Характеристика спектра молекулярной патологии при ретинобластоме и разработка ДНК-диагностического протокола тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Бабенко, Ольга Владимировна

• Бабенко, Ольга Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2001

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика спектра молекулярной патологии при ретинобластоме и разработка ДНК-диагностического протокола»

Ретинобластома (РБ) - злокачественная опухоль сетчатки глаза, встречающаяся в популяции с частотой 1 на 10000-13000 живых новорожденных. РБ возникает внутриутробно, либо на ранних этапах постнатального развития. Опухоль повреждает один или оба глаза, обладает высокой инвазивностью и быстро метастазирует в мозг, что является причиной гибели ребенка.

Причиной возникновения заболевания является инактивация гена-супрессора опухолевой трансформации RB1, расположенного в районе хромосомы 13ql4.1. Ретинобластома в 6-10% случаях сопровождается видимой хромосомной патологией - деле-циями участка хромосомы 13ql4.1, а в остальных - структурными и функциональными нарушениями в гене RB1.

Выделяют наследственную и спорадическую формы заболевания. Спорадическая форма ретинобластомы возникает при инактивации обоих аллелей гена RB1 в развивающихся клетках сетчатки. Наследственная предрасположенность обусловлена наличием терминальной мутации в одном из аллелей гена RB1, которая передается по аутосомно-доминантному типу наследования с варьирующей экспрессивностью и неполной пенет-рантностью. Потеря второго аллеля происходит в недифференцированных клетках сетчатки.

До недавнего времени для своевременной диагностики РБ был единственный путь: регулярное офтальмологическое обследование в первые годы жизни детей, в семьях которых встречались случаи ретинобластомы. Ранняя диагностика дает возможность проведения эффективного лечения (локальная лазерная терапия, фото- и криокоагуля-ция). На более поздних этапах развития РБ необходимо хирургическое вмешательство (энуклеация) и сопутствующие курсы радио- и химиотерапии. В связи с этим возникает необходимость разработки новых эффективных молекулярных методов диагностики РБ, оценки повторного риска возникновения опухоли в семье с ретинобластомой.

Актуальность предлагаемой работы коротко можно сформулировать следующим образом:

1. Частота ретинобластомы за последнее десятилетие возросла более, чем в три раза (с 1:34000 до 1:10000 живых новорожденных);

2. Терапия на ранних стадиях ретинобластомы в настоящее время ведется достаточно успешно, что позволяет пациентам достигать репродуктивного возраста и ставить вопрос о прогнозе потомства;

4. Практически полностью не исследован вопрос о вовлеченности других механизмов возникновения опухоли, кроме повреждений в гене RB1, составляющих 5-10%, в этиологии ретинобластомы;

5. Молекулярная диагностика мутаций при ретинобластоме в настоящее время в отечественной лабораторной практике практически не используется, хотя широко применяется за рубежом в крупных медицинских центрах.

Цель и задачи исследования.

Основной целью работы является молекулярно-генетическое исследование причин возникновения ретинобластомы и разработка эффективного ДНК-диагностического протокола для различных форм ретинобластомы на основе молекулярно-биологических технологий.

Задачами исследования являются:

1. Поиск и характеристика точковых мутаций и микроструктурных аномалий гена у пациентов с ретинобластомой. Исключение терминального характера мутаций и их носительства у родственников больного с ретинобластомой.

2. Проведение анализа состояния зиготности гена RB1 в операционном материале ретинобластомы с использованием внутригенных и внегенных микросателлитных маркеров.

3. Проведение анализа промоторной области гена RB1 в целях поиска аномального метилирования, как одной из возможных причин возникновения ретинобластомы.

4. Проведение анализа состояния метилирования промоторной области гена pl6/CDKN2A в образцах ретинобластомы, как одного из возможных событий.

5. Разработка ДНК-диагностического протокола. Оптимизация диагностических подходов с целью раннего выявления опухоли и оценки риска заболевания у близких родственников больного с ретинобластомой.

Научная новизна.

В результате проведенного исследования изучен спектр молекулярной патологии - структурные и функциональные нарушения в гене RB1 у пациентов с различными формами ретинобластомы в 60 семьях. Выявлено 47 мутаций в различных экзонах и интрон-ных областях гена RB1, 24 мутации описаны впервые. В 19 случаях подтвержден терминальный характер мутаций. Описаны 3 новых полиморфизма в гене RB1. Проведен анализ состояния зиготности гена RB1 в операционном материале ретинобластомы, потеря гетерозиготности определена в 71% случаев опухоли. Обнаружено аномальное метилирование промоторной области гена RB1 в 27% образцов ретинобластомы, что значительно превышает данные зарубежных авторов. Впервые проведено исследование статуса метилирования промоторной области гена pl6/CDKN2A в образцах ретинобластомы, продемонстрировано 9 случаев аномального метилирования (17%) из 52 исследованных опухолей. Разработана мультиплексная метилчувствительная ПЦР для совместной оценки статуса метилирования промоторных районов генов RB1 и p!6/CDKN2A. Показано, что работу по скринингу мутаций у больных со спорадической формой РБ целесообразно проводить на ДНК из операционного материала. Исследование структурных изменений в случае семейной и/или двухсторонней ретинобластомы возможно проводить на ДНК из лимфоцитов периферической крови пациентов с РБ и их близких родственников.

Практическая значимость.

В результате выполненного исследования разработаны подходы для молекулярной диагностики и характеристики микроструктурной патологии, мутаций и функциональных нарушений в гене RB1, приводящих к развитию ретинобластомы. Результаты исследования внедрены в практику работы РОНЦ РАМН, МИГБ им. Гельмгольца, межрегиональных МГЦ и региональных медико-генетических консультаций. Социально-экономическая значимость результатов связана с повышением точности лабораторной диагностики, возможностью проведения пренатальной диагностики, прогнозом течения и профилактикой заболеваний.

Положения, выносимые на защиту.

1. Определены частота и спектр молекулярной патологии гена RB1 при различных формах ретинобластомы.

2. Охарактеризованы новые мутации и полиморфизмы в гене RB1.

3. Показано, что аномальное метилирование промоторных участков генов RB1 и/или pl6/CDKN2A является одним из механизмов, приводящих к развитию опухоли.

4. Разработаны оптимальные подходы для лабораторной ДНК-диагностики наследственной и спорадической форм ретинобластомы.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Бабенко, Ольга Владимировна

Выводы.

1. Определен спектр молекулярной патологии гена RB1 при обследовании 60 пациентов с ретинобластомой (пациентов и членов их семей всего 187). Обнаружены две гемизиготные делеции, 6 перестроек (микроделеций и инсерций) 41 точковая мутация в гене RB1. 24 мутации описаны впервые. Терминальный характер мутаций был подтвержден в 19 случаях ретинобластомы, 31 структурное изменение охарактеризованоы как спорадические. Выявлено 6 полиморфизмов в экзонах 12, 14, 17 и в 1, 8, и 10 интронах гена RB1, 3 из них описано впервые.

2. Определена потеря гетерозиготности хотя бы по одному из внутригенных маркеров, расположенных во 2 и 20 интронах гена RB1, в 37 опухолях (71%). В 31 образце ПГ сочеталась с выявленными мутациями.

3. Определено аномальное метилирование промоторной области гена RB1 в 14 образцах ретинобластомы (27%) из 52 исследованных опухолей. В 10 опухолях гиперме-тилироваение сочеталось с ПГ, в 3 - с мутациями в гене RB1. Впервые продемонстрировано метилирование промоторной области гена RB1 в ДНК из лимфоцитов периферической крови.

4. Исследован статус метилирования гена pl6/CDKN2A в образцах ретинобластомы. Аномальное метилирование промоторной области р1б было выявлено в 9 образцах опухоли (17%) из 52 исследованных РБ. В 5 из них метилирование р16 выявлено совместно с полной инактивацией гена RB1, в 2 образцах РБ совместно с инактивацией одного из аллелей RB1.

5. Разработан эффективный ДНК-диагностический протокол для обследования больных с различными формами ретинобластомы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Ретинобластома - одно из часто встречаемых эмбриональных злокачественных заболеваний у детей, которое повреждает сетчатку и приводит к инвалидизации ребенка. Своевременная терапия РБ позволяет сохранить жизнь практически у 90% детей, адаптировать их к социальной жизни. Знание первичного молекулярного дефекта гена RB1 при ретинобластоме позволяет выявить врожденную форму заболевания и проводить своевременную диагностику, оценку риска повторного возникновения опухоли в семье с РБ. Кроме того, при подтверждении терминального характера мутации значительно повышается риск возникновения у больного других злокачественных новообразований (ос-теогенной саркомы, мелкоклеточного рака легких, фибросаркомы, нейроэндокринных и других опухолей) на протяжении последующей жизни, что требует регулярного онко-диспансерного наблюдения. Поэтому становится необходимым проведение комплексного обследования пациента с ретинббластомой, включающего поиск молекулярной патологии в гене RB1 и характеристику обнаруженного изменения (терминального или соматического).

Подходы к диагностике наследственных и онкологических заболеваний, представляют собой комплекс молекулярно-генетических методов, которые позволяют решать проблемы ранней диагностики и молекулярной характеристики патологии. Современные методы молекулярной диагностики РБ позволяют определять причину возникновения опухоли практически у 80% пациентов. Эффективность и экономичность ДНК-диагностики определяется правильным выбором тактики исследования, сочетанием выбранных методов анализа. В настоящей работе сделана попытка полностью описать причины, приводящие к развитию ретинобластомы у каждого конкретного пациента, определить как структурные повреждения, так и эпигенетические нарушения, приводящие к инактивации гена RB1. С этой целью проведено молекулярно-генетическое обследование 60 семей с различными формами ретинобластомы. Представленное в работе комплексное исследование молекулярной патологии в гене RB1 позволило обнаружить оба мутационных события, приводящих к развитию ретинобластомы почти у 95% пациентов с РБ и проводить эффективную диагностику и определение носительства терминальных мутаций в семьях высокого риска. В результате исследования описаны 24 новые мутации и 3 полиморфизма в различных экзонах и интронных областях гена RB1. Кроме того, показано, что в 27% случаев РБ причиной инактивации одного из аллелей гена RB1 является событие эпигенетическое - метилирование, равноценное функциональной делеции. Впервые удалось продемонстрировать метилирование промоторной области RB1 в ДНК из лимфоцитов периферической крови - событие аналогичное терминальной мутации. До настоящего времени биаллельное метилрование было показано только для генов р1б в меланомах,/?/5 в лейкозных клетках и MLH1 при колоректалных раках.

Ретинобластома относится к категории моногенных опухолей, но в некоторых случаях не удается выявить мутационных событий приводящих к полной инактивации гена RB1 в опухоли. В таких случаях необходимо учитывать возможность мозаицизма, что затрудняет детекцию мутаций. Кроме того, комплексное взаимодействие и повреждение генов при злокачественной трансформации позволяет высказать предположение о вовлечении в процесс развития опухоли других механизмов, влияющих на активность RB1 и, следовательно, развитие ретинобластомы. С этой целью в работе был изучен статус метилирования одного из основных генов-регуляторов активности белка RBI - pi6. В работе впервые продемонстрировано аномальное метилирование промоторной области гена-регулятора клеточного цикла pl6/CDKN2A в образцах ретинобластомы, что, возможно, является сопутствующим повреждением или одним из пусковых механизмов развития опухоли.

Комплексное изучение структурных и функциональных нарушений генов, приводящих к злокачественной трансформации, является не только фундаментальной проблемой, способствующей пониманию общих закономерностей развития и дифференцировки специализированных тканей в частности и процессов канцерогенеза в целом, но и социально значимой прикладной задачей ДНК-диагностики конкретных злокачественных новообразований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бабенко, Ольга Владимировна, 2001 год

1. Баранова А.В., Янковский Н.К. // Гены-супрессоры опухолевого роста. // Мол. биология, Т. 32, №2, с. 206-218.

2. Бровкина А.Ф. // Ретинобластома. // В кн. "Наследственные и врожденные заболевания сетчатки и зрительного нерва" под ред. А.М.Шамшиновой. М. Медицина 2001, с. 360-371.

3. Залетаев Д.В. // Цитогенетическое изучение менделирующих форм МВПРЮ. // В кн. "Хромосомы человека в норме и патологии". М. 1989, с. 105-117.

4. Залетаев Д.В.Юпигенетическая патология при наследственных и онкозаболеваниях.// В сб. научных трудов РАЕН «Проблемы биомедицины на рубеже XXI века». М., 2000, с. 303-309

5. Зборовская И.Б. // Молекулярно-биологические исследования онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста в клинической практике. // В кн. Канцерогенез. М. 2000, с. 361-380.

6. Киселева Н.П., Киселев Ф.Л. if Эпигенетические изменения и канцерогенез. // В кн. Канцерогенез. М. 2000, с. 93-105.

7. Копнин Б.П. // Опухолевые супрессоры и мутаторные гены. // В кн. Канцерогенез. М. 2000, с. 75-92.

8. Лихтейнштейн А.В., Киселева Н.П. // Метилирование ДНК и канцерогенез. // Биохимия 2001, т. 66, вып. 3, с. 293-317.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. // "Молекулярное клонирование." // М., "Мир", 1984,479 с.

10. Стрельников В.В., Немцова М.В., Чеснокова Г.Г., Кулешов Н.П., Залетаев Д.В. // Диагностика синдрома Мартина-Белл на основе анализа структурно-функциональных изменений 5'-нетранслируемой области гена FMR1. // Мол. Биология 1999, т. 33. № 2, с. 330-336.

11. Яценко А.Н. // Молекулярно-генетическая характеристика района локализации гена, ответственного за множественную экзостозную хондродисплазию (ЕХТ1). // Авт. канд. дис. М., 1996.

12. Alonso J., Garcia-Miguel P., Adelairas J. et al. // Spectrum of germline RBI gene mutations in Spanish retinoblastoma patients: phenotypic and molecular epidemiological implications. // Hum. Mutat. 2001, v. 17, p. 412-422.

13. Amoaku W.M., Willshaw H.E., Parkes S.E., Shah K.J., Mann J.R. // Trilateral retinoblastoma: report of five patients. // Cancer 1996, v. 78, p. 858-863.

14. Archer S.Y., Hodin R.A. // Histone acetylation and cancer. // Current opinion in Genetics& Development 1999, v. 9, p. 171-174.

15. Bandara L.R., Adamczewski J.P., Hunt Т., La Thangue N.B. // Cyclin A and the retinoblastoma gene product complex with a common transcription factor. // Nature 1991, v. 352, p. 249-251.

16. Baylin S.B., Herman J.G., Graff J.R., Vertino P.M., Issa J.P. // Alterations in DNA methylation: a fundamental aspect of neoplasia. // Adv. Cancer Res. 1998, v. 72, p.141-196.

17. Baylin S.B., Esteller M., Rountree M.R., Bachman K.E., Schuebel K., Herman J.G. // Aberrant patterns of DNA methylation, chromatin formation and gene expression in cancer. // Hum. Mol. Genet. 2001, v. 10, p. 687-692.

18. Benedict W. F., Murphree A.L., Banerjee A., Spina C.A., Sparkes M.C. and Sparkes R.S. // Patient with 13 chromosome deletion: evidence that the retinoblastoma gene is a recessive cancer gene. // Science 1983, v. 219, p. 973-975.

19. Blanquet V., Turlean C., Gross-Morand S., Senamaud-Beaufort C., Doz F., Besmond C. // Spectrum of germline metation in the RB 1 gene: study of 232 patiens with hereditary and non hereditary retinoblastoma. // Hum. Mol. Genet. 1995, v. 4, p. 383-388.

20. Brehm A., Kouzarides T. // Retinoblastoma protein meets chromatin. // Trends in Biochemical Sciences 1999, v. 24, p. 142-145.

21. Bremner R., Du D.C., Connolly-Wilson M., Bridge P., Ahmad K., Mostachifi H., Rushlow D. and Gallie B. // Deletion of RB exons 24 and 25 causes low-penetrance retinoblastoma. // Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 559-570.

22. Buchkovich K., Duffy L. A. and Harlow E. // The retinoblastoma protein is phosphorylated during specific phases of the cell cycle. //Cell 1989, v. 58,p. 1097-1105.

23. Cance W.G., Brerman M.F., Dudas M.E., Huang C.M., Cordon-Cardo C. // Altered expression of the retinoblastoma gene product in human sarcomas. // New Eng. J. Med. 1990, v. 323, p. 1457-1462.

24. Cavenee W. K., Dryja T.P., Phillips R.A., Benedict W.F., Godbout R., Gallie B.L., Murphree A.L., Strong L.C. and White R.L. // Expression of recessive alleles by chromosomal mechanisms in retinoblastoma. // Nature 1983, v. 305, p. 779-784.

25. Chellappan S.P., Hiebert S., Mudryj M. et al. // The E2F transcription factor is a cellular target for theRB protein. // Cell 1991, v. 65, p. 1053-1061.

26. Chen P.L., Scully P., Shew J.Y., Wang J.Y. and Lee W.H. // Phosphorylation of the retinoblastoma gene product is modulated during the cell cycle and cellular differentiation. // Cell 1989, v. 58, p. 1193- 1198.

27. Claudio P.P., Howard C.M., Pacilio C., Cinti C. et al. // Mutation in the retinoblastoma-related gene RB2/pl30 in lung tumors and suppression of tumor growth in vivo by retrovirus-mediated gene transfer. // Cancer Res. 2000, v. 60, p. 372-382.

28. Comings D.E. // A general theory of carcinogenesis. // Proceeding of the National Academy of the Sciences of the USA 1973, v. 70, p. 3324-2228.

29. Connolly M.J., Payne R.H., Johnson G., Gallie B.L., Allderdice P.W., Marshall W.H. and Lawton R.D. // Familial retinoblastoma with reduced penetrance and variable expressivity. // Hum. Genet. 1983, v. 65, p. 122-124.

30. Costello J.F., Fruhwald M.C., Smiraglia D.J. et al. // Nature Genet. 2000, v. 25, p. 132-138.

31. Cowell J.K., Smith Т., Bia B. // Frequent constitutional С to T mutation in CGA-arginin codons in the RBI gene produce premature stop codons in patients with bilateral(hereditary) retinoblastoma. // Europ. J. Hum. Genet. 1994, v. 2, p. 281-290.

32. DeCaprio J.A., Ludlow J.W., Lynch D., Furukawa Y., Griffin J. et al. // The product of the retinoblastoma susceptibility gene has properties of a cell cycle regulatory element. // Cell 1989, v. 58, p. 1085-1095.

33. Draper G.J., Sanders B.M., Kingston J.E. // Second prymary neoplasm in patient with retinoblastoma. // Br. J. Cancer. 1988, v. 53, p. 661-671.

34. Dryja T.P., Mukai S., Rapaport J. M. and Yandell D.W. // Parental origin of mutations of the retinoblastoma gene. // (Abstract) Am. J. Hum. Genet. 45 (suppl.): A19 only, 1989.

35. Dryja T.P., Rapaport J., McGee T.L., Nork T.M. and Schwartz T.L. // Molecular etiology of low-penetrance retinoblastoma in two pedigrees. // Am. J. Hum. Genet. 1993, v. 52, p. 1122-1128.

36. Dunn J.M., Phillips R.A., Zhu X., Becker A. and Gallie B.L. // Mutations in the RBI gene and their effects on transcription. // Molec. Cell. Biol. 1989, v. 9, p. 4596-4604.

37. Dyson N., Buchkovich K, Whyte P. and Harlow E. // The cellular 107k protein that binds to adenovirus El A also associated with the large T antigen of SV40 and JC virus. // Cell. 1989, v. 58, p. 248-255.

38. Dyson N., Howley P.M., Munger K. and Harlow E. // The human papilloma virus-16 E7 oncoprotein is able to bind to the retinoblastoma gene product. // Science 1989, v. 243, p. 934-937.

39. Eng C., Abramson D.H., Ellsworth R.M., Wong F.L., Goldman M.B., Seddon J. et al. // Mortality from second tumors among long-term survivors of retinblastoma. // J. Nanl. Cancer. Inst. 1993, v. 85, p. 1121-1128.

40. Eng C., Herman J.G. and Baylin S.B. //Natura Genet. 2000, v. 24, p. 101-102.

41. Ewen M.E., XingY., Lawrwnce J.B., Livingston D.M. // Molecular cloning, chromosomal mapping, andexpression of the cDNA for pi07, a retinoblastoma gene product-related protein. // Cell 1991, v. 66, p. 1155-1164.

42. Fearon E.R. // Human cancer syndromes: clues to the origin and nature of cancer. // Science 1997, v. 278, p. 1043-1050.

43. Feinberg A.P., Vogelstein B. // Hypomethylation distinguishes genes of some human cancer from their normal counterparts. // Nature, 1983, v.301, p. 89.

44. Field S.J., Tsai F.Y., Kuo F„ Zubiaga A.M., Kaelin W.G., Livingston D.M., Orkin S.H., Greenberg M. E. // E2F-1 Functions in mice to promote apoptosis and supress proliferation. //Cell 1996, v. 85,p. 549-561.

45. Francke U. // Retinoblastoma and chromosome 13. // Cytogenet. Cell Genet. 1976, v. 14, p.131.134. ^

46. Friend S., Bernards R., Rogelj S., Weinberg R., Rapaport J., Albert D., Dryja T. // A human DNA segment with properties of the gene that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma. //Nature 1986, v. 323, p. 643-646.

47. Gade J.R., Meyer C. and Wettern F.O. // The E7 proteins of the nononcogenic human papillomavirus type 6b (HPV-6b) and the oncogenic HPV-16 differ in retinoblastoma protein bilding and other propertis. // Journal of Virology 1990, v. 64, p. 723-730.

48. Goodrich D. W.; Wang N. P.; Qian Y.W.; Lee E. Y.H. P. and Lee W.H. // The retinoblastoma gene product regulates progression through the G1 phase of the cell cycle. // Cell 1991, v. 67, p. 293-302.

49. Greger V., Debus N.; Lohmann D.; Hopping W.; Passarge E.; Horstemke B. // Frequency and parenteral origin of hypermethylated RBI allels in retinoblastoma. // Hum. Genet. 1994, v. 94, p. 491-496.

50. Greger V.; Passarge E.; Hopping W.; Messmer E.; Horsthemke B. // Epigenetic changes may contribute to the formation and spontaneouse regression of retinoblastoma. // Hum.Genet. 1989, v. 83, p. 155-158.

51. Gruis N.: Abeln E.; Bardoel E. et al. // Br. J. Cancer. 1993, v. 68, p. 308-313.

52. Hagstrom S.A. and Dryja T.P. // Mitotic recombination map of 13cen-13ql4 derived from an investigation of loss of heterozygosity in retinoblastomas. // Proc. Nat. Acad, Sci. 1999, v. 96, p. 2952-2957.

53. Hanada M., Delia., Aiello A., Stadtmauer E., Reed J.C. // bcl-2 gene hypomethylation and high-level expression in B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Blood, 1993, v. 82, p. 1820.

54. Hannon G.J., Demetrick D., Beach D. // Isolation of the Rb-related pi30 through its interaction with CDK2 and cyclins. // Genes and Development 1993, v. 7, p. 2378-2391.

55. Harbour J.W., Luo R.X., Dei Santi A., Postigo A.A., Dean D.C. // Cdk phosphorilation triggers sequental intramolecular interaction that progressively block Rb functions as cells move through Gl. // Cell 1999, v. 98, p. 859-869.

56. Hensel C., Hsieh C.L., Lee W.H., Pam-Lee E., Gazdar A., Sakaguchi A.Y., Naylor S.L. // Allele loss and lack of expression of the RB-1 locus in small cell lung cancer. (Abstract). // Am. J. Hum. Genet. 1988, v. 43, A25.

57. Henson J.W., Schnitker B.L. Correa K.M., von Diemling A., Fassbender F., Xu H.J., Benedict W.F., Yandell D.W., Louis D.N. // The retinoblastoma gene is involved in malignant progression of astrocytomas. // Ann. Neurol. 1994, v. 36, p. 714-721.

58. Herman J.G., Graff J.R., Myohanen S., Nelkin B.D., Baylin S.B. // Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996, v. 93, p. 9821-9826.

59. Hogg A., Onadim Z., Baird P. and Cowell J. // Detection of heterozygous mutation in the RBI gene in retinoblastoma patient using SSCP analysis and PCR sequencing. // Oncogene 1992, v. 7, p. 1445-1451.

60. Horsthemke В., Greger V., Barnert H.J., Hopping W. and Passarge E. // Detection of submicroscopic deletions and a DNA polymorphism at the retinoblastoma locus. // Hum. Genet. 1987, v. 76, p. 257-261.

61. Hsieh J.K., Chan F. S., O'Connor D.J., et al. // RB regulates the stability and the apoptotic function of p53 via MDM2. // Molec. Cell 1999, v. 3, p. 181-193.

62. Kaelin W.G., Pallas D.C., DeCaprio J.A., Kaye F.J., Livingston D. M. // Identification of cellular proteins that can interact specifically with the T/ElA-binding region of the retinoblastoma gene product. // Cell 1991, v. 64, p. 521-532.

63. Kamb A., Gruis N.A., Weaver-Feldhaus J. et al. // A cell regulatory potentially involved in genesis of many tumor types. // Science 1994, v. 264, p. 436-440.

64. Kato M.; Shimizu Т.; Nagayoshi M.; Kaneko A.; Sasaki M. and Ikava Y. // Genomic imprinting of the human serotonin-receptor (HTR2) gene involved in development of retinoblastoma. // Hum. Genet. 1996, v.59, p. 1084-1090.

65. Kennet S.B., Udvadia A.J., Horowitz J.M. // Sp3 encodes multiple proteins that differ in their capacity to stimulate or repress transcription. // Nucleic Acids Res. 1997, v. 26, p. 3110-3117.

66. Kiono Т., Foster S.A., Koop J.I., McDougall J.K., Galloway D.A., Klingelhutz A.J. // Both Rb/pl6INK4a inactivation avd telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. // Nature 1998, v. 396, p. 84-89.

67. Krawczak M.; Reiss J.; Cooper D.N. // The mutational spectrum of single base-pair substitution in mRNA splice junction of human genes: causes and consequences. // Hum. Genet. 1992, v. 90, p. 41-54.

68. Knudson A.G. // Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1971, v. 68, p. 820-823.

69. Landegren U. // Laboratory protocols for mutation detection. // Oxford University Press, Oxford, 1996,127 p.

70. Lee W.H.; Bookstein R.; Hong F.; Young L.J.; Shew J.Y. and Lee E.H. II Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence. // Science 1986, v. 235, p.1394-1399.

71. Lee W. H., Lee E. Y. // The retinoblastoma gene: from its basic umderstanding as a signal mediator for growth find differentiation to its use in the treatment qf cancer. // Gan To Kagaku Ryoho 1997, v. 24, p. 1368-1380.

72. Lee W.H., Bookstein R., Hong F.D. et al. // Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence. // Science 1987, v. 235, p. 1394-1399.

73. Lele K.P.; Penrose L.S. and Stallard H. B. // Chromosome deletion in a case of retinoblastoma. // Ann. Hum. Genet. 1963, v. 27, p. 171-174.

74. Lohmann D.; Horsthemke В.; Gillessen K.G.; Stefani F.H.; Hofler H. // Detection of small RBI gene deletions in retinoblastoma by multiplex per and high-resolution gel electroforesis. // Hum. Genet. 1992, v. 89, p. 49-53.

75. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // Distinct RBI gene mutation with low penetrance in hereditary retinoblastoma. // Hum. Genet. 1994, v. 94, p. 349-354.

76. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // The spectrum of RBI germ-line mutation in hereditary retinoblastoma. // Hum. Genet. 1996, v. 58, p. 940949.

77. Lohmann D.R.; Gerick M.; Brandt В.; Oelschlager U.; Lorenz В.; Passarge E.; Horsthemke B. // Constitutional RBI-gene mutation in patient with isolated unilateral retinoblastoma. // Am. J. Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 282-294.

78. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // Molecular genetics and diagnosis of retinoblastoma. Significance for ophthalmologic practice. // Ophthalmologe 1997, v. 94, p. 263-267.

79. Lukas J., Parry D., Aagard L., Mann D.J. et al. // Retinoblastoma-protein-depend cell-cycle inhibition by the tumour supressor pl6. // Nature 1995, v. 375, p. 503-506.

80. Ludlow J.W.; DeCaprio J.A.; Huang C,M.; Paycha E.and Livingston D.M. // SV40 Large T antigen binds preferently to an underphosphorylated member of the retinoblastoma susceptibility gene family. // Cell 1989, v. 56, p. 57-65.

81. Lueder G.T., Judisch G.F., Wen B.C. // Heritable retinoblastoma and pinealoma. // Arch. Ophthal. 1991, v. 109, p. 1707-1709.

82. Luo R.X., Postigo A.A., Dean D.C. // Rb interacts with histone deacetylase to repress transcription. // Cell 1998, v. 92, p. 463-473.

83. Mancini D., Singh S., Ainsworth P., Rodenhiser D. // Constitutively methylated CpG dinucleotides as mutation hot spots in the retinoblastoma gene (RBI). // Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 80-87.

84. Matsunaga E. // Recurrence risks to relatives of patients with retinoblastma. // Jpn. J. Ophthal. 1978, v. 22, p. 313-319.

85. McGee T.L.; Yandell D.W. and Druja T.P. // Structure and partial genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene. // Gene 1989, v. 80, p. 119-128.

86. Motegi Т., Kaga M., Yanagawa Y., Kadowaki H., Watanabe K., Inoue A., Komatsu M., Minoda K. // A recognizable pattern of the midface of retinoblastoma patients with interstitial deletion of 13q. // Hum. Genet. 1983, v. 64, p. 160-162.

87. Motegi Т., Komatsu M., Nakazato Y., Ohuchi M., Minoda K. // Retinoblastoma in a boy with a de novo mutation of a 13/18 translocation: the assumption that the retinoblastoma

88. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // Distinct RBI gene mutation with low penetrance in hereditary retinoblastoma. // Hum. Genet. 1994, v. 94, p. 349-354.

89. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // The spectrum of RBI germ-line mutation in hereditary retinoblastoma. // Hum. Genet. 1996, v. 58, p. 940949.

90. Lohmann D.R.; Gerick M.; Brandt В.; Oelschlager U.; Lorenz В.; Passarge E.; Horsthemke B. // Constitutional RBI-gene mutation in patient with isolated unilateral retinoblastoma. // Am. J. Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 282-294.

91. Lohmann D.R.; Brandt В.; Hopping W.; Passarge E.; Horsthemke B. // Molecular genetics and diagnosis of retinoblastoma. Significance for ophthalmologic practice. // Ophthalmologe 1997, v. 94, p. 263-267.

92. Lukas J., Parry D., Aagard L., Mann D.J. et al. // Retinoblastoma-protein-depend cell-cycle inhibition by the tumour supressor pi6. // Nature 1995, v. 375, p. 503-506.

93. Ludlow J.W.; DeCaprio J.A:; Huang C.M.; Payeha E.and Livingston D.M. // SV40 Large T antigen binds preferently to an underphosphorylated member of the retinoblastoma susceptibility gene family. // Cell 1989, v. 56, p. 57-65.

94. Lueder G.T., Judisch G.F., Wen B.C. // Heritable retinoblastoma and pinealoma. // Arch. Ophthal. 1991, v. 109, p. 1707-1709.

95. Luo R.X., Postigo A.A., Dean D.C. // Rb interacts with histone deacetylase to repress transcription. // Cell 1998, v. 92, p. 463-473.

96. Mancini D., Singh S., Ainsworth P., Rodenhiser D. // Constitutively methylated CpG dinucleotides as mutation hot spots in the retinoblastoma gene (RBI). // Hum. Genet. 1997, v. 61, p. 80-87.

97. Matsunaga E. // Recurrence risks to relatives of patients with retinoblastma. // Jpn. J. Ophthal. 1978, v. 22, p. 313-319.

98. McGee T.L.; Yandell D.W. and Druja T.P. // Structure and partial genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene. // Gene 1989, v. 80, p. 119-128.

99. Motegi Т., Kaga M., Yanagawa Y., Kadowaki H., Watanabe K., Inoue A., Komatsu M., Minoda K. // A recognizable pattern of the midface of retinoblastoma patients with interstitial deletion of 13q. // Hum. Genet. 1983, v. 64, p. 160-162.

100. Mulligan G., Jacks T. // The retinoblastoma gene family: cousins with overlapping interests. // Trends in Genetics 1998, v. 14, p. 223-229.

101. Munier F.L., Thonney F., Balmer A., Uffer S., Heon E., Van Mellr G., Rutz H.P., Pescia G., Schorderet D.F. // Prognostic factors associated with loss of heterozygosity at the RBI locus in retinoblastoma. // Ophthalmic Genet. 1997, v. 18, p. 7-12.

102. Munger K.; Werness B.A.; Dyson N., Harlow E. and Howley P.M. // Complex formation of human papillomavirus E7 protein with the retinoblastoma tumor supressor gene product. // EMBO Journal 1989, v. 8, p. 4099-4105.

103. Musarella M.A.; Gallie B.L. // A simplified scheme for genetic counseling in retinoblastoma. //J. Pediatr. Ophtalmol. Strabismus. 1987, v. 24,p. 124-125.

104. Nevins J.R. // The Rb/E2F pathway and cancer. // Hum. Mol. Genet. 2001, v. 10, №10, p. 699-703.

105. Newsham I.F., Hadjistilianou Т., Cavenee W.K. // Retinoblastoma. // in "The Genetic Basis of Human Cancer", ed. by B.Vogelstein and K.W.Kingler. // McCraw-Hill Companies, 1998, p. 363-387.

106. Ng H.H., Bird A. // DNA methylation and chromatin modification. // Cur. Op. In Genet. And Develop. 1999, v. 9, p. 158-163.

107. Noorani H.; Khan H.; Gallie B. and Detsky A. // Cost comparison of molecular versus conventional screening of relatives at risk for retinoblastoma. II Hum. Genet. 1996, v. 50, p. 301-307.

108. Ohtani-Fujita N.; Dryja ТР.; Rapaport JM.; Fujita Т.; Matsumura S.; Ozasa K. // Hypermethylation in the retinoblastoma gene is associated with unilateral, sporadic retinoblastoma. // Cancer. Genet. 1997, v. 98, p. 43-49.

109. Palmisano W.A., Divine K.K., Geno Saccomanno et al. // Predicting lung cancer by detecting aberrant promoter methylation in sputum. // Cancer Research. 2000, v.60, p. 59545958.

110. Riley D.J., Liu C.Y., Lee W.H. // Mutation of N-terminal regions render the retinoblastoma protein insufficient for functions in development and tumor suppression. // Mol. Cell Biol. 1997, v. 17, p. 7342-7352.

111. Robertson K.D., Jones P.A. // DNA methylation: past, present and future direction. // Cancer Biology 2000, v. 21, №3, p. 461-467.

112. Sakai Т.; Toguchida J.; Ohtani N.; Yandell D. W.; Rapaport J. M. and Dryja T. P. // Allele-specific hypermethylation of the retinoblastoma tumor-suppressor gene. // Am. J. Hum. Genet. 1991, v. 48, p. 880-888.

113. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. // Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Cold Spring Harbor, NY.

114. Shiio Y., Yamamoto Т., Yamaguchi N. // Negative regulation of Rb expression by the p53 gene product. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1992, v. 89, p. 5206-5210.

115. Sippel K.C., Fraioli R.E., Smith G.D., Schalkoff M.E., Sutherland J., Gallie B.L., Draja T.P. // Frequeny of somatic and germ-line mosaicism in retinoblastoma: implicationfor genetic counseling. // Am. J. Hum. Gen. 1998, v. 62, p. 610-619.

116. Sparkes R.S., Muller H.s Klisak I., Abram J.A. // Retinoblastoma with 13q; chromosomal deletion associated with maternal paracentric inversion of 13q. // Science 1979, v. 203, p. 1027-1029,

117. Sparkes R.S.; Murphree A.L.; Lingua R.W.; Sparkes M.C.; Field L.L.; Funderburk S.J. and Benedict W.F. // Gene for hereditary retinoblastoma assigned to human chromosome 13 by linkage to esterase D. // Science 1983, v. 219, p. 971-973.

118. Stirzaker C.; Millar D.; Paul C.; Warnecke P.; Harrison J.; Vincent P.; Frommer M.; Clark S. // Extensive DNA methylation spanning the Rb promoter in retinoblastoma tumors. // Cancer Res. 1997, v. 57, p. 2229-2237

119. Tazi J. and Bird A. // Cell 1990, v. 58, p. 909-920.

120. Toguchida J.; McGee T.L.; Paterson J.C.; Eagle J.R.; Tucker S.; Yandell D.W. and Dryja T.P. // Complete genomic sequence of the human retinoblastoma susceptibility gene. // Genomics 1993, v. 17, p. 535-543.

121. Toyota M., Ho S., Ahuja N. et al. // Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. // Cancer Res. 1999, v. 59, p. 2307-2312.

122. Trouche D. // Control of cell proliferation by the retinoblastoma gene product (editorial). // Patol. Biol. 1997, v. 45, p. 5-8.

123. Turleau C., de Grouchy J., Chavin-Colin F., Junien C., Seger J., Schlienger P., Leblanc A., Haye C. // Cytogenetic forms of retinoblastoma: their incidence in a survey of 66 patients. // Cancer Genet. Cytogenet. 1985, v. 16, p. 321-334.

124. Vogel F. // The genetics of retinoblastoma. // Hum. Genet. 1979, v. 52, p. 1-54.

125. Weinberg R.A. // The retinoblastoma protein and cell cycle control. // Cell 1995, v. 81, p. 323-330.

126. Windle J.J., Albert D.M., O'Brien J.M., Marcus D.M., Disteche C.M., Bernards R., Mellon P.L. // Retinoblastoma in transgenic mice. // Nature 1990, v. 343, p. 665-669.

127. Wiggs J.; Nordenskjold M.; Yandell D.; Rapaport J.; Grondin V. et al. // Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma, using DNA polymorphisms within the retinoblastoma gene.//New Eng. J.Med. 1988, v. 318, p. 151-157.

128. Zajaczek S., Jakubowska A., Gorki., Kurzawski G., Krzystolik Z., Lubinski J. // Frequency and nature of germline RBI gene mutations in a series of patients with sporadic unilateral retinoblastoma. // Eur. J of Cancer, 1999, v.35, p. 1824-1827.

129. Zeschnigk M., Lohmann D., Horsthemke B. // A PCR test for detection of hypermethylated alleles at the retinoblastoma locus. // J. Med. Genet. 1999, v. 36, p. 793794.

130. Zhang H.S., Postigo A.A., Dean D.C. // Active transcriptional repression by the Rb-E2F complex mediates G1 arrest triggered by pi6 (INK4a), TGF-beta, and contact inhibition. // Cell 1999, v. 97, p. 53-61.