Химическая характеристика и стандартизация полисахаридов Saussureasalicifolia L., Saussureacontroversa DC. и SaussureafroloviiLedeb., обладающих иммунотропной активностью тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Гулина Екатерина Игоревна

• Гулина Екатерина Игоревна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Гулина Екатерина Игоревна

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Фармакологическая активность и химическая структура полисахаридов растений рода Заияяитва

1.2. Перспективы использования полисахаридов в качестве иммунотропных средств

1.3 Способы получения и характеристики полисахаридов

1.4 Современные подходы в стандартизации ЛРС и фармацевтических

субстанций на основе полисахаридов

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение полисахаридного комплекса и исследование факторов, влияющих на процесс экстракции

2.2.2 Химический анализ полисахаридных комплексов

2.2.3 Стандартизации сырья

2.2.4 Исследование иммунотропной активности

2.3 Статистическая обработка

Глава 3. Характеристика ПСК Заияяитва яаИ^оЫа Ь., Заияяитва соМтоувтяа ЭС. и Заияяитва fтolovii ЬеёеЬ

3.1 Результаты изучения химического состава ПСК, полученных при разном рН, и их воздействия на пролиферацию и продукцию N0 перитонеальными макрофагами

3.2 Результаты изучения химического состава ПСК, полученных при разной температуре, и их воздействия на пролиферацию и продукцию N0

перитонеальными макрофагами

Глава 4. Оптимизация методики выделения полисахаридного комплекса из Заияяитва яаИ^оНа Ь. и его характеристика

Глава 5. Химическая структура фракций полисахаридов Заияяитва яаЫ^оНа и их

влияние на пролиферацию и продукцию N0 макрофагами

Глава 6. Разработка методик стандартизации растительного сырья и субстанции рамногалактогликана Заияяитва яаИ^оНа

6.1 Стандартизация травы Заияяитва яаИ^оНа (Ь.) ЭС

6.1.1 Морфолого-анатомическое исследование травы Заияяитва яаИ^оНа Ь

6.1.2 Разработка товароведческих показателей качества сырья

6.1.3 Разработка методик качественного и количественного определения полисахаридов

6.2 Стандартизация субстанции рамногалактогликана из травы соссюреи иволистной

6.2.1 Определение общих фармакопейных параметров качества субстанции по требованиям ГФ XV

6.2.2 Определения параметра «Подлинность»

6.2.3 Определение параметра «Посторонние примеси»

6.2.4 Разработка и валидация методики стандартизации по показателю

«Количественное определение»

Выводы

Список литературы

Приложение №

Приложение №

Приложение №

Приложение №

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Химическая характеристика и стандартизация полисахаридов Saussureasalicifolia L., Saussureacontroversa DC. и SaussureafroloviiLedeb., обладающих иммунотропной активностью»

Актуальность проблемы.

Нарушение работы иммунной системы, включающее аутоиммунные, хронические, вялотекущие инфекционные и онкологические заболевания, зачастую связаны с недостаточностью ТШ-зависимого типа иммунного ответа и на сегодняшний день стали распространенной патологией [1]. Для избирательного действия на пораженное звено иммунной системы используют лекарственные препараты, мишенью для которых являются макрофаги [2]. Несмотря на развитие комбинаторного синтеза и привлечения искусственного интеллекта для конструирования новых лекарственных препаратов, растительные препараты по-прежнему имеют широкий спектр применения, поскольку они обладают меньшим числом побочных эффектов, нетоксичны и биосовместимы [3,4].

В ходе многочисленных исследований биологической активности полисахаридов (ПС) установлено, что для данной группы присущ разнообразный спектр действия, среди которого особое внимание привлекает воздействие на иммунную систему [4-9]. Механизм этого действия заключается в способности ПС непосредственно взаимодействовать с макрофагами, посредством связывания с рецепторами, в результате чего происходит стимуляция или подавление Т^-зависимого иммунного ответа, усиление фагоцитарной и цитотоксической активности, продукция активных форм кислорода и N0, секреция цитокинов (фактор некроза опухолей-а (ФНО-а), интерлейкин-1р (ИЛ-1Р), ИЛ-6, ИЛ-12, ИЛ-10 и т. д.) [10,11].

Установлено [12-15], что активность полисахаридов зависит от состава, структуры и содержания примесей, которые определяются способом выделения и очистки.

Перспективными источниками растительных ПС, обладающих иммунотропной активностью, являются представители рода Заияяитва ЭС., а именно 8 яаЫ^оНа, Б. соМтоувтяа и 8./то1оуИ [16].

Наряду с выраженной специфической активностью, ПС обладают низкой аллергенностью, мутагенностью, общей и специфической токсичностью и редкими

побочными эффектами, что делает разработку новых высокоэффективных и безопасных иммунотропных лекарственных средств на основе ПС перспективной и востребованной [8,10,17].

Степень разработанности темы исследования.

Полисахариды, выделенные из представителей семейства Астровые (Asteraceae), в том числе из рода соссюрея (Saussurea DC.), проявляют разнообразные фармакологические эффекты (гиполипидемический, противовоспалительный, иммуностимулирующий и противоопухолевый) [5,18— 23]. Проведенные ранее скриннинговые исследования [24] химического состава Сибирских представителей рода соссюрея выявили, что виды Saussurea salicifolia L. (соссюрея иволистная, SS), Saussurea controversa DC. (соссюрея спорная, SC) и Saussurea frolovii Ledeb. (соссюрея Фролова, SF) отличались высоким содержанием водорастворимых полисахаридов, обладающих разной степенью иммунотропной активности [16]. Однако, в настоящее время отсутствует нормативная документация, регламентирующая качество растительного сырья и субстанций на основе полисахаридов, выделенных из растений рода соссюрея.

Цель: на основании результатов сравнительного химико-фармакологического исследования полисахаридов растений рода Saussurea предложить способ выделения водоростворимых полисахаридов, обладающих выраженным активирующим влиянием на NO-продуцирующую активность перитонеальных макрофагов, установить параметры структуры и разработать методики их стандартизации.

Задачи:

1. Выделить полисахаридные комплексы из исследуемых растений рода Saussurea при различных условиях и охарактеризовать их химическую структуру;

2. Провести сравнительное исследование влияния способа выделения полисахаридных комплексов на пролиферацию и NO-продуцирующую активность перитонеальных макрофагов мышей in vitro;

3. На основании проведенного исследования выбрать перспективный объект и определить оптимальные условия его выделения;

4. Установить параметры структуры и влияние на пролиферацию и NO-продуцирующую активность перитонеальных макрофагов индивидуальных полисахаридов травы соссюреи иволистной;

5. Разработать методики контроля качества и определить параметры стандартизации растительного сырья и фармацевтической субстанции.

Научная новизна.

1. Впервые выделены при разных условиях и охарактеризованы полисахаридные комплексы Saussurea salicifolia, Saussurea controversa и Saussurea frolovii;

2. Впервые проведено сравнительное исследование влияния условий экстракции на физико-химические параметры полисахаридных комплексов и их воздействия на пролиферацию и NO-продуцирующую активность перитонеальных макрофагов in vitro;

3. Определено влияние параметров выделения на выход полисахаридного комплекса травы SS;

4. Впервые проведено фракционирование, установлен состав индивидуальных полисахаридов травы Saussurea salicifolia и их влияние на пролиферацию и NO-продуцирующую активность перитонеальных макрофагов.

Значимость результатов исследования.

Данные, полученные при изучении химической структуры и влияния полисахаридных комплексов Saussurea salicifolia на пролиферацию и NO-продуцирующую активность перитонеальных макрофагов, составляют основу для дальнейших разработок новых терапевтических средств применимых при заболеваниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа.

Установлены диагностические признаки и числовые показатели качества для стандартизации травы соссюреи иволистной. Разработана и валидирована гравиметрическая методика определения полисахаридов в траве соссюреи иволистной. Полученные данные вошли в проект ФС «Соссюреи иволистной трава». Для субстанции ПСК соссюреи иволистной определены числовые

показатели качества, разработаны и валидированы спектрофотометрические методики с использование фенола и 3,5-диметиофенола, которые вошли в проект нормативной документации на субстанцию рамногалактогликана из травы соссюреи иволистной (Баияяитва яаИС/оИа Ь.).

Представленные в диссертационной работе теоретические положения и практические результаты применяются в учебном процессе кафедры фармацевтического анализа и химии ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 3.4.2 - фармацевтическая химия, фармакогнозия. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, а именно пунктам 2, 3, 6 паспорта специальности.

Положения, выносимые на защиту.

1. Характеристика химического состава полисахаридных комплексов, выделенных при разных условиях экстракции (рН и температура), из Заияяитва яаИ^оЫа, Заияяитва еоМтоувтяа и Заияяитва fтolovii;

2. Результаты скринингового исследования влияния полисахаридных комплексов, выделенных из Заияяитва яаИ^оНа, Заияяитва еоМтоувтяа и Заияяитва fтolovii, на пролиферацию и N0-продуцирующую активность перитонеальных макрофагов;

3. Результаты оптимизации методики выделения полисахаридного комплекса из травы Заияяитва яаИ^оНа Ь.;

4. Результаты изучения химической структуры фракций полисахаридного комплекса Ж и их влияние на пролиферацию и N0-продуцирующую активность перитоненальных макрофагов;

5. Результаты определения параметров стандартизации, разработки и валидации гравиметрической методики количественного определения ПСК травы Заияяитва яаЫ^оНа и спектрофотометрических методик определения субстанции ПСК Заияяитва яаИ^оНа для внесения в проекты ФС «Соссюреи иволистной

трава» и НД на субстанцию рамногалактогликана из травы соссюреи иволистной (8ашяитва яаИ^оНа Ь.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах из перечня ВАК, 7 тезисов докладов на международных и всероссийских конференциях.

Личный вклад автора. Каждый этап диссертационного исследования проводился при непосредственном участии автора, а именно составление литературного обзора, планирование дизайна экспериментов, выбор материалов и методов исследования, заготовка сырья, проведение экспериментальных работ, получение, обработка, систематизация данных и обсуждение результатов работы. Автор принимал участие в написании и оформлении материалов докладов, тезисов, рукописей статей для публикации, взаимодействии с редакциями и научными базами, выступал с результатами работы на конференциях всероссийского и международного уровней.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 144 страницах компьютерного текста, содержит 23 таблицы и 26 рисунков. Структура диссертационной работы включает введение, 6 глав с выводами к ним, общее заключение, список сокращений, список литературы, содержащий 154 наименования, и 4 приложения.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Фармакологическая активность и химическая структура полисахаридов растений рода Saussurea

Род Saussurea DC. (соссюрея) - это космополитный и многочисленный род, принадлежащий к семейству Asteraceae (Сложноцветные) [25,26]. Его видовая численность превышает 450 наименований, распространенных главным образом, в Азии [27]. Установлено, что центральная Азия и Дальний восток России являются ареалом произрастания порядка 150 видов [27], около100 видов произрастают в восточной Азии [27], более 60 видов на территории Индии [28], более 300 видов на территории Китая [29]. Представители рода соссюрея встречаются на территории Монголии, в Европе и Северной Америке [26,30]. Растения рода Saussurea широко используются в традиционной народной Китайской и Тибетской медицине, народной медицине Дальнего востока, Сибири, Бурятии и Монголии [24,26]. Помимо этого, некоторые представители внесены в официнальные издания, например, S. involucrate представлена в Китайской фармакопее [32], S. costus (синоним S. lappa) - в Американской травяной фармакопее [33]. Наиболее изученными представителями данного рода являются S. involucrata, S. costus (синоним S. lappa), S. medusa, S. laniceps, S. gossypiphora, S. tridactyla, S. nivea, S. petrovii, S. polycolea, и S. stella [24,26,28-32]. В таблице 1 представлены виды активности и проявляющие ее группы БАВ, обнаруженные в растениях рода Saussurea.

Таблица 1 - Активность БАВ, выделенных из растений рода Saussurea

Вид активности Растение Группа БАВ Ссылка

Адаптогенная S. involucrata Полисахариды [32]

Антибактериальная S. oligantha Тритерпены [26]

S. petrovii Сесквитерпеновые лактоны [26]

Антивирусная S. laniceps Полисахариды [23]

Антидепрессивная S. costus Сесквитерпеновые лактоны, эфирные масла [29]

Антимеланогенная S. involucrata Полисахариды [34]

Антимикробная S. lappa Этанольный экстракт [29]

Вид активности Растение Группа БАВ Ссылка

& сояШ Водный и этанольный экстракт [35]

Антимикробная и остеогенная Б. соМтоувтяа Полисахариды, фенолы [36]

Антимикробная и противогрибковая Б. сояШ Флавоноидные глкикозиды [26]

Антиоксидантная Б. туо1ист^а Полисахариды [36]

Б. 1атсеря Полисахариды [14]

- Сесквитерпеновые лактоны [29]

Антиоксидантная и антивозрастная Б. туо1ист^а Полисахариды и фенолы, флавоноиды [32]

Антипаразитическая Б. сояШ Отвар, Метанольный экстракт [29]

Антиструвитная Б. сояШ Водный и этанольный экстракт [35]

Влияние на систему комплимента Б. сояШ Полисахариды [38]

Б. туо1ист^а Полисахариды [30]

Гепатопротекторная Б. сояШ Сесквитерпеновые лактоны [29]

Гипогликемическая Б. сояШ н/д [29]

Б. шеёша н/д [29]

Гиполипидемическая Б. сояШ Водный экстракт [29]

Защита от ультрафиолета Б. Мёа^Ш Полисахариды, флавоноиды [39,40]

Б. туо1ист^а Полисахариды [41]

Иммуномодуляторная Б. сояШ Сесквитерпеновые лактоны [42]

Б. туо1ист^а Этанольный экстракт, флавоноиды, [32]

Иммуносупрессивная Б. сояШ Сесквитерпеновые лактоны [29]

Б. 1атсеря Сесквитерпеновые лактоны [26]

Б. шеёша Лигнаны [26]

Иммунотропная Б. соМтоуетяа Полисахариды [16]

Б. яаНа/оНа Полисахариды [16]

Б. ].То1оуИ Полисахариды [16]

Инсектицидная Б. сояШ Эфирное масло [29]

Метаболическое средство (Ингибирование тирозин фосфатазы 1В) Б. сояШ Тритерпены [26]

Нейропротекторная Б. шеёша Фенольное производное [26]

Нейропротекторная и антигипоксическая Б. туо1ист^а Этанольный экстракт и экстракт петролейным эфиром [32]

Противоаллергическая Б. сояШ Сесквитерпеновые лактоны [29]

Противовоспалительная Б. сотса Лигнаны [26]

Б. сояШ Сесквитерпеновые лактоны [29]

Водный и этанольный экстракт [35]

Б. involucтata Этанольный экстракт, флавоноиды [32]

Метанольный экстракт [43]

Полисахариды [34]

Противогрибковая Б. сояШ Конъюгаты из хитозана и этанольного экстракта [44]

Противораковая/ противоопухолевая Б. caulopteтa Сесквитерпеновые лактоны [26]

Б. сояШ Стероиды, Сесквитерпеновые лактоны [26,29]

Б. involucтata Этанольный экстракт и этилацетатная фракция (флавоноиды), Сесквитерпеновые лактоны [32]

Б. шеёша Лигнаны [26]

Б. ратАота Сесквитерпеновые лактоны [26]

Вид активности Растение Группа БАВ Ссылка

X petrovii Сесквитерпеновые лактоны [26]

S. stella Стероиды [26]

Противоязвенная S. pulchella Этанольный экстракт [45]

Противоязвенная и желчегонная S. costus Ацетоновый экстракт, сесквитерпеновые лактоны [26,29]

Регуляторы роста растений S. costus Сесквитерпеновые лактоны [26]

Спазмолитическая S. costus Алкалоидная фракция [29]

Согласно данным, приведенным в таблице 1, большое число исследований БАВ растений рода Saussurea посвящено изучению группы сесквитерпеновых лактонов или суммарным извлечениям. Говоря про группу полисахаридов, выделенных из растений рода Saussurea, необходимо отметить, что ее представители проявляют разнообразную активность. Наиболее изученными являются полисахариды & involucrata, для которых установлено наличие адаптогенной, антимеланогенной, антиоксидантной, антивозрастной, противовоспалительной активности, также полисахариды оказывают влияние на систему комплемента и обладают протекторными свойствами против ультрафиолетового излучения. Полисахариды, выделенные из & controversa обладают антимикробной, остеогенной и иммунотропной активностью, & laniceps - антивирусной и антиоксидантной, & costus - оказывают влияние на систему комплимента, & tridactyla - проявляют защитные свойства от ультрафиолета, а & frolovii и & salicifolia - обладают иммунотропной активностью.

Несмотря на возрастающее количество исследований, связанных с изучением структуры и активности представителей рода Saussurea, сведения о полисахаридах все еще носят неполный характер. На сегодняшний момент проведены исследования состава и активности полисахаридов, выделенных из & costus, S. tridactyla, S. laniceps, S. involucrata, S. controversa, S. salicifolia, S. frolovii. Данные по изученным видам активности, способу выделения полисахаридов, методах исследования и химической характеристики представлены в таблице 2:

Таблица 2 - Сведения о полисахаридах, выделенных из растений рода Saussurea

я <и е Химическая характеристика Вид активности

Источник ^ (Л о а « 8 £ Выделенны вещества Выход, % % >У о УК, % Белок, % ММ, кДа Моносахари дный состав Структура Методы исследовани Ссылка

Экстрагент вода, 6070 °С Инулин н/д н/д н/д н/д н/д н/д + Иммуностим улирующая, не влиял на фагоцитирую щую активность гранулоцитов и макрофагов Оптическое вращение, ИК, ТСХ, 13С ЯМР, содержание фруктозы [46]

1 Корни & са'Ш Предварительная очистка водой и этиловым спиртом, экстрагент вода очищенная, 100°С APS-W1 2,77 н/д н/д н/д 3,9 Man:glu 1:1 + Активирует систему комплимента по классическом у и альтернативн ому пути; Антикоагуля нтный эффект Молекулярно- массовое распределение; моносахаридный состав, ^ ЯМР [47]

2 Б. Мёа^1а Предварительная очистка этиловым спиртом, экстрагент вода очищенная, 85°С Полисах ариды н/д н/д н/д н/д н/д н/д н/д Защита от ультрафиолет а н/д [39] [40]

я <и е Химическая характеристика Вид активности

£ Источник ^ Е? о а « « « о ч с Выделенны вещества Выход, % 0х >У о УК, % Белок, % ММ, кДа Моносахари дный состав Структура Методы исследовани Ссылка

Последовательная экстракция: 1. Водой очищенной (95°С) Водорас творимы е полисах ариды 6,0 н/д н/д н/д н/д L-Arab, D- gal, D-glu н/д н/д

Надземная часть S. 2. Водой очищенной подкисленной до рН=4 (50°С) Кислые полисах ариды 1,3 н/д н/д н/д н/д L-Arab, D- gal, D-glu н/д н/д Определение общих углеводов (антрон-серный), моносахаридный [48]

3 controversa состав (БХ)

3. 0,7% раствором оксалата аммония (70° С) Пектино вые веществ а 16,0 н/д н/д н/д н/д L-Arab, D-galA н/д н/д

Листья S. controversa Водный остаток после экстракции флавоноидов PS-SC 4,8 н/д 6,71± 0,25 16,15 ±0,48 108,6 gal, ara, xyl, glc, uronic acids, man, rha 10.1:3.3:2.2:2.1:1. 7:0.9:0.5 н/д Антибактери альная и остеогенная Примесь белка (метод Лоури с предварительным осаждением), уроновые кислоты (3,5-диметилфенол-серный метод), [36]

я <и (D Химическая характеристика « т

£ Источник ^ Е? о а « « « о ч с Выделенны вещества Выход, % 0х >У о УК, % Белок, % ММ, кДа Моносахари дный состав Структура о н в и |Н а В Методы исследовани Ссылка

молекулярно- массовое распределение (ВЭЖХ); моносахаридный состав (ГЖХ, ацетилирование)

1. Предварительная очистка хлороформом, этилацетатом и этиловым спиртом, последовательная экстракция водой очищенной при 25°С и 70°С ПС1 н/д н/д 59,54 ±0,35 Не обна руже но н/д rha 1,65%, ara 12,47%, xyl 2,32%, man 0,67%, glc 1,74%, gal 21,60% н/д

3 Листья S. controversa ПС2 н/д н/д 64,20 ±0,59 26,22 ±0,28 н/д rha 0,28%, ara 1,87%, xyl 0,74%, man 2,43%, glc 9,28%, gal 34,62% н/д Усиливают продукцию да макрофагами Примесь белка (метод Лоури), уроновые кислоты (карбазол-серный), моносахаридный состав (ГЖХ, ацетилирование) [49]

rha 0,48%, ara

2. Экстракция 40% спиртом этиловым ПСэ н/д н/д 6,71± 0,09 16,15 ±0,28 н/д 4,85%, xyl 0,16%, man 0,24%, glc 0,88%, gal 6,57% н/д

я <и е Химическая характеристика « т

£ Источник ^ Е? о а « « « о ч с Выделенны вещества Выход, % 0х >у о УК, % Белок, % ММ, кДа Моносахари дный состав Структура о н в и ^ В Методы исследовани Ссылка

Листья S. controversa 3. Экстракция водой очищенной, подкисленной до рН=2-3 ПС4 н/д н/д 4,81± 0,09 2,88± 0,08 н/д rha 0,55%, ara 4,59%, xyl 0,64%, man 1,58%, glc 1,90%, gal 6,80% н/д Усиливают продукцию N0 макрофагами Примесь белка (метод Лоури), уроновые кислоты (карбазол-серный), моносахаридный состав (ГЖХ, ацетилирование) [49]

3 Надземная часть S. controversa Предварительная очистка хлороформом, этилацетатом и этанолом. Последовательная экстракция водой очищенной при 25 и 70°С ПС1 1,93± 0,35 н/д 59,54 ±0,35 Не обна руже но 448,1 Rha:ara:xyl:man: glc:gal 1,65:12,47:2,32:0, 67:1,74:21,6 н/д Усиливают продукцию N0 макрофагами Примесь белка (метод Лоури с предварительным осаждением),уроновы е кислоты (3,5-диметилфенол), молекулярно- массовое распределение (ВЭЖХ), моносахаридный состав (ГЖХ, ацетилирование) [16]

ПС2 0,74± 0,16 н/д 64,2± 0,59 26,22 ±0,68 101,82 Rha:ara:xyl:man: glc:gal 0,28:1,87:0,74:1,6 7:0,83:4,18

w s и F о н о

53

и

<D

О

а «

s «

о

ч о

S s

и н

(D О

ч а

а Э

Ч (D

Я «

m

Химическая характеристика

0х ч

О

х

m

>У о

0х w

О

ч

е

W

а к

S И

ра

ар т

хс

S 8

§ 1 о Ö

2 ч

а р

& S

и т с

о

и «

и т

m

-а

Ч о т е

Цветы

S. laniceps

Предварительная очистка этиловым спиртом, экстрагент вода очищенная 90°С, очистка от белка (метод Севага). Разделение на DEAE-Sepharose, очистка Sephadex в-150

SLT-3

н/д

95,8± 2,5

51,8

Не обна руже но

10,113

Man, rha, glucA, galA, glc, gal, xyl, ara

0.25:0.53:0.19:15. 35:0.51:1.10:0.63: 1.73

н/д

SLT-4

н/д

96,5± 1,9

59,6

Не обна руже но

12,392

Man, rha, glucA, galA, glc, gal, xyl, ara

0.92:5.61:0.93:19. 50:2.42:5.27:3.01

н/д

Антиоксидан

тная активность, ингибирован ие

образования внутриклеточ

ных АФК, предотвраща ющий AAPH-индуцирован ный гемолиз

Содержание общих углеводов (фенол-серный); примесь белка; молекулярно-

массовое распределение

(ВЭЖХ); моносахаридный состав (ВЭЖХ), ИК

Цветы

S. laniceps

Предварительная очистка этиловым спиртом и ацетоном, экстрагент вода очищенная 90°С, очистка от белка (метод Севага). Разделение на DEAE-Sepharose. Очистка Sephadex в-150

SLP-4

н/д

96,6

н/д

н/д

19,681

Man, rha, galA, glc, gal, xyl, ara 0,825:2,030:14,99 8:0,841:8,260:4,0 39:6,009

Антивирусна я активность

Содержание общих углеводов (фенол-серный); молекулярно-

массовое распределение

(ВЭЖХ); моносахаридный состав, третичная структура, установление структуры, ИК, метилирование, ГХ-

МС, частичный кислотный гидролиз, ЯМР ('H NMR, 13C

4

+

я <и е Химическая характеристика я т

£ Источник ^ Р? о я « я « о ч о ^ Выделенны вещества Выход, % % >у о УК, % Белок, % ММ, кДа Моносахари дный состав Структура о н в и g ä В Методы исследовани Ссылка

NMR, 1H1H COSY, NOESY, HSQC and HMBC)

Ara:rha:fuc:xyl:m an:gal:glc:glcA:ga lA

5 Надземная часть S. involucrata Предварительная очистка смесью бензол:метанол (2:1), экстрагент вода очищенная 50°С,100°С 50 °C N 50 °C Ac 100 °C N 100 °C н/д н/д н/д н/д 15,5 17,5 17,3 61,0 1) 47,7:1,9:-:5:1:15,6:28,8:-:- 2) 8,1:5,9:-:5,3:2:13,8:12,5:- :52,4 3) 59,3:0,9:-:1,8:14,5:3:20,5:- 4) 10:3:-:7,2:1,4:12:3,8:-:62,6 + Активируют систему комплимента Моносахаридный состав, молекулярно-массовое распределение, порядок связей (ГХ-МС) [30]

S. involucrata Предварительная обработка петролейным эфиром (1:10), 90 % этанолом (1:10). Оптимизация экстракции. Разделение БЕАЕ-650М, очистка 8ерИааех в-150 SIP-1 SIP-2 SIP-3 н/д н/д н/д н/д 5,39 0,2357 0,4823 Rha:ara:xyl:man: glc:gal 1) 12,65:13,04:2,55: 10,69:30,43:29,64 2) 20,77:20,72:4,62: 7,61:8,80:37,47 3) 24,08:6,40:2,81:1 1,62:22,36:32,73 + Противовосп алительная активность Моносахаридный состав, молекулярно- массовое распределение, ИК, частичный кислотный гидролиз, периодатное окисление, метилирование, ЯМР (1H NMR, 13C NMR, HSQC, HMBC, COSY, TOCSY, NOESY), пространственная структура [34]

я <и е Химическая характеристика « т

£ Источник ^ Е? о а я « « о ч с Выделенны вещества Выход, % % о УК, % Белок, % ММ, кДа Моносахари дный состав Структура о н в и |Н а В Методы исследовани Ссылка

Надземная часть 5". ••аИс/оНа ПС1 1,17± 0,31 н/д 21,23 ±0,71 Не обна руже но 158,49 КИа:ага:ху1:шап: 5,86:21,76:4,79:2, 43:9,28:34,62 Примесь белка (метод Лоури с

6 Предварительная очистка хлороформом, этилацетатом и этанолом. Последовательная экстракция водой очищенной при 25 и 70°С. ПС2 0,61± 0,18 н/д 39,16 ±0,83 2,22± 0,22 94,6 1,67:10,02:6,85:2, 83:6,68:30,56 н/д Усиливают продукцию N0 макрофагами предварительным осаждением), уроновые кислоты (3,5-диметилфенол), молекулярно- массовое распределение (ВЭЖХ), моносахаридный состав (ГЖХ, ацетилирование) [16]

7 Надземная часть 5. /го1оуИ ПС1 1,44± 0,27 н/д 52,39 ±0,61 Не обна руже но 64,03 КИа:ага:ху1:шап: я1е:яа1 2,53:16,95:3,94:0, 73:3,49:19,97

ПС2 0,66± 0,11 н/д 27,61 ±0,47 18,41 ±0,65 225,42 2,43:16,95:3,33:1, 38:10,03:19,84

Исходя из данных приведенных выше, наиболее применяемыми методами для исследования полисахаридов, выделенных из растений рода Saussurea, являются: определение мономерного состава и характеристика молекулярно-массового распределения. Реже используется ЯМР- и ИК-спектроскопия, а также определение общих и кислых сахаров спектрофотометрическими методами. Менее распространены методы установления пространственной структуры, проведение кислотного гидролиза, метелирования, периодатного окисления и установления порядка связей.

Помимо данных, приведенных в таблице 2, также известно о наличии водорастворимых полисахаридов (экстрагент - вода очищенная, 80°С), кислых полисахаридов (экстрагент - вода очищенная, подкисленная до рН=4, 70°С) и пектиновых веществ (экстрагент - 0,7% раствор оксалата аммония, 70°С) выделенных из семи сибирских видов растений рода соссюрея: S. parviflora (Poir.) DC., S. latifolia Ledeb., S. amara (L.) DC., S. frolovii Ledeb. S. daurica Adams., S. salicifolia (L.) DC. и S. controversa DC. [24].

Несмотря на широкую распространенность растений рода Saussurea на территории Сибири и ведущиеся исследования состава и активности, ни один из видов не является официнальным. Разными исследователями выделены представители группы полисахаридов из растений рода Saussurea, однако не изучено влияние параметров экстракции на состав и структуру, которые, как известно, влияют на биологическую активность [13]. В связи с этим вызывают интерес для дальнейшего изучения виды Saussurea salicifolia, S. controversa и S. frolovii, которые, по литературным данным, содержали наибольшее количество полисахаридов, среди 7 сибирских видов Saussurea [50] и в эксперименте in vitro проявили эндотоксин-независимую иммунотропную активность [16].

1.2. Перспективы использования полисахаридов в качестве иммунотропных средств

Первой линией защиты при внешнем воздействии на организм антигенов таких как бактерии или вирусы, или внутренних изменениях микросреды, вызванных, например, ишемией, некрозом или апоптозом, являются макрофаги [51]. Кроме этого известно, что они вносят существенный вклад в инициацию воспалительного процесса и развитие заболеваний хронического, аутоиммунного и онкологического генеза [52]. Макрофаги при активации могут принимать разные типы фенотипической и функциональной поляризации [51]. От типа поляризации зависит дальнейшее развитие специфического иммунного ответа и активация клеток (ТИ1, ТИ2, ТИ17 и Тге§), отвечающих за протекание патологического процесса и воспалительной реакции, системный метаболизм, гематопоэз, васкулогенез, тканевой гомеостаз [53,54].

Чаще всего выделяют два фенотипа макрофагов: М1 и М2. М1 -провоспалительные или классически активированные макрофаги - продуцируют провоспалительные цитокины (фактор нектороза опухоли-а, интерлейкины (ИЛ)-1Р, 6, 12, 23). К их функциям относят фагоцитоз, индукцию воспаления, противоопухолевую и микробицидную активность. Активация М1 происходит посредством стимуляции цитокинами ТИ1 - ИНФ-у или совместно ИНФ-у с ЛПС и ФНО-а с помощью экспрессии факторов транскрипции (например, ядерного фактора-кВ). В результате чего происходит усиление в М1 активности циклооксигеназы и индуцибельной NO-синтазы. М2 - противовоспалительные или альтернативно активированные макрофаги - обладают иммунорегуляторными свойствами, продуцируют противовоспалительные цитокины (интерлейкин-10) и трансформирующий фактор роста-Р, антагонист рецептора ИЛ-1 (ИЛ-1Яа), и экспрессируют печеночную аргиназу. Помимо подавления воспаления, они способствуют восстановлению и ремоделированию тканей, гомеостазу и васкулогенезу [52,55-58]. Изначально макрофаги находятся в состоянии фенотипа М1. При длительном инфекционном или воспалительном воздействии возможно

возникновение хронического воспаления, дальнейшее повреждение тканей и дисфункция органов, в данных условиях для подавления воспаления необходима активация М2 [51,56]. Таким образом, при воспалительном или травмирующем воздействии очень важен баланс М1 и М2, который определяет дальнейшую судьбу органа.

Однако, имеются данные о том, что макрофаги могут проявлять свойства, характерные как для классически (М1), так и для альтернативно активированных (М2) фенотипов. Например, при изучении кожных ран установлена продукция макрофагами цитокинов ФНО-а и ИЛ-12, характерных для фенотипа М1, и ИЛ-10, CD206, CD163, CD36 и рецепторов к ИЛ-4 типичных для М2 макрофагов. На модели обратимого фиброза и в ткани печени человека при циррозе обнаружен тип макрофагов с выраженной фибринолитической активностью. В изучаемых макрофагах экспрессируются гены аргиназы 1, маннозных рецепторов и IGF. Они продуцируют ММП-9, ММП-12, проявляют выраженную способность к пролиферации и фагоцитозу, однако не синтезируют ИЛ-10, ИЛ-1га, ФРО-р. Кроме этого проводились исследования, посвящённые изучению макрофагов при инфицировании микобактериями селезенки мышей. Установлено торможение пролиферации Т-лимфоцитов и секрецию ими Th1 и Th2 цитокинов, стимулирующее поляризацию в Th17 направлении. Супрессивные макрофаги способны экспрессировать гены активные в М1 макрофагах - ИЛ-12, ИЛ-1Р, ИЛ-6, ФНО-а, iNOS и одновременно гены CD163, ИЛ-10, маннозных рецепторов и других маркеров М2 макрофагов [59]. Таким образом, существование двух четко различимых популяций ставится под сомнение. Кроме этого, известно, что макрофаги обладают фенотипической пластичностью, в результате которой возможна реполяризация из одного типа в другой [53,60]. Именно это свойство делает макрофаги мишень для регуляции баланса Th1/Th2 [61]. Суммируя вышесказанное можно сделать вывод, что в основе контроля за воспалительным процессом и восстановлением функции поврежденного органа лежат макрофагальные клетки, тип их поляризации и взаимосвязь между про- и противовоспалительным ответом [62].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гулина Екатерина Игоревна, 2023 год

На №

АКТ

внедрения в учебный процесс кафедры химии результатов диссертационной работы Гулиной Екатерины Игоревны на тему «Химическая характеристика и стандартизация полисахаридов Saussurea salicifolia L., Saussurea controversa DC. и Saussurea frolovii Ledeb., обладающих иммунотропной активностью», представленной на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук по специальности 3.4.2 - фармацевтическая химия, фармакогнозия.

Мы, нижеподписавшиеся, комиссия в составе: председателя - заведующего кафедрой, д-ра фармацевт, наук, доцента Зыковой M.B. и членов: доцента, канд. хим. наук Голубиной O.A., доцента, канд. фармацевт, наук Логвиновой Л.А. удостоверяем, что результаты диссертационной работы Гулиной Е.И. внедрены в учебный процесс кафедры химии в раздел «Биологически активные органические соединения» (по дисциплине органическая химия, 1 курс фармацевтического факультета), в разделы дисциплины «Физико-химические методы анализа» (3 курс медико-биологического факультета, медицинская биохимия), в раздел «Биологически активные соединения» (по дисциплине химия, 1 курс лечебного факультета) с 2023 г (протокол № 7 от 23.06.2023). Получены новые данные и методики, касающиеся исследования природных полисахаридов современными методами физико-химического анализа (спектрального, хроматографического).

Председатель

Члены комиссии

Jtax

M.B. Зыкова

O.A. Голубина

Л.А. Логвинова