Кинетические закономерности катализа и инактивации фермента простагландин H синтазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат физико-математических наук Филимонов, Иван Сергеевич

• Филимонов, Иван Сергеевич
• кандидат физико-математических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Филимонов, Иван Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Свойства фермента PGHS.

1.1 Биологическая роль PGHS.

1.2 Структура PGHS.

1.3 Каталитические свойства PGHS.

Глава 2. Критический анализ современного состояния проблемы.

2.1 Механизм циклооксигеназной реакции PGHS.

2.2 Механизм пероксидазной реакции PGHS.

2.3 Взаимодействие пероксидазной и циклооксигеназной активностей.

2.4 Бифункциональные ферменты.

2.5 Инактивация PGHS в ходе катализируемых реакций.

2.6 Кинетический механизм инактивации PGHS.

2.7 Исследование PGHS методами масс-спектрометрии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 3. Материалы и методы.

3.1 Материалы.

3.2 Методы.

3.2.1 Получение PGHS.

3.2.2 Очистка PGHS.

3.2.3 Определение белка.

3.2.4 Осаждение белка.

3.2.5 Электрофорез в полиакриламидном геле.

3.2.6 Гидролиз белков в ПААГ.

3.2.7 Получение масс-спектров.

3.2.8 Определение активностей PGHS.

3.2.9 Обработка кинетических кривых.

3.2.10 Приготовление растворов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 4. Теоретические основы обработки результатов.

4.1 Проблема интерпретации экспериментальных данных.

4.2 Анализ математической модели фермента, подверженного необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции.

4.2.1 Модель фермента, подверженного необратимой инактивации в ходе катализируемой реакции.

4.2.2 Оценка характерных времен тЕ, ts, thwct.

4.2.3 Достижение стационарных состояний по активным формам фермента при расходовании субстрата и инактивации фермента в ходе реакции.

4.2.4 Связность интермедиатов как критерий кинетического поведения механизма ферментативной реакции.

4.2.5 Изменение концентрации субстрата и инактивация фермента в ходе реакции.

Глава 5. Кинетические закономерности циклооксигеназной и пероксидазной реакций, катализируемых ферментом PGHS.

5.1 Молекулярный кислород (субстрат циклооксигеназной реакции) в кинетическом механизме бифункционального фермента простагландин Н синтазы.

5.1.1 Влияние типа донора электронов на качественный вид зависимости скорости циклооксигеназной реакции от концентраций кислорода.

5.1.2 Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода при различных концентрациях арахидоновой кислоты.

5.1.3 Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации кислорода при разных концентрациях донора электронов (адреналина).

5.1.4. Зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты в присутствии и в отсутствие донора электронов.

5.2 Пероксидазная активность бифункционального фермента простагландин

Н синтазы.

5.2.1 Зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации перекиси водорода.

5.2.2 Зависимость скорости пероксидазной реакции от концентрации TMPD при различных концентрациях перекиси водорода.

Глава 6. Построение кинетической модели бифункционального фермента PGHS.

Глава 7. Методы определения параметров инактивации фермента PGHS.

Практическое применение результатов теории.

7.1. Определение параметров инактивации фермента PGHS в случае малого расходования субстрата за время реакции.

7.2 Определение параметров инактивации фермента PGHS при существенном расходовании субстрата за время реакции.

7.3 Сравнение методов расчета параметров инактивации на модельном эксперименте.

Глава 8. Кинетические закономерности инактивации фермента PGHS в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций.

8.1 Кинетические закономерности инактивации фермента PGHS в ходе циклооксигеназной реакции.

8.2 Кинетические закономерности инактивации фермента PGHS в ходе пероксидазной реакции.

8.3 Анализ экспериментальных данных в терминах связности.

Глава 9. Масс-спектрометрические исследования PGHS.

9.1 Изменение массы молекулы PGHS в ходе катализируемых реакций.

9.2 Разработка и оптимизация методов пробоподготовки для исследования фермента PGHS методами масс-спектрометрии.

9.3 Сравнение методов пробоподготовки фермента PGHS для масс-спектрометрических исследований.

9.4 Масс-спектр белка, обработанного трипсином.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетические закономерности катализа и инактивации фермента простагландин H синтазы»

Фермент простагландин Н синтаза (PGHS, простагландин-эндопероксид синтаза, циклооксигеназа К.Ф. 1.14.99.1) — катализирует превращение арахидоновой кислоты в простагландин Н2, который является исходным соединением в биосинтезе простагландинов, тромбоксана и простациклина в организме млекопитающих, в том числе человека [1]. PGHS имеет два активных центра, в которых протекает циклооксигеназная (окисление арахидоновой кислоты до простагландина G2 [2]) и пероксидазная (восстановление перекисной группы простагландина G2 до спиртовой [3]) реакции. В результате двух реакций образуется простагландин Н2 [4], который далее под действием специфических ферментов — конвертаз — может превращаться в другие физиологически активные соединения, такие как простагландины Е2, D2, F2a, тромбоксан А2, простациклин [1, 5, 6, 7].

Простагландины являются внутриклеточными сильнодействующими регуляторами, участвующими в формировании клеточного ответа на самые различные внешние воздействия, включая гормональные, механические, действие лекарственных препаратов и др. [8].

У млекопитающих одна изоформа простагландин Н синтаза (PGHS-1) постоянно присутствует в клетках, обеспечивая их нормальное функционирование [9], другая изоформа (PGHS-2) нарабатывается в ответ на определенные стимулы, такие как цитокины или факторы роста [10]. Изоферменты простагландин Н синтазы являются значимыми фармакологическими мишенями (действие всех нестероидных противовоспалительных средств обусловлено ингибированием этого фермента), однако механизм действия фермента до конца не установлен, что обуславливает актуальность данной темы.

PGHS является многосубстратным бифункциональным ферментом, подвергающимся, необратимой инактивации в ходе катализируемых им реакций. Для исследования кинетических свойств таких сложных ферментов 7 требуется разработка новых теоретических подходов, учитывающих независимое протекание и взаимное влияние катализируемых реакций.

Наряду с арахидоновой кислотой в циклооксигеназной реакции принимают участие две молекулы кислорода. Между тем работ, посвященных исследованию влияния концентрации этого субстрата на ферментативную реакцию практически нет [11, 12]. Исследование концентрационных зависимостей по кислороду интересно также потому, что внутриклеточная концентрация кислорода сильно варьирует и отличается от концентрации растворенного молекулярного кислорода при атмосферном давлении. [12].

Для детального исследования явления инактивации фермента PGHS необходимо разработать методы получения концентрационных зависимостей параметров инактивации, в том числе в области низких концентраций субстратов ферментативной реакции, где скорость реакции снижается вследствие расходования субстрата.

Химические механизмы инактивации фермента PGHS в ходе катализируемых реакций до сих пор не установлены. Современные методы масс-спектрометрии могут оказаться полезными для выявления возможных химических модификаций на молекулярном уровне, приводящих к инактивации фермента в ходе катализируемых реакций. Применение этих методов требует разработки и оптимизации способа пробоподготовки.

Эти актуальные вопросы и предстояло решить в данной диссертационной работе.

Цель исследования. Определить кинетический механизм катализа и инактивации в ходе катализируемых реакций бифункционального фермента простагландин Н синтазы.

Задачи исследования:

1) Определить условия применения стационарного приближения для ферментов, подвергающихся необратимой инактивации в ходе 8 катализируемых реакций. Получить выражения для описания экспериментально наблюдаемых величин.

2) Провести экспериментальное исследование кинетических закономерностей катализа и инактивации PGHS в случае циклооксигеназной и пероксидазной реакций.

3) Разработать кинетическую модель катализа бифункционального фермента PGHS, учитывающую состояние двух его активных центров, основываясь на двумерной кинетической модели действия для бифункциональных ферментов.

4) Разработать и обосновать теоретические и практические подходы для определения зависимости константы инактивации от концентрации субстрата путем анализа интегральной кривой в условиях истощения по субстрату.

5) Разработать оптимальный способ пробоподготовки и анализа фермента PGHS методами масс-спектрометрии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Филимонов, Иван Сергеевич

выводы

1. Проведено экспериментальное исследование кинетики катализа фермента PGHS. Показано, что циклооксигеназная реакция строго следует кинетике Михаэлиса-Ментен в широком диапазоне концентраций кислорода в отсутствие донора электронов, и не следует кинетике Михаэлиса-Ментен в присутствии донора электронов. Показано, что в присутствии донора электронов циклооксигеназная реакция ингибируется избытком кислорода. Показано, что зависимость скорости циклооксигеназной реакции от концентрации арахидоновой кислоты не линеаризуется в двойных обратных координатах, как в отсутствие донора электронов, так и в присутствии донора электронов.

2. Показано, что в механизмах циклооксигеназной и пероксидазной реакций присутствуют необратимые стадии между пунктами донирования субстратов. Показано, что кинетические закономерности катализа фермента PGHS могут быть объяснены в рамках двумерной кинетической модели для многосубстратных бифункциональных ферментов. Показано, что в доступном диапазоне концентраций субстратов величины констант скоростей псевдопервого порядка в механизме пероксидазной реакции гораздо меньше величин констант скоростей первого порядка для мономолекулярных реакций в механизме действия фермента PGHS.

3. Проведено теоретическое исследование обобщенной модели многосубстратной ферментативной реакции, интермедиаты которой могут подвергаться необратимой инактивации в ходе реакции. С применением теоремы Тихонова о предельном переходе в дифференциальных уравнениях с малым параметром при старшей производной определены условия применимости стационарного приближения. Проанализировано квазистационарное решение исходной системы. Дискриминированы решения для каталитических и инактивационных процессов. Определены экспериментально наблюдаемые характеристики для катализа и инактивации.

141

4. Разработан метод определения константы инактивации из интегральной кинетической кривой накопления продукта ферментативной реакции в условиях истощения по субстрату. Показано, что метод позволяет рассчитывать константу инактивации для всего диапазона концентраций варьируемого субстрата, а также позволяет воспроизводить непрерывную зависимость константы инактивации от концентрации субстрата путем обработки интегральной кинетической кривой.

5. Показано, что существуют два механизма инактивации фермента PGHS: инактивация, тесно связанная с актом катализа циклооксигеназной и пероксидазной реакций, и инактивация, обусловленная дополнительным взаимодействием фермента с перекисью водорода.

6. Показано, что масса нативного фермента PGHS меньше, чем масса фермента PGHS после катализа циклооксигеназной и пероксидазной реакций. Масс-спектры фермента PGHS, обработанного трипсином, отличаются для образца нативного фермента и образцов фермента после протекания циклооксигеназной и пероксидазной реакций. Это может быть свидетельством химических модификаций в процессе катализа и инактивации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

Проанализирована обобщенная кинетическая схема для ферментов, подверженных необратимой инактивации в ходе катализируемых реакций. Выявлены условия применимости стационарного приближения для инактивирующихся ферментов.

Предложен теоретический подход и разработан метод определения зависимости константы инактивации фермента от концентрации субстрата из интегральных кинетических кривых при условии существенного расходования субстрата.

Экспериментально определены зависимости кинетических параметров циклооксигеназной и пероксидазной реакций PGHS от концентраций субстратов этих реакций. Показано, что циклооксигеназная реакция строго следует кинетике Михаэлиса-Ментен в широком диапазоне концентраций кислорода в отсутствие донора электронов, и не следует кинетике Михаэлиса-Ментен в присутствии донора электронов. В кинетических механизмах циклооксигеназной и пероксидазной реакций проведена локализация положения необратимых стадий.

На основании обобщенной двумерной кинетической модели действия для бифункциональных ферментов разработана кинетическая модель действия фермента PGHS. Получено выражение для скорости циклооксигеназной реакции, описывающее весь набор экспериментальных фактов.

Экспериментально определены зависимости параметров инактивации фермента PGHS в ходе циклооксигеназной и пероксидазной реакций от концентраций субстратов реакций.

Разработана и оптимизирована методика пробоподготовки для исследования фермента PGHS методами масс-спектрометрии. Получены масс-спектры PGHS для нативного фермента и для' фермента, принимавшего участие в катализе циклооксигеназной ^ пероксидазной реакций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Филимонов, Иван Сергеевич, 2010 год

1. Samuelsson, В. Prostaglandins and thromboxanes / В. Samuelsson, M. Goldyne, E. Granstrom, M. Hamberg, S. Hammarstrom, C. Malmsten // Annu. Rev. Biochem. 1978. - V. 47. - P. 997-1029.

2. Hamberg, M. Isolation and structure of two prostaglandin endoperoxides that cause platelet aggregation / M. Hamberg, J. Svensson, T. Wakabayashi, B. Samuelsson // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1974. - V. 71. - №2. - P. 345-349.

3. Hamberg, M. Detection and isolation of an endoperoxide intermediate in prostaglandin biosynthesis / M. Hamberg, B. Samuelsson // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1973. - V. 70. - №3. - P. 899-903.

4. Helliwell, R.J.A. Prostaglandin synthases: recent developments and a novel hypothesis / R.J.A. Helliwell, L.F. Adams, M.D. Mitchell // Prost. Leukot. and Essential Fatty Acids. 2004. - V. 70. - №2. - P. 101-113.

5. Vane, J.R. Inhibition of prostaglandin synthesis as a mechanism of action for aspirin-like drugs / J.R. Vane // Nature 1971. - V. 231. - P. 232-235.

6. Hammarstrom, S. Biosynthesis and biological actions of prostaglandins and thromboxanes / S. Hammarstrom // Arch. Biochem. Biophys. — 1982. V. 214.-№2.-P. 431-445.

7. Yokoyama, С. Cloning of human gene encoding prostaglandin endoperoxide synthase and primary structure of the enzyme / C. Yokoyama, T. Tanabe // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989. - V. 165. - P. 888-894.

8. Lands, W.E.M. Oxygen requirement for prostaglandin biosynthesis / W.E.M. Lands, J. Sauter, G.W. Stone // Biochem. Prostaglandins and Medicine-1978.-V. 1. —№2. — P. 117-120.

9. Juranek, I. Affinities of various mammalian arachidonate lipoxygenases and cyclooxygenases for molecular oxygen as substrate / I. Juranek, H. Suzuki, S. Yamamoto // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - V. 1436. - №3. - P. 509-518.

10. Kuehl, F.A.Jr. Prostaglandins, arachidonic acid, and inflammation / F.A.Jr. Kuehl, R.W. Egan // Science. 1980 Nov 28. - V. 210. - №4473. - P. 978984.

11. Feigen, L.P. Vascular influences of prostaglandins: introduction / L.P. Feigen, A.L. Hyman // Fed. Proc. 1981 May 15. - V. 40. - №7. - P. 19851986.

12. Patrono, С. Aspirin as an antiplatelet drug / C. Patrono // N. Engl. J. Med. -1994.-V. 330.-№18.-P. 1287-1294.

13. Kuehl, F.A.Jr. Role of prostaglandin endoperoxide PGG2 in inflammatory processes / F.A.Jr. Kuehl, J.L. Humes, R.W. Egan, E.A. Ham, G.C. Beveridge, C.G. Van Arman // Nature. 1977. - V. 265. - P. 170-173.

14. Vane, J.R. Prostaglandins as mediators of inflammation / J.R. Vane // Adv. Prostaglandin and Thromboxane Res. 1976. - V. 2. - P. 791-801.

15. Zhang, Y. Inhibition of cyclooxygenase-2 rapidly reverses inflammatory hyperalgesia and prostaglandin E2 production / Y. Zhang, A. Shaffer, J. Portanova, K. Seibert, P.C. Isakson // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1997. V. 283. -№3.- P. 1069-1075.

16. Watanabe, K. Biosynthesis of prostaglandin F2 alpha from prostaglandins H2 and D2 by an apparently homogeneous enzyme / K. Watanabe, R. Yoshida, T. Shimizu, O. Hayaishi // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. 1985.- V. 15.-P. 151-153.

17. Wlodawer, P. Some properties of prostacyclin synthase from pig aorta / P. Wlodawer, S. Hammarstrom // FEBS Lett. 1979. - 97 (1). - P. 32-36.

18. Ullrich, V. Thromboxane synthase as a cytochrome P450 enzyme / V. Ullrich, M. Haurand // Adv. Prostaglandin Thromboxane Leukot. Res. -1983.-V. 11.-P. 105-110.

19. Christ-Hazelhof, E. Purification and characterisation of prostaglandin endoperoxide D-isomerase, a cytoplasmic, glutathione-requiring enzyme / E. Christ-Hazelhof, D.H. Nugteren // Biochim. Biophys. Acta 1979. - V. 572. -№1.-P. 43-51.

20. Bergstrom, S. The enzymic formation of prostaglandin E2 from arachidonic acid. Prostaglandins and related factors 32 / S. Bergstrom, H. Danielsson, B. Samuelsson // Biochim. Biophys. Acta 1964. - V. 90. - P. 207-210.

21. Hayaishi, O. Prostaglandins and sleep / O. Hayaishi, H. Matsumura // Adv. Neuroimmunol. 1995. - V. 5. - P. 211-216.

22. Варфоломеев, С.Д. Простагландины молекулярные биорегуляторы / С.Д. Варфоломеев, А.Т. Мевх. - М.: Изд-во Московского ун-та, 1985.

23. Giles, H. The biology and pharmacology of PGD2 / H. Giles, P. Leff // Prostaglandins 1988 Feb. - V. 35. - №2. - P. 277-300.

24. Hayaishi, O. Prostaglandin D synthase is the key enzyme in the promotion of physiological sleep / O. Hayaishi, H. Matsumura, Y. Urade // J. Lipid. Mediat.- 1993.-V. 6.-P. 429-431.

25. Tomura, T. Distribution of prostaglandins in the animal kingdom / T. Tomura, H. Ogata // Biochem. Biophys. Acta 1976. - V. 431. - №2. - P. 127-131.

26. Borgeat, P. Arachidonic acid metabolism in polymorphonuclear leucocytes:unstable intermediates in formation of dihydroxy acids / P. Borgeat, B.146

27. Samuelsson//Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976.-V. 73.-№7.-P. 32133217.

28. Miyamoto, T. Purification of prostaglandin endoperoxide synthetase from bovine vesicular gland microsomes / T. Miyamoto, N. Ogino, S. Yamamoto, O. Hayaishi // J. Biol. Chem. 1976 May 10. - V. 251. - №9. - P. 26292636.

29. Roth, G.J. The heme-binding properties of prostaglandin synthetase from sheep vesicular gland / G.J. Roth, E.T. Machuga, P. Strittmatter // J. Biol. Chem. 1981 Oct 10.-V. 256.-№19.-P. 10018-10022.

30. Van der Ouderaa, F.J. On the haemoprotein character of prostaglandin endoperoxide synthetase / F.J. Van der Ouderaa, M. Buytenhek, F.J. Slikkerveer, D.A. van Dorp // Biochim. Biophys. Acta. — 1979 Jan 29. -572(1).-P. 29^12.

31. Kulmacz, R.J. Protection of prostaglandin H synthase from trypsin upon binding of heme / R.J. Kulmacz, W.E.M. Lands // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1982 Jan 29. - V. 104. - №2. - P. 758-764.

32. Veno, R. Activation mechanism of prostaglandin endoperoxide synthetase by hemoproteins / R. Veno, T. Shimizu, K. Kondo, O. Hayaishi // J. Biol. Chem. 1982. - V. 257. - №10. - P. 5584-5588.

33. Marshall, P.J. Prostaglandin H synthase: distinct binding sites for cyclooxygenase and peroxidase substrates / P.J. Marshall, R.J. Kulmacz // Arch. Biochem. Biophys. 1988. - V. 266. - P. 162-170.

34. Picot, D. The X-ray crystal structure of the membrane protein prostaglandin H2 synthase-1 / D.Picot, P.J. Loll, R.M. Garavito // Nature 1994. - V. 367. - P. 243-249.

35. Fu, J.Y. The induction and suppression of prostaglandin H2 synthase (cyclooxygenase) in human monocytes / J.Y. Fu, J.L. Masferrer, K. Seibert, A. Raz, P. Needleman // J. Biol. Chem. 1990 Oct 5. - V. 265. - №28. - P. 16737-16740.

36. Hla, T. Human cyclooxygenase-2 cDNA / T. Hla, K. Neilson // Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 1992 Aug 15.-V. 89.-№16.-P. 7384-7388.

37. Smith, W.L. Cyclooxygenases: structural, cellular, and molecular biology / W.L. Smith, D.L. DeWitt, R.M. Garavito // Annu. Rev. Biochem. 2000. -V. 69.-P. 145-182.

38. Luong, С. Flexibility of the NSAID binding site in the structure of human cyclooxygenase-2 / C. Luong, A. Miller, J. Barnett, J. Chow, C. Ramesha, M.F. Browner // Nat. Struct. Biol. 1996. - V. 3. - P. 9277-9233.

39. Kulmacz, R.J. Concerted loss of cyclooxygenase and peroxidase activities from prostaglandin H synthase upon proteolytic attack / R.J. Kulmacz // Prostaglandins 1989. - V. 38. - P. 277-288.

40. Raz, A. Differential modification of cyclooxygenase and peroxidase activities of prostaglandin endoperoxidase synthase by proteolytic digestion and hydroperoxides / A. Raz, P. Needleman // Biochem. J. 1990. — V. 269. - P. 603-607.

41. Guo, Q. Comparison of prostaglandin H synthase isoform structures using limited proteolytic digestion / Q. Guo, S. Chang, L. Diekman, G. Xiao, R.J. Kulmacz // Arch. Biochem. Biophys. 1997. - V. 344. - P. 150-158.

42. Kulmacz, R.J. Comparison of the properties of prostaglandin H synthase-1 and -2 / R.J. Kulmacz, W.A. van der Donk, A.L. Tsai // Prog. Lipid. Res. — 2003. V. 42. - №5. - P. 377^104.

43. Toh, H. Prostaglandin endoperoxide synthase contains an EGF-like domain /H. Toh//FEBS Lett. 1989.-V. 258.-P. 317-319.

44. Smith, T. Purification and characterization of the human recombinant histidine-tagged prostaglandin endoperoxide H synthases-1 and -2 / T. Smith, J. Leipprandt, D. DeWitt // Arch. Biochem. Biophys. 2000. - V. 375.-P. 195-200.

45. Chandraseseekharan, N.V. COX-3 a cyclooxygenase-1 variant inhibited byacetaminophen and other analgesic/antipyretic drugs: cloning, structure, andexpression / N.V. Chandraseseekharan, H. Dai, K.L. Roos, N.K. Evanson, J.149

46. Tomsik, T.S. Elton, D.L. Simmons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. -V. 99.-P. 13926-13931.

47. Shaftel, S.S. COX-3: a splice variant of cyclooxygenase-1 in mouse neural tissue and cells / S.S. Shaftel, J.A. Olschowka, S.D. Hurley, A.H. Moore, M.K. O'Banion // Brain. Res. Mol. Brain. Res. 2003. - V. 119. - P. 213215.

48. Smith, W.L. Prostaglandin endoperoxide H synthases (cyclooxygenases)-l and -2 / W.L. Smith, R.M. Garavito, D.L. DeWitt // J. Biol. Chem. 1996. -V. 271.-P. 33157-33160.

49. Malkovski, M.G. The productive conformation of arachidonic acid bound to prostaglandin synthase / M.G. Malkovski, S.L. Ginell, W.L. Smith, R.M. Garavito // Science 2000. - V. 289. -№5486. - P. 1933-1937.

50. Nugteren, D.H. Isolation and properties of intermediates in prostaglandin biosynthesis / D.H. Nugteren, E. Hazelhof // Biochim. Biophys. Acta 1973 Dec 20. - V. 326. -№3. - P. 448-461.

51. Struijk, C.B. Specificity in the enzymayic conversion of polyunsaturated fatty acids into prostaglandins / C.B. Struijk, R.K. Beerthuis, D.A. Van Dorp // Nobel Symposium 2. Prostaglandins, Stokholm, Almqwist & Wiksell. — 1967.-P. 51-56.

52. Van Dorp, D.A. Recent development in the biosynthesis and analyses of prostaglandins / D.A. Van Dorp // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1971. - V. 180. — №1. - P. 181-195.

53. Hemler, M.E. Lipoxygenation activity of purified prostaglandin-forming cyclooxygenase / M.E. Hemler, C.G. Crawford, W.E.M. Lands // Biochemistry-1978 May2.-V. 17.-№9.-P. 1772-1779.

54. Hemler, M.E. Accelerative autoactivation of prostaglandin biosynthesis by PGG2 / M.E. Hemler, G. Graff, W.E.M. Lands // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1978 Dec 29.-V. 85.-№4.-P. 1325-1331.

55. Hemler, M.E. Evidence for a peroxide-initiated free radical mechanism of prostaglandin biosynthesis / M.E. Hemler, W.E.M. Lands // J. Biol. Chem. — 1980 Jul 10.-V. 255.-№13.-P. 6253-6261.

56. Marnett, L.J. Oxygen 18 investigation, of the prostaglandin synthetasedependent co-oxidation of diphenylisobenzofuran / L.J. Marnett, M.J:151

57. Bienkowski, W.R. Pagels // J. Biol. Chem. 1979 Jun 25. - V. 254. - №12. -P. 5077-5582.

58. Hamberg, M. On the mechanism of the biosynthesis of prostaglandins E-l and F-l-alpha / M. Hamberg, B. Samuelsson // J. Biol. Chem. — 1967 Nov 25.-V. 242.-№22.-P. 5336-5343.

59. Nugteren, D.H. The participation of molecular oxygen in the biosynthesis of rostaglandins / D.H. Nugteren, D.A. van Dorp // Biochim. Biophys. Acta -1965 Jun 1. V. 98. - №3. - P. 654-656.

60. Samuelsson, B. On the incorporationn of oxygen in the conversion of 8,11,14-eicosatrienoic acid to prostaglandin El / B. Samuelsson // J. Amer. Chem. Soc. 1965. - V. 87.-№13.-P. 3011-3013.

61. Samuelsson, B. Biosynthesis of prostaglandins / B. Samuelsson // Fed. Proc. 1972. -V. 31. -№5. — P. 1442-1450.

62. Egan, R.W. Mechanism for irreversible self-deactivation of prostaglandin synthetase / R.W. Egan, J. Paxton, F.A.Jr. Kuehl // J. Biol. Chem. 1976. -V. 251.-P. 7329-7335.

63. Kalyanaraman, B. The free radical formed during the hydroperoxide-mediated deactivation of ram seminal vesicles is hemoprotein-derived / B. Kalyanaraman, R.P. Mason, B. Tainer, Т.Е. Eling // J. Biol. Chem. 1982. -V. 257. - №9. - P.4764-4768.

64. Karthein, R. Higher oxidation states of prostaglandin H synthase. EPR study of a transient tyrosyl radical in the enzyme during the peroxidase reaction / R. Karthein, R. Dietz, W. Nastainczyk, H.H. Ruf// Eur. J. Biochem. 1988. -V. 171.-№1-2.-P.313-320.

65. Shimokawa, T. Tyrosine 385 of prostaglandin endoperoxide synthase is required for cyclooxygenase catalysis / T. Shimokawa, R.J. Kulmacz, D.L. DeWitt, W.L. Smith // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - №33. - P. 2007320076.

66. Marnett, L.J. Cyclooxygenase mechanisms / L.J. Marnett // Curr. Opin. Chem. Biol. 2000. - V. 4. - P. 545-552.

67. Longu S. The reaction mechanism of plant peroxidases / S. Longu, R. Medda, A. Padiglia, J.Z. Pedersen, G. Floris // Ital. J. Biochem. 2004. - V. 53.-№1.-P. 41-45.

68. Hsuanyu, Y. Prostaglandin H synthase kinetics. The effect of substituted phenols on cyclooxygenase activity and the substituent effect on phenolicperoxidatic activity / Y. Hsuanyu, H.B. Dunford // J. Biol. Chem. — 1992. -V. 267. -№25. -P. 17649-17657.

69. Koshkin, V. Coupling of the peroxidase and cyclooxygenase reactions of prostaglandin H synthase / V. Koshkin, B.H. Dunford // Biochim. Biophys.Acta 1999. - V. 1430. - №2. - P. 341-348.

70. Kulmacz, R.J. Comparison of branched-chain and tightly coupled reaction mechanisms for prostaglandin H synthase / R.J. Kulmacz, A.-L. Tsai, C. Wei//Biochemistry 1995.-V. 34.-№26.-P. 8499-8512.

71. Hazelton, W.D. Prostaglandin H synthases: members of a class of quasi-linear threshold switches / W.D. Hazelton, J.H. Tien, V.W. Donato, R. Sparks, C.M. Ulrich // Biochem. Pharmacol. 2004. - V. 68. - №3. - P. 423—432.

72. Yourno, J. Enzyme evolution: generation of a bifunctional enzyme by fusion of adjacent genes / J. Yourno, T. Kohno, J.R. Roth // Nature 1970. - V. 228. - №5274. - P. 820-824.

73. Huang, X. Channeling of substrates and intermediates in enzyme-catalyzed reactions / X. Huang, H.M. Holden, F.M. Raushel // Annu Rev. Biochem. -2001. — V. 70.-P. 149-180.

74. Meek, T.D. Purification and characterization of the bifunctional thymidylate synthetase-dihydrofolate reductase from methotrexate-resistant Leishmania tropica / T.D. Meek, E.P. Garvey, D.V. Santi // Biochemistry -1985. V. 24. - №3. - P. 678-686.

75. Miles, E.W. The molecular basis of substrate channeling / E.W. Miles, S. Rhee, D.R. Davies // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - №18. - P. 1219312196.

76. Schneider, T.R. Loop closure and intersubunit communication in tryptophan synthase / T.R. Schneider, E. Gerhardt, M. Lee, P.H. Liang, K.S. Anderson, I. Schlichting // Biochemistry 1998. - V. 37. - №16. - P. 53945406.

77. Leys, D. Channelling and formation of 'active' formaldehyde in dimethylglycine oxidase / D. Leys, J. Basran, N.S. Scrutton // EMBO J. -2003. V. 22. - №16. - P. 4038-^4048.

78. Gehring, A.M. Acetyltransfer precedes uridylyltransfer in theformation of UDP-N-acetylglucosamine in separable active sites of thebifunctional GlmU protein of Escherichia coli / A.M. Gehring, W.J. Lees,155

79. D.J. Mindiola, C.T. Walsh, E.D. Brown // Biochemistry 1996. - V. 35. -№2.-P. 579-585.

80. Miles, B.W. Regulatory control of the amidotransferase domain of carbamoyl phosphate synthetase / B.W. Miles, J.A. Banzon, F.M. Raushel // Biochemistry 1998. - V. 37. - №47. - P. 16773-16779.

81. Eling, Т.Е. Studies on the reduction of endogenously generated prostaglandin G2 by prostaglandin H synthase / Т.Е. Eling, W.C. Glasgow, J.F. Curtis, W.C. Hubbard, J.A. Handler // J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. -№19.-P. 12348-12355.

82. Easterby, J.S. A generalized theory of the transition time for sequential enzyme reactions / J.S. Easterby // Biochem. J. 1981. - V. 199. — №1. — P. 155-161.

83. Easterby, J.S. The kinetics of consecutive enzyme reactions. The design of coupled assays and the temporal response of pathways / J.S. Easterby//Biochem. J. 1984. -V. 219.-№3.-P. 843-847.

84. Liang, P.H. Kinetic reaction scheme for the dihydrofolate reductase domain of the bifunctional thymidylate synthase-dihydrofolate reductase from Leishmania major / P.H. Liang, K.S. Anderson // Biochemistry — 1998. -V. 37.-№35.-P. 12206-12212.

85. Kulmacz, R.J. Interaction between peroxidase and cyclooxygenase activities in prostaglandin-endoperoxide synthase. Interpretation of reaction kinetics / R.J. Kulmacz, R.B. Pendleton, W.E.M. Lands // J. Biol. Chem. -1994. V. 269. - №8. - P. 5527-5536.

86. Вржещ, П.В. Кинетическая модель бифункционального многосубстратного фермента. Стационарное приближение / П.В. Вржещ//Биохимия 1999.-Т. 64.-№4.-С. 502-512.

87. Волькенштейн, М.В. I Диаграмный метод решения задач стационарной ферментативной кинетики / М.В. Волькенштейн, Ю.Б. Магаршак // Биофизика 1970. - Т. 15. - С. 777-784.

88. Корниш-Боуден, Э. Основы ферментативной кинетики / Э. Корниш-Боуден. -М.: Мир, 1979.

89. Cha, S. A simple method for derivation of rate equations for enzyme-catalyzed reactions under the rapid equilibrium assumption or combined assumptions of equilibrium and steady state / S. Cha // J. Biol. Chem. -1968.-V. 243.-№4.-P. 820-825.

90. Тихонов, A.H. Системы дифференциальных уравнений, содержащие малые параметры при производных / А.Н. Тихонов // Математический сборник 1952. - Т. 31. - №73. - С. 575-586.

91. Smith, W.L. Oxygenation of polyunsaturated fatty acids during prostaglandin biosynthesis by sheep vesicular gland / W.L. Smith, W.E.M. Lands // Biochemistry 1972. - V. 11. - P. 3276-3285.

92. Deeb, R.S. Heme catalyzes tyrosine 385 nitration and inactivation of• prostaglandin» H2 synthase-1 by peroxynitrite' / R.S. Deeb, G. Hao, S.S.157

93. Gross, M. Laine, J.H. Qiu, B. Resnick, E.J. Barbar, D.P. Hajjar, R.K. Upmacis // J. Lipid. Res. 2006 May. - V. 47. - №5. - P. 898-911.

94. Marshall, P.J. Constraints on prostaglandin biosynthesis in tissues / P.J. Marshall, R.J. Kulmacz, W.E.M. Lands // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262.-№8.-P. 3510-3517.

95. Kulmacz, R.J. Prostaglandin H synthase and hydroperoxides: peroxidase reaction and inactivation kinetics / R.J. Kulmacz // Arch. Biochem. Biophys. 1986. - V. 249. - №2. - P. 273-285.

96. Song, I. Different suicide inactivation processes for the peroxidase and cyclooxygenase activities of prostaglandin endoperoxide H synthase-1 / I. Song, T.M. Ball, W.L. Smith // Biochem. Biophys. Res. Communs. -2001.-V. 289.-№4.-P. 869-875.

97. Wu, G. A mechanistic study of self-inactivation of the peroxidase activity in prostaglandin H synthase-1 / G. Wu, C. Wei, R.J. Kulmacz, Y. Osawa, A.L. Tsai // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - №14. - P. 92319237.

98. Tsai, A.L. Prostaglandin H synthase. Kinetics of tyrosyl radical formation and of cyclooxygenase catalysis / A.L. Tsai, G. Palmer, R.J. Kulmacz//J. Biol. Chem. 1992. - V. 267.-№25.-P. 17753-17759.

99. Bambai, В. Role of Asn-382 and Thr-383 in activation and inactivation of human prostaglandin H synthase cyclooxygenase catalysis / B. Bambai, C.E. Rogge, B. Stec, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 2004. - V.г 279. №6. - P. 4084—4092.

100. Lu, G. Comparison of the peroxidase reaction kinetics of prostaglandin H synthase-1 and -2 / G. Lu, A.L. Tsai, H.E. Van Wart, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - №23. - P. 16162-16167.

101. Wu, G. Cyclooxygenase inactivation kinetics during reaction of prostaglandin H synthase-1 with peroxide / G. Wu, RJ. Kulmacz, A.L. Tsai // Biochemistry 2003. - V. 42. - №46. - P. 13772-13777.

102. Цаплина, JI.A. Потеря циклооксигеназной и пероксидазной активностей простагландин-Н-синтазы в процессе катализа / Л.А. Цаплина, П.В. Вржещ // Биохимия 2007. - Т. 72. - №6. - С. 774-784.

103. Лебедев, А.Т. Масс-спектрометрия в органической химии / А.Т. Лебедев. -М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2003. — 493 с.

104. Whitehouse, С.М. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers / C.M. Whitehouse, R.N. Dreyer, M. Yamashita, J.B Fenn // Anal. Chem. 1985. - V. 57. - №3. - P. 675-679.

105. Dole, M. Molecular Beams of Macroions / M. Dole, R.L. Hines, R.C. Mack, R.C. Mobley, L.D. Ferguson, M.B. Alice // J. Chem. Phys. 1968. -V. 49. - №5. - P. 2240-2249.

106. Snyder, P. Biochemical and biotechnological applications of electrospray ionization mass spectrometry / P. Snyder. — ACS, Washington D. C., 1995, -601 p.

107. Gaskell, S.J. Electrospray: Principles & Practice / S.J. Gaskell // J. Mass Spectrom. 1997. - V. 32. - P. 677-688.

108. Gamero-Castano, M. Kinetics of small ion evaporation from the charge and mass distribution of multiply charged clusters in electrosprays /

109. Kebarle, P. A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry/ P. Kebarle // J. Mass Spectrom. -2000.-V. 35.-№7.-P. 804-817.

110. Fernandez de la Mora, J. Electrochemical Processes in Electrospray Ionization Mass Spectrometry / J. Fernandez de la Mora, G. J. Van Berkel, C. G. Enke, R. B. Cole, M. Martinez-Sanchez, J. B. Fenn // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. - P. 939-952.

111. Tito, M.A. Electrospray time-of-flight mass spectometry of the intact MS2 virus capsid / M.A. Tito, K. Tars, K. Valegard, J. Hajdu, C.V. Robinson // J. Am. Chem. 2000. - V. 122. - P. 3550-3551.

112. Lawrence, E.O. On the Production of High Speed Protons / E.O. Lawrence, N.E. Edelfsen // Science 1930 October 10. - V. 72. - P. 376377.

113. Sommer, H. A Precise Method of Determining the Faraday by Magnetic Resonance / H. Sommer, H.A. Thomas, J.A. Hippie // Phys. Rev. 1949.-V. 76.-P. 1877-1878.

114. Marshall, A.G. Relaxation and spectral line shape in Fourier transform ion resonance spectroscopy / A.G. Marshall, M.B. Comisarow, G. Parisod // J. Chem. Phys. 1979. - V. 71. - №11. - P. 4434-4444.

115. Karas, M. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds / M. Karas, D. Bachmann, D. Bahr, F. Hillenkamp // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987. - V. 78. - P. 53-68.

116. Tanaka, К. Protein and Polymer Analyses up to m/z 100,000 by Laser Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry / K. Tanaka, H. Waki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida // Rapid Commun. Mass Spectrom. -1988.-V. 2. -№8. P. 151-153.

117. Karas, M. Influence of the Wavelength in High-Irradiance Ultraviolet Laser Desorption Mass Spectrometry of Organic Molecules / M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp // Anal. Chem. 1985. - V. 57. - P. 2935-2939.

118. Karas, M. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons / M. Karas, F. Hillenkamp // Anal. Chem. 1988.-V. 60.-№20.-P. 2299-2301.

119. Spengler, B. Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis / B. Spengler, R.S. Cotter // Anal. Chem. 1990. - V. 62. - №8. -P. 793-796.

120. Hillenkamp, F. How cool is MALDI? An introduction to high pressure MALDI ion sources / F. Hillenkamp, S. Berkenkamp, A. Leisner // Proc. 50th ASMS Conf. On Mass Spectrometry and Allied Topics, Orlando, F.L. -2002.

121. Zenobi, R. Ion formation in MALDI mass spectrometry / R. Zenobi, R. Knochenmuss // Mass Spectrom. Rev. 1998. - V. 17. - P. 337-366.

122. Karas, M. Ionization in matrix-assisted laser desorption/ionization: singly charged molecular ions are the lucky survivors / M. Karas, M. Glucksmann, J. Schafer // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. - P. 1-12.

123. Knochenmuss, R. Secondary ion-molecule reactions in matrix-assisted laser desorption/ionization / R. Knochenmuss, A. Stortelder, K. Breuker, R. Zenobi // J. Mass Spectrom. 2000. - V. 35. - P. 1237-1245.

124. Nemeth, J.F. Characterization of the glycosylation sites in cyclooxygenase-2 using mass spectrometry / J.F. Nemeth, G.P.Jr.

125. Hochgesang, L.J. Marnett, R.M. Caprioli // Biochemistry 2001 Mar 13. -V. 40.-№10.-P. 3109-3116.

126. Mutsaers, J.H. Determination of the structure of the carbohydrate chains of prostaglandin endoperoxide synthase from sheep / J.H. Mutsaers, H. van Halbeek, J.P. Kamerling, J.F.Vliegenthart // Eur. J. Biochem. 1985 Mar 15. - V. 147. - №3. - P. 569-574.

127. Otto, J.C. N-glycosylation of prostaglandin endoperoxide synthases-1 and -2 and their orientations in the endoplasmic reticulum / J.C. Otto, D.L. DeWitt, W.L. Smith // J. Biol. Chem. 1993 Aug 25. - V. 268. - №24. - P. 18234-18242.

128. Shimokawa, T. Expression of prostaglandin endoperoxide synthase-1 in a baculovirus system / T. Shimokawa, W.L. Smith // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992 Mar 31. - V. 183. - №3. - P. 975-982.

129. Boutaud, О. Characterization of the lysyl adducts formed from prostaglandin H2 via the levuglandin pathway / O. Boutaud, C.J. Brame, R.G. Salomon, L.J. 2nd Roberts, J.A. Oates // Biochemistry 1999 Jul 20. -V. 38. -№29. - P. 9389-9396.

130. Kulmacz, R.J. Attachment of substrate metabolite to prostaglandin H synthase upon reaction with arachidonic acid / R.J. Kulmacz // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987 Oct 29. - V. 148. - №2. - P. 539-545.

131. Lowry O.H. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosenbrough, A.L. Farr, R.J. Randall // J. Biol. Chem. 1951. -V. 193.-№1.-P. 265-272.

132. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254

133. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature 1970 Aug 15. - V. 227. - №5259. - P. 680-685.

134. Франк, Г.М. Руководство по изучению биологического окисления полярографическим методом / Г.М.Франк, М.Н. Кондрашова, Е.Н. Мохова, Ю.С. Ротенберг. М.: Наука, 1973.

135. Kulmacz, R.J. Prostaglandin Н synthase: spectroscopic studies of the interaction with hydroperoxides and with indomethacin / R.J. Kulmacz, Y. Ren, A.-L. Tsai, G. Palmer // Biochemistry 1990. - V. 29. - №37. - P. 8760-8771.

136. Кузнецова, Ю.А. Чувствительный метод определения активности простагландин-Н-синтазы / Ю.А. Кузнецова, В.Б. Ромах, M.JL Строкин, А.Т. Мевх // Вестн. моек, ун.-та 1998. - Т. 39. - №5. - С. 302-304.

137. Falk, J.E. Porphyrins and metalloporphyrins / J.E. Falk // Elsevier Amsterdam. N.Y.-L. 1964. - V. 2. - P. 181-241.

138. Вржещ, П.В. Квазиравновесное приближение в ферментативной кинетике. Необходимые и достаточные условия применения в случае односубстратных реакций и оценка точности / П.В. Вржещ // Биохимия -2008.-Т. 73.-№Ю.-С. 1390-1397.

139. Рубин, А.Б. Биофизика / А.Б. Рубин // В 2 т. М.: Наука, 2004. -Т. 1: Теоретическая биофизика.

140. Тихонов, А.Н. Дифференциальные уравнения / А.Н. Тихонов, А.Б. Васильева, А.Г. Свешников. М.: Наука. Физматлит, 1998. — 232 с.

141. Li, В. Quasy-steady-state laws in enzyme kinetics / В. Li, Y. Shen, B. Li // J. Phys. Chem. A 2008. - V. 112. - P. 2311-2321.

142. Klonowski, W. Simplifying principles for chemical and enzyme reaction kinetics / W. Klonowski // Biophys. Chem. 1983. - V. 18. - P. 73-87

143. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Инактивация фермента в процессе реакции / П.В. Вржещ, С.Д. Варфоломеев // Биохимия 1985. - Т. 50. - №1. - С. 139-147.

144. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Ингибирование продуктами, обратимыми и необратимыми ингибиторами / П.В. Вржещ // Биохимия 1988. - Т. 53. -№10.-С. 1704-1711.

145. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика многосубстратных ферментативных* реакций / П.В. Вржещ. М.: ООО «МАКС Пресс», 2003.

146. Волькенштейн, M.B. / М.В. Волькенштейн, Б.Н. Гольдштейн // Биохимия 1966. - Т. 31 - С. 541-547.

147. King, E.L. A schematic method of deriving the rate laws for enzyme-catalyzed reactions / E.L. King, C. Altman // J. Phys. Chem. — 1956. — V.60. -P. 1375-1378.

148. Swinney, D.C. Differential allosteric regulation of prostaglandin H synthase 1 and 2 by arachidonic acid / D.C. Swinney, A.Y. Mak, J. Barnett, C.S. Ramesha//J. Biol. Chem. 1997. - V.272.-P. 12393-12398.

149. Garavito, R.M. The structure of mammalian cyclooxygenases / R.M. Garavito, A.M. Mulichak // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2003. -V.32.-P. 183-206.

150. Вржещ, П.В. Интегральная кинетика многосубстратных ферментативных реакций. Критерии кинетического поведения и характеристические координаты для решения прямой и обратных задач / П.В. Вржещ // Биохимия 1996. - Т. 61 - С. 2069-2083.

151. Bambai, В. Prostaglandin Н synthase: effects of peroxidase cosubstrates on cyclooxygenase velocity / B. Bambai, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 2000. - V.275. - P. 27608-27614.

152. Вржещ, П.В. Стационарная кинетика бифункциональных ферментов. Учет иерархии быстрых и медленных каталитических циклов в обобщенной модели / П.В. Вржещ // Биохимия — 2007. Т. 72. - №9. - С. 936-943.

153. Chen W. Hydroperoxide dependence and cooperative cyclooxygenase kinetics in prostaglandin H synthase-1 and -2. / W. Chen, T.R. Pawelek, R.J. Kulmacz // J. Biol. Chem. 1999. - V.274. - №29. - P. 20301-20306.