Хромосомная организация и эволюция геномов грызунов (Rodentia, Mammalia) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, доктор наук Романенко Светлана Анатольевна

• Романенко Светлана Анатольевна
• доктор наук
• 2019

Оглавление диссертации доктор наук Романенко Светлана Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы исследования

Цели и задачи работы

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы диссертационного исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации

Вклад автора

Структура и объем диссертации

Благодарности

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Систематика, филогения и кариология отряда Rodentia

1.1.1. Систематические и филогенетические отношения в отряде Я^епйа

1.1.1.1. Систематика и филогенетика грызунов

1.1.1.1.1. Филогенетические отношения между представителями подотряда Myomorpha

1.1.2. Особенности кариотипов грызунов

1.2. Типы перестроек хромосом и возможное их значение для видообразования

1.2.1. Межхромосомные перестройки в эволюции кариотипов грызунов

1.2.1.1. Робертсоновские транслокации

1.2.1.2. Тандемные транслокации

1.2.2. Внутрихромосомные перестройки в эволюции кариотипов грызунов

1.2.2.1. Инверсии

1.2.2.2. Центромерные сдвиги

1.2.3. Вариации количества и распределения конститутивного гетерохроматина у грызунов

1.2.4. В-хромосомы

1.2.5. Нестандартные системы определения пола у представителей отряда Rodentia

1.3. Реконструкция предковых кариотипов

1.4. Особенности организации хромосомных наборов и кариотипическая эволюция в отдельных таксонах грызунов

1.4.1. Подотряд Anomaluromorpha

1.4.2. Подотряд Castorimorpha

1.4.3. Подотряд Hystricomorpha

1.4.4. Подотряд Myomorpha

1.4.4.1. Семейство Dipodidae

1.4.4.2. Семейство Calomyscidae

1.4.4.3. Семейство Muridae

1.4.4.3.1. Подсемейство Gerbillinae

1.4.4.3.2. Подсемейство Murinae

1.4.4.3.3. Подсемейства Deomyinae и Otomyinae

1.4.4.4. Семейство Cricetidae

1.4.4.4.1. Подсемейство Arvicolinae

1.4.4.4.2. Подсемейства Cricetinae и Neotominae

1.4.4.4.2. Подсемейство Sigmodontinae

1.4.5. Подотряд Sciuromorpha

1.5. Предковый кариотип грызунов

1.6. Скорость кариотипической эволюции в отряде Rodentia

1.7. Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Ферменты

2.1.3. Праймеры

2.1.4. Антибиотики, антимикотики, культуральные среды, сыворотки

2.1.5. Растворы и буферы

2.1.6. Исследованные образцы

2.1.7. Суспензии фиксированных метафазных клеток

2.1.8. Хромосомоспецифичные ДНК-библиотеки

2.1.9. Микродиссекционные ДНК-библиотеки

2.1.10. Теломерные и рибосомные ДНК-зонды

2.2. Методы

2.2.1. Получение и криоконсервация культур первичных фибробластов

2.2.2. Приготовление суспензий хромосом

2.2.2.1. Клетки костного мозга

2.2.2.2. Первичные фибробласты

2.2.3. Приготовление препаратов и дифференциальное окрашивание хромосом

2.2.4. Получение фракции высокоповторенных последовательностей ДНК

2.2.5. Получение ДНК-библиотек

2.2.5.1. ДНК-библиотеки сортированных хромосом

2.2.5.1.1. Набор сортированных хромосом Castor fiber

2.2.5.1.2. Набор сортированных хромосом Cavia porcellus

2.2.5.1.3. Набор сортированных хромосом Cricetulus griseus

2.2.5.1.4. Набор сортированных хромосом Dicrostonyx torquatus

2.2.5.1.5. Набор сортированных хромосомMicrotus agrestis

2.2.5.1.6. Набор сортированных хромосом Mesocricetus auratus

2.2.5.1.7. Набор сортированных хромосом Mus musculus

2.2.5.1.8. Набор сортированных хромосом Tamias sibiricus

2.2.5.1.9. Набор сортированных хромосом Homo sapiens

2.2.5.2. Микродиссекционные ДНК-библиотеки

2.2.5.3. Теломерные и рибосомные ДНК-зонды

2.2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ

2.2.7. Реконструкция предковых кариотипов

2.2.8. Секвенирование ДНК-библиотек и анализ их состава

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Hystricomorpha: морская свинка (Caviaporcellus) и перуанская свинка (С. tschudii)

3.1.1. Получение и характеризация хромосомоспецифичных проб C. porcellus; привязка проб к G-окрашенным хромосомам

3.1.2. Стандартизация кариотипа

3.1.3. Схема распределения теломерных повторов и рибосомной ДНК

3.1.4. Реципрокный хромосомный пэйнтинг между хромосомами человека и морской свинки (C. porcellus)

3.1.5. Кариотип перуанской свинки (Cavia tschudii) и сравнительная хромосомная карта с хромосомами морской свинки (C. porcellus)

3.2. Castorimorpha: речной бобр (Castor fiber)

3.3. Sciuromorpha: азиатский бурундук (Tamias sibiricus)

3.4. Myomorpha: сравнительный хромосомный пэйнтинг

3.4.1. Род Allocricetulus и Cricetulus sokolovi

3.4.1.1. Кариотипирование Allocricetulus

3.4.1.2. Кариотипирование Cricetulus sokolovi

3.4.1.3. Локализация пробM. auratus на хромосомах Cricetulus sokolovi и видов рода Allocricetulus

3.4.2. Реципрокный хромосомный пэйнтинг между хромосомами золотистого хомячка M. auratus и темной полевки M. agrestis

3.4.3. Полевочьи - подсемейство Arvicolinae

3.4.3.1. Копытный лемминг (Dicrostonyx torquatus)

3.4.3.1.1. Кариотип D. torquatus

3.4.3.1.2. Проточный кариотип копытного лемминга

3.4.3.2. Реципрокный пэйнтинг между парами видов D. torquatus -M. agrestis и D. torquatus -M. auratus

3.4.3.3. Род Alticola

3.4.3.4. Роды Arvicola иMyodes

3.4.3.5. Слепушонки. Род Ellobius

3.4.3.6. Роды Alexandromys, Microtus, Terricola

3.4.3.7. Род Lasiopodomys

3.4.3.7.1. Ь. mandarinus

3.4.3.8. Внутрихромосомные перестройки в кариотипах полевочьих

3.4.4. Внутрихромосомные перестройки в кариотипах видов Мшга<!еа

3.4.4.1. Области гомологии между ММи3 и соответствующими хромосомами других грызунов

3.4.4.2. Области гомологии между ММи6 и соответствующими хромосомами других грызунов

3.4.4.3. Области гомологии между ММШ8 и соответствующими хромосомами других

грызунов

3.4.4.4. Области гомологии между MMU19 и соответствующими хромосомами других грызунов

3.4.5. Состав В-хромосом лесных и полевых мышей рода Apodemus

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Корректировка сравнительных хромосомных карт бобра и бурундука

4.2. Первые сравнительные хромосомные карты между представителями Hystricomorpha и человеком

4.2.1. Предковые ассоциации, обнаруженные в кариотипе морской свинки

4.2.2. Уровень кариотипической дивергенции свинок

4.3. Кариотипические отношения между отдельными таксонами хомячьих (Cricetinae)

4.3.1. Род Allocricetulus

4.3.1.1. Эволюция кариотипа Allocricetulus

4.3.2. Кариотипическая эволюция в подсемействе Cricetinae

4.4. Кариотипическая эволюция в подсемействе Arvicolinae

4.4.1. Кариотип D. torquatus

4.4.2. Сложная система половых хромосом у L. mandarinus и внутриаутосомный полиморфизм

4.4.3. Высокий консерватизм кариотипов в роде Alticola

4.4.4. Эволюция хромосом в роде Ellobius

4.4.5. Предковый кариотип подтрибы Мгсгойш

4.4.6. Кариотипическая эволюция в роде Lasiopodomys

4.4.7. Реконструкция предкового кариотипа АтсоН^с

4.4.8. Предполагаемый ход кариотипической эволюции в подсемействе Ат^Итс

4.4.9. Внутрихромосомные перестройки в эволюции кариотипов полевочьих

4.4.10. Скорость кариотипической эволюции в подсемействе АтсоН^а

4.5. Предполагаемый предковый кариотип отряда Rodentia и обзор кариотипической эволюции в таксоне

4.6. рДНК и интерстициальные теломерные повторы

4.7. Внутрихромосомные перестройки в эволюции кариотипов Muroidea

4.7.1. Эволюция консервативных сегментов

4.7.2. Эволюционные новые центромеры

4.8. Эволюция и происхождение В-хромосом у Apodemus

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Список публикаций по теме диссертационной работы

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. Список публикаций в рецензируемых журналах по результатам конференций по теме диссертации

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. Полный список видов грызунов, вовлеченных в сравнительные исследования с помощью метода хромосомного пэйнтинга

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

дУТФ - дезоксиуридинтрифосфат ед. акт. - единица активности мин. - минута млн - миллион

ПИ - перицентрическая инверсия

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

рДНК - рибосомная ДНК

рРНК - рибосомная РНК

ч. - час

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭНЦ - эволюционно новая центромера или неоцентромера ЯОР - ядрышкообразующий район

AAK (ancestral Arvicolinae karyotype) - предковый кариотип подсемейства Arvicolinae

AAlK (ancestral Allocricetulus karyotype) - предковый кариотип рода

Allocricetulus

AaccK (ancestral Allocricetulus, Cricetulus, Cricetus karyotype) - предковый кариотип группы, объединяющей роды Allocricetulus, Cricetulus и Cricetus.

ACnK (ancestral Cricetinae karyotype) - предковый кариотип подсемейства Cricetinae

AEK (ancestral Ellobius karyotype) - предковый кариотип рода Ellobius AMK (ancestral Muroidea karyotype) - предковый кариотип надсемейства Muroidea

AMdK (ancestral Muridae karyotype) - предковый кариотип семейства Muridae

AMiK (ancestral Microtina karyotype) - предковый кариотип полевочьих подтрибы Microtina

AMnK (ancestral Murinae karyotype) - предковый кариотип подсемейства Murinae

ASK (ancestral Sciuromorpha karyotype) - предковый кариотип Sciuromorpha ASdK (ancestral Sciuridae karyotype) - предковый кариотип семейства Sciuridae

BAC (bacterial artificial chromosome) - искусственная бактериальная хромосома

CBG (C-band by barium using Giemsa) - бэндинг, полученный путем обработки препаратов метафазных хромосом раствором гидроксида бария и последующей окраской красителем Гимза; С-окрашивание или С-бэндинг DABCO (1,4-diazabicyclo(2.2.2)octane) - 1,4-диазабицикло(2,2,2)октан DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) - 4,6-диамидино-2-фенилиндол DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) - фосфатный буфер модификации Дюльбекко

dist (distal) - дистальная часть

DOP (degenerated oligonucleotide primer) - частично вырожденный праймер FISH (fluorescence in situ hybridization) - флуоресцентная гибридизация in

situ

FN (fundamental number) - фундаментальное число кариотипа, суммарное количество плеч хромосом

FNa (fundamental autosomal number) - суммарное количество плеч аутосом GAK (Glires ancestral karyotype) - предковый кариотип Glires GTG (G-band by trypsin using Giemsa) - бэндинг, полученный лимитированной протеолитической обработкой препаратов метафазных хромосом и последующей окраской красителем Гимза; G-окрашивание или G-бэндинг

ITS (interstitial telomeric sequences) - интерстициальные теломерные последовательности

LAK (Lasiopodomys ancestral karyotype) - предковый кариотип рода Lasiopodomys

LINE (long interspersed elements) - длинные диспергированные повторы med (medial) - медиальная часть

prox - проксимальная часть

PAR (pseudoautosomal regions) - псевдоаутосомный район RAK (Rodentia ancestral karyotype) - кариотипа предка грызунов Rb (Robertsonian translocation) - робертсоновская транслокация SINE (short interspersed elements) - короткие диспергированные повторы sLAK (ancestral karyotype of Lasiopodomys subgenus) - предковый кариотип подрода Lasiopodomys

SSC (saline-sodium citrate buffer) - стандартный солевой буфер SRY (sex-determining region Y) - ген определения пола, кодирующий фактор развития яичка, белковый продукт гена SRY запускает развитие зародыша по мужскому пути полового развития

ter (terminal) - терминальный участок

WGA (whole genome amplification) - полногеномная амплификация 2n - диплоидное число хромосом

Для сокращения латинских названий видов в работе использованы четырехбуквенные обозначения: первая буква родового названия и три первые буквы видового. Например, Cricetulus griseus - CGRI. Трехбуквенные обозначения сохранены для человека (HSA - Homo sapiens) и домовой мыши (MMU - Mus musculus).

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Хромосомная организация и эволюция геномов грызунов (Rodentia, Mammalia)»

Актуальность темы исследования

Сравнительные цитогенетические исследования представляют собой важную часть изучения геномов животных. Методы классической цитогенетики и современные молекулярно-цитогенетические подходы позволяют достаточно быстро и детально сравнивать полные геномы представителей самых разнообразных таксонов, внося существенный вклад в решение спорных вопросов таксономии, систематики, филогении и биогеографии. По сравнению с морфометрией, сравнительный анализ кариотипов помимо филогенетического родства исследуемых видов, предоставляет информацию и об изменениях в их геномной организации.

Основные успехи современной цитогенетики связаны с развитием методов флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), которая определяет гомологию районов в геномах сравниваемых видов на основании сродства их последовательностей ДНК. В настоящее время FISH позволяет выявлять районы гомологии с разрешением до примерно 4 млн пар нуклеотидов (п.н.), тем самым давая возможность описывать большую часть значимых меж- и внутрихромосомных перестроек.

За 20 с небольшим лет, прошедших с момента разработки метода сравнительного хромосомного пэйнтинга, в исследования были вовлечены около 200 видов млекопитающих, представляющих основные отряды. Это позволило установить, что, по сути, единых тенденций преобразования кариотипов в ходе эволюции нет. Есть таксоны (ластоногие, куницеобразные, кошачьи), для которых характерны довольно невысокие скорости преобразования геномов, когда лишь небольшое число перестроек отличает кариотипы современных видов от кариотипа предка. Есть, напротив, таксоны (мышевидные грызуны, собачьи, гиббоновые), характеризующиеся быстрой реорганизацией генома, т. е. те, в которых значительное число перестроек привело к массовой перетасовке предковых синтенных групп. Тем не менее, внутри фактически каждого такого таксона встречаются исключения, а количество перестроек и скорости их

фиксации могут варьировать в разы. В целом по данным сравнительного хромосомного пэйнтинга для некоторых отрядов и для всего класса млекопитающих удалось реконструировать предковые кариотипы, состоящие из наиболее вероятных комбинаций консервативных сегментов хромосом, восстановить события, происходившие при формировании кариотипов ныне живущих видов и повлекшие перетасовку этих сегментов. При этом, с учетом того, что преимущественно из каждого отряда исследовано несколько видов, актуальным остается детальное изучение кариотипических взаимоотношений между представителями родов и семейств. Также важно подчеркнуть, что в основном выводы сделаны на основании анализа межхромосомных перестроек, так как до сих пор работы по детекции внутрихромосомных перестроек крайне немногочисленны и охватывают ограниченное число видов.

Грызуны (Rodentia) - самый крупный отряд млекопитающих, характеризующийся практически повсеместным распространением представителей, огромным разбросом значений диплоидных чисел хромосом в их кариотипах, различной морфологией хромосом, вариациями по количеству и распределению блоков гетерохроматина, наличием добавочных хромосом (В-хромосом) и сложных систем половых хромосом в кариотипах отдельных видов. Кариотипические отношения внутри отряда изучены крайне неравномерно. В целом считается, что представители подотряда Sciuromorpha (белкообразные) характеризуются достаточно консервативными кариотипами, близкими по структуре к кариотипу возможного предка всех грызунов. Эта консервативность позволяет, в том числе, проводить сравнительные исследования внутри этого таксона с использованием пэйнтинг-проб человека. Myomorpha (мышеобразные) и Hystricomorpha (дикобразообразные), напротив, отличаются крайне высокой перестроенностью геномов. Сведения об особенностях организации и эволюции кариотипов боброобразных (Castorimorpha) и шипохвостообразных (Anomaluromorpha) крайне скудны. Для многих видов, в том числе и широко использующихся в качестве лабораторных (хомячки, песчанки, морская свинка), получены данные только о структуре кариотипа и выполнено дифференциальное

окрашивание хромосом, тогда как сравнительные хромосомные карты отсутствуют.

В целом в биологии в настоящее время наблюдается тенденция сдвига внимания в область изучения геномов на уровень последовательностей ДНК. В то же время разного плана цитогенетические исследования не только не теряют актуальности, но и приобретают особую значимость в сфере геномных проектов. Особенно это важно для видов, являющихся популярными лабораторными объектами (большинство - грызуны), так как отсутствие привязки последовательностей ДНК к хромосомам значительно ограничивает изучение функционирования геномов.

Степень разработанности темы исследования

К настоящему моменту из примерно 2277 видов современных грызунов в исследования по сравнительному хромосомному пэйнтингу вовлечено около 130 видов, представляющих преимущественно подсемейства Sigmodontinae (СпсеМае) и Мигтае (Muridae) внутри подотряда Myomorpha, различные подсемейства подотрядов Hystгicomoгpha и Sciuгomoгpha. Крайне слабо в подобные исследования включены представители очень многочисленных и кариотипически разнородных подсемейств Спсейпае и АтсоНпае (Cгicetidae). Кроме того, на хромосомах отдельных видов проведена локализация только единичных проб, т. е., полногеномные сравнительные хромосомные карты получены не были. Из-за того, что на хромосомах представителей различных подотрядов были локализованы разные наборы пэйнтинг-проб, невозможно оценить кариотипическое родство на уровне подотрядов. Кариотипические отношения внутри многих таксонов более низкого ранга тоже не разрешены. Отсутствует общепризнанная схема, отражающая филогенетические отношения даже на уровне подотрядов. Системы нестандартных половых хромосом и В-хромосомы, широко представленные у представителей подотряда Myomorpha, описаны преимущественно методами классической цитогенетики, тогда как информация о молекулярно-генетическом составе этих элементов остается неизвестной.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы является изучение хромосомной организации и особенностей эволюции геномов грызунов из разных таксонов с помощью современных молекулярно-цитогенетических методов. Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить хромосомную организацию геномов представителей подотрядов Castorimorpha (боброобразные), Hystricomorpha (дикообразообразные), Sciuromorpha (белкообразные) и Myomorpha (мышеобразные), определить хромосомные маркеры отдельных подотрядов грызунов и реконструировать вероятный предковый кариотип отряда Rodentia, обсудить вероятные пути хромосомных преобразований геномов в этих таксонах.

2. Описать внутрихромосомные перестройки в различных таксонах надсемейства Muroidea (подотряд Myomorpha) и на примере подсемейства Arvicolinae оценить вклад внутрихромосомных перестроек в формирование кариотипов современных видов грызунов.

3. Детально на цитогенетическом уровне описать системы нестандартных половых хромосом у различных представителей грызунов (копытного лемминга Dicrostonyx torquatus, китайских полевок Lasiopodomys mandarinus, слепушонок Ellobius alaicus и E. tancrei), проанализировать состав В-хромосом лесных и полевых мышей рода Apodemus.

Научная новизна, теоретическая и практическая значимость

работы

Все основные результаты данного исследования получены впервые.

С применением молекулярно-цитогенетических методов выявлены консервативные районы хромосом, определены их границы у значительного числа видов грызунов. Полные сравнительные хромосомные карты построены для 26 видов грызунов (двух видов Hystricomorpha, 24 видов Myomorpha), внесены уточнения в карты 10 видов, геномы которых были изучены ранее. Важно, что при построении карт использованы хромосомные наборы видов с детально картированными геномами (домовая мышь, золотистый хомяк, человек), что

позволяет в дальнейшем использовать эти карты в качестве первичного материала для картирования геномов исследованных видов.

Впервые выполнена локализация полного набора пэйнтинг-проб человека на хромосомах представителя подотряда дикобразообразных грызунов Hystricomorpha - морской свинки (Cavia porcellus). Данный вид является распространенным лабораторным объектом для изучения множества заболеваний человека, например, диабета и атеросклероза, и, хотя геном вида полностью отсвеквенирован, привязки скаффолдов к хромосомам отсутствуют [Gajos-Draus, Duda, Ber^sewicz, 2017; The guinea pig genome browser at UCSC: Broad/cavPor3; Yang et al., 2018]. Полученные данные - первый шаг на этапе финишной сборки генома морской свинки.

Впервые подробно исследованы кариотипические отношения в подсемействах Cricetinae и Arvicolinae. Локализация проб человека на хромосомах представителей всех подотрядов грызунов позволила впервые определить кариотипические отношения между подотрядами.

По данным сравнительного хромосомного пэйнтинга реконструированы предковые кариотипы подотряда Myomorpha и отдельных семейств, подсемейств и родов внутри него, пересмотрена вероятная структура предкового кариотипа, общего для отряда грызунов в целом. Полученные результаты позволяют описывать эволюционные события, приведшие к формированию хромосомных наборов современных видов.

Впервые на обширной выборке видов изучен вклад внутрихромосомных перестроек в эволюцию геномов современных видов. Подтверждена гипотеза о том, что значимость их для эволюции очень высока, при этом огромное число внутрихромосомных перестроек фиксируется в аутосомах.

Впервые на молекулярно-цитогенетическом уровне подробно описаны системы нестандартных половых хромосом у нескольких видов слепушонок рода Ellobius, у китайских полевок Lasiopodomys mandarinus, у копытного лемминга Dicrostonyx torquatus. Описание механизмов эволюции половых хромосом отдельных видов важно для понимания эволюции геномов в целом и для

понимания формирования генетических отклонений, связанных с половыми хромосомами, у человека.

Определено происхождение добавочных хромосом у лесных и полевых мышей рода Apodemus.

Методология и методы диссертационного исследования

т-ч и

В основе современных исследований хромосомной организации и эволюции геномов лежит представление о том, что кариотип является видоспецифичным признаком, представляющим собой совокупность как количественных (размеры хромосом и их число), так и качественных (морфология хромосом) характеристик хромосомного набора [Левитский, 1924]. Еще в рамках развития синтетической теории эволюции [Dobzhansky, 1937] были высказаны первые предположения о том, что изменения в хромосомных наборах могут приводить к видообразованию, позже были высказаны идеи об инициирующей роли хромосомных перестроек в этих процессах [Mayr, 1954; Wallace, 1953], которые получили в дальнейшем широкое развитие [Matthey, 1960; White, 1968; White, 1978]. Одним из важнейших в тот период стало заключение о том, что внутренняя структура хромосом и распределение гетерохроматина могут накладывать ограничения на возможность перестроек [White, 1978]. Таким образом, изучение хромосомной организации стало одной из фундаментальных основ в вопросах изучения эволюции геномов, что привело к формулированию идей о неравномерности скоростей кариотипической эволюции, развитию теории о существовании предковых кариотипов и направлениях кариотипической эволюции [Matthey, 1972].

Накопление информации об организации геномов было сопряжено с развитием и разработкой новых методов и изменением методологических подходов к анализу данных. Так, существенный скачок наблюдался в 70-х годах XX века, когда разработка методов анализа дифференциально окрашенных хромосом показала сохранение протяженных блоков в ходе эволюции в кариотипах разных видов. Разработка метода FISH вывела это направление исследований на новый уровень, позволив перейти от описания сходства

хромосомных наборов по диплоидным числам, морфологии хромосом и рисунку бэндинга к анализу гомологий на уровне ДНК. Возможность сравнивать геномы на уровне ДНК изменила ландшафт всей эволюционной биологии, дав достоверную информацию о предковых формах современных организмов [Кунин, 2017]. На самых разных уровнях разработка методологии филогенетических реконструкций на основе данных по структуре хромосомных наборов [Dobigny et al., 2004a; Robinson, Ruiz-Herrera, Avise, 2008] позволила решать сложные таксономические проблемы.

На этом основан принцип выбора экспериментальных и теоретических подходов к получению и анализу результатов настоящей работы. При проведении исследования использованы методы классической и молекулярной цитогенетики, молекулярной биологии, методы работы с культурами клеток: рутинное окрашивание хромосом, С- и G-бэндинг, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), микродиссекция, полимеразная цепная реакция (ПЦР), электрофорез, выделение ДНК, получение культур клеток, криоконсервация, фиксация культур клеток для получения суспензий метафазных хромосом. При анализе результатов, реконструкции предковых кариотипов и путей эволюции хромосомных наборов, использованы методы кладистики [Dobigny et al., 2004a; Hennig, 1966].

Положения, выносимые на защиту

1. Использование методов традиционной и молекулярной цитогенетики позволяет уточнить филогенетические взаимоотношения между отдельными таксонами внутри отряда Rodentia, неразрешимые другими методами, в т.ч. молекулярными.

2. Эволюция хромосомных наборов грызунов сопровождалась как периодами активной фиксации меж- и внутрихромосомных перестроек, так и длительными периодами сохранения предковых форм кариотипов.

3. Реорганизация кариотипов некоторых групп грызунов происходила за счет множественных внутрихромосомных перестроек в отдельных консервативных сегментах.

4. Эволюция систем половых хромосом у полевочьих включала формирование цитогенетически неразличимых изоморфных половых хромосом у одних видов и серию последовательных транслокаций аутосом на предковую для плацентарных млекопитающих Х-хромосому у других видов.

5. Процесс формирования В-хромосом был независимым у лесных и полевых мышей рода Apodemus.

Степень достоверности и апробация результатов

Все результаты, полученные в ходе выполнения работы, достоверны, что подтверждается логическим обоснованием выводов и согласованностью результатов данной работы с результатами, полученными другими научными группами.

Результаты исследования были представены на следующих конференциях:

1. Romanenko S.A., Perelman P.L., Serdyukova N.A., Graphodatsky A.S. Comparative cytogenetics and phylogeny of muroid rodents / 11th International Conference Rodens et Spatium on Rodent Biology // Myshkin, Russia. 2008. July 2428. Устный доклад.

2. Kosyakova N., Trifonov V., Romanenko S., Wagner R., Mkrtchyan H., Weise A., Liehr T. Generation of murine whole and partial chromosome painting probes based on FISH-microdissection / 20 Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft fur Humangenetik // Aachen, Germany. 2009. April 1-3.

3. Bakloushinskaya I., Romanenko S., Graphodatsky A., Lyapunova E. Robertsonian fan of Ellobius tancrei: temporal and spatial analysis / 10th International Mammalogical Congress // Mendoza, Argentina. 2009. August 9-14.

4. Лемская Н.А., Рубцова Н.В., Голенищев Ф.Н., Саблина О.В., Романенко С.А., Графодатский А.С. Сравнительная цитогенетика десяти видов полевок рода Microtus (Arvicolinae, Rodentia) / Международная конференция «Хромосома 2009» // Новосибирск. 2009. 31 августа-6 сентября.

5. Романенко С.А, Сердюкова Н.А., Перельман П.Л., Трифонов В.А., Графодатский А.С. Сравнительная цитогенетика мышевидных грызунов /

Международная конференция «Хромосома 2009» // Новосибирск. 2009. 31 августа-6 сентября. Устный доклад.

6. Баклушинская И.Ю., Романенко С.А., Графодатский А.С., Матвеевский С.Н., Коломиец О.Л, Ляпунова Е.А. Роль робертсоновских транслокаций в эволюции слепушонок рода Ellobius (Rodentia, Mammalia) / Международная конференция «Хромосома 2009» // Новосибирск. 2009. 31 августа-6 сентября.

7. Trifonov V., Kosyakova N., Romanenko S., Wagner R., Mkrtshyan H., Weise A., Liehr T. Generation of murine whole and partial chromosome painting probes based on FISH-microdissection / VIIIth Russian Congress "Modern technologies in pediatrics and child surgery" // Moscow. 2009. 19-22 октября.

8. Liehr T., Trifonov V.A., Romanenko S.A., Leibiger C., Mkrtchan H., Weise A., Stanyon R., Graphodatsky A.S., Kosyakova N. Murine FISH-banding-mcb probe development and application / 19th International Colloquium on Animal Cytogenetics and Gene Mapping // Balice/Krakow, Poland. 2010. June 6-9.

9. Romanenko S.A., Serdukova N.A., Perelman P.L., Trifonov V.A., FergusonSmith M.A., Yang F. Pattern of karyotype evolution in Myomorpha (Rodentia, Mammalia) / 19th International Colloquium on Animal Cytogenetics and Gene Mapping // Balice/Krakow, Poland. 2010. June 6-9. Устный доклад.

10. Романенко С.А., Лемская Н.А., Беклемишева В.Р., Сердюкова Н.А., Роот А.Н., Перельман П.Л., Графодатский А.С. Цитогенетические аспекты эволюции грызунов / Международное совещание «Териофауна России и сопредельных территорий» // Москва. 2011. 1-4 февраля. Устный доклад.

11. Баклушинская И.Ю., Романенко С.А., Сердюкова Н.А., Графодатский А.С., Саидов А.С., Ляпунова Е.А. Хромосомная изменчивость слепушонок: новые формы и новые границы / Международное совещание «Териофауна России и сопредельных территорий» // Москва. 2011. 1-4 февраля.

12. Матвеевский С.Н., Коломиец О.Л., Романенко С.А., Сердюкова Н.А., Графодатский А.С., Ляпунова Е.А., Баклушинская И.Ю. Анализ механизмов начальных этапов видообразования на основе изучения синаптонемных комплексов у гибридов разнохромосомных форм слепушонок E. tancrei /

Международное совещание «Териофауна России и сопредельных территорий» // Москва. 2011. 1-4 февраля.

13. Romanenko S.A., Lemskaya N.A., Beklemisheva V.R., Serdukova N.A., Perelman P.L., Trifonov V.A., Graphodatsky A.S. Chromosome evolution in Rodentia / VIth European Congress of Mammology (ECM 2011) // Paris, France. 2011. July 19-23. Устный доклад.

14. Bakloushinskaya I., Romanenko S., Serdukova N., Graphodatsky A., Matveevsky S., Kolomiets O. Lyapunova E. Expanding boundaries of chromosomal variability in mole voles Ellobius tancrei (Rodentia) / VIth European Congress of Mammology (ECM 2011) // Paris, France. 2011. July 19-23.

15. Лемская Н.А., Романенко С.А., Лопатина Н.В. Сравнительная цитогенетика скальных полевок / Международная научная конференция «Зоологические исследования за 20 лет независимости Республики Казахстан», посвященная 20-летию независимости Республики Казахстан // Алматы, Казахстан. 2011. 22-23 сентября.

16. Баклушинская И.Ю., Коломиец О.Л., Романенко С.А., Матвеевский С.Н., Графодатский А.С., Ляпунова Е.А., Джаст В. Загадочная система детерминации пола у слепушонок Ellobius, или возможна ли жизнь без Y-хромосомы / Международная конференция «Хромосома 2012» // Новосибирск. 2012. 2-7 сентября.

17. Павлова С.В., Булатова Н.Ш., Романенко С.А., Сердюкова Н.А. Сравнительное хромосомное картирование маркерных сайтов ДНК - теломерных повторов и генов rRNA - у хромосомно-дивергировавших видов и гибридов рода Microtus (Rodentia, Mammalia) / Международная конференция «Хромосома 2012» // Новосибирск. 2012. 2-7 сентября.

18. Романенко С.А, Лемская Н.А., Беклемишева В.Р., Гладких О.Л., Сердюкова Н.А., Перельман П.Л., Трифонов В.А., Фергюсон-Стим М.А., Янг Ф, Графодатский А.С. Сравнительная цитогенетика мышевидных грызунов / Международная конференция «Хромосома 2012» // Новосибирск. 2012. 2-7 сентября. Устный доклад.

19. Романенко С.А, Лемская Н.А., Гладких О.Л., Сердюкова Н.А., Голенищев Ф.Н., Баклушинская И.Ю., Лопатина Н.В., Абрамов С.А., Сморкачева А.В., Булатова Н.Ш. Сравнительная цитогенетика грызунов подсемейства Arvicolinae / Всероссийская научная конференция «Актуальные проблемы современной териологии» // Новосибирск. 2012. 18-22 сентября. Устный доклад.

20. Romanenko S.A. From field sampling to genome projects /1st symposium "Application and conservation of wildlife cell cultures" // Hamburg, Germany. 2013. August 29-30. Приглашенный доклад.

21. Romanenko S.A., Lebedev V.S., Perelman P.L., Serdukova N.A., FergusonSmith M.A., Yang F., Graphodatsky A.S. Chromosome evolution in Cricetinae (Myomorpha, Rodentia) / The 19th International chromosome conference // Bologna, Italy. 2013. September 2-6. Устный доклад.

22. Bakloushinskaya I., Tambovtseva V., Romanenko S., Matveevsky S. Is monobrachial homology the end or the start of chromosomal speciation? Ellobius' case / 7th European Congress of Mammalogy // Stockholm, Sweden. 2015. August 17-21. Устный доклад.

23. Гладких О.Л., Романенко С.А., Лемская Н.А., Сердюкова Н.А., О'Брайен П., Картавцева И.В., Сморкачева А.В., Голенищев Ф.Н., Фергюсон-Смит М.А., Янг Ф., Графодатский А.С. Внутривидовой хромосомный полиморфизм вида Lasiopodomys mandarinus / Международная конференция «Хромосома 2015» // Новосибирск. 2015. 24-28 сентября.

24. Романенко С.А., Маликов В.Г., Дэрвиш Д., Махмуди A., Голенищев Ф.Н. Calomyscus. Каждая особь - новый вид? / Международная конференция «Хромосома 2015» // Новосибирск. 2015. 24-28 сентября.

25. Romanenko S.A. Review on cytogenetic studies in mammals / 22nd International Colloquium on Animal Cytogenetics and Genomics // Toulouse, France. 2016. July 2-5. Лекция.

26. Романенко С.А., Федорова Ю.Е., Сердюкова Н.А., Графодатский А.С. Внутрихромосомные перестройки в эволюционно консервативных синтенных блоках полевочьих / Международная конференция «Хромосома 2018» // Новосибирск. 2018. 20-24 августа. Устный доклад.

Публикации

По результатам работы опубликованы 23 статьи (Приложение 1), все журналы входят в список ВАК, и тезисы 26 докладов в материалах отечественных и зарубежных конференций. Кроме того, 3 статьи (Приложение 2) по теме диссертации были опубликованы в спецвыпусках различных рецензируемых журналов по результатам конференций.

Вклад автора

Автором были выполнены следующие виды работ: получение и культивирование значительной части используемых в работе первичных линий фибробластов грызунов, получение суспензий хромосом большей части животных, вовлеченных в исследование, дифференциальное окрашивание кариотипов большинства исследованных видов, создание методом микродиссекции большинства районоспецифичных проб и части хромосомоспецифичных. Автор готовил препараты для гибридизации in situ, анализировал результаты локализации пэйнтинг-проб, идентифицировал хромосомы и принимал непосредственное участие в обработке и анализе полученных данных. Подготовка публикаций проводилась совместно с соавторами. Более детально вклад автора в выполнение отдельных блоков работ прописан в разделах "Материалы и методы" и "Результаты".

Структура и объем диссертации

Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, содержащего 422 ссылки, и 3 приложений. Диссертация изложена на 300 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 66 рисунков.

Благодарности

Работа выполнена в Отделе разнообразия и эволюции животных Института молекулярной и клеточной биологии СО РАН. Автор выражает сердечную благодарность своим учителям - Александру Сергеевичу Графодатскому и

Полине Львовне Перельман, а также всем сотрудникам Отдела разнообразия и эволюции геномов ИМКБ СО РАН за постоянную поддержку, активное обсуждение результатов работ и полезнейшие советы. Выполнение работы было бы невозможно без сотрудничества с зарубежными коллегами, предоставившими наборы сортинговых пэйнтинг-проб, - Роско Станионом, Малколмом Фергюсон-Смитом, Патрицией О'Брайен, Фентангом Янгом. Автор выражает признательность Томасу Лиру за возможность стажировки в его лаборатории и глубокое освоение метода микродиссекции. Среди российских коллег отдельно хотелось бы поблагодарить Наталью Алькуатовну Сердюкову за выполнение практически всего спектра молекулярно-биологических работ, Наталью Анатольевну Лемскую и Ольгу Леонидовну Гладких за совместную работу по эволюции полевочьих, Виолетту Робертовну Беклемишеву за сотрудничество в области сравнения кариотипов белко- и боброобразных, Владимира Александровича Трифонова за всестороннее обсуждение результатов и полезнейшие советы. Автор благодарит Марию Райичич, Николая Борисовича Рубцова, Татьяну Витальевну Карамышеву и Алексея Игоревича Макунина за сотрудничество в области изучение состава добавочных хромосом мышей рода Apodemus. Автор искренне благодарен всем тем, кто помогал в сборе материалов для получения культур клеток и суспензий метафазных хромосом - Владимиру Святославовичу Лебедеву, Ирине Юрьевне Баклушинской, Федору Николаевичу Голенищеву, Владимиру Геннадьевичу Маликову, Нине Шамильевне Булатовой, Наталье Васильевне Лопатиной, Сергею Александровичу Абрамову, Антонине Викторовне Сморкачевой, Ирине Васильевне Картавцевой и многим другим. Разные этапы работы были поддержаны в разное время грантами РФФИ, DFG и РНФ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Систематика, филогения и кариология отряда Rodentia

1.1.1. Систематические и филогенетические отношения в отряде

Rodentia

Ближайшей к Rodentia (грызуны) группой обычно считаются зайцеобразные (Lagomorpha), хотя некоторые авторы указывают на большую близость грызунов к приматам или рукокрылым [Honeycutt, Adkins, 1993; Misawa, Janke, 2003]. Вместе с зайцеобразными грызуны составляют надотряд Glires.

После расхождения с общий предком зайцеобразных около 65 миллионов (млн) лет назад грызуны подверглись впечатляющей дивергенции, приведшей к формированию огромного числа наблюдаемых сегодня видов [Donoghue, Benton, 2007; Huchon et al., 2002]. В настоящее время грызуны распространены повсеместно, за исключением Антарктиды, и представляют собой наиболее многочисленный отряд млекопитающих: более 42% всех живущих млекопитающих являются грызунами, при этом отряд включает не менее 2277 определенных видов [Carleton, Musser, 2005]. Точный подсчет числа видов затруднен из-за сложностей таксономической идентификации отдельных грызунов и продолжающегося обнаружения в природе новых, ранее неописанных представителей отряда. Систематические и филогенетические отношения между отдельными таксонами грызунов были неоднократно пересмотрены за последние десятилетия, но, тем не менее, определены не полностью.

1.1.1.1. Систематика и филогенетика грызунов

Отряд Rodentia с большой долей вероятности монофилетичен. Данные о разделении его на подотряды крайне противоречивы. Изначально по морфологическим признакам грызуны были разделены на три подотряда (Sciurognathi - белкообразные, Hystricognathi - дикообразные и Myomorpha -мышевидные грызуны) [Соколов, 1977; Simpson, 1945], затем, с развитием и более широким применением методов молекулярной генетики отряд был разделен на два подотряда (Sciurognathi - белко- и мышеобразные и Hystricognathi -

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Романенко Светлана Анатольевна, 2019 год

- к. -

MAUR9

Ш

CGRI1 TTRI1 MMU6

*

I

TTRI3 CGRI8

MAUR6

ETAL17

Ъ

\

¡¥1

* _4»_ »_ » _ • •

ETAL1 DTOR1 AOEC1 MMU6 MROS1

Ж

А В С ü ~

£ _

F О

-Cricetinae -Arvicolinae

MMU6

Рисунок 47. Многоцветный бэндинг c пробами хромосомы 6 мыши. Локализация проб на хромосомах: а - крысы (RNOR) и б - лесной мыши (APEN). Слева направо: многоцветный бэндинг, каналы SpectrumGreen, SpectrumOrange, TexasRed, Cyanine5 и диэтиламинокумарин, профиль распределения флуорохромов вдоль хромосомы и инвертированный DAPI-бэндинг изучаемой хромосомы. в - сравнительная карта хромосом видов подсемейства Murinae. г -идиограмма хромосомы 6 мыши (MMU6), районоспецифичные зонды и схема их мечения. Гомологичные участки хромосом и ориентации сегментов у Cricetinae (д) и Arvicolinae (е). ж - идиограмма хромосомы 6 мыши (MMU6) и эволюционные точки разрывов, наблюдаемые у Cricetinae и Arvicolinae.

У трех изученных видов Cricetinae синтенный блок MMU6 разделен на две области. У золотистого хомяка они расположены на MAUR6q и MAUR9q [Romanenko et al., 2006]. MMU6qA2-6qB2 соответствует сегменту в MAUR9q и MMU6qB3-6qter гомологична MAUR6q (Рисунок 47д). Два региона на TTRIlprox и TTRI3dist гомологичны MMU6, что также подтверждается ранее полученными данными сравнительного хромосомного пэйнтинга [Romanenko et al., 2007b]. TTRIlprox гомологичен MMU6prox (6qA2-6qB2). Дистальный район TTRI3 гомологичнен дистальному участку MMU6 (6qB3-6qter) с сохранением порядка сегментов (Рисунок 47д).

У китайского хомячка MMU6 гомологична двум районам на CGRIlq и CGRI8 [Romanenko et al., 2006; Yang, O'Brien, Ferguson-Smith, 2000]. Данные многоцветного бэндинга показывают, что район на CGRI1 соответствует MAUR9q и TTRI1 (MMU6qA2-6B2); блок CGR8 соответствует MAUR6q и TTRI3 (MMU6qB3-6qter) с обратным порядком сегментов (CGRI8q dist соответствует MMU6qB3 и CGRI8pdist соответствует MMU6qdist; Рисунок 47д).

У четырех видов Arvicolinae многоцветный бэндинг с использованием специфичных для MMU6 зондов выявил высокую степень перестроенности хромосом. У всех изученных видов в MMU6qC1 появился разрыв. У восточноевропейской полевки, копытного лемминга и полевки-экономки области, гомологичные MMU6, расположены в двух областях хромосом 1 (MROS1, DTOR1, AOEC1). У A. oeconomus область AOEC1qprox гомологична MMU6prox (6qA2-6qC1). Кроме того, выявлена инверсия в районе с участием сегмента MMU6qA2-6qB1 (Рисунок 47е). Область AOEC1q dist гомологична MMU6 dist (6qC1-6qter) с консервативным распределением сегментов.

В кариотипе слепушонки MMU6 гомологична двум районам на ETAL1 и дистальной части ETAL17 [Romanenko et al., 2007a]. Применение микродиссекционных проб для хромосомы 6 подтвердило эти результаты и показало, что район на ETAL17 гомологичен MMU6prox (6qA2-6qB1), ETAL1prox гомологичен MMU6qB1-6qB3 и ETAL1dist гомологичен MMU6qC1-qter (Рисунок 47е). Таким образом, данные многоцветного бэндинга выявили ранее недетектированный разрыв у этого вида Arvicolinae (6qB1). Кроме того,

результаты многоцветного бэндинга на хромосомах слепушонки позволили нам предположить, что на ETAL1 возникла ЭНЦ.

3.4.4.3. Области гомологии между MMU18 и соответствующими хромосомами

других грызунов

Известно, что ММШ8 гомологична двум сегментам в кариотипе крысы: большому региону на RNOR18 ^апуоп & а1., 1999] и крошечному дополнительному блоку на RNOR17q [Не1ои а а1., 2001]. Оба участка гомологии подтверждаются данными многоцветного бэндинга, и наши результаты показывают, что сегмент на RNOR17q1 гомологичен самой проксимальной части ММи18. Нам удалось уточнить, что позиция центромеры на метацентрической хромосоме RNOR18 соответствует MMU18qD (Рисунок 48а).

Мы подтвердили, используя набор районоспецифичных зондов, что есть две области, гомологичные ММШ8, одна на АРЕШ3 и другая на АРЕШ6 [Matsubara е/ а1., 2004]. Кроме того, мы смогли определить, что маленький сегмент на АРЕШ3 гомологичен проксимальной части ММШ8 (MMU18qA1). Более того, мы также установили, что сегменты на АРЕШ6 имеют обратный порядок: центромерная область АРЕШ6 соответствует теломерной области ММи18, что указывает на ранее нераспознанную активацию ЭНЦ (Рисунок 48б).

В кариотипе золотистого хомячка районы, гомологичные ММи18, подверглись дополнительным эволюционным разрывам. Хотя ранее данные сравнительного хромосомного пэйнтинга показали, что имеются две области гомологии ММи18 в кариотипе этого вида (MAUR3qprox и MAUR11q) (Рисунок 17, ^отапепко е1 а1., 2006]), применение многоцветного бэндинга позволило выявить новый гомологичный регион на MAUR7q (Рисунок 48в). Анализ распределения сегментов показал, что регион MAUR7qprox гомологичен ММи18ргох (MMU18qA1), MAUR11q окрашивался MMU18qA2-18qD в обратном порядке и МА^З окрашивался MMU18qD-18qE (Рисунок 48в).

Рисунок 48. Области гомологии между ММШ8 и соответствующими хромосомами крысы (а) и восточноазиатской мыши (б). Районы гомологии между ММи18 и соответствующими хромосомами Спсейпае (в-д) и АтсоНпае (е). Для объяснения рисунка см. также подпись к рисунку 47.

В дополнение к сегменту, расположенному на CGRI2q [Romanenko et al., 2006; Yang, O'Brien, Ferguson-Smith, 2000], область, гомологичная MMU18qA1, была выявлена на CGRI3pprox. Порядок сегментов на CGRI2q идентичен MMU18qA2-qdist (Рисунок 48г). MMU18 гомологична области TTRI2q, показывая консервативное распределение сегментов, т. о., подтверждая гомологии TTRI2q/CGRI2q/MAUR3+11, определенные ранее [Romanenko et al., 2007a]. Дополнительный сигнал, соответствующий MMU18 prox, выявлен на TTRI1 (регион гомологичен MAUR7 и CGRI3 в соответствии с ранее полученными данными [Romanenko et al., 2007b], Рисунок 48г).

Мы подтвердили, что MMU18 гомологична AOEC4p [Sitnikova et al., 2007], причем отметили, что порядок расположения сегментов в MMU18qdist соответствует AOEC4pdist. Дополнительно, мы обнаружили еще один, ранее невыявленный, крошечный блок MMU18qA1 на AOEC9qprox ([Sitnikova et al., 2007], Рисунки 33, 48д). Дистальная часть MMU18 гомологична DTOR12 с консервативным распределением сегментов и гомологична MROS18 с обратным расположением сегментов (Рисунок 48е). Мы подтвердили, что MMU18 гомологична ETAL16 [Romanenko et al., 2007a], а порядок сегментов сохранен. Тем не менее, мы обнаружили дополнительный регион, гомологичный MMU18qA2-18qB, в проксимальном участке ETAL2q (Рисунок 48е).

3.4.4.4. Области гомологии между MMU19 и соответствующими хромосомами

других грызунов

Подтверждено, что MMU19 гомологична области RNOR1q43-qter, как ранее было обнаружено с помощью окрашивания хромосом [Helou et al., 2001; Stanyon et al., 1999] и секвенирования [The Ensembl genome assembly for rat (Rattus norvegicus): RGSC3.4]. С помощью многоцветного хромосомного бэндинга показано, что для этого участка характерно консервативное распределение (консервативная теломерная позиция) у следующих видов: APEN1, MAUR2, CGRI3 [Romanenko et al., 2006], TTRI8q (регион гомологичен MAUR2 и CGRI3, см. [Romanenko et al., 2007b]), AOEC5q [Sitnikova et al., 2007], MROS8q, DTOR3q и ETAL10qdist [Romanenko et al., 2007a] (Рисунок 49).

Рисунок 49. Участки хромосом, гомологичные MMU19, в кариотипах различных видов Muroidea.

3.4.5. Состав В-хромосом лесных и полевых мышей рода Apodemus

Непосредственно автором работы получены культуры фибробластов 4 особей A. flavicollis (3977-3980), микродиссекцией получены пробы B-хромосом A. flavicollis: проба AflB1 (особь 3727), пробы AflB2-B8 (особь 3980), пробы AF1-AF10 (особь 24985). Контрольная аутосома 23 (AFLA23) из особи 3980 A. flavicollis (проба Afl23) получена Марией Райичич (Сербия). Пробы В-хромосом A. peninsulae получены д. б. н. В. А.Трифоновым, д. б. н. Н. Б. Рубцовым, к. б. н. Т. В. Карамышевой. Хромосомоспецифичные библиотеки амплифицированы с использованием набора WGA (Sigma). После первичного анализа в работе была оставлена часть проб (Таблица 9). Специфичность библиотек была подтверждена FISH. Подготовка проб для секвенирования проводилась А.С. Дружковой, биоинформатический анализ полученных результатов секвенирования был выполнен к. б. н. А.И. Макуниным.

Таблица 9. Список особей рода Apodemus, включенных в работу, и использованных в работе микродиссекционных проб

Индивидуум Кариотип Проба Источник клеток Место отлова

А. flavicollis 3727 48,Х^+1В ААВ1 те стикулярные ткани Милошев До, Сербия

А. Аау1со1Ш 3980 48,ХХ,+ 1В ААВ5, ААВ6, ААВ7, АА23 культура фибробластов Орашац, Сербия

А. flavicollis 3977 48,ХХ,+ 1В культура фибробластов Петница, Сербия

А. flavicollis 3978 48^ культура фибробластов Орашац, Сербия

А. flavicollis 3979 48^ культура фибробластов Орашац, Сербия

А. flavicollis 3656 48,ХХ,+2В костный мозг Милошев До, Сербия

А. flavicollis 3854 48,ХХ,+3В - костный мозг Месич, Сербия

А. flavicollis 24985 48,ХХ,+3В АЙ_В костный мозг Ростовская обл., Россия

А. flavicollis 24943 48,XY,+1B костный мозг Минская обл., Беларусь

А. реттиШе Sib04 48,XY,+3B +3Вмикро Аре тВ культура фибробластов Сохондинский заповедник, Забайкальский край, Росия

А. реттиШе 01-09 48,XY+18 Вмикро Аре_аВ культура фибробластов Ташкино, Красноярский край, Россия

Примечание. Различные морфотипы В-хромосом в кариотипе А. рвттЫав обозначены, как Аре_тВ (марохромосомы) и Ape_dB (точечные или микрохромосомы).

Все полученные ДНК-зонды полностью окрашивали В-хромосомы А. Аау1со1Ш и некоторые дополнительные участки А-хромосом (Рисунок 50). Пробы В-хромосом, полученные из одной особи, давали при гибридизации идентичную картину. Из 10 проб (AF1-AF10), полученных для особи 24985, в работе были использованы только две (обозначены АЙ_В), которые были получены из В-хромосом.

Рисунок 50. Apodemus Аау1со1Ш. а - G-окрашенная метафазная пластинка из клеточной культуры фибробластов самки 3980 с одной В-хромосомой и б -гибридизация на ней же АЙВ1 (зеленый сигнал). в - гибридизация пробы АЙ_В (Ростов-на-Дону, Россия) (красный сигнал) на хромосомах самки 3980 (Орашац, Сербия). Гибридизация различных В-специфических зондов на метафазы самцов без В-хромосом из одной популяции: г - АЙ_В (красный сигнал); д - АЙВ5 (зеленый сигнал); е - АЙВ1 (зеленый сигнал). Хромосомы В, Y и X отмечены, стрелки показывают гетерохроматиновые блоки на маленьких аутосомах.

В-хромосомы А. Аау1со1Ш полностью гетерохроматиновые, что подтверждается данными С-окрашивания и DAPI-бэндинга. При этом конститутивный гетерохроматин выявлялся также вблизи центромер всех хромосом. При гибридизация В-специфических зондов (ААВ5 и ААВ1) на

метафазных хромосомах особи 3980 с одной B-хромосомой, помимо B-хромосом, сигналы гибридизации наблюдались в прицентромерных районах двух больших хромосом и субтеломерных областях двух пар мелких хромосом из основного набора (A) (Рисунок 50а, б).

При гибридизации двух B-специфических проб, полученных для A. flavicollis 24985 (Ростовская обл., Россия), с препаратами метафазных хромосом особей 3980 (Рисунок 50в) и 3977 с одной B-хромосомой из Сербии и 24943 из Минской области, Беларусь, выявлялось одинаковое сродство проб к В-хромосомам, прицентромерным районам половых хромосом и субтеломерной области четырех небольших аутосом, несмотря на географически отдаленное происхождение особей. Аналогичная картина наблюдалась при гибридизации зондов на препаратах с более чем одной B-хромосомой из географически различных популяций.

При гибридизации проб Afl_B, AflB5 и AflBl на метафазах самцов без B-хромосом яркие сигналы наблюдались в прицентромерных районах половых хромосом и более слабые в остальной части Y-хромосомы. Во всех изученных случаях сигнал гибридизации также присутствовал в субтеломерной области четырех небольших хромосом из A-набора (Рисунок 50г-е).

При секвенировании ДНК-библиотек A. flavicollis на платформе Illumina MiSeq всего было получено 1,6-5,6 млн парных ридов на образец. После обрезки праймеров и адаптеров и очистки от контаминаций для анализа из каждой библиотеки были оставлены 3000-31000 выравниваний, которые были слиты в 1000-6000 позиций, покрывающих в случае каждого образца 83-585 тыс. п.н. генома мыши (Таблица 10).

В соответствие с данными сравнительного хромосомного пэйнтинга [Matsubara et al., 2004] AFLA23 оказалась гомологична хромосомам мыши 10 (3478 млн п.н.) и 17 (27-38 млн п.н.). Кроме того, были выявлены несколько небольших (35-649 тыс. п.н.) участков гомологии другим хромосомам мыши, возможно, отражающие микроперестройки, невыявленные при хромосомном пэйнтинге (Таблица 11). Для подтверждения этих данных необходима локализация BAC-клонов.

Таблица 10. Данные по результатам секвенирования ДНК-библиотек А.

Аауко1Ш

Образе ц Метод амплифика ции Число ридов Число выровнен ных ридов (% от общего числа) Покры тие, п.н. Покрыты в регионах, п.н. (% от общего) % покры тия регион ов

ЛАВ1 WGЛ 532352 21814 (4.10) 308629 179407 (58.1) 5.24

ЛАВ5 WGЛ 157044 3087 (1.97) 82710 34731 (42.0) 1.02

ЛАВ6 WGЛ 555946 20042 (3.61) 168140 91281 (54.3) 2.67

ЛАВ7 WGЛ 335380 14224 (4.24) 244839 157340 (64.3) 4.60

ЛА23 WGЛ 228064 8728 (3.83) 289408 218573 (75.5) 0.39

ЛА_В WGЛ 542358 31195 (5.75) 585181 380759 (65.1) 10.24

Лpe_dB DOP 938990 21055 (2.24) 234372 54684 (23.3) 0.72

Лре тВ DOP 263030 0 10623 (0.40) 209832 98366 (46.9) 0.78

Таблица 11. Районы гомологии аутосомы А. Аау1со1Ш 23 участкам генома

мыши

Позиция Протяженность Комментарий

ММи10:33909246-78477687 44568441

ММи 11: 72622033 -72674262 52229 Семейство иЬе2 также на ММи10:77 млн п.н.

ММи17:26943243-38306309 11363066

ММи5:109174914-109218815 43901 Семейство Vmn2 также на ММи10:79/130 млн п.н., ММи17:19-23 млн п.н.

ММи5: 116419664-116454221 34557 Hspb8, Srrm4 фрагменты гена

ММи8:97394174-98042784 648610 межгенный

Всего 56710804

Мы независимо идентифицировали целевые районы для каждой В-хромосомной библиотеки. Высококачественные результаты были получены для библиотек ААВ1, ААВ7 и АЙ_В, в то время как картирование ААВ5 и ААВ6 дало меньшее количество позиций, и поэтому некоторые из меньших регионов не были выявлены. В случае ААВ5 это было вызвано более низким содержанием целевых прочтений (2% против 4% в библиотеках более высокого качества) в сочетании с меньшим количеством прочтений. Предполагается, что библиотека ААВ6 содержала меньше уникальных ампликонов, о чем свидетельствует увеличение покрытия прочтениями в позициях. Единственный популяционно-специфичный район (гомологичен ММи9, 72 млн п.н.) был идентифицирован у особи из России (Рисунок 51). Всего было идентифицировано 22 общих области, покрывающие 3,5 млн п.н. в геноме мыши (Таблица 12). После удаления наиболее значительных делеций (проявляющихся как пробелы в покрытии) общий размер неповторяющихся областей сократился до 2,2 млн п.н.. Неожиданно было обнаружено сильное перекрытие между картированными последовательностями WGA библиотек из разных биологических образцов В-хромосом (ААВ1, ААВ7 и

ЛА_В) (Таблица 13), что, скорее всего, связано с неслучайной амплификацией, а не проблемами секвенирования.

Рисунок 51. Область В-хромосомы, специфичная для российской популяции А. /1ау1со1Ш. Прочтения отсутствуют в контрольной аутосомной пробе ЛА23 и пробах В-хромосом у особей из сербской популяции (ЛЙВ1, ЛЙВ5, ЛЙВ6, ЛАВ7), но картируются у особей из российской популяции (ЛЙ_В). Референсный геном - мышь (тт10).

Таблица 12. Районы гомологии В-хромосом А. /1ау1со1Ш участкам генома

мыши

Координаты района Покры тие, п.н. Делеция, п.н. Гены Рор АреВ

ММШ:43278320-43534221 255901 97811 Nck2

ММШ:71111765-71264578 152813 50247 СуЬМ1, Dync1i2

ММи2:153694504-153766975 72471 Марге1

ММШ:135135507-135251552 116045 89482 Сепре

ММи4:86486570-87262216 775646 472423 Saxo1, Saxo1os, Rraga, Нашб, Scama8, Асег, Slc24a

ММи6:128081800-128103877 22077 Tspan9

ММШ:129218084-129234882 16798 2610044O15Rik8

MMU9:72375234-72672575 297341 Mns1, Tex9, 4930509E16Rik, Rfx7, Nedd4 +

MMU9:114604362-114660534 56172 Cnot10

MMU10:18688905-18771842 82937 46227 Arfgef3

MMU10:20263319-20310752 47433 Map7

MMU10:110209894-110590468 380574

MMU11: 112954654112967089 12435

MMU12:105832875-106077210 244335 88409 Papola, Vrk1 +

MMU13:65226655-65267978 41323 +

MMU13:74395420-74618414 222994 Zfp825, Mir692 +

MMU13:119823094-120319834 496740 165865 Tcstv1, LOC106029237, Gm20767, AF067061, BC147527, Tcstv3

MMU14:12585304-12605070 19766 Cadps

MMU15:16190645-16276524 85879

MMU17:94818796-94875639 56843 38507 Gm1976, Gm20939

MMU19:3453180-3541805 88625 Ppp6r3

MMU 19:3792014637987977 67831 29395 Myof

MMUX:18236354-18342298 105944 Kdm6a

Всего 3718923 1078366 38 3

Примечание. Pop - специфичный для популяции район (присутствует только в образце

из России), ApeB - регионы, присутствующие в B-хромосомах A. peninsulae.

Таблица 13. Перекрытие между прочтениями разных образцов В-хромосом

A. flavicollis

AflB1 AflB7 Afl_B

AflB1 179407 101149 128161

AflB7 0.601 157340 113013

Afl_B 0.462 0.424 375510

Примечание. На диагонали (серый) - п.н., покрытые прочтениями для образца, выше диагонали - п.н., покрытые двумя образцами, ниже диагонали - пропорция, покрытие двумя образцами. Перекрытие между всеми тремя образцами составляет 81108 п.н. (весовая пропорция 0,342).

Функциональная кластеризация была выполнена для 29 из 38 генов, расположенных в областях, присутствующих в B-хромосомах. Было установлено, что В-хромосомы A. flavicollis несут гены, связанные с формированием микротрубочек и кодированием белков клеточного цикла: Cenpe (белок центромеры E), Dync1i2 (промежуточная цепь 2 цитоплазматического динеина 1), Mnsl (специфичный для мейоза структурный ядерный белок 1) и Maprel (белок, ассоциированный с микротрубочками, семейство RP/EB, член 1). Другие менее значимые категории включали в себя нуклеотидсвязывающие, мембранные и металлсвязывающие белки.

По сравнению с аутосомами в В-хромосомах накапливается больше замен (1 производная позиция на 28-31 п.н. против 1 на 44 п.н.) относительно генома мыши, что согласуется с предположением о деградации добавочных хромосом. По той же причине в генах наблюдалась повышенная доля несинонимичных мутаций. В генах Cenpe, Rraga и Kdm6 наблюдались множественные миссенс-замены, свидетельствующие о нарушении функции белковых продуктов. Самые большие скопления повторов в AFLA23 были в основном представлены семействами B2 (SINE) и L1 (LINE). В В-хромосомах также наблюдались сателлитные повторы (включая MurSatRep1) вместе с рассеянными ERRL (MaLR) и ERVK (LTR). В некоторых случаях транспозоны были расположены тандемно. Таким образом, хотя у A. flavicollis был обнаружен только один цитологический

тип B-хромосомы, на молекулярном уровне наблюдались некоторые небольшие структурные различия между B-хромосомами из разных популяций.

В кариотипе A. peninsulae были выявлены и изучены два морфотипа В-хромосом - макро- (сходные по размерам с аутосомами) и точечные или микрохромосомы. Специфичность библиотек В-хромосомам была подтверждена результатами FISH [Karamysheva et al., 2002; Rubtsov et al., 2004]. Результаты секвенирования представлены в таблице 10. Области гомологии в геноме мыши были предсказаны для обоих типов В-хромосом. Общий размер областей после удаления предполагаемых делеций составил 9,4 млн п.н. для Ape_mB и 5,5 млн п.н. для Ape_dB, что значительно выше, чем для проб В-хромосом A. flavicollis (2,2 млн п.н.). Области Ape_dB представляют подмножество областей Ape_mB (Таблица 14), но размер отдельных геномных районов часто больше.

Некоторые районы включали семейства генов, имеющие высокий уровень гомологии последовательностям в нескольких областях генома мыши, и, таким образом, были обнаружены более одного раза:

1) три области содержали семейство NLR, связанное с воспалением (Nlrp9a, Nlrp9b, Nlrp9c), из хромосомы MMU7. Учитывая 80-83% гомологию между этими генами в геноме мыши в положениях, охватываемых прочтениями, мы предположили, что только один из этих генов может быть представлен на B-хромосомах. Лучшим кандидатом является Nlrp9c - единственный район, включающий не только ген, но и прилежащую межгенную последовательность.

2) три региона содержали гены семейства нейрексинов. Их гомологи, демонстрирующие 86% идентичность последовательности, обнаружены на MMU1 (Cntnap5a, Cntnap5b) и MMU17 (Cntnap5c). Более вероятно, что гомолог гена из MMU17 присутствует на B-хромосомах, так как он показывает более высокое сходство последовательности, а его З'-конец покрыт прочтением (покрытие отсутствует на З'-конце в других двух генах).

3) два тандемных массива Vmn2r (Vmn2r8-Vmn2r17 в MMU5: 109 млн п.н., Vmn2r84-Vmn2r87 в MMU10: 130-мегапиксельные рецепторы, связанные с белком G, активные в вомероназальных сенсорных нейронах), были покрыты равномерно (гомология 90-99%). Вероятно, будет присутствовать некоторая часть

массива из ММШ0, так как там в область гомологии входит соседний уникальный ген Tespa1.

Таблица 14. Районы В-хромосом А. реттЫае

Аре_тВ Ape_dB

Координаты Покрыт ие, п.н. Делеция, п.н. Покры тие, п.н. Делеци я, п.н. Гены АЙВ F

ММи1:692031 47-69291853 88706

ММи1:989777 86-99996062 1018276 602083 СпШар5Ь +

ММи1:115323 851-116921762 877124 1596110 711892 СпШар5а +

ММи5:777887 20-81363556 3378151 1913052 3574836 Adgrl3

ММи5:108807 389-109566339 758950 Vmn2r8, Vmn2r10-16 +

ММи6:636777 75-64370313 445955 622831 Grid2

ММи7:200073 48-20049653 42305 Мгр9Ь +

ММи7:263647 50-26405959 41209 Ыгр9с

ММи7:265327 46-26590055 57309 Ыгр9а +

ММи8:176168 60-18585134 968274

ММи8:710074 82-71752571 736506 678611 745089 704826 Наш8, Муо9Ь, Fcho1

ММи8:961008 49-97192382 1091533

ММи9:618910 43-61948808 31610 57765 крз

ММи10:13029 8025130515743 217718 105577 Tespa1, Vmn2r84- 87

ММи12:17663 534-17902100 238566

ММи12:10596 6399106395893 429494 Vrk1 +

ММи13:57094 114-57300295 206181

ММи13:65227 129-65267950 40821 +

ММи13:74400 291-74595262 194971 +

ММи15:68391 833-68958113 566280 Khdrbs3

ММи17:57519 769-58410742 122532 890973 696486 СпШар5е Vmn2r12 0(только аВ)

ММи18:25414 707-26070641 655934 Се1/4, AW55491 8

ММи18:30147 020-30451161 304141 Pik3c3

ММи18:40628 555-40689636 53570 32470

ММи18:84461 062-84536174 75112 18867 7/р407

Всего 12641228 3193746 7644518 2113204 32 3 5

Примечание. Координаты в первом столбце даны для максимального диапазона между

макро-В-хромосомами (Аре_тВ) и точечными В-хромосомами (Ape_dB). АЙВ -регионы, присутствующий на В-хромосомах А. flavicoПis. F - предполагаемые ложноположительные области, возникшие в результате гомологии между членами семейства генов.

Области с представителями семейств СПпар5 и Vmn2r присутствовали как на точечных, так и на макро-В-хромосомах, а Мгр9 - только на макро-В-хромосомах. Исключение предполагаемых ложноположительных результатов

уменьшило размеры B-хромосомной области до 7 296 тыс.п.н. для Ape_mB и до 3935 тыс.п.н. для Ape_dB.

Для функционального анализа мы использовали комбинированный список генов как для точечных, так и для макро-В-хромосом областей. 30 из 32 этих генов могли быть использованы поисковой системой DAVID GO. Оценки обогащения были высокими для нуклеотидсвязывающих (2,84), ламинин- и EGF-подобных доменов (1,93), цитоскелета (0,7) и ион-связывающих (0,09) белков.

Плотность вариантов последовательности была выше в точечных В-хромосомах (1 вариант на 27 п.н.) по сравнению с макро-В-хромосомах (1 вариант на 35 п.н.). Мы не наблюдали более высокой плотности вариантов в областях, общих для типов В-хромосом, что можно было бы ожидать, если бы все общие области были старше, чем макро-В-хромосомоспецифичные. В Ape_mB две области не имели отличий от генома мыши на протяжении 0,7 тыс. п.н. (MMU12: 17 млн п. н.) и 1,9 тыс. п.н. (MMU13: 74 млн п. н.) полученной последовательности, хотя уровень консервативности последовательности среди плацентарных млекопитающих [Miller et al., 2007] не был повышен в этих регионах. Низкое соотношение несинонимичных и синонимичных замен (dN/dS) наблюдалось в точечных В-хромосомах (0,95) по сравнению с макро-В-хромосомами (2,50) и В-хромосомами A. flavicollis (1,68-1,71). Варианты сдвига рамки считывания в гене Kif23 наблюдались у обоих типов В-хромосом.

Оба морфотипа В-хромосом A. peninsulae были обогащены LINE элементами L1. Было обнаружено, что точечные В-хромосомы обогащены смесью основных центромерных повторов (клоны APE_HindIII_7, APE_BstXI_S11, APE_BstXI_S23) [Matsubara et al., 2008], а макро-В-хромосомы обеднены ею. Минорный центромерный повтор APE_EcoRI_1 был обнаружен в очень низком количестве копий только в точечных В-хромосомах. Сателлитные повторы, в том числе MurSatRep1, LTR ERVK и ERVL (MaLR), а также семейства генов (NLR, Vmn2r), были обнаружены среди более мелких кластеров.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Корректировка сравнительных хромосомных карт бобра и

бурундука

Многонаправленный хромосомный пэйнтинг, выполненный для T. sibiricus, Homo sapiens и C. fiber, позволил с высоким уровне достоверности выявить районы гомологии между хромосомами всех трех видов.

Наши данные подтвердили наличие десяти ранее выявленных сегментных ассоциаций хромосом человека в кариотипе бурундука [Li et al., 2004], тем не менее, нами были также обнаружены две дополнительные ранее не описанные сегментные ассоциации, гомологичные HSA7/12/22 и HSA12/8/4/8/12/22 (Рисунок 11б). Отдельного внимания заслуживает обнаружение третьего сегмента, гомологичного HSA12c в прителомерном районе хромосомы TSIB2. Возможно этот сегмент HSA12 был пропущен в других исследованиях беличьих из-за его малого размера. Однако, поскольку высокое качество экспериментов по локализации проб человека на хромосомах беличьих не вызывает сомнений, можно предположить, что появление трех сегментов HSA12 характерно именно для бурундука. Например, перицентрическая инверсия могла привести к разделению предковой синтении HSA12/22 в кариотипе бурундука и сформировать дополнительный, третий сегмент HSA12. Известно, что кариотипы Sciuridae очень консервативны, и поскольку считается, что два сегмента хромосомы HSA12 входили в состав кариотипа предка млекопитающих, именно второй вариант развития событии (с инверсией) наиболее вероятен.

Филогенетическая позиция семейства Castoridae долго оставалась спорной. Анализ распределения SINE и секвенирование митохондриальных геномов отдельных видов грызунов зачастую показывали родство представителей этого таксона мышеподобным грызунам [Churakov et al., 2010; Horn et al., 2011]. Первые же результаты сравнительного хромосомного пэйнтинга показали, что геном речного бобра сильно перестроен по сравнению с беличьими [Graphodatsky et al., 2008]. Использование многонаправленного хромосомного пэйнтинга в данной работе подтвердило сильную перестроенность кариотипа речного бобра и

позволило обнаружить множество не описанных гомологичных районов и сегментных ассоциаций в его кариотипе: HSA3/16, 5/19, 7/12, 8/4/8/19, 10/16 и 12b/22b (Рисунок 11а). Таким образом, в кариотипе современного речного бобра сохранились только четыре синтенные ассоциации (HSA12/22 (два фрагмента), HSA8/4/8 и HSA3/21 (с инверсией)), характерные для всех бореоэутерий [Froenicke et al., 2006]. Другие предковые ассоциации, такие как HSA7/16, 14/15 и 16/19, на цитогенетическом уровне в геноме C. fiber не выявлялись. Возможно, в будущем их следы удастся обнаружить путем картирования генов или полногеномного сравнительного анализа.

4.2. Первые сравнительные хромосомные карты между представителями Hystricomorpha и человеком

В прошлом веке морская свинка, Cavia porcellus, была одной из самых важных биомедицинских моделей животных. Однако постепенно она утратила популярность из-за отсутствия современных геномных данных, позволяющих использовать этот вид в качестве модельного. Геном морской свинки был секвенирован в 2008 году, но до сих пор не собран до уровня хромосом. Отсутствовали также данные, позволяющие связать кариотип морской свинки с кариотипом человека.

В ходе проведенной работы были созданы наборы сортинговых хромосомоспецифичных проб морской свинки и получены карты гомологии хромосом этого вида и хромосом человека. Также была выполнена локализация проб морской свинки и человека на хромосомах еще одного представителя того же рода из подотряда Hystricomorpha - перуанской свинки. Здесь важно подчеркнуть, что последние данные молекулярных исследований показывают, что вид C. porcellus берет начало от популяций C. tschudii [Spotorno et al., 2004; Dunnum, Salazar-Bravo, 2010], а наши данные показывают идентичность кариотипов этих видов. Значительное филогенетическое расстояние, разделяющее дикобразообразных грызунов и приматов (время расхождения между предком грызунов и общим предком приматов (надотряд Euorchontoglires) и парнокопытных составляет около 80-100 млн лет [Huchon et al., 2002; Li et al., 1990]), а также огромное число хромосомных перестроек, различающих

кариотипы человека и свинок, существенно осложнило проведение FISH. Из-за их сходного размера множество хромосом C. porcellus были обнаружены в разных пиках проточного кариотипа. Цитогенетически хромосомы также было трудно идентифицировать из-за схожего размера и морфологии, похожего рисунка G-бэндинга и, в некоторых случаях, низкой эффективности гибридизации. Только сочетание опыта и ресурсов различных лабораторий позволило нам преодолеть эти трудности и добиться полного и точного сравнения кариотипов морской свинки и человека.

4.2.1. Предковые ассоциации, обнаруженные в кариотипе морской

свинки

При реципрокном сравнительном хромосомном пэйнтинге в геноме морской свинки были выявлены только пять ассоциаций хромосом человека, общих для морской свинки и предполагаемых предков плацентарных/грызунов [Graphodatsky et al., 2008]: HSA3/21, 8/4/8, 12/22 (дважды) и 14/15. Аналогичные ассоциации были выявлены и в кариотипе перуанской свинки. При этом данные реципрокного пэйнтинга однозначно указывают на то, что ассоциация HSA4/8/4 в кариотипах свинок образована другими сегментами хромосом человека 4 и 8, по сравнению с кариотипами других грызунов. Весьма вероятно, что другие синтенные ассоциации идентичны тем, что найдены у других грызунов, однако, только будущие исследования смогут проверить, идентичны ли точки разрывов и происхождение этих синтений. Напротив, ассоциации HSA7/16 и 16/19, рассматриваемые как предковые для плацентарных, не были найдены в кариотипе морской свинки. Кроме того, три синтенные ассоциации (HSA1/10, 3/19 и 9/11), считавшиеся предковыми для грызунов, также не были обнаружены у C. porcellus. Наиболее вероятным объяснением полученных результатов является то, что 1) ассоциации были потеряны в эволюционной линии, ведущей к морской свинке, из-за высокой скорости преобразования ее хромосом, или 2) размер сохраненных предковых ассоциаций у морской свинки был ниже разрешения методов, используемых в нашем исследовании. Сборка генома свинки до уровня хромосом позволила бы провести полногеномный сравнительный анализ предковых ассоциаций.

4.2.2. Уровень кариотипической дивергенции свинок

Число аутосомных консервативных сегментов, выявленных в кариотипах разных видов, может служить мерой расхождения их кариотипов. Грызуны отделились от древа млекопитающих около 100 млн лет назад по оценкам молекулярных часов, и еще через 40 млн лет Hystricomorpha разошлись с другими подотрядами грызунов [Adkins, Walton, Honeycutt, 2003]. В отряде Rodentia количество консервативных сегментов, выявленных при локализации проб человека, варьирует от 36-37 у бельчьих до 95 в геномах мыши и крысы (Таблица 1). Этот диапазон различий обусловлен, по меньшей мере, двумя способами реорганизации генома у грызунов: медленной консервативной эволюцией в Sciuromorpha и высокой эволюционной скоростью в Myomorpha, при которой происходит разрыв предковых синтений. Данные реципрокного хромосомного пэйнтинга между морской свинкой и человеком позволили нам оценить уровень хромосомной дивергенции между кариотипами двух этих видов. При локализации хромосомоспецифичных проб человека мы обнаружили в общей сложности 78 гомологичных районов между морской свинкой и человеком. Из этого можно заключить, что свинки имеют высокую скорость эволюции хромосом. Эта скорость сравнима, но несколько ниже, чем в подотряде Myomorpha (78 против 95 сегментов, обнаруженных у мыши).

4.3. Кариотипические отношения между отдельными таксонами хомячьих (Cricetinae)

4.3.1. Род Allocricetulus

Начиная с первого исследования [Matthey, 1960], два вида рода Allocricetulus (A. curtatus и A. eversmanni) часто оказывались в центре внимания сравнительной цитогенетики. Данные рутинного окрашивания указывали на то, что кариотипы A. curtatus (2n=20) и представителей группы A. eversmanni (2n=26) должны отличаться из-за перестроек хромосом. Поскольку не было отмечено связи между 2n и фундаментальным числом, FN, то было предположено, что хромосомные различия более сложны, чем простые события слияния/разделения. Сравнение G-окрашенных хромосом A. curtatus и A. eversmanni ssp. [Romanenko et

а1., 2007Ь] указало на значительные различия между кариотипами этих видов. Несмотря на обнаружение крупных консервативных синтенных блоков, было отмечено, что кариотипы А. curtatus и А. еуе^тапт ssp. отличаются рядом робертсоновских слияний, возможными инверсиями или/и центромерными сдвигами внутри некоторых консервативных блоков. Сравнение же кариотипов различных подвидов А11вспсеШ1ш выявило новые детали организации их хромосомных наборов и эволюции хромосом внутри рода.

Особь А. curtatus из Тувы, изученная здесь, имела FN=34, тогда как описанная ранее А. си^а^ особь неизвестного происхождения имела FN=32 ^отапепко et а1., 2007Ь; Sablina, Radjabli, Graphodatsky, 2006]. Различия в числе плеч были вызваны разной морфологией пары хромосом 8, которая была субметацентрической по данным настоящего исследования и акроцентрической в предыдущих описаниях. Учитывая небольшой размер выборки и отсутствие информации о происхождении ^отапепко et а1., 2007Ь; Sablina, Radjabli, Graphodatsky, 2006], остается неясным, является ли эта разница проявлением внутрипопуляционной изменчивости в пределах А. curtatus. Были также выявлены различия по количеству и локализации блоков гетерохроматина на паре хромосом 7 по сравнению с предыдущей публикацией ^аЫта, Radjabli, Graphodatsky, 2006].

Ранее сообщаемые данные о кариотипе А. еуе^татт не содержали информации о подвиде. Тем не менее, внутривидовые различия в морфологии хромосом и С-бэндинга могли быть использованы для идентификации подвидов. На основе морфологии хромосом пары 6 [Kartavtseva, Vorontsov, 1992] было предложено рассматривать особей с 2 акроцентриками как А. е. pseudocurtatus (здесь AEVP6), тогда как животных с 2 субметацентриками, либо как А. е. еуе^тапт (здесь AEVE4), либо как кариотипически идентичный ему А. е. beljaevi. Мы полагаем, что кариотип А. еуе^тапт, опубликованный ранее ^аЫта, Radjabli, Graphodatsky, 2006], принадлежит подвиду А. е. pseudocurtatus, поскольку морфология его хромосом идентична морфологии хромосом исследованной здесь особи этого подвида с фундаментальным числом плеч аутосом (FNa) равным 34. Единственные различия между двумя кариотипами А. е.

pseudocurtatus - рисунок С-окрашивания хромосомы 4, которая имела прицентромерный C-позитивный блок у ранее описанной особи [Sablina, Radjabli, Graphodatsky, 2006], но более сложное распределение гетерохроматина по нашим данным.

Анализ кариотипа A. eversmanni ssp., опубликованного ранее (AEV в работе [Romanenko et al., 2007b]), потребовал установления соответствия между нумерациями хромосом, использованными в разных исследованиях. Мы выяснили, что AEV4 (субметацентрик) = AEVP6 (акроцентрик), AEV6 = AEVP7, AEV7 = AEVP9, AEV9 = AEVP4. Таким образом, особь, исследованную ранее [Romanenko et al., 2007b], следует отнести к подвиду A. e. eversmanni.

Кариотип А. e. eversmanni идентичен кариотипу A. e. beljaevi по числу хромосом и их морфологии. Этот вывод согласуется с предыдущими публикациями по изучению A. e. beljaevi на основе традиционного окрашивания хромосом [Kartavtseva, Vorontsov, 1992] и настоящего сравнения А. е. eversmanni и гибрида A. e. beljaevi х A. e. pseudocurtatus.

Хромосомные различия между A. e. pseudocurtatus и двумя другими подвидами (AEVE, AEVB) гораздо сложнее, чем предполагалось по данным классической цитогенетики [Воронцов, Крюкова, 1969; Kartavtseva, Vorontsov, 1992], т. е. не ограничиваются различной морфологией пары хромосом 6 (в AEVP). Из данных сравнительного хромосомного пэйнтинга следует, что кариотипы двух подвидов - A. e. eversmanni и А. е. pseudocurtatus - отличаются, по меньшей мере, тремя робертсоновскими событиями типа слияния/разделения. Мы установили, что AEVE3q и AEVP3q гомологичны различным хромосомам M auratus (Рисунок 14а). Более того, мы обнаружили, что AEVP7 гомологична AEVE3q и AEVE4p, и показали, что AEVE4q гомологична AEVP6.

Результаты FISH показали, что отчасти районы гомологии хромосом A. e. pseudocurtatus и A. curtatus по G-бэндингу были определены неверно [Romanenko et al., 2007b]. Теперь мы установили, что AEVP7 гомологична ACUR2p, а ACUR1 гомологична всей AEVP1 и не содержит AEVP4. Несмотря на большое сходство рисунка бэндинга, неверно были определены районы, гомологичные ACUR6, 7, 8 и 9. Устранение неточностей позволило выдвинуть гипотезы о различиях в

рисунке G-бэндинга между видами. По-видимому, за счет инверсии в q-плече AEVEX, G-позитивные бэнды расположены ближе к центромере у AEVPX и АСиЯХ.

MAUR18 соответствовали два района гомологии на ACUR9 и AEVP8, где они были разделены небольшим промежутком (нет сигнала в области центромеры). AEVE5 и AEVB5 имеют только один регион, гомологичный MAUR18. Различия в локализации MAUR18 на AEVE5, AEVB5, AEVP8 и ACUR9 могут быть объяснены либо перицентрической инверсией, либо сдвигом центромеры, либо изменением размера блока гетерохроматина. Использование районоспецифичных микродиссекционных зондов или ВАС и исследование мейоза у гибридов может в будущем помочь выбрать верную гипотезу. Ассоциация MAUR8/18 выявлена в кариотипах всех исследованных АПо^^еШ^.

4.3.1.1. Эволюция кариотипа Allocricetulus

Сравнение результатов настоящей работы с ранее полученными данными для других хомячьих позволило определить элементы, которые могли присутствовать в кариотипе предка АНо^^еШ^ (AAlK, Рисунок 52а).

Элементы, гомологичные MAUR2/7/11а/3/13, 5а/9а/14а/16/15, 8/18, 20, 21 и X, присутствовалив кариотипах всех четырех таксонов АПо^^еШ^ и могут рассматриваться как входящие в AAlK в виде отдельных хромосом. Морфология предковых хромосом остается неизвестной. Однако из сравнений некоторых консервативных аутосомных сегментов АПо^^еШ^ и хомячков внешней группы мы можем предположить, что большинство хромосом AAlK были акроцентрическими [Яотапеп^ е1 а1., 2007Ь]. Формирование кариотипов современных Allocricetulus из AAlK происходило за счет робертсоновских слияний.

Рисунок 52. а - кариотип предка Allocricetulus (AAlK) и б - возможные пути формирования кариотипов Allocricetulus из AAlK. Черные полосы обозначают положение центромеры. Цифры справа показывают гомологию хромосомным сегментам M. auratus. Элементы AAlK, расположенные в оранжевых рамках, участвовали в хромосомных перестройках. Пунктирные оранжевые рамки обозначают предковые элементы, состояние которых в AAK не может быть однозначно определено. См. комментарии в тексте. fus - слияние; fis - деление; tr - реципрокная транслокация; ACUR - A. curtatus; AEVB - A. e. beljaevi; AEVE - A. e. eversmanni; AEVP - A. e. pseudocurtatus.

Рассмотрение предкового состояния MAUR1 и MAUR10 заслуживает отдельного внимания. Ассоциация MAUR1/10 была выявлена у A. е. pseudocurtatus и в кариотипах некоторых близких видов из внешней группы -Cricetulus barabensis, C. longicaudatus, C. migratorius и Cricetus cricetus. Однако она отсутствовала у C. griseus, С. preudogriseus и C. sokolovi, а также в кариотипах более отдаленных родов - Calomyscus, Peromyscus и Phodopus [Romanenko et al., 2007b]. Поэтому данные сравнительного хромосомного пэйнтинга не дают четких доказательств в поддержку или опровержение гипотезы о том, что MAUR1/10 был предковой для рода Allocricetulus (Рисунок 52а).

Другая загадка - это происхождение AEVE4 (MAUR14b/9b/19/17). Вероятно, что ее происхождение из AAlK (Рисунок 52б) требует двух перестроек: слияния MAUR5b/11b/14b и MAUR9b/19/17 с последующей реципрокной транслокацией MAUR5b/11b/14b/9b/19/17 и MAUR10.

Синтения МАиЯ2/7/11а/3/13 является характерной для рода Allocricetulus. Ранее опубликованные данные сравнительного G-бэндинга показали, что эта ассоциация присутствует в кариотипе Cricetulus sokolovi [Romanenko et al., 2007b]. Но наши данные FISH для C. sokolovi выявили, что ассоциация МАиЯ2/7/11а/3/13 разная у этих видов. У C. sokolovi она содержит лишь небольшую часть MAUR7, а не всю хромосому, как у Allocricetulus. Итак, мы должны рассматривать независимое происхождение синтении МАиЯ2/7/11а/3/13 в кариотипах C. sokolovi и Allocricetulus.

Отдельным вопросом является таксономический статус видов и подвидов в Allocricetulus. Первоначально разделение на A. e. beljaevi и A. e. eversmanni было сделано только на основании вариаций цвета шерсти [Митина, 1959]. Сравнительный хромосомный пэйнтинг не выявил различий между этими подвидами. Возможно, что данные сравнения последовательностей ДНК смогут обеспечить поддержку для разделения подвидов. Цитогенетические данные дают сильную поддержку делению рода Allocricetulus на 2 таксона - A. curtatus и группу A. eversmanni. Статус подвида цитогенетически подтверждается для A. e. pseudocurtatus по сравнению с A. e. beljaevi/A. e. eversmanni.

В целом сравнительный хромосомный пэйнтинг 4 таксонов Allocricetulus показывает высокую степень консервативности геномной организации в этом роде хомячков. Очевидно, что робертсоновские слияния сыграли основную роль в эволюции кариотипа группы Allocricetulus. Также наблюдались другие механизмы хромосомной эволюции: вариации по гетерохроматину и возможное перемещение центромер привели к структурным хромосомным различиям между видами. Результаты сравнительных цитогенетических исследований (как бэндинг, так и FISH) предлагают, однако, двусмысленный сценарий эволюции группы. Полномасштабные молекулярные исследования группы необходимы для разрешения таксономических отношений между видами Allocricetulus.

4.3.2. Кариотипическая эволюция в подсемействе Cricetinae

До настоящего исследования C. sokolovi и A. curtatus были включены в сравнительные исследования только по данным G-бэндинга [Romanenko et al., 2007b]. Тогда же было показано, что C. sokolovi является сестринским видом для рода Allocricetulus, тогда как другие полосатые хомячки ближе к Cricetus cricetus и C. longicaudatus. Объединение Allocricetulus+C. sokolovi поддерживалось двумя предполагаемыми синапоморфиями: наличием уникальной ассоциации MAUR2/7/11/3/13 и разрывом MAUR6. Тем не менее, последующий анализ данных хромосомного пэйнтинга показал, что ассоциация MAUR2/7/11/3/13 не идентична в этих двух линиях. В отличие от Allocricetulus, кариотип C. sokolovi содержит 2 фрагмента MAUR7, один из которых является частью синтении MAUR2/7/11/3/13, тогда как другой формирует ассоциацию с MAUR1. По-видимому, ассоциации MAUR2/7/11/3/13 у Allocricetulus и MAUR2/7b/11/3/13 у C. sokolovi возникли независимо. Кроме того, теперь ясно показано, что кариотип C. sokolovi включает в себя один элемент, гомологичный MAUR6, и не содержит ассоциаций MAUR1/18/8, 10/20, в отличие от того, что сообщалось ранее [Romanenko et al., 2007b]. Разрыв MAUR7 и наличие ассоциаций MAUR1/7a и 8/18/10 - уникальные особенности C. sokolovi среди Cricetinae. Полученные данные заставили внести существенные уточнения в сравнительную карту хромосом видов из родов Cricetus, Cricetulus и Allocricetulus (Рисунок 53, [Romanenko et al., 2007b]).

Рисунок 53. Сравнительная карта хромосом представителей родов Cricetus, Cricetulus и Allocricetulus.

Общий анализ данных сравнительного хромосомного пэйнтинга, полученных для разных видов Cricetinae, позволил приблизиться к пониманию структуры предкового кариотипа этого подсемейства и хода кариотипической эволюции в таксоне. Ранее проведенные реконструкции [Romanenko et al., 2007b] потребовали существенного пересмотра в связи с получением новых данных о структурах кариотипов современных видов и получению новых схем, отражающих филогенетические отношения между видами.

В работе мы опирались на филогению Cricetinae, предложенную ресурсом TimeTree [TimeTree: the timescale of life] (Рисунок 54). Несмотря на то, что в соответствии с ранее полученными данными [Neumann et al., 2006] род Phodopus представляет собой наиболее раннее ответвление в таксоне, это не находит отражения в современных филогенетических построениях. Порядок ответвления родов внутри Cricetinae по молекулярным данным остается неразрешенным.

Отношения между видами внутри рода Phodopus остались неизменными, что прекрасно согласуется с кариотипическими данными. Вероятнее всего, предок рода имел 2n=40 и содержал следующие элементы, гомологичные MAUR:

1/16/3/13, 2/15, 3, 4/10/3/11, 4/12, 5р, 5^ 6/11, 6/15, 7, 8, 8/18, 8/19/17, 9/14, 10, 11, 16/20, 19, 21, X. В ветви, ведущей к Р. campbeШ и Р. sungorus, произошло 6 слияний, 3+15/2, 5q+9/14, 7+8/19/17, 8/18+5р+4/10/3/11, 10+16/20, что привело к формированию кариотипа с 2п=28, структура которого идентична кариотипам обоих видов. Формирование же кариотипа Р. roborovskii происходило за счет других преобразований: у этого вида произошел разрыв элемента MAUR5p и слияния 5q+16/20, 7+10, 8/18+5р+8/19/17 (Рисунок 54).

Род Mesocricetus несомненно монофилетичен. Кариотип предка всего рода имел, по-видимому, 2п=46. При этом в ветви, идущей к М. аига^ и М. raddei, произошли слияния предковых элементов MAUR5 и 9, а также разрыв предковой ассоциации MAUR3/11. Согласно филогенетическим построениям виды М. Ьга^П и М. newtoni объединяются в единую кладу. Такое объединение не находит подтверждения на цитогенетическом уровне: для М. Ьга^П характерны разрыв MAUR3/11 и слияния MAUR1+9, 4+9 и 11+13, тогда как кариотип М. newtoni характеризуется слияниями MAUR9, 1+4, 5+19, 13+18 (Рисунок 54). Таким образом, разрыв предковой ассоциации MAUR3/11 стоит рассматривать как независимое событие, произошедшее у разных видов внутри рода Mesocricetus.

В соответствие с данными молекулярных исследований род АПоспсеШ1ш филогенетически наиболее близок роду Cricetus, а С. sokolovi формирует единую кладу с СпсеШ1ш migratorius (Рисунок 54). Цитогенетических обоснований для такого объединения нет. В целом данные сравнительных цитогенетических исследований не дают подтверждения выделению многих ветвей внутри группы, объединяющей роды АПоспсеШ1ш, СпсеШ1ш и СпсеШ.

Рисунок 54. Кариотипическая эволюция в подсемействе Cricetinae. Структура древа соответствует ранее опубликованной [TimeTree: the timescale of life]. AAK - предковый кариотип подсемейства Arvicolinae, AAlK - предковый кариотип рода Allocricetulus, AaccK - предковый кариотип группы, объединяющей роды Allocricetulus, Cricetulus и Cricetus, ACnK - предковый кариотип подсемейства Cricetinae. Значения диплоидных чисел хромосом для отдельных узлов древа приведены в квадратах. Перестройки представлены в элементах, гомологичных хромосомам M. auratus. «-» - разрыв, «+» - слияние.

По-видимому, слияние MAUR4+12 может рассматриваться, как маркерное для рода СпсеШЫ, а слияния MAUR5p/9p/14/16/15+9q/19/17 и MAUR 5q/11/14+11/3/13, как объединяющие для видов С. barabensis, С. griseus и С. pseudogriseus (Рисунок 54). По цитогенетическим данным виды С. griseus и С. pseudogriseus могут быть объединены общим разрывом - разрывом ассоциации

MAUR1/10. В целом можно предположить, что предковый кариотип группы, объединяющей роды Allocricetulus, Cricetulus и Cricetus (AaccK), имел 2n=26 и состоял из следующих элементов: MAUR1/10, 2/7, 4, 5p/9p/14/16/15, 5q/11/14, 6, 8/18, 9q/19/17, 11/3/13, 12, 20, 21, X. По сумме синапоморфий и сравнению с представителями внешних групп кажется наиболее вероятным, что предковый кариотип AaccK+Tscherskia triton состоял из MAUR1, 2, 4, 5p, 5q/11, 6, 7, 8, 9 (две), 10, 11/3/13, 12, 14, 15, 16, 17/19, 18, 19, 20, 21 и X, т. е. имел 2n=44. Тем не менее, уже на этом уровне возникает вопрос о точном количестве элементов, гомологичных, например, MAUR14 и 19. И тот и другой фрагменты могли быть представлены или одним, или двумя отдельными элементами, что допускает вариации диплоидного числа хромосом в кариотипе предка этой клады. В любом случае, формирование AaccK и кариотипа T. triton требует огромного числа хромосомных перестроек. В кариотипе T. triton произошли разрывы предковых элементов MAUR1, 2, 9, 11 и, в общей сложности, 12 слияний: 1+9, 1+19, 2+11+12, 2+16+9, 4+5q/11, 5p+14, 6+17/19, 7+18+9, 8+15. AaccK сформировался за счет разрыва предкового элемента MAUR14, слияния двух предковых элементов MAUR19 в один и слияний MAUR1+10, 2+7, 5+9+14+16+15, 8+18, 9+19/17, 5/11+14.

Необходимо отметить, что в целом для эволюции кариотипов хомячков из родов Allocricetulus, Cricetulus и Cricetus характерно присутствие множества конвергентных событий. Например, хотя слияние MAUR5q/11/14+9q/19/17 было обнаружено по результатам FISH в кариотипах C. sokolovi и Allocricetulus curtatus, его наличие у этих видов вызвано, по-видимому, конвергенцией, а не общим происхождением, т. к. подобная синтения не была обнаружена у других видов Allocricetulus, Cricetus и других видов Cricetulus. Аналогично и со слиянием MAUR5q/11/14+11/3/13, выявленном в разных ветвях древа.

Реконструкция предкового кариотипа подсемейства Cricetinae (ACnK) не была проведена ранее. Здесь, при попытке определить вероятную структуру мы опирались на данные молекулярных исследований, согласно которым, сестринским к группе Cricetinae является подсемейство Arvicolinae. Поскольку для изучения представителей подсемейства полевочьих в основном

использовались наборы сортинговых проб темной полевки, а полная локализация набора проб золотистого хомячка была проведена на хромосомы крайне ограниченного числа видов, то все размышления о структуре ACnK в значительной мере спекулятивны. Не вызывает сомнений присутствие в кариотипе предка Cricetinae синтений MAUR3/11, 8/18 и 17/19. Выявить на данном этапе другие синтении не представляется возможным. Таким образом, можно лишь предположить, что ACnK имел 2n=54 и состоял из элементов MAUR1, 2, 3, 3/11, 4, 5, 5, 6, 7, 8, 8/18, 9 (два), 10 (два), 11, 12, 13, 14, 15, 16 (два), 17/19, 19, 20, 21 и X. При этом, по совокупности всех данных, полученных для подсемейства хомячьих, можно предположить, что число предковых элементов, гомологичных MAUR 3, 5 и 14, могло варьировать от 1 до 2. Если брать в расчет состав ACnK с 2n=54, то формирование кариотипа общего предка рода Mesocricetus, T. triton и AaccK произошло за счет разрывов предковых синтений MAUR8/18 и слияний предковых элементов MAUR3, 8, 10 и 16. Таким образом, цитогенетические данные подтверждают базальную позицию рода Phodopus внутри Cricetinae.

У Mesocricetus произошел разрыв MAUR17/19 и слияние предковых элементов MAUR11 и 19. Всего 2 слияния, MAUR13+3/11 и 5+11, произошли при формировании кариотипа предка, объединяющего AaccK+T. triton. При формировании предкового кариотипа рода Phodopus случились разрывы MAUR3, 4, 6, 8, 11, 15 и слияния MAUR1+16+3+13, 2+15, 4+10+3/11, 4+12, 6+11, 6+15, 8+19/17, 9, 9+14, 16+20.

Сравнительные цитогенетические данные, полученные для палеарктических хомячьих, подчеркивают, что периоды довольно медленной эволюции хромосом (или даже застоя), характерной для некоторых ветвей дерева Cricetinae, чередовались с периодами быстрой кариотипической эволюции в других линиях. Быстрая эволюция кариотипа характерна для Tscherskia triton [Romanenko et al., 2007b], рода Allocricetulus и C. sokolovi. Более того, данные по C. sokolovi указывают, что даже в пределах компактного рода, такого как Cricetulus, изменение скоростей эволюции кариотипа может быть существенным. Подобная же картина наблюдается у полевочьих из родов Ellobius [Romanenko et

al., 2007a], Microtus (подрод Alexandromys) и Lasiopodomys (см. ниже). Следовательно, хромосомная дивергенция могла способствовать возникновению эффективных репродуктивных барьеров между различными таксонами хомячьих.

4.4. Кариотипическая эволюция в подсемействе Arvicolinae

Arvicolinae, полевочьи, являются уникальным подсемейством с наиболее сложной филогенетической историей среди всех грызунов [Abramson et al., 2009a; Galewski et al., 2006; Jaarola et al., 2004; Martinkova, Moravec, 2012]. Это одна из наиболее кариологически разнообразных таксономических групп млекопитающих. Arvicolinae, несомненно, монофилетические, но состав и филогенетические связи между даже четко определенными таксонами остаются весьма противоречивыми [Abramson et al., 2009a; Buzan et al., 2008; Galewski et al., 2006]. Считается, что было три последовательные волны эволюционной радиации: 1) трибы Prometheomyini (занимает самую базальную и обособленную позицию), Ondatrini, Lemmini, Dicrostonychini; 2) триба Myodini; 3) трибы Ellobiini, Lagurini, Arvicolini и Pliomyini [Abramson et al., 2009a]. Филогенетические связи внутри каждой группы еще не полностью решены. Таким образом, подсемейство включает 30-32 родов, сгруппированных в 10-11 триб [Павлинов, Лисовский, 2018].

Охарактеризованы кариотипы почти всех видов. Диплоидные хромосомные числа варьируют от 17 до 64, но в подсемействе описаны множественные случаи внутривидового хромосомного полиморфизма [Lemskaya et al., 2015; Meyer et al., 1996]. Было высказано предположение, что такие значительные кариотипические вариации являются результатом катастрофической эволюции, сопровождающейся как меж-, так и внутрихромосомными перестройками.

4.4.1. Кариотип D. torquatus

Отличительной чертой рода копытных леммингов, Dicrostonyx, является широкая кариотипическая изменчивость, особенно по сравнению с их ближайшими родственниками - настоящими леммингами (род Lemmus). Диплоидное число хромосом у представителей рода варьирует от 2n=28 у D. vinogradovi до 2n=86 у D. torquatus [Орлов, Булатова, 1983; Чернявский,

Козловский, 1980; Gileva, 1983]. Это резко контрастирует с единообразным диплоидным числом (2n=50), описанным для четырех видов настоящих леммингов, кариотипированных к настоящему времени [Gileva, 1983]. Было высказано предположение, что изменение диплоидного числа хромосом в роде Dicrostonyx обусловлено в основном центрическими слияниями А-хромосом [Gileva, 1983]. Исключительно вариация в количестве B-хромосом приводит к высоким числам хромосом у D. torquatus, где 44 A-хромосомы считались регулярными элементами кариотипа вида (2n=44+Bs), а кариотипы с 0 до 42 B-хромосомами были зарегистрированы в различных популяциях [Орлов, Булатова, 1983; Fredga et al., 1999; Gileva, 2004].

Тем не менее, методы классической цитогенетики не позволяли провести надежное различие между хромосомами набров А и В, и без молекулярного цитогенетического анализа идентификация В-хромосом должна была рассматриваться как предварительная. FISH с зондами M. agrestis позволил установить, что две маленькие пары хромосом в кариотипе копытного лемминга, которые имеют тот же размер, что и В-хромосомы, гомологичны MAGR24 и, следовательно, относятся к стандартному А-набору. Таким образом, мы утверждаем, что диплоидное число хромосом в кариотипе проанализированного самца D. torquatus составляет 2n=45+Bs (Рисунок 20). Нечетное число хромосом в А-наборе объясняется сложной системой половых хромосом, выявленной в кариотипе особи.

Интересно, что в исследованиях по мейотическому спариванию истинная Y-хромосома в кариотипе D. torquatus не была идентифицирована [Gileva, 1980; Gileva, Chebotar, 1979], а также не визуализировалась путем хромосомного пэйнтинга в наших экспериментах. Это позволило поместить D. torquatus в короткий список атипичных видов млекопитающих, у которых отсутствует истинная Y-хромосома (Таблица 2). Мы предположили, что во время формирования кариотипа вида в его нынешнем виде имела место транслокация предковой Y-хромосомы на аутосому с последующим удалением большинства частей истинной Y-хромосомы. Тем не менее, потенциальная элиминация предковой Y-хромосомы и отсутствие современных исследований мейоза с

высоким разрешением не позволили установить наличие такой Y-специфической области у D. torquatus. В дальнейшем необходимы молекулярные исследования кариотипа D. torquatus с зондами, содержащими гены из стандартной псевдоаутосомной области млекопитающих, для проверки предложенного состава кариотипа. Учитывая явное отсутствие истинной Y-хромосомы, система половых хромосом в настоящее время может быть обозначена как X1X2Y1. Три половые хромосомы могут быть интерпретированы как результат двойного транслокационного события, приведшего к формированию трех монобрахиальных гомологов (Рисунок 20).

Ранее аналогичная гетероморфная структура половых хромосом была описана для D. torquatus torquatus с Полярного Урала [Gileva, 1980]. Важно отметить, что рисунок G-бэндинга хромосомы X2 (= хромосома 19 у [Gileva, 1980]) и p-плеча Y1-хромосомы (= хромосома 18) отличается от такового у исследованного индивидума. Исходя из этого можно предположить, что в разных популяциях D. torquatus с участием разных аутосом могли формироваться гетероморфные системы половых хромосом.

4.4.2. Сложная система половых хромосом у L. mandarinus и внутриаутосомный полиморфизм

Комбинация половых хромосом обычно определяет, является ли особь самцом или самкой у видов с хромосомным определением пола. Большинство видов млекопитающих имеют обычную систему половых хромосом XX/XY, где Y несет ген SRY. Было предложено, что половые хромосомы возникли из пары аутосом, где один из гомологов приобрел локус определения пола [Graves, 2006; Ohno, 1967]. Дальнейшие эволюционные процессы привели к накоплению полоспецифичных генов как на X, так и на Y-хромосоме, подавлению рекомбинации между ними и быстрому вырождению Y, иногда приводящему к полной потере Y-хромосомы [Graves, 2006]. Этот процесс может быть осложнен межхромосомными перестройками (слияния, разрывы, транслокации), что приводит к появлению либо нео-половых хромосом, либо комплексу множественных половых хромосом. Нео-половые хромосомы возникают при переносе аутосом или аутосомных сегментов на предковые половые хромосомы

[Zhou et al., 2008], а в некоторых случаях последующее разделение или новое слияния таких нео-половых хромосом приводят к появлению множественных половых хромосом [Toder et al., 1997]. Аутосомный материал часто добавляется к одной из половых хромосом или к обоим из них [Nguyen et al., 2013; Pala et al., 2012; Yang et al., 1995]. Даже в случаях с известным составом нео-половых хромосомных комплексов, многие вопросы остаются без ответа в отношении поведения этих элементов в мейозе, локализации определяющих пол локусов и роли неохромосомных комплексов в видообразовании и т. д.

Хотя некоторые системы половых хромосом, отличные от XX/XY, обнаруживаются в различных таксонах млекопитающих, грызуны демонстрируют самый широкий спектр систем половых хромосом и даже механизмов хромосомного определения пола (Таблица 2). Многие виды с необычными системами половых хромосом относятся к подсемейству Arvicolinae, а китайская полевка, наравне с копытным леммингом, является одним из них.

Полиморфизм половых хромосом L. mandarinus ранее был описан только на основании анализа G- и C-бэндинга [Ковальская, Орлов, 1974; Liu, Yan, Zhu, 2010; Wang et al., 2003; Zhu et al., 2003]. Ванг с соавторами предположили, что полиморфизм мог был вызван перемещением аутосом на Х-хромосому [Wang et al., 2003]. Метод сравнительного хромосомного пэйнтинга позволил нам установить, что нео-половые хромосомы у L. mandarinus возникли в результате по меньшей мере двух независимых транслокаций аутосом на половые хромосомы. Среди исследованных нами особей обнаружилось два типа половых хромосом у самок и один тип у самцов. Первый комплекс половых хромосом самок L. mandarinus состоит из одной метацентрической хромосомы (нео-Х1), одной субметацентрической хромосомы (нео-Х2) и одной небольшой акроцентрической хромосомы, называемой здесь «нео-Х3». По крайней мере, две пары предковых аутосом участвовали в формировании этих нео-Х-хромосом. У самок со вторым типом комплекса при том же диплоидном числе хромосом половые хромосомы представлены одной субметацентрической хромосомой (нео-Х2) и двумя акроцентрическими хромосомами нео-Х3 и нео-Х4. Система половых хромосом

самцов была обозначена как нео-Х и нео-Y, где нео-Х гомологична нео-Х1 самок, а нео-Y - хромосоме нео-Х4 самок.

Это открытие согласуется с теорией, предложенной на основе наблюдения необычного синапса в мейозе у китайской полевки [Borodin et al., 2012]. Бивалент XY L. mandarinus содержит две области спаривания. Обе области спаривания относительно велики и обе участвуют в регулярной рекомбинации, подобно псевдоаутосомным областям у человека [Borodin et al., 2012]. Эти области, возможно, возникли de novo после транслокаций аутосомных сегментов, как предложено для областей спаривания хромосом человека [Graves, Wakefield, Toder, 1998].

Образование метацентрических нео-Х и нео-Х1 сопровождалось накоплением гетерохроматина в части X-хромосомы, гомологичной MAGR13. Похоже, что либо предковая Х-хромосома, либо предковый аутосомный сегмент несли гетерохроматиновый блок, который препятствовал распространению инактивации на аутосомную часть после транслокация [Wang et al., 2014]. Мы предполагаем, что слияние MAGR13/X с MAGR17/19 произошло сравнительно недавно поскольку область слияния сохранила ITS (Рисунок 38). Аналогично и для хромосомы нео-Х2, на которой, по-видимому, накопление гетерохроматина также способствовало ограничению распространения инактивации. Таким образом, мы охарактеризовали сложный хромосомный состав полового тривалента в кариотипах самок и бивалент в кариотипе самца китайской полевки. Тем не менее, чтобы понять это явление на молекулярном уровне требуются дополнительные исследования с изучением локализации и функции генов, определяющих пол.

Еще на основании рутинного окрашивания хромосом, а после и путем сравнения рисунка G-бэндинга, было показано, что морфология пар аутосом 1 и 2 в кариотипе L. mandarinus может быть различной. Более того, было высказано предположение, что подобный аутосомный полиморфизм является подвидо-видоспецифичным и возник в результате инверсии [Kovalskaya, Smorkatcheva, 2011; Wang et al., 2003]. Среди 12 изученных особей полиморфизм наблюдался только по паре хромосом 2, причем результаты сравнительного хромосомного

пэйнтинга позволили нам описать три типа этой аутосомы: 2а - акроцентрик, гомологичный MAGR1/5, 2Ь - акроцентрик, гомологичный MAGR1/5/1/5/1/5, 2с -субметацентрик, гомологичный MAGR5/1/5/1 (Таблица 6, Рисунок 39). Таким образом, данные пэйнтинга подтвердили, что различия в морфологии хромосом, формирующих эту пару, является результатом перицентрической инверсии, а отличия в рисунке бэндинга акроцентриков могут быть вызваны инверсией. В целом кариотипы проанализированных особей характеризовались значительными вариациями по этой паре аутосом. Наибольшее разнообразие было описано для самок с системой половых хромосом нео-Х1, нео-Х2, нео-Х3, а наименьшее для самцов, что, наиболее вероятно, связано лишь с различным числом проанализированных особей Ь. mandarinus. Несомненно, что дальнейшие исследования молекулярного состава пары хромосом 2 необходимы, чтобы ответить на вопросы о причинах столь высокой частоты внутрихромосомных перестроек в этом сегменте кариотипа китайских полевок.

4.4.3. Высокий консерватизм кариотипов в роде ЛШсоШ

Род скальных полевок АШсо1а объединяет 12 видов [СагЫоп, Musser, 2005]. Кариотипированы на основании С- и G-окрашивания были 7 видов: АШсо1а 1етттш [Bykova, Vasilyeva, Gileva, 1978], А. semicanus (два подвида), А. barakshin, А. argentatus, А. strelzowi (2 подвида) [ШеЬЛег et а1., 1992]. При этом была отмечена схожесть рисунка G-бэндинга хромосом этих видов, но оговорено, что наличие большого числа акроцентриков, имеющих лишь один G-позитивный бэнд, создает сложности при сопоставлении кариотипов [ШеЬЛег et а1., 1992]. Так и в нашем случае из-за разного уровня разрешения трудно было установить гомологию пар хромосом начиная с пары 13 у видов, проанализированных в настоящей работе и изученных ранее. Тем не менее, данные сравнительного хромосомного пэйнтинга убедительно показали, что, по крайней мере, между видами А. barakshin, А. olchonensis, А. strelzowi и А. Шушсш нет выявляемых межхромосомных перестроек. Все кариотипические различия между ними вызваны различным накоплением и распределением блоков гетерохроматина.

4.4.4. Эволюция хромосом в роде Ellobius

Изучение хромосомных наборов слепушонок позволило обосновать существование трех видов двойников: E. talpinus, E. tancrei, E. alaicus, при этом для E. talpinus s. str. (2n=FN= 54) до сих пор неизвестна какая-либо хромосомная изменчивость, а для двух остальных видов этой группы описана широкая хромосомная изменчивость робертсоновского типа: E. tancrei 2n=31-54, FN=56; E. alaicus 2n=50-52, FN=56 [Lyapunova et al., 1984].

В настоящем исследовании метод сравнительного хромосомного пэйнтинга не выявил каких-либо различий в распределении синтенных групп в кариотипах двух исследованных близкородственных видов E. talpinus и E. tancrei (2n=54). Единственным различием, наблюдаемым между этими кариотипами, было положение центромеры на паре хромосом 7. Мы не смогли определить с помощью пэйнтинга, было ли изменение положения этой центромеры результатом инверсии, как предполагалось ранее [Ляпунова, Воронцов, 1978], или результатом центромерного сдвига, т. е. формирования неоцентромеры. На большую вероятность второго варианта указывает только то, что субметацентрическая хромосома 7 E. tancrei и E. alaicus не содержит видимых гетерохроматиновых блоков, а отсутствие больших доменов гетерохроматина является одной из специфических черт, проявляющихся при возникновении неоцентромер [Alonso et al., 2010]. Кроме того, данные многоцветного бэндинга показали, что в кариотипе E. talpinus присутствует минимум одна эволюционно новая центромера (на хромосоме ETAL1).

Зонд MAGR X давал сигналы на обеих Х-хромосомах E. tancrei и E. talpinus. Никаких различий между хромосомными наборами самцов и самок или между двумя Х-хромосомами обнаружено не было [Romanenko et al., 2007a]. Аналогично и для Х-хромосом E. alaicus. Было продемонстрировано отсутствие транслокаций какой-либо аутосомы, Y-хромосомы или их частей на X-хромосому. Хотя предыдущие исследования E. talpinus указывают на функциональные различия для пары ХХ-хромосом у самцов и самок, которые также могут встречаться у E. tancrei и E. alaicus [Kolomiets, Matveevsky,

ВаЫошЫшкауа, 2010], на цитогенетическом уровне половые хромосомы самцов и самок этих трех видов являются изоморфными.

Все проанализированные формы Е. аШсш имели неописанное ранее для этого вида 2п=48. Принадлежность изученных особей именно к виду Е. аШсш, а не Е. tancrei, была подтверждена результатами анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента митохондриального гена cyt Ь [Саидов и др., 2018]. То, что все изученные особи Е. аШсш были отловлены за пределами ареала (Алайской долины), приписываемого данному виду, заставляет пересмотреть границы обитания вида. Кариотип особей характеризовался присутствием трех робертсоновских слияний, таких как Rb(2.11), Rb(3.10) и Rb(4.9), пара хромосом 7 при этом была представлена парой субметацентриков. Здесь важно подчеркнуть, что ранее было установлено, что для кариотипа Е. аШсш характерно присутствие типичного крупного метацентрика [Воронцов, Раджабли, 1967; Ляпунова, Воронцов, 1978]. Новые данные описывают этот метацентрик как Rb(2.11).

Восточная слепушонка, Е. tancrei, на основной части ареала имеет 2п=54. Многочисленные работы показывают существование неполного робертсоновского веера у слепушонок из Сурхобской долины (Памиро-Алай) (обзор [Lyapunova et а1., 2010]). Причем данные по анализу популяции за 25 летний период показывают, что активная гибридизация между различными хромосомными формами до сих пор сохраняется в центральной части популяции. Описание формы с 2п=30 (появление Rb(24.26), Рисунок 29), т. е. с максимальным количеством слияний у Е. tancrei, показывает существование полного робертсоновского веера у этого вида, а также сдвигает границу зоны хромосомного полиморфизма на восток, ближе к Е. а1а^ш.

По результатам картирования зоны робертсоновского веера Е. tancrei в долине рек Сурхоб-Вахш (Памиро-Алай) на основании сравнения G-окрашенных хромосом было выделено более 10 областей обитания разнохромосомных форм, разграниченных естественными природными барьерами [Lyapunova et а1., 2010]. В рамках настоящей работы методами молекулярной цитогенетики были описаны все типы Rb, характерные для особей из различных ареалов. Описана сложная

хромосомная изменчивость в этом регионе, где даже особи с идентичными диплоидными числами хромосом несут независимые Rb. Например, 50-хромосомные формы из одной точки отлова имели разные структуры кариотипа за счет гетероморфизма по отдельным парам хромосом. Если в кариотипе особи 24911 были выявлены только Rb(2.18), Rb(5.9), то особь 24909 несла в дополнение к Rb(2.18) пары, гетероморфные по Rb(1.8) и Rb(5.9) (Рисунок 29в).

Крайне интересным моментом стало обнаружение у восьми восточных слепушонок (особи 24919, 24910, 24914, 24915, 25601, 25618, 25613, 25614) слияния Rb(2.11), причем у животных, обитающих в разных популяциях, на разных берегах реки Сурхоб (Рисунок 55). Это открытие поднимает вопрос о возможном независимом, конвергентном возникновении этой перестройки у Е. ¡апсге1 и сестринского вида Е. а1а1сш. Также любопытен тот факт, что у всех особей Е. 1апсге1, несущих Rb(2.11), всегда обнаруживалось и слияние Rb(3.18). Перестройка Rb(5.9) была выявлена в кариотипах всех проанализированных особей Е. 1апсге1 из зоны робертсоновского веера. Другие перестройки, такие как Rb(1.8), Rb(4.14), Rb(6.12), Rb(10.19), Rb(13.23), Rb(15.22), а также Rb(16.20), характерны для кариотипов большинства изученных особей. Слияние Rb( 17.25) встретилось в кариотипах особей из трех популяций (Шингелич, Шилбили и Саринай, рисунок 25), значительно удаленных друг от друга и разобщенных мощными географическими барьерами, что может также указывать на независимость происхождения данной перестройки хромосом. Для особей из Сарипула характерно слияние Rb(11.25), в других точках оно обнаружено не было.

Рисунок 55. Хромосомная изменчивость у Е. /апсге1 в Памиро-Алае.

Также крайне важно подчеркнуть, что хромосомная изменчивость была обнаружена и за пределами зоны робертсоновского веера, причем кариотип особи Е. /апсге1 из Ходжа-Оби-Гарм характеризовался особенными слияниями хромосом ^^4.12) и Rb(9.13)), не выявленными в хромосомных наборах других особей (Рисунок 29б).

Таким образом, можно заключить, что группы популяций Е. /апсге1, расположенные на разных берегах реки Сурхоб, формировались независимо друг от друга, и хотя гибридизация играла важную роль в их истории, ее распространение было ограничено географическими барьерами. Географическая разобщенность, несомненно, способствовала закреплению перестроек в хромосомных наборах восточных слепушонок. Также, несмотря на присутствие слияния Rb(2.11) в кариотипах как Е. аЫсш, так и Е. /апсге1, кажется более вероятным независимое происхождение этой перестройки у этих видов, тем более, что за все время наблюдений среди более 400 проанализированных особей Е. /апсге1 не было найдено ни одного животного с 2п=52 и единственной парой

Rb(2.11) [Вак1ошЫшкауа, Lyapunova, 2003]. Кроме того, как упоминалось выше, у Е. 1апсге1 с Rb(2.11) в кариотипе всегда присутствовало и слияние Rb(3.18), тогда как у Е. аЫсш в различных сочетаниях встречались слияния Rb(1.3), Rb(4.9), Rb(3.10), нехарактерные для Е. 1апсге1.

В целом, все три представителя подрода ЕПоЫш являются классическими сестринскими видами: они практически неразличимы фенотипически, но существенно отличаются генетически. Можно считать, что возникновение этих видов представляет собой пример значительного эволюционного последствия изменения положения центромер, имевшего место в течение 1 млн лет, прошедшего с момента расхождения Е. 1апсге1+ Е. аШсш и Е. 1а1ртш.

Ранее для рода ЕПоЫш, единственного среди полевочьих, если брать в расчет данные сравнительного хромосомного пэйнтинга, была проведена реконструкция предкового кариотипа ^отапепко е1 а1., 2007а]. Внесение уточнений в сравнительную карту хромосом Е. 1а1ртш существенно не отразилось на структуре предложенного в той работе предкового кариотипа рода ЕПоЫш, АЕК (Рисунок 56). Единственное, что кажется более вероятным, это что синтения MAGR2/8a была представлена в виде единого фрагмента, так как именно в виде единого фрагмента она встречается в кариотипах практически всех изученных видов полевочьих (см. ниже). Таким образом, диплоидное число хромосом в АЕК должно быть сокращено с 2п=56 до 2п=54 (Рисунок 56).

Рисунок 56. Гипотетический предковый кариотип рода ЕПоЫш. Для наглядности отдельные консервативные сегменты хромосом М. атаХт (MAUR) представлены 23 различными цветами и пронумерованы справа от идиограмм, также справа показана гомология отдельным хромосомам и сегментам хромосом М. agrestis (MAGR). Гомология отдельным консервативным сегментам хромосом М. тшсЫш (MMU) показана слева от идиограмм (по материалам [Romanenko еХ а1., 2006; Sitnikova еХ а1., 2007]).

В то же время анализ обновленных данных указывает на то, что на сравнительной карте хромосом Е. lutescens, полученной ранее, также был пропущен небольшой фрагмент, гомологичный MAGR17. По-видимому, он расположен в интерстициальном районе q-плеча хромосомы 5 (по результатам локализации реципрокного пэйнтинга в паре золотистый хомячок-темная полевка должен быть участок гомологии MAGR17=MAUR16), которая, таким образом, гомологична MAGR1c/1b/17b/18/20 (Рисунок 57). Из-за значительной перестроенности кариотипа этого вида подтвердить или опровергнуть предположение с помощью хромосомного пэйнтинга не представляется возможным.

МАШ MAGR MMU

*

5

X

6

7

8

Рисунок 57. G-окрашенный кариотип Е. lutescens. Черные квадраты обозначают позиции центромер. Вертикальные черные полосы отмечают локализацию хромосомных сегментов М. agrestis (MAGR, слева), М auratus (MAUR, в центре). Локализация хромосомных сегментов М. ттси1т (MMU, справа) была установлена на основе ранее опубликованных данных [Romanenko et а1., 2006; Sitnikova et а1., 2007]. Числа рядом с вертикальными линиями соответствуют хромосомам М. agrestis и М. атаХт. Серым цветом отмечен предполагаемый дополнительный участок гомологии хромосомам MAGR, не отмеченный ранее [Romanenko et а1., 2007a].

Все представители современного таксона Microtina, имеющего статус подтрибы, ранее относились к единому роду Microtus. Матти попытался реконструировать предковый кариотип трибы Microtina (в нынешнем понимании) (AMiK), основываясь на морфологии хромосом и рисунке GTG-бэндинга [Matthey, 1973]. Было высказано предположение, что AMiK имел 2n = 56, и все хромосомы были акроцентрическими из-за широкого распространения подобного кариотипа у представителей таксона.

В данном случае для определения, имеет ли хромосома или хромосомный сегмент предковое состояние, в качестве внешней группы был выбран род Ellobius (Рисунок 56), относимый к другой трибе полевочьих. Согласно принципам реконструкции предковых кариотипов, ассоциации MAGR1/17 и MAGR2/8 следует рассматривать в качестве предковых для всех изученных видов

4.4.5. Предковый кариотип подтрибы Microtina

Microtina. По-видимому, хромосомы, гомологичные хромосомам MAGR2, 4-7, 1016, 18-24, были сохранены в AMiK, а хромосомы, гомологичные MAGR1, 8, 9 и 17, присутствовали в AMiK в виде двух элементов. Предковое состояние MAGR3 трудно определить однозначно, но картина FISH-локализации MAGR3 на хромосомах таких видов Arvicolinae, как D. torquatus, Arvicola amphibious и Myodes rutilus, являющихся базальными для трибы Microtina [Mazurok et al., 2001; Galewski et al., 2006; Jaarola et al., 2004], указывает на более вероятное представление MAGR3 в AMiK как единого сегмента. Кроме того, в кариотипе Lasiopodomys gregalis и других Lasiopodomys (об этом ниже) MAGR3 также сохранилась в виде единого сегмента, а этот род занимает базальное положение внутри трибы Microtina [Mazurok et al., 2001; Galewski et al., 2006; Jaarola et al., 2004]. На основании этого видится более вероятным, что MAGR3 была представлена в AMiK в виде одного сегмента.

Анализ данных сравнительного хромосомного пэйнтинга указывает на то, что AMiK, по-видимому, имел 2n=54 (Рисунок 58). Поскольку большинство кариотипов Microtus с высокими диплоидными числами состоят из акроцентрических элементов, мы предполагаем, что этот тип морфологии может быть характерным для предкового кариотипа. Примечательно, что предлагаемый здесь AMiK отличается от AMiK, основанного на традиционном подходе, только одной парой хромосом. Более того, структура AMiK полностью идентична структуре AEK (Рисунок 56).

4.4.6. Кариотипическая эволюция в роде Lasiopodomys

Род Lasiopodomys занимает особое положение в трибе Microtina. Статус всего таксона Lasiopodomys, его видовой состав и, в частности, разделение рода на подроды Stenocranius (L. gregalis и L. raddei) и Lasiopodomys (L. mandarinus и L. brandtii) остаются неясными [Abramson, Kostygov, 2010; Abramson et al., 2009b; Petrova et al., 2016]. Часто при изучении морфологически сходных видов цитогенетические признаки предоставляют дополнительные филогенетические данные для решения проблем систематики и таксономии.

Рисунок 58. Предполагаемый предковый кариотип Microtina (AMiK). Одиночные хромосомы M. agrestis, представленные одним элементом в AMiK, показаны серым цветом. Хромосомы, представленные двумя элементами, отмечены парами разных цветов.

Наличие MAGR1bc/17b (ассоциация, общая почти для всех Arvicolmae и содержащая фрагмент MAGR1b/17b, который также был обнаружен у некоторых видов Cricetinae) и MAGR2/8a (общая для всех Arvicolinae) в кариотипах трех изученных видов Lasiopodomys может рассматриваться как синапоморфная черта подсемейства Arvicolinae. Ассоциации MAGR12/18, 17a/19 и 22/24 ранее не были обнаружены в кариотипах других грызунов и могут быть определяющими маркерами рода Lasiopodomys. Важно подчеркнуть, что L. brandtii и L. gregalis несут кластеры рДНК на хромосомных сегментах, гомологичных MAGR1bc/17b, вероятно, имеющих одно и то же происхождение (то же самое для кластеров рДНК в L. brandtii и L. gregalis, расположенные на хромосомных сегментах, гомологичных MAGR21).

Ассоциации MAGR2a/8a/19b, 8Ъ/21, 9Ь/23, 11/13Ъ, 12Ь/18 и 17a/19a были обнаружены в кариотипах L. mandarinus и L. Ьш^Ш и могут быть характерными для подрода Lasiopodomys. Хотя некоторые из этих ассоциаций, по-видимому, имеют общее происхождение с другими видами АтсоНпае и СпсеНпае, использование проб копытного лемминга оказалось эффективным для определения статуса этих, казалось бы, общих ассоциаций.

Несмотря на то, что MAGR12/18 и MAGR17a/19 являются ключевыми синапоморфными ассоциациями для всего рода Lasiopodomys, разрывы MAGR12 и MAGR19, приведшие к образованию MAGR12a, MAGR12b/18 и MAGR17a/19a, MAGR19b (входит в состав MAGR2a/8a/19b), соответственно, характерны только для подрода Lasiopodomys. Кариотип L. mandarinus характеризуется высокой фрагментацией по сравнению с кариотипами его сестринских видов. Отсутствие ассоциации MAGR22/24 (= DTOR17/20/21) в кариотипе L. mandarinus, вероятно, является вторичным событием из-за разрыва хромосом. Однако мы не можем исключить возможность того, что наличие ассоциации MAGR22/24 в кариотипах L. Ьш^Ш и L. gregalis было только результатом конвергентной эволюции. В этом случае L. mandarinus сохранил предковое состояние. Таким образом, происхождение ассоциации MAGR22/24 не было однозначно определено.

Обнаруженные здесь общие хромосомные ассоциации, похоже, подтверждают эволюционную близость L. mandarinus и L. brandtii и их изоляцию от L. gregalis, обеспечивая цитогенетические данные для таксономического разделения подродов на основе анализа последовательностей ДНК [AЪramson, Kostygov, 2010; AЪramson et al., 2009Ъ; Mezhzherin, Zykov, Morozov-Leonov, 1993]. Более того, цитогенетические исследования выявляют возможные хромосомные синтении (12/18, 17а/19 и 22/24), которые поддерживают отдельную позицию рода внутри АтсоНпае (Рисунок 59).

- разрыв + слияние

Рисунок 59. Кариотипическая эволюция в подсемействе АтсоНпае. Топология древа соответствует молекулярной филогении полевочьих, полученной ранее [Abramson et а1., 2009а]. ААК - предковый кариотип Arvicolinae, AMiK -предковый кариотип подтрибы Microtini, LAK - предковый кариотип рода Lasiopodomys, sLAK - предковый кариотип подрода Lasiopodomys. Нумерация хромосом приведена в ААК, LAK и sLAK. * - см. обсуждение.

4.4.7. Реконструкция предкового кариотипа Arvicolinae

Систематические связи между видами Arvicolinae остаются в значительной степени противоречивыми. Филогенетические деревья, основанные на анализе митохондриальных последовательностей, показывают другой порядок ветвления по сравнению с деревьями, построенными с использованием ядерных последовательностей или комбинаций митохондриальных и ядерных последовательностей [Abramson et al., 2009b; Cook, Runck, Conroy, 2004; Galewski et al., 2006]. Однако разные авторы [Abramson et al., 2009a; Galewski et al., 2006] единодушны в том, что род Dicrostonyx первым отделился от корня дерева Arvicolinae, за ним последовал род Myodes, причем роды Arvicola и Microtus находятся на самых последних ветвях (Рисунок 59). Триба Ellobini, которая включает в себя род Ellobius, была вовлечена в молекулярный анализ только в одной предыдущей публикации [Abramson et al., 2009a].

Робертсоновские транслокации являются наиболее распространенным типом межхромосомных перестроек, зафиксированных в эволюции полевочьих [Li et al., 2006b; Meyer et al., 1996]. К сожалению, этот тип перестроек малоинформативен в качестве характеристик для кладистического анализа из-за частого повторного использования точек разрывов [Dobigny et al., 2004a; Trifonov et al., 2008]. Для описания путей кариотипической эволюции в таксоне мы соотнесли выявленные перестройки с молекулярной филогенией полевочьих, полученной ранее [Abramson et al., 2009a] (Рисунок 59). Использование нескольких наборов пэйнтинг-проб позволило детальнее проанализировать синтенные ассоциации, выявленные в кариотипах различных видов, и обеспечило более глубокое понимание кариотипических отношений между видами Arvicolinae.

В настоящее время данные по изучению широкого списка видов полевочьих, представляющих как "ранние", так и "поздние" ветви, позволяют реконструировать предковые кариотипы для таксонов ниже уровня подсемейства. Получение сравнительных карт хромосом отдельных видов полевочьих и M. auratus (Cricetinae) дает возможность реконструировать предполагаемый предковый кариотип Arvicolinae (AAK).

В целом структура ААК сходна с AMiK и, следовательно, с АЕК. Важный вопрос касается количества сегментов MAGR1. Количество других сегментов, гомологичных MAGR, сходно в AMiK и ААК. Существует два возможных варианта: а) было три предковых сегмента MAGR1 в ААК, которые сохранились в геномах В. torquatus (в DTOR4, 5 и 8), ЕПоЫш talpinus (в ETAL5, 9 и 18), у большинства видов хомяков и мышей; б) два сегмента MAGR1 содержались в предковом кариотипе (и сохранились у других изученных полевочьих), один из которых впоследствии разорвался в некоторых линиях. Синтения MAGR1/17 была обнаружена в кариотипах практически всех проанализированных видов. С использованием хромосомоспецифичных зондов В. torquatus мы обнаружили эту синтению на хромосоме М. auratus 16 (Рисунок 17), где MAGR1/17 гомологична DTOR5. Однако ассоциация MAGR1/17, обнаруженная у всех видов полевочьих, за исключением В. torquatus, содержит дополнительную часть MAGR1, гомологичную DTOR4. Таким образом, MAGR1/17 (=DTOR5) является предковой хромосомой для АтсоНпае, а также для всего семейства Cricetidae. Синтенная ассоциация MAGR1/17 (=DTOR4/5) появилась позже в эволюции полевочьих, по-видимому, после отделения ветви, ведущей к В. torquatus (Рисунок 59). В итоге можно заключить, что для ААК характерно диплоидное число хромосом 2п=56 и три сегмента, гомологичных MAGR1 (Рисунок 60).

В целом, эволюция кариотипа у АтсоНпае указывает на сохранение некоторых крупных консервативных сегментов и множественные внутрихромосомные перестройки в некоторых консервативных сегментах. Наиболее ярким примером является ассоциация MAGR2/8. Этот сегмент гомологичен MAGR2/8 ргох = DTOR1 (Рисунок 20) и, несомненно, присутствует в ААК, но его предковый состав не может быть определен без данных по различным видам полевочьих с использованием районоспецифичных зондов.

9а

6 8а 10а

За 11а

I

8а

2 4

13 7а

5а 4 21 16а 14а

14 15

8Ь

16Ь

10Ь

6 2а

I

7 12 | 1а 13

7

10 1а

11 18

12

8

10

15 17а

11 12

13

14

16 11Ь 17а ЗЬ 8Ь 7Ь

15 16

18

5Ь 20

I

20

17

9Ь

17Ь 19а

23 19Ь 9Ь « 24 14ь|

19 1Ь 9а 5с

18 19 20

х х

21 2Ь 22 19а ** 19В 101Э1 1?ь 9с 24 14ЬЦс

21 22 23 24 25 26 27 X

Рисунок 60. Предполагаемый предковый кариотип АтсоНпае (ААК). Хромосомы М. agrestis, представленные в ААК одним элементом, показаны серым цветом. Хромосомы, представленные двумя элементами, отмечены парами разных цветов. Номера хромосом М agrestis показаны справа, а их соответствие хромосомам М. аига^ представлено слева.

С учетом этих результатов мы полагаем, что структура ААК очень похожа на АМгК и на АЕК (Рисунок 56, 58). Разница в диплоидном числе хромосом вызвана разрывом в сегменте MAGR1. Более того, синтения MAGR13 = DTOR12 = MAUR3/11 в ААК отличается от синтении в АМЖ. Представляется более вероятным, что инверсия в сегменте MAGR13 = DTOR12 = MAUR11/3/11 появилась позже в эволюции АтсоНпае или могла возникнуть независимо в отдельных ветвях. В ААК синтения MAGR13 соответствует DTOR12 = MAUR3/11. Состав синтений, гомологичных MAGR1/17, 2/8 и 3, при анализе данных пэйнтинга, выполненного с использованием хромосомоспецифичных проб, остается неясным.

4.4.8. Предполагаемый ход кариотипической эволюции в подсемействе

ArvicoИnae

Сравнение хромосом полевочьих не выявило специфических перестроек, которые явно поддерживали бы структуру ветвления на молекулярном дереве. По

сути кариотип, сходный по структуре с AMiK (аналогичен ААК, в котором произошло слияние хромосом 25+27), возник после отделения В. torquatus. Формирование АЕК сопровождалось одной инверсией, при этом отсутствуют межхромосомные перестройки, различающие кариотипы Е. talpinus, Е. аШсш и Е. tancrei.

Большинство филогенетических исследований поддерживают раннее отделение общего предка рода Lasiopodomys от трибы АтсоНш [Абрамсон, Лисовский, 2012; Abramson et а1., 2009Ь; Petrova et а1., 2015]. Мы обнаружили три цитогенетических маркера, которые поддерживают обособленное положение Lasiopodomys в трибе АтсоНш (слияния ААК10+17, 15+18 и 22+26) и приводят к формированию предкового кариотипа рода Lasiopodomys, LAK (Рисунок 59). В дальнейшем серия разрывов и слияний дала начало предковому кариотипу подрода Lasiopodomys ^АК).

Среди других представителей подтрибы Microtina только для подрода Alexandromys (А. maximowiczii и А. оесопошш) три слияния предковых хромосом были определены как характерные. Дальнейшая эволюция кариотипов Alexandromys была отмечена пятью слияниями и одним разделением для М. maximowizcii и девятью слиянием предковых хромосомных элементов для А. oeconomus. Никаких перестроек, специфических для М. rossiaemeridionalis, М. guentheri и Т. daghestanicus, обнаружено не было. Кариотипы других изученных видов характеризовались небольшим количеством межхромосомных перестроек (Рисунок 59).

Ассоциация MAGR8/19 была обнаружена у кариотипов М. dogramacii и А. maximowiczii и могла быть следствием конвергентной эволюции хромосом.

Несмотря на ограниченный уровень разрешения, хромосомоспецифичные библиотеки позволили выявить отдельные внутрихромосомные перестройки в кариотипах полевочьих. Наиболее интригующими оказались случаи, когда перестройки наблюдались в сегменте, гомологичном MAGR2/8 рюх = DTOR1 = MAUR6q/10p/8q prox/9q dist. Инверсия внутри этого сегмента, приведшая к формированию MAGR2/8/2, была обнаружена у М. rossiaemeridionalis, А. maximowiczii и А. oeconomus. Кроме того, по сравнительным картам хорошо видно

(Рисунок 36), что положение центромер в хромосомах, гомологичных MAGR2/8, варьирует у видов Microtina. Также оно отличается и в некоторых других участках, например, в участке, гомологичном MAGR3 = MAUR5/21/16/14, который в виде единого фрагмента присутствует у всех представителей подсемейства АтсоНше [Lemskaya и др., 2010; Romanenko и др., 2007a].

Использование различных наборов проб для сравнения видов позволило нам показать, что отличия между кариотипами близкородственных видов обусловлены не только слияниями и разделениями предковых элементов кариотипа, но и большим числом внутрихромосомных перестроек, включая инверсии и появление ЭНЦ.

4.4.9. Внутрихромосомные перестройки в эволюции кариотипов

полевочьих

Неоднократно предполагалось, что количество внутрихромосомных перестроек недооценивается как цитогенетическими, так и биоинформационными методами, что их вклад в эволюцию кариотипов неизвестен, но, по-видимому, очень велик. Чтобы проверить эту гипотезу, мы определили степень представленности внутрихромосомных перестроек в эволюционно консервативных синтенных блоках 1, 3 и 7 предкового кариотипа АтсоНше (ААК, Рисунок 60). ААК1 и ААК3 гомологичны ассоциации хромосом Microtus agrestis (MAGR) 2^ и MAGR3, соответственно. ААК7 гомологичен дистальной части MAGR1. Хотя все эти хромосомы имеют очень сходный рисунок G-бэндинга среди изученных видов, положение центромер значительно варьирует. Ранее предполагалось, что изменение морфологии этих консервативных синтеннных блоков вызвано внутрихромосомными изменениями, которые не обязательно ограничиваются только событиями центромерных сдвигов [Lemskaya и др., 2010; Romanenko и др., 2017]. Наборы хромосомоспецифичных зондов позволили выявить инверсии внутри фрагментов, гомологичных ААК1, а микродиссекционные зонды выявили большое количество ранее недетектированных внутрихромосомных перестроек в этом и двух других участках.

Наиболее сложная ситуация наблюдалась в области, гомологичной ААК1. В кариотипах исследованных полевок были обнаружены ассоциации АОЕС2/8 и 2/8/2 с различными центромерными положениями. У некоторых видов (Б. torquatus, L. gregalis, М. агуаШ и Т. savii) мы не смогли однозначно отличить тип перестройки, вызвавший изменение положения центромеры в области, перекрываемой зондами 1.6.-1.8.. Для решения этого вопроса требуются более тонкие молекулярные методы.

Как и в случае межхромосомных перестроек, внутрихромосомные были нанесены на филогенетическое древо (Рисунок 61). Такой подход к картированию четко идентифицирует основные типы хромосомных изменений, характерные не только для таксономической группы, но и для синтенных блоков. Следовательно, мы смогли определить, что центромерные репозиции преобладают в областях, гомологичных ААК1 и ААК7 (5 центромерных сдвигов против 3-4 пара- или перицентрических инверсий). Однако в области ААК3 парацентрические инверсии были более распространены (6 парацентрических инверсий против одного зарегистрированного центромерного сдвига) (Рисунки 43-45, Таблица 8). В то же время структура хромосом современных видов была сформирована за счет одной или двух внутрихромосомных перестроек в хромосомах предка полевочьих. В отличие от межхромосомных перестроек, среди внутрихромосомных оказались перестройки, специфичные для целых родов или триб (Рисунок 61). Только у ЕНоЫш было больше разрывов, чем внутрихромосомных перестроек, среди трех проанализированных регионов. В других ветвях внутрихромосомных перестроек было в 2-5 раз больше, чем межхромосомных (Рисунки 58, 61). Таким образом, можно предположить, что у АтсоНпае и, возможно, у других грызунов и даже у некоторых других млекопитающих или позвоночных внутрихромосомные перестройки были ключевыми перестройками в эволюции.

Высокая частота внутрихромосомных перестроек подтверждается и результатами работы по локализации районоспецифичных зондов, полученных для некоторых хромосом мыши, на отдельных видах грызунов, когда возникновение ЭНЦ было показано на хромосомах 11 А. оесопотш, 10 Б.

torquatus и 13 E. talpinus. Это указывает на то, что появление ЭНЦ не редкость у Arvicolinae.

Рисунок 61. Филогенетическое древо полевочьих, построенное на основе литературных данных [Abramson et al., 2009a; Buzan et al., 2008; Martínková, Moravec, 2012]. Специфические перестройки приведены над каждой ветвью и соответствуют AAK1 (красный), AAK3 (зеленый), AAK7 (синий). CR -центромерный шифт, FI - разрыв, PA - парацентрическая инверсия, PE -перицентрическая инверсия. Гомоплазии, обнаруженные в разных ветвях древа, взяты в одинаковой формы серые фигуры. Дерево отражает только порядок ветвления, но не относительный масштаб. Длина ветвей не является информативной.

Таким образом, можно предположить, что внутрихромосомные перестройки были основной движущей силой эволюции хромосом у млекопитающих. Этот процесс был недооценен или остался незамеченным за крупномасштабными перегруппировками, такими как разрывы, слияния или крупные инверсии, которые были обнаружены и описаны в течение нескольких

десятилетий сравнительных исследований с использованием хромосомоспецифичных зондов.

Недавно было обнаружено, что перицентрические инверсии наиболее активно фиксируются в геномах близкородственных видов птиц с перекрывающимися ареалами [Hooper, Price, 2017]. В нашем случае ареалы большинства видов полевочьих, включенных в исследование, значительно перекрывались [Shenbrot, Krasnov, 2005]. Даже для пар родственных видов с перекрывающимися ареалами и сходными фенотипами были отмечены значительные различия в структуре кариотипов и внутривидовой хромосомный полиморфизм. Несмотря на относительно молодой эволюционный возраст всего подсемейства было обнаружено лишь несколько гибридных особей между M. arvalis и M. rossiaemeridionalis (причем только в неблагоприятной экологической зоне), при отсутствии естественной гибридной зоны [Gileva et al., 2000]. Кариотипы этих видов значительно различались по морфологии аутосом среднего и малого размера и Х-хромосомы, которые в данной работе не анализировались [Lemskaya et al., 2010; Rubtsov et al., 2002]. Согласно ранее опубликованным данным, межвидовые различия в структуре эухроматиновой части X-хромосом этих видов были вызваны некоторыми инверсиями [Rubtsov et al., 2002]. Мы обнаружили только одну внутрихромосомную перестройку в AAK1 между M arvalis и M. rossiaemeridionalis. Тот факт, что только несколько случайных гибридов между M. arvalis и M. rossiaemeridionalis были обнаружены на огромном перекрывающемся участке, поддерживает репродуктивную изоляцию этих морфологически неразличимых видов, как это было отмечено у птиц [Hooper, Price, 2017; Zorenko, Malygin, 1984].

Семь видов дальневосточных полевок (род Alexandromys) имеют частичное перекрытие ареалов в некоторых районах к востоку от озера Байкал [Shenbrot, Krasnov, 2005]. Перестройки, обнаруженные в настоящем исследовании, показывают, что помимо значительного числа робертсоновских транслокаций, парацентрические и перицентрические инверсии также сыграли большую роль в изоляции видов. В дополнение к описанным здесь внутрихромосомным перестройкам виды демонстрируют различную морфологию Х-хромосомы;

сообщалось о множественных случаях аутосомного полиморфизма из-за перицентрических инверсий [Lemskaya et al., 2010; Lemskaya et al., 2015]. Эти кариопитические реорганизации из-за внутрихромосомных перестроек также могут указывать на продолжающуюся репродуктивную изоляцию этих видов в областях перекрытия их ареалов.

Согласно недавно предложенной гипотезе, инверсии у птиц чаще фиксируются в половых хромосомах, чем в аутосомах [Hooper, Price, 2017]. Среди плацентарных млекопитающих, для которых было описано явление значительного консерватизма Х-хромосомы, было обнаружено мало заметных исключений. Например, Х-хромосома китопарнокопытных претерпела множественные инверсии и центромерный сдвиг в процессе эволюции, а у серых полевок (род Microtus) межвидовые отличия в структуре эухроматиновой части Х-хромосом были вызваны инверсиями [Proskuryakova et al., 2017; Rubtsov et al., 2002]. Нам еще предстоит проверить гипотезу о том, что перестройки в половых хромосом имеют более высокую скорость фиксации, чем в аутосомах. Однако тот факт, что у полевочьих существенно варьирует морфология половых хромосом, может поддержать эту гипотезу.

Другие вопросы, касающиеся перестроек внутри консервативных эволюционных сегментов, остаются открытыми. Являются ли определенные синтенные блоки менее склонными к внутрихромосомным перестройкам и сохраняются ли в течение эволюции? Случайным ли образом изменения внутри синтенных блоков распределены по всему геному? Здесь мы изучили только три консервативных аутосомных блока из 27 в AAK. Важно отметить, что среди 28 видов, включенных в анализ, мы не обнаружили каких-либо внутрихромосомных перегруппировок в трех тестируемых областях между некоторыми близкими видами, такими как Ellobius talpinus / E. tancrei или M. dogramacii / M. guentheri. Кроме того, эти две пары видов также не обнаруживают различий на цитогенетическом уровне между их Х-хромосомами [Bakloushinskaya et al., 2012; Lemskaya et al., 2010]. Этот результат может указывать на то, что эволюция в таксономически и кариотипически разнообразном таксоне Arvicolinae может

происходить за счет различных механизмов или затрагивать различные консервативные блоки.

В заключение хотелось бы подчеркнуть, что сравнительный вклад меж- и внутрихромосомных перестроек в формирование геномов все еще остается неясным. В целом результаты подтверждают гипотезу о том, что частота и важность внутрихромосомных перестроек, возможно, были значительно недооценены, особенно у некоторых видов [Hoffmann, Sgro, Weeks, 2004; Kirkpatrick, Barton, 2006; Romanenko et al., 2012]. К сожалению, различные подходы (биоинформатика, цитогенетика) часто дают противоречивые результаты о количестве и типах перестроек. В некоторых таксонах было показано, что внутрихромосомные перегруппировки более часты, чем межхромосомные перестройки [Capozzi et al., 2016; Fan et al., 2015; Proskuryakova et al., 2017]. Примечательно, что вклад внутрихромосомных перестроек был более значительным в быстро эволюционирующих группах. Здесь мы демонстрируем, что это характерно также и для полевок.

Ранее у приматов было показано, что некоторые хромосомные области неоднократно участвуют в перестройках [Ruiz-Herrera, Castresana, Robinson, 2006]. Также часто высказывалось предположение, что накопление мобильных элементов и сегментных дупликаций в точках разрывов, вероятно, коррелирует с перестройками [Capozzi et al., 2012]. Возможно, некоторые определенные последовательности также способствовали возникновению перестроек в геномах полевочьих. Результаты нашей работы подтверждают эту гипотезу, показывая, что, по-видимому, идентичные, независимые разделения и инверсии произошли в разных филогенетических ветвях. Однако отсутствие данных секвенирования и собранных до уровня хромосом геномов полевочьих не позволяет нам проверить эти выводы на уровне последовательностей ДНК. Тем не менее мы можем заключить, что знания о хромосомных перестройках важны для изучения разнообразия и эволюции таксонов полевок. Кроме того, можно предположить, что перестройки хромосом являются важным, возможно, доминирующим механизмом быстрой эволюции в этом таксоне.

4.4.10. Скорость кариотипической эволюции в подсемействе Arvicolinae

Количество хромосомных перестроек, происходящих в определенный эволюционный период, указывает на скорость эволюционной кариотипической реорганизации. Ранее было обнаружено, что скорость эволюции кариотипа сильно варьирует (в несколько раз) на филогенетическом древе млекопитающих [Veyrunes et al., 2006]. У грызунов средняя скорость эволюции кариотипа была определена как одно слияние/разделение на 1 млн лет [Schibler et al., 1998]. Arvicolinae относится к группе видов, характеризующейся еще более высоким темпом хромосомной реорганизации.

Согласно филогенетическим оценкам базальная радиация родов Dicrostonyx, Prometheomys, Ondatra и трибы Lemmini имела место 6,4, 6,8, 7,7 и 7,2 млн лет назад, соответственно, а время расхождения Arvicolinae/Cricetinae было рассчитано как 18,2 млн лет [Abramson et al., 2009b]. В течение 0,5 млн лет, прошедших от времени формирования AAK до отделения M. rutilus, произошла одна межхромосомная перестройка. AMiK образовался около 2,4 млн лет назад (при этом на эволюционном отрезке в 3,5 млн лет фиксации межхромосомных перестроек не наблюдалось) и LAK - около 1,8 млн лет назад. Скорость хромосомных перестроек в ветке, ведущей от AMiK к LAK, составляет примерно 5 перестроек на 1 млн лет.

Род Lasiopodomys демонстрирует повышенную скорость хромосомных перестроек по сравнению с другими грызунами: кариотип L. gregalis эволюционировал из предполагаемого LAK за счет одного деления и семи слияний, т. е., происходило более четырех хромосомных перестроек за млн лет. Предполагаемый общий предковый кариотип для подрода Lasiopodomys (sLAK) может быть сформирован из LAK путем пяти разделений и четырех слияний (Рисунок 59). Поскольку время расхождения L. brandtii и L. mandarinus неизвестно, мы можем только отметить, что скорость около 10 перестроек на млн лет характерна для эволюции видов подрода Lasiopodomys.

Несмотря на то, что неизвестно время расхождения видов внутри трибы Ellobini и рода Ellobius, 32 перестройки, характерные для кариотипа E. lutescens, указывают на то, что скорости хромосомной эволюции были крайне высоки и в

этой ветви. Для ветви, ведущей к A. oeconomus, также характерна высокая скорость (около 6 перестроек на млн лет) фиксации межхромосомных перестроек. Для других ветвей полевочьих эти показатели существенно ниже.

Очевидно, что скорость эволюции кариотипа варьирует в разных ветвях филогенетического дерева, а также внутри ветвей. Примечательно, что в кариотипах M. rossiaemeridionalis, M. guentheri и T. daghestanicus не было обнаружено специфических разделений и/или слияний предковых хромосом, но обнаружены внутрихромосомные пеерстройки, характерные для этих таксонов. Хотя в целом большее число внутрихромосомных перестроек в проанализированных сегментах было выявлено в кариотипах видов, характеризующихся и большим числом межхромосомных перестроек, например, Ellobius, Lasiopodomys.

Интересно, что повышенная частота перестроек хромосом у Lasiopodomys -не единственный показатель быстрых эволюционных геномных изменений. Ранее для L. gregalis была отмечена очень высокая частота мутаций в митохондриальном гене цитохрома b. Оцененная скорость оказалась на порядок выше, чем предыдущие оценки для полевок рода Microtus. Высокое генетическое разнообразие было обнаружено как внутри, так и между линиями узкочерепных полевок [Abramson et al., 2009b; Petrova et al., 2015].

В целом наши результаты показывают, что кариотипическая эволюция полевочьих сопровождалась как периодами активной фиксации перестроек, так и длительными периодами сохранения предковых форм кариотипов. В среднем скорости эволюции кариотипов полевочьих значительно превышают скорости, характерные для грызунов.

4.5. Предполагаемый предковый кариотип отряда Rodentia и обзор кариотипической эволюции в таксоне

Структура кариотипа предка грызунов (RAK) была предложена ранее (Рисунок 4) [Graphodatsky et al., 2008]. Считалось, что RAK имеет 2n=50, несет три фрагмента, гомологичных HSA3, и ассоциации HSA3/21, 4/8p, 7/16, 12/22, 14/15, 16/19, характерные для плацентарных [Ferguson-Smith, Trifonov, 2007].

Статус нескольких ассоциаций, например, HSA1q/10p, 3/19 и 9/11, оставался спорным.

Ассоциация HSA3/19 обнаружена у всех хищных, одного вида насекомоядных, а также у всех изученных видов Sciuridae и Anomaluromorpha. При этом она отсутствует у сонь рода Eliomys (Gliridae, Rodentia) [Sannier et al., 2011], речного бобра, морской свинки и мышеобразных грызунов. Следовательно, вопрос о ее присутствии в RAK до сих пор остается открытым. Аналогичная ситуация наблюдается и с ассоциациями HSA1q/10p и 9/11. Изначально они рассматривались как предковые для Glires, хотя и не были выявлены в кариотипе долгонога, а позже они также не были обнаружены в кариотипах садовых сонь [Sannier et al., 2011], речного бобра и морской свинки. При этом обе эти ассоциации присутствуют в кариотипе кролика, пищухи, мыши, крысы и всех белкообразных [Романенко и др., 2010; Korstanje et al., 1999; Li et al., 2004; Li et al., 2006a; Nilsson et al., 2001; Richard et al., 2003; Robinson, Yang, Harrison, 2002; Stanyon et al., 2003]. Такая картина может быть результатом конвергенции признака у отдельных зайцеобразных, беличьих и мышеобразных или может отражать утрату предкового признака в определенных ветвях древа.

Вопрос о числе фрагментов, гомологичных HSA3, может быть решен более определенно: совокупность данных по сравнению кариотипов грызунов и зайцеобразных с хромосомами человека, полученных в этой работе и другими коллективами [Korstanje et al., 1999; Li et al., 2004; Li et al., 2006a; Richard et al., 2003; Robinson, Yang, Harrison, 2002; Stanyon et al., 2003], все же указывает на то, что, вероятнее, что один сегмент входил в состав ассоциации HSA3а/21, а второй сегмент соответствовал остальной части хромосомы HSA3b. Следовательно, диплоидное число хромосом в RAK должно быть сокращено с 50 до 48 хромосом (Рисунок 62).

Рисунок 62. Предковые кариотипы: а - Glires (GAK, 2п=50) и б - Rodentia (RAK, 2п=48). Гомологии отдельных консервативных сегментов человеческим хромосомам обозначены 23 различными цветами и пронумерованы справа от каждой схемы.

В целом интеграция полученных результатов с ранее опубликованными данными позволяет предположить, что предковый кариотип Glires ^АК) состоял из 50 хромосом и содержал следующие синтенные ассоциации хромосом человека: ША1, 1/10, 2, 2, 3, 3/21, 4, 4/8, 5, 6, 7, 7/16, 8, 9/11, 10, 12а/22а, 12Ь/22Ь, 13, 14/15, 16/19, 17, 18, 19, 20 и X. При этом формирование КАК [Graphodatsky а а1., 2008] из GAK сопровождалось двумя событиями: инверсией в ассоциации ША4а/8р (получение ША8р/4а/8р) и слиянием ША3Ь+19р (Рисунок 62). Вопрос о присутствии ШАЦ/10р, 3/19 и 9/11 остается нерешенным. КАК был размещен у основания дерева, чтобы проследить его реорганизацию во время эволюции грызунов (Рисунок 63).

Рисунок 63. Кариотипическая эволюция в отряде Rodentia. Датировки для отдельных узлов указаны по данным ресурса TimeTree [TimeTree: the timescale of life]. AAK - предковый кариотип подсемейства Arvicolinae, ACnK - предковый кариотип подсемейства Cricetinae, AMK - предковый кариотип надсемейства Muroidea, AMdK - предковый кариотип семейства Muridae, AMnK - предковый кариотип подсемейства Murinae, ASK - предковый кариотип Sciuromorpha, ASdK - предковый кариотип семейства Sciuridae. Значения диплоидных чисел хромосом для отдельных узлов древа приведены в квадратах. «-» - разрыв, «+» - слияние. На древе отмечено только количество перестроек в каждой ветви относительно хромосом H. sapiens.

Молекулярные филогении не всегда универсальны, но большинство из них рассматривают Sciuromorpha в качестве базальной клады в пределах Rodentia [Blanga-Kanfi et al., 2009; Churakov et al., 2010; DeBry, 2003; Huchon et al., 2002; Murphy et al., 2001; Steppan, Adkins, Anderson, 2004]. Разрыв фрагмента HSA3b и слияние HSA8/4/8+12/22 являются перестройками, отличающими предковый кариотип Sciuromorpha (ASK, 2n=48) от RAK (Рисунок 63). К формированию вероятного кариотипа предка семейства Sciuridae (ASdK) с 2n=38 привело 5

дополнительных слияний: HSA1+8, 2+17, 7+22/12, 10+13, 14/15+20 [Beklemisheva et al., 2011; Graphodatsky et al., 2008; Li et al., 2004; Li et al., 2006a; Richard et al., 2003]. Формирование кариотипа сонь рода Eliomys из ASK сопровождалось 12 разрывами, 12 слияниями и минимум 1 инверсией [Sannier et al., 2011].

Подотряды Anomaluromorpha, Hystricomorpha, Myomorpha и Castorimorpha образуют единую кладу, основанную на присутствии ассоциации HSA1/7, утрате синтении HSA7/16 и разрывах HSA1, 4, 5, 6, 11 и 15 в кариотипах всех изученных представителей. К сожалению, отсутствие в базах данных информации по сборкам геномов до уровня хромосом для представителей всех подотрядов, кроме пары видов мышеобразных, не позволяет проверить идентичны ли точки разрывов в этих сегментах. Также существует вероятность того, что ассоциация HSA10/16 могла быть предковой для этой клады. Ассоциация HSA8/19, несмотря на то, что она была обнаружена у C. fiber и P. capensis, включала различные негомологичные фрагменты HSA8, поэтому не может считаться предковой для группы. Таким образом, можно предположить, что предковый кариотип подотрядов Anomaluromorpha, Hystricomorpha, Myomorpha и Castorimorpha имел 2n=60 (или 2n=62, если ассоциация HSA1/10 сходна у Myomorpha и Sciuromorpha) и содержал элементы, гомологичные HSA1, 1/7 , 1/10, 2, 2, 3, 3/19, 3/21, 4, 4, 4/8, 5, 5, 6, 6, 7, 8, 9/11, 10/16, 11, 12/22 (две), 13, 14/15, 15, 16/19, 17, 18, 20, X и Y (Рисунок 54).

Ряд перестроек указывает на близкие эволюционные отношения подотрядов Myomorpha и Castorimorpha: слияния HSA5+17 (отсутствует у Mus и Rattus по результатам сравнения последовательностей ДНК, но присутствует у Sicista по результатам FISH) и HSA11+15, разрыв HSA14/15 [Graphodatsky et al., 2008]. Возможно, что и разрыв HSA12, приведший к образованию трех фрагментов, гомологичных HSA12, в кариотипах бобра и мышовки [Graphodatsky et al., 2008], является характеристикой, объединяющей эти таксоны. Однозначного ответа в этом случае получить пока нельзя. Ранее отмечалось, что кариотип предка плацентарных содержит два фрагмента HSA12, в составе двух ассоциаций HSA12/22. Три же фрагмента, гомологичных HSA12, помимо кариотипов бобра и мышовки, были выявлены и у морской свинки, а также у

зайцеобразных - кролика [Korstanje et al., 1999] и пищухи [Романенко и др., 2010; Ye et al., 2011]. Из-за отсутствия молекулярных данных, позволяющих точно определять границы точек разрывов, не представляется возможным определить имеют ли данные фрагменты сходное эволюционное происхождение или нет. Схожая проблема возникает и при анализе выявленных ассоциаций, поскольку методы, использованные для анализа геномов мыши, крысы и мышовки обладают разной разрешающей способностью. Если опираться на данные молекулярных филогений, согласно которым Hystricomorpha находится в базальной позиции по отношению к кладе Anomaluromorpha + Myomorpha + Castorimorpha [Blanga-Kanfi et al., 2009; Churakov et al., 2010; Ferguson-Smith, Trifonov, 2007; Horn et al., 2011], то разрыв HSA12 на три фрагмента следует рассматривать как конвергентное событие, которое имело место независимо у Hystricomorpha, Myomorpha и Castorimorpha.

Морская свинка демонстрирует пример «катастрофической» реорганизации кариотипа: минимум 30 слияний, 32 разрыва, а также множественные инверсии отличают ее кариотип от кариотипа предка подотрядов Anomaluromorpha, Hystricomorpha, Myomorpha и Castorimorpha. Здесь также крайне важно напомнить, что ассоциация HSA4/8 в кариотипе морской свинки сформирована другими фрагментами, отличными от тех, что входят в подобную ассоциацию в кариотипе предка грызунов. При формировании кариотипа долгонога имели место 5 разрывов и 16 слияний (Рисунок 54). Формирование кариотипа современного бобра от узла древа, объединяющего Castorimorpha и Myomorpha, сопровождалось меньшим количеством перестроек: оно включало разрывы ассоциаций 1/7, 1/10, 3/19, 9/11, 16/19 и 11 слияний.

В пределах Myomorpha кариотип только одного вида (Sicista betulina) был исследован с использованием хромосомоспецифичных зондов человека [Graphodatsky et al., 2008]. Этот вид относится к Dipodoidea, надсемейству, представляющему базальную ветвь внутри Myomorpha [Jansa, Weksler, 2004; Steppan, Adkins, Anderson, 2004]. Два других вида (M musculus и R. norvegicus) сравнивали с человеком с использованием кардинально отличных подходов, т. е. на основе полных данных секвенирования генома. Поскольку разрешение методов

значительно различается, это исключает воссоздание структуры предкового кариотипа для Myomorpha, основываясь исключительно на гомологии хромосомам человека. Также не представляется пока возможным установить, есть ли какие-либо общие синтении, поддерживающие выделение подотряда Myomorpha на эволюционном древе.

Хотя кариотипы многих видов мышеобразных изучены с помощью набора сортинговых проб мыши, основные затруднения при анализе кариотипической эволюции в подотряде Myomorpha возникают по причине того, что для изучения разных таксонов все же используются различные наборы пэйнтинг-проб. Так, по совокупности всех данных невозможно сейчас определить, есть ли общие перестройки хромосом, характерные для ветви Deomyinae+Gerbillinae, поскольку для изучения песчанковых не использовались пробы мыши. Невозможность проведения полномасштабного сравнения кариотипов представителей этих подсемейств, а также практически полное отсутствие данных реципрокного сравнительного пэйнтинга, приводит к проблемам при реконструкции предковых кариотипов таксонов уровня семейства и подсемейства.

Хотя предковый кариотип подсемейства Murinae (ancestral Murinae karyotype, AMnK) был реконструирован ранее [Badenhorst, Dobigny, Robinson, 2012], авторами не были взяты в расчет данные по Micromys minutus [Nakamura et al., 2007], что, по-видимому, и привело к явному искажению результатов и схожести полученного кариотипа с кариотипом предка трибы Rattini [Badenhorst et al., 2011]. В соответствие с современными представлениями M. minutus также входит в трибу Rattini [Aghova et al., 2018; Lecompte et al., 2008]. На основании этого кажется более вероятным, что предковый кариотип трибы имел 2n=56 и состоял из следующих элементов: MMU1, 1, 2, 2/13, 3, 4, 5, 5, 5/6, 5/11, 7/19, 8, 8, 9, 10, 10/17, 10/17, 11/17/16, 12/17, 13, 13/15, 14, 14, 15, 16, 17/1/17, 18, X. В таком случае формирование кариотипа предка Rattini с 2n=46 (по [Badenhorst et al., 2011]) требовало разрывов предковых элементов MMU5, 17 и 18 и слияний 1+4, 2/13+18, 5+12/17, 5+18, 8+14, 10+17, 10/17+13, 10/17+15. В кариотипе же M. minutus произошли разрывы MMU2, 4, 6, 9 (два), 13, 16, разрывы ассоциаций 5/11 и 17/(11/16), слияния 6+13 и 1/17+13+12/17 (Рисунок 64).

Рисунок 64. Вероятная схема кариотипической эволюции в семействе Muridae. Структура древа соответствует [TimeTree: the timescale of life]. AMnK -предковый кариотип подсемейства Murinae. Значения диплоидных чисел хромосом для отдельных узлов древа приведены в квадратах. * - предковый кариотип Rattini с 2n=46 по данным Баденхорост с соавт. [Badenhorst et al., 2011]. «-» - разрыв, «+» - слияние. На древе отмечено количество перестроек в каждой ветви в хромосомах M. musculus.

Согласно принципам кладистики общий кариотип триб Arvicanthini+Otomyini+Millardini+Apodemini+Murini был схож с общим кариотипом триб Apodemini+Murini и имел 2n=48: MMU1, 2, 2/13, 3, 4, 5, 5/6, 5/11, 7/19, 8, 8, 9, 10, 10/17, 10/17, 11/17/16, 12/17, 13/15, 14, 15, 16, 17/1/17, 18, X. Формирование кариотипа предка рода Mus [Veyrunes et al., 2006] произошло в ходе разрывов ассоциаций 10/17, 11/17/16, 12/17, 17/1/17 и слияний фрагментов MMU10, 16, 17 (три), формирования ассоциации 1+4. Таким образов, в отличие от Бадерхорст с соавт. [Badenhorst et al., 2011] мы рассматриваем наличие ассоциации MMU1/4, как конвергентный признак, возникший независимо у представителей рода Mus и отдельных представителей трибы Rattini. При формировании кариотипа предка трибы Apodimini произошел разрыв ассоциации MMU2/13 и слияние двух фрагментов MMU2. В дальнейшем кариотип рода

Apodemus [Matsubara et al., 2004] возник в результате разрыва MMU18 и возникновения ассоциации MMU13+18, общий предок рода Tokudaia [Murata et al., 2012] - в результате слияния фрагментов MMU17 и разрыва ассоциации MMU17/(11/16) (Рисунок 64).

Кариотип общего предка триб Arvicanthini+Otomyini+Millardini сформировался за счет слияния двух фрагментов MMU17 и разрывов фрагментов MMU1, 9 и ассоциаций MMU5/6 и MMU17/(11/16), имел 2n=54 и содержал MMU1, 1, 2, 2/13, 3, 4, 5, 5, 5/11, 6, 7/19, 8, 8, 9, 10, 10/17, 10/17, 11/16, 12/17, 13/15, 14, 15, 16, 17/1/17, 18, X. В кариотипе Millarda meltada [Nakamura et al., 2007] произошли слияния MMU1, 1+13, 2, 9+(17/1/17/1)+14, 15, разрывы MMU16 (два) и ассоциаций 2/13 и 10/17. Ситуация с общим предком триб Arvicanthini+Otomyini не совсем ясна. Кариотипы двух видов, относимых к этим трибам, несут ассоциацию MMU10/17/19. Из-за отсутствия данных реципрокного пэйнтинга невозможно установить, сформирована ли она одинаковыми предковыми элементами или нет. В любом случае, формирование современных кариотипов представителей этих триб требовало более 20 слияний и разрывов.

Кажется вероятным, что AMnK имел 2n=48, как и предполагал Баденхорст с соавт. [Badenhorst, Dobigny, Robinson, 2012], однако, содержал иные фрагменты и ассоциации хромосом мыши: MMU1, 2, 2/13, 3, 4, 5, 5/6, 5/11, 7/19, 8, 8, 9, 10, 10/17, 10/17, 11/17/16, 12/17, 13/15, 14, 15, 16, 17/1/17, 18, X. Кариотип предка трибы Rattini возник за счет разрывов предковых элементов MMU1, 5, 13 и 14 (Рисунок 64). Реконструировать предковый кариотип всего семейства Muridae (ancestral Muridae karyotype, AMdK) не представляется возможным, хотя очень вероятно, что он имел в своем составе ассоциации MMU2/13, 5/11, 11/16 (или 11/17/16), 7/17, 10/17, 12/17, 13/15 и 17/1/17. Более того, анализ всех данных, накопленных по Muridae, поднимает вопрос о том, насколько точно определено количество элементов, гомологичных MMU17, в кариотипе каждого изученного вида? Вероятно, что ассоциация MMU11/16, обнаруженная у многих мышиных, представляет собой все же ассоциацию MMU11/17/16. Непонятно, идентичны ли ассоциации MMU10/17 в кариотипах разных видов. Для поиска ответов на эти

вопросы необходимы или данные реципрокного хромосомного пэйнтинга, или исследования кариотипов видов с помощью более точных инструментов.

Еще более сложна и запутана ситуация с представителями семейства Cricetidae. Хотя результаты реципрокных пэйнтингов между парами мышь/ золотистый хомяк и золотистый хомяк/темная полевка (^отапепко а1., 2006; Sitnikova а1., 2007] и данные настоящего исследования) позволяют выявить отдельные синапоморфии в кариотипах предков АтсоНпае и СпсеНпае, невозможность сопоставления с кариотипами представителей внешней группы из-за использования других наборов проб (в случае Sigmodontinae) или отсутствия данных реципрокного пэйнтинга и, соответственно, точного соответствия районов гомологии (в случае Neotomynae) практически исключает на данном этапе возможность реконструкции предковых кариотипов выше уровня подсемейства внутри Cricetidae. Можно лишь предположить, что общий кариотип подсемейств АтсоНпае и СпсеНпае содержал следующие элементы, гомологичные хромосомам золотистого хомячка и мыши: МАиК2=ММи7/17, МАШ14/16=ММШ/П, МАШ7=ММШ/13, МАШ3/11=ММШ8,

МАШП=ММШ3/15, МАШ4=ММШ/16, MAUR10=MMU11/17/16,

МАШ17/19=ММШ, МАШ5/9=ММШ/17, МАШ5=ММШ7/1Л0/17, МАШ8/10=ММШ2/17, MAUR14=MMU10/17. Вопрос о наличии или отсутствии других ассоциаций, а также о количестве фрагментов, входящих в состав предкового кариотипа, на данном этапе не может быть разрешен.

Таким образом, несмотря на наибольшую включенность грызунов (а среди них - представителей семейства Cricetidae), по сравнению с представителями других отрядов, в исследования по сравнительному хромосомному пэйнтингу, на древе сохраняется множество неразрешенных узлов кариотипических взаимоотношений, причем большинство из них находятся внутри подотряда Myomorpha и семейства Cricetidae.