - їьрї І'іґі

1__'бОІі* »О»-*

Г»; ІахіР Ї-7— і-З .іЗае в*ре і. П

Ріа'. апеїб г і г V ог«с І8

о.

її:

> гі г1 І1..1 т

"^СН о

Г^'СГ'пґс ъ — .сн :«7«_.эп

Е^че^'с'-' ҐІ ^ й З'й і —-ОН І'.т ЇЇ'

гЛСгЮїгійС*- І ' і- Н, З Р) Ї-'О -І «С<~ ічОГП -.2*-О *

ґі ї 1 Г 5- 7-У-- «Оп -ііт'іп -Оп

сан»: ¿НІ =

ІОїг'йе П -Ї їЗІа І! н 5»7»3*--ч»5-Іп

АпІГ.ОСу5ПІЙІП5

ї

-є і » '.'і І .

Суапс-і' і-'--' — -'

¿1 'і.чп £-~---С-*

А ПЇГ.ОС у = ПІП5

J ^аІгС'О-ГІт С"£. з .'ІП.'І Йв

Рис. 3. Основные фенольные ангиоксидангы [471

Важнейшим свойством многих фенольных соединений является способность к обратимому окислению, то есть из фенольных групп в хиноидные, и восстановлению последних в гидрохинон (рис. 4).

Это обуславливает их участие в окислительно-восстановительных реакциях, в которых они могут быть донорами или акцепторами электронов и протонов. В ходе ступенчатого свободнорадикальиого окисления (СРО) промежуточными продуктами являются семихинонные радикалы, которые в присутствии легкоокисляющихся веществ проявляют антиоксидантный эффект до тех пор, пока полностью не превратятся в гидрохиноны.

Рис. 4. Равновесие хинон-гидрохинон с промежуточным соединением

Как показывают исследования, только восстановленные (фенольпые) формы проявляют антиоксидантные свойства, в то время как окисленные (хинонные) формы фенольных соединений обладают очень слабой (па 3 порядка ниже) ашиоксидантной активностью (ДОА) [48].

он

о

о

Tocopherols

W п

Рис. 5. Структурные формулы токоферолов, токотриенолов и тротокса [47]

Витамин Е. В настоящее время под общим названием витамин Е объединена группа токоферолов — маслянистых веществ, хорошо растворимых в жирах и органических растворителях, но нерастворимых в воде. К группе токоферолов относя т и водорастворимый аналог витамина Е - тролокс. На рис. 5 представлены структурные формулы веществ, относящихся к группе токоферолов.

Биологическая активность того или иного токоферола в значительной степени зависит от его гидрофобной боковой цепи - структурно-соответствующие звенья этой части молекулы токоферола специфически включаются (встраиваются) в мембрану, точнее, в ее липидный двойной слой [49].

Кофермент О. Это группа коферментов - бензохинонов, содержащих хиноидную группу и несколько изопрениловых групп. Структурная формула кофермента Р представлена на следующем рисунке:

Рис. 6. Структурная формула кофермента

В клетках человека и большинства млекопитающих представлено только одно из соединений группы кофермента С) - кофермент 0>](). Его естественный уровень в крови человека составляет порядка 1 мг/л [50]. Кофермент С), в отличие от других антиоксиданте в, регенерируется организмом. Кофермент восстанавливает АОА витамина Е [51 ].

Эстрогены. Общее собирательное название подкласса стероидных гормонов, производимых в основном яичниками у женщин и в небольших количествах у мужчин.

Они могут накапливаться в биомембранах и непосредственно влиять на их структуру и функцию. Механизм их действия подобен фенольным антиоксидантам и обусловлен антирадикальной активностью. Таким образом, в сложной многоступенчатой антиоксидантной системе организма имеется

о

о

:Н,

гормональное звено. Поэтому очевидно, что собственный гормональный фон организма может оказывать влияние на скорость перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Серосодержащие соединения. Одним из таких соединений является глутатион:

Рис. 7. Структурная формула глутатиона.

Отношение восстановленный/окисленный глутатион внутри клетки является одним из важнейших параметров, который показывает уровень внутриклеточной токсичности (уровень оксидативного стресса) [52]. Эти биомолекулы, включающие ЭН-группы, обеспечивают функционирование одного из основных механизмов антиоксидантной системы.

Витамин С (Ь-аскорбиновая кислота, аскорбат). Аскорбиновая кислота (АК) является восстановителем за счёт наличия в молекуле енольной группировки. Как хороший донор электронов, она легко окисляется различными окислителями. Таким образом, витамин С является одним из сильнейших антиоксидантов.

Концентрация аскорбиновой кислоты в плазме в норме составляет приблизительно 10—20 мкг/мл. К тому же от обеспеченности организма витамином С зависит уровень витамина Е в тканях [53].

Витамин А и каротиноиды. Витамин А и его предшественники — каротиноиды — являются полиненасыщенными соединениями, для которых характерно чередование простых и сопряженных двойных связей (рис. 8).

НБ

О

Рис. 8. Структурные формулы основных каротиноидных антиоксидангов |47].

Как витамин А, так и (3-каротин защищают мембраны клеток мозга от разрушительного действия свободных радикалов, при этом (3-каротин нейтрализует самые опасные виды свободных радикалов: радикалы

полиненасыщенных кислот и радикалы кислорода [54].

* * *

Таким образом, в организме сосуществует множество антиоксидантов, которые сложным образом влияют на активность друг друга и на общую антиоксидантную активность (т.е. суммарную способность всех антиоксидантов, имеющихся в системе, защищать биологические клетки от действия оксидантов). При этом зачастую необходимо знать именно общую антиоксидантную активность образца, которую невозможно определить даже при известных антиоксидантных активностях и концентрациях отдельных компонентов системы.

2.1. Методы определения антиоксидантной активности

Методы определения антиоксидантной активности крайне разнообразны. Особенностями процесса окисления являются окисляемый субстрат, антиоксидант и инициатор окисления, а также интермедиа™ и конечные продукты; мониторинг концентрации любого из этих веществ может быть использован для оценки антиоксидантной активности.

При определении антиоксидантной активности инициатор окисления и целевой субстрат должны быть тщательно обдуманы. Антиоксидант может

защищать липиды от окислителей, в то время как другие биологические молекулы подвергаются их разрушающему действию. Кроме того, эффективность действия антиоксиданта зависит от используемого окислителя, а разные антиоксиданты могут нелинейно влиять на активность друг друга. Все это является причинами того, что в настоящее время не существует общепринятого метода определения общей антиоксидаптной активности.

Нужно быть очень осторожными при экстраполировании данных, полученных in vitro, на пищевые продукты, и особенно на живые системы, так как общая антиоксидантная активность является результатом интерференции множества факторов. Более того, существует существенная разница между антиоксидантной активностью отдельного антиоксиданта и активностью того же антиоксиданта в смеси различных антиоксидантов.

Результаты выражаются различными способами, что затрудняет сравнение. Практическое определение должно показывать как минимум две вещи: дает ли данное вещество антиоксидантный или прооксидантный эффект (т.е. ослабляет или усиливает действие оксидантов) в тестовых условиях и какой-либо количественный показатель этого эффекта для сравнения с другими веществами.

Для оценки антиоксидантной активности используются различные методы. Современные методы оценки антиоксидантной активности можно разделить на две группы. Первая группа методов основана на детекции окисляемого продукта, например, продукта окисления липидов. Однако такие методы требуют больших временных затрат и использования субстрата -биологических тканей. Поэтому большой интерес вызывают методы, основанные на генерации радикалов в образце и изучении их дальнейшего разложения, не требующие использования субстрата.

2.2.1. Тесты на стабильность

Тесты на стабильность масел и жиров, такие как Rancimat, Active Oxygen Method и Schaal oven test обычно включают в себя изучение степени порчи продукта [55,56], иногда под действием УФ излучения, но чаще под действием

температуры. Нагревание масел и периодическое тестирование прироста веса -один из старейших методов определения антиоксидантной активности [57]. Он не требует сложного оборудования и определяет непосредственно поглощение кислорода, хотя прирост массы может быть вызван другими факторами. Для их исключения образец подвергают предварительному нагреву в инертной атмосфере. Методика может быть усовершенствована до более сложного непрерывного мониторинга массы и энергетических изменений в образце, как это сделано в термогравиметрии/дифференциальной сканирующей калориметрии. Результат выражается в виде времени индукции. Чем больше это время, тем эффективнее антиоксидант [58,59]. Обычные субстраты - сало, пищевые масла, или модельные субстраты, например, метиллинолеат.

2.2.2. Содержание пероксидов

Этот параметр представлен общим содержанием пероксидов и гидроксидов в липидной фазе. Для его расчета обычно используется метод йодометрического титрования, разработанный более 60 лет назад [60] и являющийся основой стандартных методов [61,62] определения концентрации пероксидов. Гидроксиды и пероксиды окисляют водный йодид-ион до йода, который затем титруется стандартным раствором тиосульфата и крахмала как индикатор конечной точки. Реакции выглядят следующим образом:

ROOH + 2Н+ + 2Г 12 + ROH + Н20 ROOR + 2Н+ + 21" -> I2 + 2ROH I2 + 2S 2 0 32"-^ S4062" + 2r где ROH - гидроксид липида и ROOR - пероксид липида. Содержание пероксидов затем рассчитывается в миллиэквивалентах на килограмм образца. К ограничениям данного метода относятся [63] низкие чувствительность и селективность, возможность присоединения йода по ненасыщенным связям липидов, ведущая к заниженным результатам, окисление йодида растворенным кислородом и различная активность разных пероксидов. По этим причинам были разработаны другие методы определения содержания пероксидов, но йодометрическое титрование все еще остается стандартной процедурой.

2.2.3. Определение концентрации ТБК-активпых продуктов ПОЛ (TBARS)

Метод TBARS (Thiobarbituric acid reactive substances) был предложен более 40 лет назад и сейчас является одним из наиболее широко используемых методов для определения антиоксидантной активности [64]. Методика включает определение малонового диальдегида (МДА), формирующегося при расщеплении ненасыщенных жирных кислот в результате окисления липидов. Постулируется, что образование МДА из жирных кислот, содержащих меньше трех двойных связей, происходит при вторичном окислении первичных карбонильных соединений [65]. МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием розового пигмента (TBARS), как показано на рис. 9, который затем измеряется спектрофотометрически по поглощению на 532-535 нм.

Рис. 9. Образование пигмента при взаимодействии ТБА с малоновым диальдсгидом [65].

Процедура включает два этапа: сначала субстрат окисляется при добавлении ионов переходных металлов (меди или железа) или источника свободных радикалов и затем степень окисления определяется при добавлении ТБК и спектрофотометрическом определении продуктов. Окисление ингибируется при добавлении антиоксидантов и можно увидеть уменьшение поглощения. Результаты могут быть описаны как степень подавления окисления. Процедура ТВАЯЭ широко используется, несмотря на

неспецифичность реакции и существенное влияние условий окисления на развитие окраски.

2.2.4. Определение концентрации конечных продуктов распада

В результате разрушения первичных продуктов окисления липидов образуется сложная смесь [66], включающая эпоксиды, кетоны (например, бутаноны, пентаноны, октаноны), углеводороды, а также насыщенные и ненасыщенные альдегиды, такие как гексаналь. Используются различные методы определения этих более или менее стабильных конечных продуктов окисления. Антиоксидантная активность характеризуется степенью подавления одного или более вторичных продуктов окисления в сравнении с контролем. Гексаналь - один из наиболее часто определяемых продуктов ПОЛ, для его определения используются как сенсорные, так и физико-химические методы. В то время как другие методики не являются специфичными, физико-химическое определение гексаналя предлагает возможность анализа единственного, хорошо определяемого конечного продукта. Значимость гексаналя как аналита для мониторинга окисления (или для определения антиоксидантной активности) выявлена Снайдером и коллегами [67], которые показали, что образование гексаналя на порядок превышает образование всех других продуктов окисления. Исключение составляет пентаналь, концентрации которого сравнимы с концентрациями гексаналя, из-за высокой стабильности он может быть даже более подходящим аналитом, чем гексаналь.

2.2.5. Определение содержания свободных радикалов

Метод ABTS

Методика основана на ингибировании образования радикальных катионов 2,2'-азинобис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновой кислоты (ABTS) [68] и не требует использования субстрата. ABTS обладает высокой растворимостью в воде а также химической стабильностью и дает пик поглощения при 342 нм. Субстрат пероксидазы, окисляясь в присутствии пероксида водорода, образует метастабилы-гый радикальный катион с

характеристическим спектром поглощения и высоким поглощением при 414 нм. В спектре присутствуют также вторичные пики поглощения при 645, 734 и 815 нм. Его использование основано на образовании ферримиоглобинового радикала, который затем реагирует с ABTS с образованием радикального катиона, как показали Райс-Эванс и Миллер [68]. Накопление ABTS'+ может быть остановлено в присутствии антиоксидантов. Сравнительная способность антиоксидантов разрушать ABTS'+ может быть определена спектрофотометрически по поглощению вблизи 734 нм, чтобы снизить интерференцию с другими поглотителями и мутностыо образца.

Дифенилпикрилгидразин (DPPIi) радикал

Метод основан на контроле концентрации DPPH-радикала, который используют в качестве оксиданта. DPPH-радикал поглощает при 517 нм и во вторичной системе, в отсутствие субстрата, антиоксидантная активность может быть определена по уменьшению этого поглощения при уменьшении концентрации DPPH-радикала за счет его разрушения антиоксидантами. Результаты выражаются в виде ЕС5о, т.е. количества антиоксиданта, необходимого, чтобы снизить начальную концентрацию радикалов в 2 раза. Также рассчитывалось время, необходимое, чтобы достичь устойчивого состояния с концентрацией ЕС5о (Тксзо)- Был определен новый параметр, включающий оба вышеперечисленных, называемый антирадикальной эффективностью [69].

Оба последних метода, основанные на кинетических параметрах реакций разрушения ABTS- и DPPH-радикалов, не используют субстрат. Их популярность объясняется простотой и экспрессностыо, но к данным, полученным этими методами, нужно относиться с осторожностью, вследствие отсутствия этих оксидантов в реальных системах и зависимости АОА от выбора оксиданта.

2.2.6. Метод FRAP

Метод FRAP (Ferric reducing antioxidant power) [70,71] основан на восстановлении антиоксидангами комплекса трехвалентного железа с трипиридилтриазином Fe(TPTZ)J+ в кислой среде. При этом образуется ярко окрашенный комплекс Fe(TPTZ)2+, об антиоксидантной активности судят по возрастанию пика при 593 нм. Результат выражается микроэквивалентах Fe"" или в долях активности стандартного антиоксиданта. Авторы заявляют, что метод прост и экспрессен.

2.2.7. Определение по общему поглощению свободных радикалов (TRAP)

Метод TRAP (Total radical- trapping antioxidant parameter), разработанный Вэйнером с коллегами [72], основан на определении поглощения кислорода в течение контрольной окислительной реакции, индуцируемой термическим разрушением 2,2'-азобис(2-амидинопропан)гидрохлорида (ААРН). Вэйнер с коллегами исследовал поглощение кислорода в термостатируемой ячейке с кислородным электродом во время окисления линолеата свободными радикалами. Главным недостатком этого метода было измерение конечной точки по кислородному электроду, который не был стабилен в течение требуемого периода времени (больше 2 часов на образец), поэтому метод был модифицирован [73] - для измерения конечной точки начали использовать хемилюминесценцию, что дает больше возможностей для автоматизации. Метод требует длительного времени измерений и имеет много других

недостатков [74], но идея полезна для сравнения антиоксидаптных активностей.

* *

Антиоксидантная активность может быть определена многими способами. При этом определение антиоксидантной активности отдельных компонентов сложной смеси является долгим и дорогостоящим процессом. Кроме того, данные, полученные таким путем не могут характеризовать общую антиоксидантную активность системы в целом, так как эффект системы антиоксидантов не является аддитивным (например, в такой системе возможен

синергизм) [75]. В связи с этим интересно определение общей антиоксидантной активности системы.

При определении антиоксидантной активности ключевую роль играет выбор оксиданта. Большинство современных методик анализа использует в качестве оксиданта различные окислители. Но время жизни природных радикалов (таких, как супероксид-радикал и гидроксид-радикал) пренебрежимо мало, что не позволяет полностью проследить за кинетикой их разложения. Основным недостатком использования стабильных искусственных радикалов (ABTS-радикал и DPPH-радикал) и окислителей (С12, Вг2, Ь, комплексы трехвалентного железа, бихромат-анион) является то, что таких окислителей нет в человеческом организме, что негативно сказывается на корреляции полученных таким образом данных in vitro с АОА анализируемого вещества in vivo. Единственным достаточно сильным и стабильным природным окислителем является пероксид водорода. Ранее в нашей лаборатории был разработан сенсор на пероксид водорода на основе берлинской лазури - самого эффективного электрокатализатора восстановления пероксида водорода [7], с помощью которого возможно осуществлять постоянный мониторинг концентрации Н202 [46]. В данной работе предлагается использовать эти датчики для контроля реакции разложения пероксида водорода под действием антиоксидантов и разрабатывается новый способ оценки АОА по кинетическим параметрам данной реакции.

Заключение диссертации по теме «Аналитическая химия», Вохмянина, Дарья Владимировна

выводы

1. Разработан новый способ совместной иммобилизации фермента и медиатора без использования ковалентного связывания в полимерные мембраны из сред с высоким содержанием органического растворителя. Показано, что в полученной ферментсодержащей полимерной мембране медиатор сохраняет диффузионную подвижность. Найден новый медиатор для фермента глюкозооксидазы - фенотиазин.

2. Путём совместной иммобилизации глюкозооксидазы и медиатора создан безреагентный глюкозный биосенсор второго поколения, со следующими аналитическими характеристиками: диапазон определяемых концентраций глюкозы 0.5 - 20 мМ, коэффициент чувствительности (1.34±0.06) мА*М-1*см-2. Путем интеграции биосенсора с тонкослойной ячейкой создана система для анализа малых объемов (1-1.5 мкл) цельной крови; время анализа составило 10 с.

3. Предложен способ оценки антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода. На примере анализа биологических добавок показана корреляция результатов, полученных предложенным способом и классическим методом, основанным на регистрации максимума спектра поглощения тиобарбитурат-активных продуктов перекисного окисления липидов.

4. Показана возможность оценки общего антиоксидантного статуса сыворотки крови с помощью способа, основанного на определении кинетических параметров реакции разложения пероксида водорода. Антиоксидантная активность сыворотки крови спортсменов коррелирует с наличием гипоксии, вызванной физической нагрузкой.

5. Продемонстрирована принципиальная возможность использования сенсоров на основе берлинской лазури для оценки антиоксидантной активности наночастиц способом, основанным на мониторинге реакции разложения Н202. Показано, что антиоксидантная активность наночастиц в значительной мере зависит от условий их синтеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Вохмянина, Дарья Владимировна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. American Diabetes Association. Self-Monitoring of Blood Glucose // Diabetes Care. 1994. V. 17. № 1. P. 81-86.

2. MacCarthy P.A., Shah A.M. Oxidative stress and heart failure // Coronary Artery Disease. 2003. V. 14. № 2. P. 109-113.

3. Rodrigo R., Rivera G. Renal damage mediated by oxidative stress: a hypothesis of protective effects of red wine // Free Radical Biology and Medicine. 2002. V. 33. №

3. P. 409-422.

4. Sohal R.S., Mockett R.J., Orr W.C. Mechanisms of aging: an appraisal of the oxidative stress hypothesis // Free Radical Biology and Medicine. 2002. V. 33. № 5. P. 575-586.

5. Yang T.T.C., Devaraj S., Jialal I. Oxidative stress and atherosclerosis // Journal of Clinical Ligand Assay. 2001. V. 24. 1. P. 13-24.

6. Yorek M.A. The role of oxidative stress in diabetic vascular and neural disease // Free Radical Research. 2003. V. 37. № 5. P. 471-480.

7. Karyakin A.A., Karyakina E.E. Prussian Blue-based 'artificial peroxidase' as a transducer for hydrogen peroxide detection. Application to biosensors // Sensors and Actuators B. 1999. V. 57. P. 268-273.

8. Будников Г.К., Майстренко В.Н., Вяселев М.Р. Основы современного электрохимического анализа. М.: Мир, 2003. 592 с.

9. Будников Г.К., Евтюгин Г.А., Майстренко В.Н. Модифицированные электроды для вольтамперометрии в химии, биологии и медицине. М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. 416 с.

10. Karyakin A.A., Vuki М., Lukachova L.V., Karyakina Е.Е., Orlov А. V, Karpachova G.P. Processible polyaniline as an advanced potentiometric pH transducer. Application to biosensors // Anal. Chem. 1999. V. 71. № 13. P. 25342540.

11. Hage R., Lienke A. Applications of Transition-Metal Catalysts to Textile and Wood-Pulp Bleaching // Angewandte Chemie International Edition. 2005. V. 45. № 2. P. 206-222.

12. Garcia-Alonso J.F., Bravo S., Casas J., Perez-Conesa D., Jacob K, Periago M.J. Changes in antioxidant compounds during the shelf life of commercial tomato juices in different packaging materials // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2009. V. 57. № 15. P. 6815-6822.

13. Wang Y., Huang J., Zhang C., Wei J., Zhou X. Determination of Hydrogen Peroxide in Rainwater by Using a Polyaniline Film and Platinum Particles Co-Modified Carbon Fiber Microelectrode // Electroanalysis. 1998. V. 10. № 11. P. 776-778.

14. Marie L., Greenway G.M. Determination of hydrogen peroxide in rainwater in a miniaturised analytical system // Analytica Chimica Acta. 2005. V. 548. № 1-2. P. 20-25.

15. Dohlman A.W., Black H.R., Royal I J.A. Expired breath hydrogen peroxide is a marker of acute airway inflammation in pediatric patients with asthma // American Review of Respiratory Disease. 1993. V. 148. № 4. P. 955-960.

16. Jobsis Q., Raatgeep H.C., Schellekens S.L., Hop W.C., Hermans P. W., de Jongste J.C. Hydrogen peroxide in exhaled air of healthy children: reference values // European Respiratory Journal. 1998. V. 12. № 2. P. 483-485.

17. Loukides S., Bouros D., Papatheodorou G., Panagou P., Siafakas N. The relationships among hydrogen peroxide in expired breath condensate, airway inflammation, and asthma severity // Chest. 2002. V. 121. № 2. P. 338-346.

18. Jobsis Q., Raatgeep H.C., Hermans P.W., de Jongste J.C. Hydrogen peroxide in exhaled air is increased in stable asthmatic children // European Respiratory Journal. 1997. V. 10. № 3. p. 519-521.

19. Nowak D., Kalucka S., Bialasiewicz P., Krol M. Exhalation of PI202 and thiobarbituric acid reactive substances (TBARs) by healthy subjects // Free Radical Biology & Medicine. 2001. V. 30. 2. P. 178-186.

20. Guatura S.B., Martinez J.A., Santos Bueno P C., Santos M.L. Increased exhalation of hydrogen peroxide in healthy subjects following cigarette consumption // Sao Paulo Medical Journal. 2000. V. 118. № 4. P. 93-98.

21. Niethammer P., Grabher C., Look А.Т., Mitchison T.J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish // Nature. 2009. V. 459. № 7249. P. 996-999.

22. Cook-Mills J.M. Hydrogen peroxide activation of endothelial cell-associated MMPS during VCAM-1-dependent leukocyte migration // Cellular and Molecular Biology. 2006. V. 52. № 4. P. 8-16.

23. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Д. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир, 1992. 614 с.

24. Zhang Y., Wilson G.S. Electrochemical oxidation of H202 on Pt and Pt+Ir electrodes in physiological buffer and its applicability to H202-based biosensors // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1993. V. 345. № 1-2. P. 253-271.

25. Wring S.A., Hart J.P. Chemically modified, carbon-based electrodes and their application as electrochemical sensors for the analysis of biologically important compounds. A review//Analyst. 1992. V. 117, P. 1215-1229.

26. Mizutani F., Yubuki S., Iijinza S. Carbon paste electrode incorporated with cobalt (II) octaethoxyphthalocyanine for the amperometric detection of hydrogen peroxide // Electroanalysis. 1995. V. 7. № 8. P. 706-709.

27. Trasatti S. Electrocatalysis by oxides—Attempt at a unifying approach // J. Electroanal. Chem. 1980. V. 111. № 1. P. 125-131.

28. Bhattacharya A.K. Correlation of the catalytic activities of oxides with their work-functions. Recombination of oxygen atoms on LT doped nickel oxides // J. Chem. Soc., Faraday Transactions. 1978. V. 74, P. 1750-1757.

29. Song M.-J., Hwang S.W, Whang D Non-enzymatic electrochemical CuO nanoflowers sensor for hydrogen peroxide detection // Talanta. 2010. V. 80. P. 16481652.

30. Batchelor-McAuley C., Shao L., Wildgoose G.G., Green M.L.H., Compton R.G. An electrochemical comparison of manganese dioxide microparticles versus a and (3 manganese dioxide nanorods: mechanistic and electrocatalytic behavior // New J. Chem. 2008. V. 32, P. 1 195-1203.

31. Lin Y., Cuil X, Li L. Low-potential amperometric determination of hydrogen peroxide with a carbon paste electrode modified with nanostructured cryptomelane-type manganese oxides // Electrochemistry Communications. 2005. V. 7. № 2. P. 166-172.

32. Yan Q., Wang Z., Zhang J., Peng H., Chen X., Нои H, Liu C. Nickel hydroxide modified silicon nanowires electrode for hydrogen peroxide sensor applications // Electrochimica Acta. 2012. V. 61. P. 148-153.

33. Yin Z., Wu J., Yang Z. Amperometric sensors based on Ni/Al and Co/Al layered double hydroxides modified electrode and their application for hydrogen peroxide detection//Biosensors and Bioelectronics. 2011. V. 26. P. 1970-1974.

34. Yaropolov A.I., Malovik V., Varfolomeev S.D., Berezin I.V. Electroreduction of hydrogen peroxide on an electrode with immobilized peroxidase // Doklady AkademiiNauk SSSR. 1979. V. 249. № 6. P. 1399-1401.

35. Wang Z., Xu Q., Wang H.Q., Yang Q., Yu J.H., Zhao Y.D. Hydrogen peroxide biosensor based on direct electron transfer of horseradish peroxidase with vapor deposited quantum dots // Sensors and Actuators B-Chemical. 2009. V. 138. № 1. P. 278-282.

36. Ekanayake E., Preethichandra D.M.G., Kaneto K. Bi-functional amperometric biosensor for low concentration hydrogen peroxide measurements using polypyrrole immobilizing matrix // Sensors and Actuators B-Chemical. 2008. V. 132. № 1. P. 166-171.

37. Setti L., Fraleoni-Morgera A., Mencarelli I., Filippini A., Ballarin В., Biase M. An HRP-based amperometric biosensor fabricated by thermal inkjet printing // Sensors and Actuators B-Chemical. 2007. V. 126. № 1. P. 252-257.

38. Lindgren A., Ruzgas Т., Gorton L., Csoregi E., Ardila G.B., Sakharov I.Y., Gazaryan I.G. Biosensors based on novel peroxidases with improved properties in direct and mediated electron transfer // Biosensors & Bioelectronics. 2000. V. 15. № 9-10. P. 491-497.

39. Hamid M, Rehman K. Potential applications of peroxidases // Food Chemistry 2009. V. 115. №4. P. 1177-1186.

40. Kang X.B., Pang G.C., Liang X.Y., Wang M, Liu J., Zhu W.M. Study on a hydrogen peroxide biosensor based on horseradish peroxidase/GNPs-thionine/chitosan // Electrochimica Acta. 2012. V. 62. P. 327-334.

41. Mathew M., Sandhyarani N. A novel electrochemical sensor surface for the detection of hydrogen peroxide using cyclic bisureas/gold nanoparticle composite // Biosensors and Bioelectronics. 2011. V. 28. P. 210-215.

42. Liu Y., Lei J., Ju H. Amperometric sensor for hydrogen peroxide based on electric wire composed of horseradish peroxidase and toluidine blue-multiwalled carbon nanotubes nanocomposite // Talanta. 2008. V. 74. P. 965-970.

43. Karyakin A.A., Gitelmacher O.V., Karyakina E.E. A high-sensitive glucose amperometric biosensor based on Prussian Blue modified electrodes // Analytical Letters. 1994. V. 27. № 15. P. 2861-2869.

44. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L. The electrocatalytic activity of Prussian blue in hydrogen peroxide reduction studied using a wall-jet electrode with continuous flow // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1998. V. 456. № 1-2. P. 97-104.

45. Karyakin A.A., Puganova E.A., Bolshakov I.A., Karyakina E.E. Electrochemical sensor with record performance characteristics // Angewandte Chemie. 2007. V. 119 №40. P. 7822-7824.

46. Sitnikova N.A., Borisova A.V., Komkova M.A., Karyakin A.A. Superstable advanced hydrogen peroxide transducer based on transition metal hexacyanoferrates // Anal. Chem. 2011. V. 83. № 6. P. 2359-2363.

47. Laguerre M., Lecomte J., Villeneuve P. Evaluation of the ability of antioxidants to counteract lipid oxidation: Existing methods, new trends and challenges // Progress in Lipid Research. 2007. V. 46. P. 244-282.

48. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты и синтетические ингибиторы радикальных процессов//Успехи химии. 1975. Т. 14. № 10. С. 1871-1886.

49. Иванов И.И., Мерзляк М. Н., Тарусов Б.Н. Витамин Е, биологическая роль в связи с антиоксидантными свойствами // В кн.: Биоантиокислители. М.: Наука. 1975. С. 30-52.

50. Ключников С.О., Гнетнева Е.С. Убихинон. Теория и клиническая практика // Педиатрия им. Сперанского. 2008. № 3. С. 14-20.

51. Абрамова Ж.И., Оксенгеидлер Г.И. Человек и противоокислительные вещества. Л.: Наука, 1985. 230 с.

52. Giordano G. Organophosphorus insecticides chlorpyrifos and diazinon and oxidative stress in neuronal cells in a genetic model of glutathione deficiency // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007. V. 219. № 2-3. P. 181.

53. Медведев Ж. Витамин С — средство от цинги или от болезней старости? // Еженедельник. 2000. Т. 415. № 21. С. 2008.

54. Викторов А.П., Войтенко А.Г. Препараты витамина А в фокусе безопасности // Провизор. 2008. № 09.

55. Armando С., Maythe S., Beatriz N.P. Antioxidant activity of grapefruit seed extract on veg- etable oils // J. Sci. Food Agric. 1998. V. 77. № 4. P. 463-467.

56. Zandi P., Ahmadi L. Antioxidant effect of plant extracts of Labiatae family // J. Food Sci. Techno 1. Mysore. 2000. V. 37. P. 436-439.

57. Mikula M., Khayat A. Reaction conditions for measuring oxidative stability of oils by thermogravimetric analysis // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1985. V. 62. № 12. P. 1694-1698.

58. Yen G.C., Lee C.E. Antioxidative properties of extracts from Aspergillus candidus broth filtrate // J. Sci. Food Agric. 1997. V. 75. № 3. P. 326-332.

59. Sanhueza J., Nieto S., Valenzuela A. Thermal stability of some commercial synthetic antioxidants // J. Amer. Oil Chem. Soc. 2000. V. 77. № 9. P. 933-936.

60. Williams K. Oils, Fats and Fatty Foods - Their Practical Examination. London: Churchill, 1966. 488 p.

61. Paquot C. IUPAC Standard Methods for the Analysis of Oils. Fats and Derivatives. Oxford: Pergamon Press, 6th edn., 1979.

62. Firestone D., ed. Official Methods and Recommended Practices of the American Oil Chemist's Society. Champaign: AOCS Press, 4th edn., 1990.

63. Shahidi F. Natural Antioxidants - Chemistry, Flealth Effects and Applications. Champaigh: AOCS Press, 1997.

64. Kishida E., Tokumaru S., Ishitani Y., Yamamoto M., Oribe M., Iguchi If., Kojo S. Comparison of the formation of malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactive substances from autoxidized fatty acids based on oxygen consumption // J. Agric. FoodChem. 1993. V. 41. № 10. P. 1598-1600.

65. Fernandez J., Perez-Alvarez J.A., Fernandez-Lopez J.A. Thiobarbituric acid test for monitoring lipid oxidation in meat // Food Chem. 1997. V. 59. № 3. P. 345-353.

66. Halliwell B., Gutteridge J.M.C. Free Radicals in Biology and Medicine. New York: Oxford University Press, 3 edn., 1999.

67. Snyder J.M., Frankel E.N., Selke E. Capillary gas chromatographic analyses of headspace volatiles from vegetable oils // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1985. V. 62, № 12. P. 1675-1679.

68. Rice-Evans C.A., Miller N.J. Total antioxidant status in plasma and body fluids // Methods Enzymol. 1994. V. 234. P. 279-293.

69. Sanchez-Moreno C., Larrauri J.A., Saura-Calixto F. A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols // J. Sci. Food Agric. 1998. V. 76. № 2. P. 270-276.

70. Benzie I.F.F., Strain J.J. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a measure of "antioxidant power": the FRAP assay // Anal. Biochem. 1996. V. 239. P. 70-76.

71. Benzie I.F.F., Strain J.J. Ferric reducing/antioxidant power assay: Direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration // Methods in Enzymology. 1999. V. 299. P. 15-27.

72. Wayner D.D.M., Burton G.W., Ingold K.U., Locke S. Quantitative measurement of the total, peroxyl radical-trapping antioxidant capability of human blood plasma by controlled peroxidation: The important contribution made by plasma proteins // FEBS Letters. 1985. V. 187. № 1. P. 33-37.

73. Luukkainen N.. Aejmelaeus R., Alho If., Metsa-Ketela T.. Ikonen S.R., Salo M.K. Plasma chain-breaking antioxidants in preterm infants with good and poor short-term outcome // Free Radical Research. 1999. V. 30. № 3. P. 189-197.

74. Ghiselli A., Serafini M., Maiani G., Azzini E., Ferro-Luzzi A. A fluorescence-based method for measuring total plasma antioxidant capability // J. Free Rad. Biol. Med. 1995. V. 18. № l.P. 29.

75. Cano A., Hernandez-Ruiz J., Garcia-Canovas F., Acosta M., Arnao M.B. An endpoint method for estimation of the total antioxidant activity in plant material // Phytochem. Anal. 1998. V. 9. № 4. P. 196-202.

76. Thevenot D.R., Toth K, Durst R.A., Wilson G.S. Electrochemical biosensors: Recommended definitions and classification // Pure and Applied Chemistry. 1999. V.

77. № 12. P. 2333-2348.

77. Корякин А.А., Уласова E.A., Вагин М.Ю., Карякина E.E. Биосенсоры: устройство, классификация и функциональные характеристики // Сенсор. 2002. Т. 1. С. 16-24.

78. Kissinger Р.Т. Biosensors—a perspective // Biosensors and Bioelectronics. 2005. V. 20. № 12. P. 2512-2516.

79. Karyakin A.A. Prussian Blue and its analogues: electrochemistry and analytical applications//Electroanalysis. 2001. V. 13. № 10. P. 813-819.

80. Hansson K, Ranby M., Johansen К Surface plasmon resonance (SPR) analysis of coagulation in whole blood with application in prothrombin time assay // Biosensors and Bioelectronics. 1999. V. 14. № 8-9 671-682.

81. Mujahid A., Dickert F.L. Surface nano-patterning of polymers for mass-sensitive biodetection // In: Nano-Bio-Sensing. NY: Springer, 2011. 248 p.

82. Schirhagl R., LatifU., Dickert F.L. Atrazine detection based on antibody replicas //J. Mater. Chem. 2011. V. 21. P. 14594-14598.

83. Clark L.C.J., Lyons C. Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery // Annals of the New York Academy of Sciences. 1962. V. 102. P. 29-45.

84. Updike S.J., Hicks G.P. The Enzyme Electrode // Nature. 1967. V. 214. № 5092. P. 986-988.

85. Guilbault G.G., Lubrano G.J., Gray D.N. Glass-metal composite electrodes // Anal. Chem. 1973. V. 45. № 13. P. 2255-2258.

86. Guilbault G.G., Lubrano G.J. An enzyme electrode for the amperometric determination of glucose // Analytica Chimica Acta 1973. V. 64. № 3. P. 439-455.

87. Scheller F.W., Pfeifer D., Schubert F., Reneberg R., Kirstein D. Application of enzyme amperometric biosensors to analysis of real objects // in Biosensors: Fundamental and applications. Oxford: Oxford University Press, 1987.

88. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L. The electrocatalytic activity of Prussian blue in hydrogen peroxide reduction studied using a wall-jet electrode with continuous flow // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1998. V. 456. № 1-2. P. 97-104.

89. Karyakin A.A., Gitelmacher O.V., Karyakina E.E. Prussian blue-based firstgeneration biosensor. A sensitive amperometric electrode for glucose // Anal. Chem. 1995. V. 67. № 14. p. 2419-2423.

90. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L. Prussian-Blue-based amperometric biosensors in flow-injection analysis // Talanta. 1996. V. 43. № 9. P. 1597-1606.

91. Lin Y.Q., Liu K, Yu P., Xiang L., Li X.C., Mao L.Q. A facile electrochemical method for simultaneous and on-line measurements of glucose and lactate in brain microdialysate with Prussian Blue as the electrocatalyst for reduction of hydrogen peroxide // Anal. Chem. 2007. V. 79. № 24. P. 9577-9583.

92. Turner. A.P.F., Karube I., Wilson G.S., Worsfold P.J. Biosensors: fundamentals and applications // Analytica Chimica Acta. 1987. V. 201. P. 363-364.

93. Bertho A. Biological Oxidations and Reductions // Annual Review of Biochemistry. 1934. V. 3. P. 23-38.

94. Battaglini F., Koutroumanis M., English A.M., Mikkelsen S.R. Targeting glucose oxidase at aspartate and glutamate residues with organic two-electron redox mediators // Bioconjugate Chemistry. 1994. V. 5. № 5. P. 430-435.

95. Kulys J., Buch-Rasmussen T., Bechgaard K, Razumas V., Kazlauskaite J., Marcinkeviciene J., Christensen J.B., Llansen H.E. Study of the new electron transfer mediators in glucose oxidase catalysis // Journal of Molecular Catalysis. 1994. V. 91. № 3. P. 407-420.

96. Cass A.E.G., Davis G., Francis G.D., Hill H.A.O., Aston W.G., Higgins 1.1, Plotkin E.V., Scott L.D.L., Turner A.P.F. Ferrocene-mediated enzyme electrode for amperometric determination of glucose // Anal. Chem. 1984. V. 56. № 4. P. 667-671.

97. Березин И.В., Богдановская В.А., Варфоломеев С.Д., Ярополов А.И., Тарасевич М.Р. Биоэлектрокатализ. Равновесный кислородный потенциал в присутствии лакказы // Докл. АН СССР. 1978. Т. 240. С. 615-617.

98. Tarasevich M.R., Yaropolov A.I., Bogdanovskaya V.A., Varfolomeev S.D. Electrocatalysis of a cathodic oxygen reduction by laccase // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1979. V. 6. № 3. P. 393-403.

99. Ярополов A.M., Маловик В., Варфоломеев С.Д., Березин И.В. Электровосстановление пероксида водорода на электроде с иммобилизованной пероксидазой//Докл. АН СССР. 1979. Т. 249. С. 1399-1401.

100. Berezin I.V., Varfolomeev S.D., Lomonosov M.V. Principles of bioelectrocatalysis // Enzyme Eng. 1980. V. 5. P. 95-100.

101. Тарасевич M.P., Богдановская В.А. Биоэлектрокатализ. Ферменты как катализаторы электрохимических реакций // В: Проблемы электрокатализа. Багоцкий B.C. (ред.). М: Наука, 1980.

102. Ярополов А.И., Карякин А.А., Варфоломеев С.Д. Биоэлектрокатализ -феномен ускорения ферментами электродных процессов // Вестник МГУ. 1983. Т. 24. С. 523-535.

103. Ярополов А.И., Карякин А.А., Гоготов И.IT., Зорин Н.А., Варфоломеев С.Д., Березин И.В. Биоэлектрокатализ. Механизм окисления молекулярного водорода на электроде с иммобилизованной гидрогеназой // Докл. АН СССР. 1984. Т. 274. С. 1434-1437.

104. Yaropolov A.I., Karyakin A.A., Varfolomeyev S.D., Berezin I V. Mechanism of H2 electrooxidation with immobilized hydrogenase // Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 1984. V. 12. P. 267-277.

105. Wollenberger U. Third generation biosensors—integrating recognition and transduction in electrochemical sensors // Comprehensive Analytical Chemistry. 2005. V. 44. P. 65-156.

106. Ferapontova E.E., Shleev S., Ruzgas T., Stoica L., Christenson A., Tkac J., Yaropolov A.I., Gorton L. Direct electrochemistry of proteins and enzymes // Perspectives in Bioanalysis. 2005. V. 1. P. 517-598.

107. Kulys J. J., Cenas N.K. Biocatalytic oxidation of glucose on the conductive charge transfer complexes // Journal of Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry. 1981. V. 128. P. 103-113.

108. Будников F.K. Биосенсоры как новый тип аналитических устройств // Соросовский образовательный журнал. 1996. Т. 12, С. 26-32.

109. Cui G., Kim S., Paeng К. A disposable amperometric sensor screen printed on a nitrocellulose strip: a glucose biosensor employing lead oxide as an interference-removing agent // Anal. Chem. 2000. V. 72. № 8. P. 1925-1929.

110. Pandey P., Upadhyay S., Pathak H.A. A new glucose biosensor based on sandwich configuration of organically modified sol-gel glass // Electroanalysis. 1999. V. 11. № 1. P. 59-64.

111. Dong S., Kuwana T. Cobalt porphyrin nafion film on carbon microarray electrode to monitor oxygen for enzyme analysis of glucose // Electroanalysis. 1991. V. 3. № 6. P. 485-491.

112. Quinto M., Losito I., Palmisano F. Disposable interference-free glucose biosensor based on an electropolymerised poly(pyrrole) permselective film // Analytica Chimica Acta. 2000. V. 420. № 1. P. 9-17.

113. Gavalas V., Chaniotakis N. Polyelectrolyte stabilized oxidase based biosensors: effect of diethylaminoethyl-dextran on the stabilization of glucose and lactate oxidases into porous conductive carbon // Analytica Chimica Acta. 2000. V. 404. № l. p. 67-73.

114. Franchina J., Lackowski W., Dermody D., Crooks R., Bergbreiter D. Electrostatic immobilization of glucose oxidase in a weak acid, polyelectrolyte hyperbranched ultrathin film on gold: fabrication, characterization, and enzymatic activity//Anal. Chem. 1999. V. 71. № 15. P. 3133-3139.

115. Produced by E.I. du Pont de Nemours and Co. Wilmington, Patent 39464-59-0, 1978.

116. Rubinstein L, Bard A.J. Polymer films on electrodes. 4. Nafion-coated electrodes and electrogenerated chemiluminescence of surface-attached tris (2,2'-bipyridine)ruthenium(2+) // J. Amer. Chem. Soc. 1980. V. 102. № 21. P. 6641-6642.

117. Olah G., Prakash G., Arvanaghi M. Stable carbocations. 232. Significant mesomeric nitrenium ion character of the cyanodiphenylmethyl cation. The first long-lived cyanocarbenium ion//J. Amer. Chem. Soc. 1980. V. 102. № 21. P. 6640-6641.

118. Harrison D., Turner R., Baltes LI. Characterization of perfluorosulfonic acid polymer coated enzyme electrodes and a miniaturized integrated potentiostat for glucose analysis in whole blood // Anal. Chem. 1988. V. 60. № 19. P. 2002-2007.

119. Dong S., Wang B., Liu B. Amperometric glucose sensor with ferrocene as an electron-transfer mediator // Biosensors and Bioelectronics. 1991. V. 7. № 3. P. 215222.

120. Wang J., Dempsey E., Ozsoz M., Smyth M. Amperometric enzyme electrode for theophylline//Analyst. 1991. V. 116. P. 997-999.

121. Chen C.Y., Tamiya E., Ishihara K., Kosugi Y., Su Y.C., Nakabayashi N., Karube I. A biocompatible needle-type glucose sensor based on platinum-electroplated carbon electrode // Appl. Biochem. Biotechnol. 1992 V. 36, № 3. P. 211-226.

122. Yao T. Enzyme electrode for the successive detection of hypoxanthine and inosine//Analytica Chimica Acta. 1993. V. 281. № 2. P. 323-326.

123. Turner R.F.B., Harrison D.J., Rajiotte R.V., Baltes Li.P. A biocompatible enzyme electrode for continuous in vivo glucose monitoring in whole blood // Sensors and Actuators B. 1990. V. 1. № 1-6. P 561-564.

124. Hahn O., Hill IT., Ritchie M., Sear J. The electrochemistry of proteins entrapped in nafion // Journal of Chemical Society - Chemical communications. 1990. V. 2. P. 125-126.

125. Fortier G., Vaillancourt M., Belanger D. Evaluation of nafion as media for glucose oxidase immobilization for the development of an amperometric glucose biosensor // Electroanalysis. 1992. V. 4. № 3. P. 275-283.

126. Harkness J.К., Murphy O.J., Hitchens G.D. Enzyme electrodes based on ionomer films coated on electrodes // Journal of Electroanalytical Chemistry. 1993. V. 357. № 1-2. P. 261-272.

127. Karyakin A.A., Karyakina E.E., Gorton L., Bobrova O.A., Lukachova L.V., Gladilin A.K., Levashov A.V. Improvement of electrochemical biosensors using enzyme immobilization from water-organic mixtures with a high content of organic solvent//Anal. Chem. 1996. V. 68. № 15. P. 4335-4341.

128. РаплиД., Янг П., Толлин Г. Вода в полимерах. М: Мир, 1984.

129. Zaks A., Klibanov A.M. Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents // Journal of Biological Chemistry. 1988. V. 263. P. 3194-3201.

130. Karyakin A.A., Kotel'nikova E.A., Lukachova L.V., Karyakina E.E., Wang J. Optimal environment for glucose oxidase in peril uorosulfonated ionomer membranes: improvement of first-generation biosensors // Anal. Chem. 2002. V. 74 № 7. P. 1597-1603.

131. Komura Т., Niu G.Y., Yamaguchi Т., Asano M. Redox and ionic-binding switched fluorescence of phenosafranine and thionine included in Nafion® films // Electrochimica Acta. 2003. V. 48. № 6. P. 631-639.

132. Rubinstein I., Bard A.J. Polimer-films on electrodes.5.electrochemistry and chemi-luminescence at nafion-coated electrodes // J. Amer. Chem. Soc. 1981. V. 103. № 17. P. 5007-5013.

133. Ohkawa H., Ohishi N., Yagi К Assay for lipid peroxides in animal-tissues by thiobarbituric acid reaction // Analyt. Biochem. 1979. V. 95. № 2. P. 351-358.

134. Kikugawa K, Kojima Т., YamakiS., Kosugi H. Interpretation of the thiobarbituric acid reactivity of rat liver and brain homogenates in the presence of ferric ion and ethylenediaminetetraacetic acid // Analyt. Biochem. 1992. V. 202. № 2. P. 249-255.

135. Архипенко Ю.В., Диденко В.В., Сазонтова Т.Г., Меерсон Ф.З. II Докл. АН СССР. 1989. Т. 304. № 6. Р. 1500.

136. Эльдерфидд Р. Гетероциклические соединения. Т. 6. М.: Изд-во иностранной литературы, 1960. 612 с.

137. Warburg О., Christian W. Isolation and crystallization of proteins of the oxidative fermentation enzymes // Biochem. Z. 1932. V. 254. P. 438.

138. Battaglini F., Koutroumanis M., English A.M., Mikkelsen S.R. Targeting glucose oxidase at aspartate and glutamate residues with organic two-electron redox mediators // Bioconjugate Chemistry. 1994. V. 5. № 5. P. 430-435.

139. Kulys J., Buch-Rasmus sen Т., Bechgaard K., Razumasa V., Kazlauskaite J., Marcinkeviciene J., Christensenc J.В., Hansen Ii.E. Study of the new electron-transfer mediators in glucose-oxidase catalysis // Journal of Molecular Catalysis. 1994. V. 91. №3. P. 407-420.

140. Heller A., Feldman B. Electrochemical glucose sensors and their applications in diabetes management // Chem. Rev. 2008. V. 108. № 7. P. 2482-2505.

141. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биокатализ в электрохимии органических соединений. Вильнюс: Москлас, 1983. 168 с.

142. Manoj К.М., Hager L.P. A colorimetric method for detection and quantification of chlorinating activity of hemeperoxidases // Analyt. Biochem. 2006. V. 348. № 1. P. 84-86.

143. Чистяков В.A. SkQ, они же ионы Скулачёва // Химия и жизнь - XXI век. 2007. № 5. С. 13-18.

143. Schrand A.M., Rahman M.F., Hussain S.M., Schlager J. J., Smith D.A., Syed A.F. Metal-based nanoparticles and their toxicity assessment // WIREs Nanomed. Nanotech. 2010. V. 2. № 5. P. 544-568.

144. Nel A., Xia Т., Madler L., Li N. Toxic potential of materials at the nanolevel // Science. 2006. V. 311. P. 622-627.

145. Oberdorster G., Oberdorster E., Oberdorster J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles // Environ. Health Perspect. 2005. V. 113. P. 823-839.

146. Mocan Т., Clichici S., Agoston-Coldea L., Mocan L., Simon S., Ilie I.R., Biris A.R., Muresan A. Implications of oxidative stress mechanisms in toxicity of nanoparticles (Review) // Acta Physiol. Hungar. 2010. V. 97. P. 247-255.

147. Sharma V., Singh P., Pandey A.K., Dhawan A. Induction of oxidative stress, DNA damage and apoptosis in mouse liver after sub-acute oral exposure to zinc oxide nanoparticles // Mutation Research - Genetic Toxicol. Environ. Mutagenesis. 2012. V. 745. P. 84-91.

148. Wang F., Gao F., Lan M, Yuan H., Huang Y., Liu J. Oxidative stress contributes to silica nanoparticle-induced cytotoxicity in human embryonic kidney cells // Toxicology in Vitro. 2009. V. 23. P. 808-815.

149. Xu J., Xu P., Li Z., Huang J., Yang Z. Oxidative stress and apoptosis induced by hydroxyapatite nanoparticles in C6 cells // J. Biomed. Mater. Research - Part A. 2012. V. 100 A. P. 738-745.

150. Siddiqui M.A., Ahamed M., Ahmad J., Majeed Khan M.A., Musarrat J., Al-Khedhairy A.A., Alrokayan S.A. Nickel oxide nanoparticles induce cytotoxicity, oxidative stress and apoptosis in cultured human cells that is abrogated by the dietary antioxidant curcumin // Food Chem. Toxicol. 2012. V. 50. P. 641-647.

151. Lin X.-L., Zhao S.-H., Zhang L, Hu G.-Q., Sun Z.-W., Yang IV.-S. Dose-dependent cytotoxicity and oxidative stress induced by "Naked" Fe304 nanoparticles in human hepatocyte // Chem. Res. in Chinese Universities. 2012. V. 28. P. 114-118.

152. Sevcu A., El-Temsah Y.S., Joner E.J., Cernik M. Oxidative stress induced in microorganisms by zero-valent iron nanoparticles // Microbes and Environments. 2011. V. 26. P. 271-281.

153. Horie M., Fukui H., Nishio K., Endoh S., Kato H., Fujita K., Miyauchi A., Nakamura A., Shichiri M., Ishida N., Kinugasa S., Morimoto Y., Niki E., Yoshida Y, Iwahashi H. Evaluation of acute oxidative stress induced by NiO nanoparticles in vivo and in vitro // J. Occupational Health. 2011. V. 53. P. 64-74.

154. Akhtar M.J., Ahamed M., Fareed M., Alrokayan S.A., Kumar S. Protective effect of sulphoraphane against oxidative stress mediated toxicity induced by CuO nanoparticles in mouse embryonic fibroblasts BALB3T3 // J. Toxicol. Sci. 2012. V. 37. P. 139-148.

155. Kumar A., Pandey A.K, Singh S.S., Shanker R., Dhawan A. Engineered ZnO and Ti02 nanoparticles induce oxidative stress and DNA damage leading to reduced

viability of Escherichia coli // Free Radical Biology and Medicine. 2011. V. 51. P. 1872-1881.

156. Ahamed M., Akhtar M.J., Siddiqui M.A., Ahmad J., Musarrat J., Al-Khedhairy A.A., AlSalhi M.S., Alrokayan S.A. Oxidative stress mediated apoptosis induced by nickel ferrite nanoparticles in cultured A549 cells // Toxicol. 2011. V. 283. P. 101— 108.

157. Ahamed M., Posgai R., Gorey T.J., Nielsen M., Hussain S.M., Rowe J.J. Silver nanoparticles induced heat shock protein 70, oxidative stress and apoptosis in Drosophila melanogaster//Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010. V. 242. P. 263-269.

158. Burello E., Worth A.P. A theoretical framework for predicting the oxidative stress potential of oxide nanoparticles // Nanotoxicol. 2011. V. 5. P. 228-235.

159. Vavrova J., Rezacova M., Pejchal J. Fullerene nano particles and their anti-oxidative effects: A comparison to other radio protective agents // J. Appl. Biomedicine. 2012. V. 10. P. 1-8.

160. Щербаков А.Б., Иванов В.К., Жолобак Н.М., Иванова О.С., Крысанов Е.Ю., Баранчиков А.Е., Спивак Н.Я., Третьяков Ю.Д. Нанокристаллический диоксид церия - перспективный материал для биомедицинского применения // Биофизика. 2011. Т. 56. №6. С. 995-1015.

161. Zholobak N.M., Ivanov V.K., Shcherbakov А.В., Shaporev A.S., Polezhaeva O S., Baranchikov A. Ye., Spivak N.Ya, Tretyakov Yu.D. UV-shielding property, photocatalytic activity and photocytotoxicity of ceria colloid solutions // J. Photochem. Photobiolog. B: Biology. 2011. V. 102. P. 32-38.

162. Жолобак H.M., Олевинская 3.M.. Спивак Н.Я., Щербаков А.Б., Иванов В К., Усатенко А. В. Антивирусное действие наночастиц оксида церия, стабилизированных низкомолекулярной полиакриловой кислотой // Журн. микробиолог. 2010. Т. 72. №3. С. 42-47.

163. Иванов В.К., Щербаков А.Б., Усатенко А.В. Структурно-чувствительные свойства и биомедицинские применения нанодисперсного диоксида церия Ц Успехи химии. 2009. Т.78. №9. С. 924-941.

164. Иванов В.К., Усатенко А.В., Щербаков А.Б. Антиоксидантная активность нанокристаллического диоксида церия по отношению к антоцианам // Журн. неорган, химии. 2009. Т. 54. №10. С. 1596-1601.

165. Babu S., Velez A., Wozniak К., Szydlowska J., Seal S. Electron paramagnetic study on radical scavenging properties of ceria nanoparticles // Chem. Phys. Lett. V. 442. P. 405-408. -

166. Иванов В.К., Щербаков А.Б., Рябоконъ И.Г., Усатенко А.В., Жолобак Н.М., Третьяков Ю.Д. Инактивирование нитроксильного радикала наночастицами диоксида церия // Докл. Акад. наук. 2010. Т. 430. №5. С. 639-642.