Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы Lic16A Clostridium thermocellum тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Дворцов, Игорь Александрович

• Дворцов, Игорь Александрович
• кандидат химических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат химических наук Дворцов, Игорь Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Распространенность СВМ

1.2 Функции СВМ

1.3 Пространственная структура СВМ

1.4 Взаимосвязь структуры и функции СВМ

1.5 Молекулярный механизм связывания СВМ

1.6 Множественные взаимодействия СВМ

1.7 Синергизм СВМ

1.8 Применения СВМ в биотехнологии

1.9 Clostridium thermocellum, продуцент термостабильных ферментов - перспективный объект для изучения различных СВМ

2. Экспериментальная часть

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Бактериальные штаммы и плазмиды

2.1.2 Химические реагенты и ферменты

2.1.3 Бактериальные среды и условия культивирования

2.1.4 Выделение и анализ плазмидной ДНК

2.1.5 Выделение хромосомной ДНК Clostridium thermocellum

2.1.6 Введение плазмидной ДНК в бактериальные клетки и экспрессия белков

2.1.7 Приготовление клеточных экстрактов и очистка белков

2.1.8 Измерение концентрации белков, белковый электрофорез и определение молярного веса белков

2.1.9 Исследование плавления белков

2.1.10 Полисахаридные субстраты

2.1.11 Определение ферментативной активности ламинариназы при гидролизе

2.1.12 Определение биохимических свойств ламинариназы и ее делеционных производных

2.1.13 Связывание с растворимыми полисахаридами

2.1.14 Связывание с нерастворимыми полисахаридами

2.1.15 Гель-проникающая хроматография

2.1.16 Анализ белковой последовательности

2.1.17 Компьютерный анализ белковых последовательностей

2.2 Результаты и обсуждение

2.2.1. Изучение функций вспомогательных модулей, прилегающих к каталитическому

2.2.1.1 Получение делеционных производных Ыс16А

2.2.1.2 Биохимические свойства делеционных производных

2.2.1.3 Плавление делеционных производных

2.2.1.4 Влияние прилегающих модулей на углевод-связывающие свойства каталитического модуля

2.2.2 Изучение свойств СВМХ

2.2.2.1 Получение и экспрессия изолированного СВМХ

2.2.2.2 Углевод-связывающие свойства СВМХ (СВМ54)

2.2.2.3 Спонтанный гидролиз СВМ54

2.2.2.4 Получение и экспрессия С-концевой части СВМ54 - СВМ54С

2.2.2.5 Углевод-связывающие свойства СВМ54С

2.2.2.6 Структура сайтов СВМ54

2.2.2.7 Анализ гомологов СВМ54

2.2.2.8 Функции СВМ54 в 1лс16А

2.2.3 Изучение свойств С-концевых СВМ 1лс16А

2.2.3.1 Получение и экспрессия С-концевых СВМ Ыс16А

2.2.3.2 Углевод-связывающие свойства С-концевых СВМ Licl6A

85

2.2.3.3 Свойства СВМ4

87

2.2.3.4 Анализ представителей 4 семейства СВМ

89

2.2.4 Роль углевод-связывающих модулей Licl6A

92

Заключение

94

Выводы

98

Список использованной литературы

99

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы Lic16A Clostridium thermocellum»

Введение

Многие углевод-активные ферменты являются мультимодульными белками, состоящими из каталитических и вспомогательных модулей. К вспомогательным модулям относятся в первую очередь углевод-связывающие модули (carbohydrate binding modules, СВМ). В настоящее время исследовано большое число СВМ, еще больше найдено по степени схожести аминокислотной последовательности. По гомологии аминокислотных последовательностей все СВМ разделены на семейства, которых в настоящий момент насчитывается больше 60. СВМ состоят из 30 - 200 аминокислотных остатков и чаще всего представляют собой модули с независимым фолдингом в мультимодульных ферментах. Существуют также СВМ - структурные компоненты мультиферментных комплексов, таких как целлюлосома и несколько СВМ - отдельных белков. СВМ проявляют сродство к широкому спектру углеводных субстратов, компонентов клеточной стенки микроорганизмов и растений, а также резервных углеводов клеток. СВМ связывают кристаллические и аморфные полисахариды, а также олигосахариды. Для ряда СВМ получены пространственные структуры, часть из них разрешена в комплексе с углеводными лигандами. На основе этих структур изучается механизм распознавания полисахаридов СВМ, выделены факторы, влияющие на связывание. Углевод-связывающие свойства СВМ и их функционирование в мультимодульных ферментах в

виде модуля с дискретной укладкой делает СВМ чрезвычайно перспективными в области биотехнологического применения. СВМ используются для очистки белков, а также для экспрессии белков, т.к. наличие СВМ во фьюжн-конструкциях с целевым белком увеличивает выход белка и улучшает его растворимость. Углеводные носители являются дешевыми и легкими в использовании материалами. СВМ применяются для иммобилизации на таких носителях целевых ферментов и целых клеток. Также известно использование СВМ для анализа структуры клеточной стенки.

Цель данной работы - изучение свойств некаталитических модулей ламинариназы Licl6A из термофильной анаэробной бактерии Clostridium thermocellum и их влияния на свойства каталитического модуля фермента. Исследуемый фермент содержит 8 некаталитических модулей, функции некоторых были неизвестны.

1. Обзор литературы

Первые свидетельства о существовании СВМ появились в 50-ых годах XX века. Исследования по энзиматической деградации целлюлозы приводили к выводу, что процесс деградации включает в себя действие неизвестного негидролитического компонента. Используя протеолитическую доступность междоменных линкеров, из целлюлаз были выделены первые СВМ [1,2,3,4]. Первоначально СВМ были классифицированы как целлюлозо-связывающие домены, поскольку именно они были обнаружены первыми. Впоследствии было найдено гораздо больше модулей, связывающих и другие углеводные субстраты, отличные от целлюлозы, что привело к необходимости переклассифицировать найденные СВМ. СВМ - это модули с непрерывными аминокислотными последовательностями внутри углевод-активных ферментов, обладающие независимой пространственной укладкой, и проявляющие углевод-связывающую активность [5,6,7].

В настоящее время известно большое количество СВМ, которые объединены в более чем 60 семейств по принципу гомологии их аминокислотных последовательностей. СВМ найдены в составе ферментов практически всех царств микроорганизмов - архей, бактерий, эукариот, а также вирусов. Классификация СВМ доступна в базе данных углевод-активных ферментов CAZY [8].

1.1 Распространенность СВМ

К СВМ относят модули, встречающиеся в составе углевод-активных ферментов -гликозил-гидролаз, трансфераз, лиаз, эстераз.

В трансферазах - ферментах, формирующих гликозидные связи, СВМ представлены в виде трехкратного повтора модулей величиной 150 аминокислотных остатков. Модули этого типа были впервые обнаружены в углевод-связывающих белках растений и животных - лектинах, таких как рицин и агглютинин из Ricinus communis, где они связывают остатки галактозы. Эти СВМ демонстрируют ось псевдосимметрии третьего порядка в согласии со своим трехкратным повтором. Помимо галактозы, такие СВМ связывают маннозу, ксилан, N-ацетил-галактозамин [9,10,11].

Лиазы деполимеризуют цепи полисахаридов, содержащих уроновые кислоты (напр. пектин), по механизму, отличному от гидролиза связей гликозил-гидролазами. За счет независимой укладки, свойства СВМ в составе лиаз не определяются свойствами каталитического модуля; и эти СВМ способны осуществлять углевод-связывающие функции, также как СВМ в составе гликозил-гидролаз [12,13]. То же самое можно сказать о роли СВМ в составе карбоксил-эстераз - ферментов, деполимеризующих гемицеллюлозу, катализируя де-0 или де-Ы-ацетилирование сахаридов, таких как пектин-метилэфиры или ацетилированный ксилан [14,15]. Также к СВМ относят домены скаффолдинов - белковых комплексов, состоящих из взаимодействующих когезиновых и докерных доменов. Скаффолдины являются

структурными компонентами целлюлосомы - мультиферментного комплекса, состоящего из гликозил-гидролаз, углевод-лиаз, карбоксил-эстераз. Такие комплексы продуцируются многими бактериями. СВМ в составе целлюлосомы выполняют функцию докерных доменов - белков, сцепляющих между собой скаффолдины. Показано, что наличие СВМ в составе скаффолдина драматически влияет на гидролитическую способность этого комплекса [16-20].

Было обнаружено, что СВМ входит в состав цитохрома [21].

Экспанзины - белки, играющие роль в росте клеточной стенки растений, являются гомологами СВМ и обладают углевод-связывающими свойствами [22]. Обнаружено несколько СВМ, не входящих в состав других белков. Например, СВМ семейства 43, белок пыльцы оливы Ole 10 (10 kDa) связывается с (3-1,3-глюканами и представляет собой отдельный полипептид [23].

В настоящее время принято различать СВМ и лектины. Лектины - углевод-связывающие белки растений и животных, характеризуются связыванием с моно- и олигосахаридами, имеют, как правило, несколько углевод-связывающих центров, обычно представлены отдельными белками [24,25]. Однако среди СВМ есть целый класс таких, которые связываются с олигосахаридами, а несколько семейств СВМ, например, 13, 14 и 18, были первоначально идентифицированы как лектины. Модули 13 семейства обладают схожей с лектинами третичной структурой, среди модулей 18 семейства есть лектино-подобные модули, входящие в состав хитиназ. Но, несмотря на эти сходства, СВМ отличаются от лектинов по типу лиганда и способу взаимодействия с ним. В случае СВМ, это субстраты с высокой степенью полимеризации и ненасыщенностью водородных связей, 2 связи/100А , в случае лектинов - олигосахара и почти полная насыщенность водородных связей -

3.5/100А2 [26,27]. Также к СВМ не относят белки системы транспорта Сахаров. 1.2 Функции СВМ

Принято выделять несколько функций СВМ, которые они осуществляют в качестве модулей гликозил-гидролаз [28].

Связывание с субстратом. Повышение скорости реакции за счет увеличения концентрации фермента возле субстрата. В этом случае удаление СВМ из фермента приводит к значительному падению активности фермента на нерастворимых субстратах. Активность на растворимых субстратах остается без изменений [29]. Таргетинг. Природные углеводные субстраты, такие как клеточная стенка и резервные полисахариды, являются сложно устроенными комплексными соединениями. Материал стенок варьирует между видами, и различается в зависимости от типа клетки и стадии развития [30]. СВМ, которые связываются с поверхностью кристаллических полисахаридов, могут входить в состав различных гликозил-гидролаз. С другой стороны, СВМ, связывающиеся с отдельной полисахаридной цепью, должны быть специфичны к тем полисахаридам, которые являются субстратами каталитического модуля гидролазы. Например, целлюлаза, ксиланаза и маннаназа содержат СВМ второго типа, которые связываются с целлюлозой, ксиланом и маннаном, соответственно. Тем самым СВМ будет сближать фермент с целевым субстратом, находя его в сложной макромолекулярной структуре клеточной стенки. Кроме того, таргетинг может осуществлять более тонкую функцию, чем простой поиск нужного субстрата среди полисахаридов клеточной стенки. Например, СВМ семейства 9 ксиланазы 10А Thermotoga maritima имеет выраженную специфичность для редуцирующих концов нерастворимых ксилана и целлюлозы. Для связывания СВМ 9 нужен прямой доступ к С1- С2-гидроксил-группам пиранозы. У природных субстратов концентрация редуцирующих концов мала из-за высокой степени полимеризации и разветвления полисахаридов. Таким образом, можно предположить таргетинг фермента к областям с повреждениями клеточной стенки [31,32]. Показано, что фьюжн-белки, содержащие СВМ семейств 1 и 3 с одним и тем же каталитическим модулем, демонстрировали разную способность деградировать кристаллическую

целлюлозу, что предполагает, что некаталитические модули распознают разные участки одного и того же полисахарида [33].

Некаталитическая деградация субстрата. Некоторые СВМ оказывались способны разрыхлять кристаллическую структуру субстрата. Впервые это было обнаружено для Ы-концевого СВМ 2 целлюлазы Се16А Се11и1отопа$Ат1 [34]. Эксперименты показали увеличение концентрации редуцирующих концов после инкубации субстрата с этим СВМ. Происходит разрыв водородных связей между полисахаридными цепями целлюлозы в микрофибриллах (рис. 1). Аналогичный эффект был получен для еще одного СВМ из семейства 20, специфичного к крахмалу [35,36]. Наличие 2 сайтов связывания в этом СВМ существенно для разрушения структуры амилозы. Полисахаридная цепь, связываясь в обоих сайтах, достаточно сильно изгибается, что приводит к разрыву водородных связей с другими цепями субстрата.

Рис 1. Некаталитическая деградация целлюлозы. А - волокно хлопка в 6000-кратном увеличении. В - в 2000-кратном увеличении. С - волокна хлопка после 6-часовой инкубации в присутствии СВМ в 6000-кратном увеличении. D - после 10-часовой инкубации в 2000-кратном увеличении.

Модуляция акгивности фермента. СВМ могут менять активность прилегающих к ним каталитических модулей. Например, СВМ семейства 3 эндоцеллюлазы Е4 Thermonospora fusca способен взаимодействовать с каталитическим модулем GH9, меняя тип его

активности [37]. Было показано, что этот каталитический модуль обладает как экзо- так и эндо-глюканазной активностью на целлюлозе. После того как каталитический модуль делает разрез полисахаридной цепи, СВМЗс связывается с каталитическим модулем, и вследствие этого взаимодействия, меняется конформация аминокислотных остатков активного центра каталитического модуля, в результате чего он процессивно отщепляет целлотетрозу с нередуцирующего конца. Кроме того, за счет взаимодействия СВМЗс и каталитического модуля фермент приобретает активность на новых субстратах [37]. Аналогичные результаты были получены для СВМ 22 бета-1,3-1,4-ксиланазы Xynl OB Clostridium stercorarium [38]. В отличие от бета-глюкана овса, на котором активности отдельного каталитического модуля и его фьюжн-белка с СВМ22 сравнимы, на ксилане ячменя отдельный каталитический модуль не имеет активности. Стабилизация фермента. Показано увеличение стабильности фьюжн-белков, содержащих различные каталитические модули и СВМ. Присутствие СВМ в составе белка увеличивает время полуинактивации, повышает температурный оптимум, делает белок более устойчивым к протеолизу. В настоящее время предполагаются два механизма, объясняющие этот эффект. Во-первых, СВМ, взаимодействуя с каталитическим модулем, уменьшает число сайтов, восприимчивых к атаке протеаз, стабилизирует третичную структуру всего белка. Во-вторых, наличие в структуре белка крупной глобулярной молекулы улучшает растворимость белка, что уменьшаем склонность к агрегации и увеличивает количество правильно уложенного белка [39-42].

1.3 Пространственная структура СВМ

В настоящее время известны ЗЭ-структуры для ряда СВМ различных семейств. Они были получены с использованием методов рентгеновской кристаллографии и ЯМР-спектроскопии. Для некоторых СВМ структуры определены в комплексе с лигандами -олигосахаридами (таблица 1).

Таблица 1. ЗО-структуры СВМ различных семейств. Указаны РБВ коды для разрешенных структур. Структуры, разрешенные в комплексе с лигандом, выделены жирным шрифтом.

Семейство Белок PDB код

СВМ1 Целлюлаза 7 А Trichoderma reesei 1CBH

СВМ2 Ксиланаза 10А Cellulomonasfimi Ксиланаза 11А Cellulomonas fimi 1EXG 2XBD, 1HEH

СВМЗ Скафолдин Clostridium cellulolyticum Скафолдин Clostridium thermocellum Целлюлаза 9A Thermobifida fusca 1G43 1NBC 1TF4

СВМ4 Ламинариназа 16A Thermotoga maritima Целлюлаза 9B Cellulomonas fimi Ксиланаза 10A Rodothermus marinus 1GUI 1ULO, 1GU3, 1CX1 1K45

СВМ5 Целлюлаза 5A Erwinia chrysanthemi Хитиназа В Serratia marcescens 1AIW 1E15

СВМ6 Ксиланаза IIA Clostridium thermocellum Ксиланаза IIA Clostridium stercorarium Эндоглюканаза 5A Cellvibrio mixtus 1UXX 1NAE, 1UY4 1UZ0

СВМ9 Ксиланаза 10A Thermotoga maritima 118 А

СВМ 10 Ксиланаза 10A Cellvibrio japonicus 1QLD

СВМ 12 Хитиназа Chi 1 Bacillus circulans 1ED7

СВМ 13 Ксиланаза 10A Streptomyces olivaceoviridis Ксиланаза 10A Streptomyces lividans B-цепь рицина токсина Ricinus communis Абрин Abrus precatorius 1XYF 1MC9 2AAI 1ABR

СВМ14 Тахицитин Tachypleus tridentatus 1DQC

СВМ 15 Ксиланаза ЮС Cellvibrio japonicus IGNy

СВМ17 Целлюлаза 5А Clostridium cellulovorans 1J83

СВМ 18 Агглютинин Triticum aestivum Антимикробный пептид Amaranthus caudatus Хитиназа/агглютинин Urtica dioica 1WGC 1MMC 1EIS

СВМ20 Глюкоамилаза Aspergillus niger ß-амилаза Bacillus cereus 1AC0 1CQY

СВМ22 Ксиланаза 10B Clostridium thermocellum 1DYO

СВМ27 Маннаназа 5A Thermotoga maritima 10F4

СВМ28 Целлюлаза 5A Bacillus sp. 1139 1UWW

СВМ29 Некаталитический белок 1 Pyromyces equi 1GWK

СВМ32 Сиалидаза 33A Micromonospora viridifaciens Галактозооксидаза Ciadobotryum dendroides 1EUU 1GOF

СВМ34 а-амилаза 13A Thermoactinomyces vulgaris Неопуллуланаза Geobacillus strearothermophillus 1UH2 1JOH

СВМ36 Ксиланаза 43A Paenibacillus polymyxa 1UX7

С помощью базы данных сравнений пространственных структур белков DALI была разработана классификация СВМ, основанная на сходстве третичной структуры [43,44]. Сейчас все СВМ можно разделить на 7 типов соответственно их ЗО-структуре [45] (таблица 2).

Таблица 2. Структурные типы СВМ

Номер Укладка Подтип укладки Семейство СВМ

1 Р-сандвич

Р -]е11уго11 2,3,4,6,11,15,17,22,27,28,29, 30,32,35,36,44

иммуноглобулин 9,20,25,26,31,33,34

2 Р-трилистник 13,42

3 Цистеиновый узел 1

4 уникальная 5,12

5 ОВ-укладка связывания олигосахаридов 1,2,3,4,5,10,12

6 Гевеиновая укладка 18

7 Уникальная 14

Как с точки зрения числа семейств, так и с точки зрения общего числа аминокислотных последовательностей, доминирующим типом укладки среди СВМ является р-сандвич (структурный тип 1). Эта укладка состоит из двух Р-листов, каждый из которых включает от 3 до 6 антипараллельных р-тяжей. Кроме СВМ, подобный тип укладки встречается у лектинов растений, галектинов животных, пентраксинов, спермадгезинов, калнексина и некоторых белков эндоплазматического ретикулума. Со всеми ними СВМ не имеет достаточного аминокислотного сходства. За редким исключением, структуры всех СВМ этого типа включают в себя связанные атомы металла, в частности, кальция. В большинстве случаев, эти ионы металлов стабилизируют структуру, однако в СВМ

семейства 36 ксиланазы Xyn43A Paenibacilluspolymyxa ион кальция является медиатором взаимодействия этого СВМ с полисахаридным лигандом [46]. У большинства СВМ этого типа, связывающих как кристаллические нерастворимые, так и растворимые субстраты, сайт связывания расположен на одной и той же поверхности ß-сандвича, образованной одним из ß-листов. Однако СВМ семейств 6 и 32, которые тоже имеют укладку типа ß-сандвич, содержат сайт связывания на границе ß-сандвича. Большое количество СВМ, обладающих укладкой типа ß-сандвич, позволяет определить этот тип укладки как суперсемейство СВМ. Более детальные структурные исследования показали, что это суперсемейство можно разделить на 2 подтипа - СВМ с укладкой типа ß-jellyroll и IG-fold (иммуноглобулиновая укладка). Например, СВМ семейства 11 целлюлазы Се15Е Clostridium thermocellum демонстрирует укладку ß-сандвич с классической искаженной структурой ß-jellyroll (рис 2): два ß-листа из 6 антипараллельных ß-тяжей формируют выпуклую и вогнутую стороны двойного ß-сандвича.

Рис 2. Укладка ß-jellyroll СВМ 11 семейства целлюлазы Се15Е Clostridium thermocellum. Обозначены остатки тирозинов, отвечающие за связывание, а также ионы кальция.

Y129

С

Поиск СВМ, структурно гомологичных этому СВМ11, показал, что подобной структурой также обладают СВМ семейств 29, 4, 22, 15, 27, 17 и 6. Все они имеют укладку р-]е11уго11, основные различия заключаются в конфигурации поверхностных боковых петель. Во всех этих СВМ вогнутая сторона (3-сандвича формирует борозду. У СВМ11 сайт связывания полисахаридов находится в этой борозде. Ионы кальция расположены вдали от связывающей борозды и являются недоступными для растворителя, поэтому, скорее всего, стабилизируют структуру, подобно ионам кальция у СВМ семейств 4, 6, 9 и 22 [47]. В противоположность этой структуре, СВМ семейства 31 ксиланазы из А1саИхепе.ч демонстрирует укладку, подобную укладке иммуноглобулина (рис. 3).

Рис. 3 Иммуноглобулиновая укладка СВМ31. а - гексамерный комплекс СВМ31, b - (3-сандвич структура мономера, с - модель поверхности СВМ31. На рисунке указаны остатки триптофанов и тирозинов, участвующие в связывании.

Р1. (32, (36 и [35 тяжи, находящиейся на одном антипараллельном (3-листе, взаимодействуют с [34, [33, Р7 и [38 тяжами другого антипараллельного листа. Кроме того, структура содержит 2 внутримолекулярных дисульфидных мостика, расположенных в N- и С-концевых петлевых областях, которые соединяют N- и С-концы и тем самым стабилизируют структуру СВМ [48]. Поиск с помощью базы данных DALI показал, что

подобный тип укладки встречается среди СВМ семейств 9, 25, 26, 33 и 34. Пространственные структуры этих СВМ подобны иммуноглобулиновой укладке, различия проистекают вследствие вставки дополнительных вторичных структур [32,4951].

Второй по распространенности среди СВМ тип укладки - р-трилистник. Чаще всего эта укладка ассоциируется с В-цепью рицина [52,53]. Укладка содержит 12 Р-тяжей, формирующих 6 поворотов-шпилек. Структура Р-бочонка формируется 3 шпильками, а 3 остальных шпильки образуют треугольную крышку для Р-бочонка, называемую шпилечным триплетом (рис. 4).

Рис. 4. Р-бочонок элемент из 1ХУР структуры СВМ 13 ксиланазы ХупЮА ЫгерЮтусеь о11гасеохчг1сИъ.

Субъединица этой укладки, называемая трилистниковым доменом, является непрерывной аминокислотной последовательностью, состоящей из 4 ß-тяжей, обладающая 2-шпилечной структурой треугольной формы. Каждый трилистниковый домен вносит 1 шпильку для формирования ß-бочонка, и 1 шпильку в шпилечный триплет. Полученная структура обладает осью псевдосимметрии 3 порядка, что дает возможность СВМ иметь 3 сайта связывания полисахаридов, расположенные в каждом трилистниковом домене [54]. Эта особенность укладки присуща СВМ 13 ксиланаз из Streptomyces lividans и Streptomyces olivaceoviridis, чем обусловлено выское сродство к ксилозе [55-58]. Лектины растений с такой укладкой используют преимущества этой укладки, образуя димеры, которые взаимодействуют с глюканами поверхности клетки со значительно большей аффинностью [52,59].

ОВ-укладка - укладка СВМ, связывающих олигосахариды. Члены семейств 3,4 и 5 представляют собой относительно маленькие полипептиды, длиной в 30-60 аминокислотных остатков, содержат лишь ß-листы и спирали и демонстируют меньшее разнообразие связываемых субстратов, по сравнению с членами семейств 1 и 2. Чаще всего они специализируются в связывании целлюлозы и хитина. Большинство имеет плоские сайты связывания, содержащие ароматические остатки, за исключением СВМ семейства 12. ЯМР-структура СВМ 12 не выявила никаких очевидных плоских гидрофобных поверхностей, которые могли бы служить сайтом связывания. К особенностям укладки можно также отнести тот факт, что сайт связывания СВМ семейства 10 ксиланазы XynlOA Cellvibrio japonicus расположен на обратной по сравнению с сайтами связывания других СВМ стороне ОВ-укладки. Гевеиновая укладка - такой тип укладки имеют некоторые маленькие, длиной приблизительно 40 аминокислотных остатков, СВМ, первоначально идентифицированных как хитин-связывающие белки растений. Укладка состоит преимущественно из спиралей.

а также 2 маленьких (3-листов, соединенных спиралью. Эта укладка содержит до удивления большой сайт связывания, что характерно для рицина \\ЮА, который способен связывать хитотетрасахарид. СВМ 18 семейства является образцом минимальной гевеиновой укладки. СВМ 14 семейства также включают в себя элементы гевеиновой укладки, однако их слияние со структурой |3-листа не позволяет отнести эти СВМ к этому типу укладки.

1.4 Взаимосвязь структуры и функций СВМ

Все СВМ можно разделить на 3 группы по типу связываемого ими субстрата. Группа А -те СВМ, которые связывают кристаллические субстраты, В - аморфные субстраты, С -олигосахариды [28]. Такое разделение основано на форме сайта связывания. Тип А - СВМ, которые связываются с поверхностью, сайт связывания представляет собой плоскую платформу. Тип В - связываются с полисахаридной цепью, сайт связывания - борозда. Тип С - связываются с короткой цепью олигосахарида, их сайт связывания может представлять собой карман (рис. 5).

Рис. 5. Форма сайта связывания СВМ различных типов. А - плоская платформа сайта связывания, В - сайт связывания в виде борозды, С - сайт связывания в виде кармана. На рисунке показаны ароматические группы триптофанов и тирозинов, участвующих в связывании.

Предпринимались попытки установить соотвествие между структурой СВМ и его функциями. Для этого все типы укладки СВМ распределялись по типам связываемого ими субстрата. Результаты представлены в таблице 3 и рисунке 6.

Таблица 3. Классификация типов укладки СВМ по типам связываемого субстрата.

Тип связываемого субстрата Структурный тип Семейства СВМ

А(кристаллические субстраты) 1,3,4,5 1,2а,3,5,10

В (аморфные субстраты) 1 2Ь,4,6,15,17,20,22,27,28, 29,34,36

С (олигосахариды) 1,2,6,7 9,13.14,18,32

Тур© В

а

Рис.6 3D-структуры СВМ, сгруппированные по типам укладки и типам субстрата. Цифры указывают на структурный тип, к которому относятся СВМ.Туре А,В, С - типы связываемого субстрата, а - семейство 17 СВМ, Сс СВМ 17 Clostridium cellulovoransin, b -семейство 4 СВМ TmCBM4-2 Termotoga maritima, с - семейство 15 СВМ, Cj СВМ15 Cellvibrio japonicus, d - семейство 3 СВМ, Ct CBM3 Clostridium thermocellum, e - семейство 2 СВМ, Cf CBM2 Cellulomonasßmi, f - семейство 9 СВМ, TmCBM9-2 Termotoga maritima, g - семейство 32 СВМ, MvCBM32 Micromonospora viridifaciens, h - семейство 5 СВМ. Ее CBM5 Erwinia chrysanthemi, i - семейство 13 СВМ, Sl СВМ 13 S. lividans, j - семейство 1 СВМ, Tr CBM1 Trichoderma reesei, k - семейство 10 СВМ, Cj СВМ 10 Cellvibrio japonicus. 1 - семейство 18 СВМ Urtica diocain, m - семейство 14 СВМ, tachychitin Tachypleus tridentatus.

Type С

Type A

Эти результаты позволяют охарактеризовать все 3 группы СВМ. Группа А. СВМ, связывающие кристаллические субстраты - эта группа СВМ самая необычная, так как свойства СВМ, входящих в группу А, существенно отличаются от других углевод-связывающих белков. Группа включает СВМ семейств 1, 2а, 3, 5 и 10, которые связываются с нерастворимой высоко кристаллизированной целлюлозой и хитином. В то время как насыщенность сайтов связывания ароматическими аминокислотными остатками соответствует большинству других углевод-связывающих белков, конформация сайта связывания в виде плоской платформы является их особенностью. Считается, что плоская архитектура сайта связывания является дополнительной к плоским гидрофобным поверхностям кристаллов целлюлозы и хитина [60,61]. Ряд исследований показал, что СВМ семейств 1 и 3 связываются с гидрофобными [110]-плоскостями кристаллов кристаллической целлюлозы. Несмотря на то, что в идеальных кристаллах площадь этих сторон слишком мала, чтобы обеспечить наблюдаемую силу связывания, in vivo эти области кристаллической целлюлозы могут быть достаточно сильно разрушены, что сделает доступной для связывания большую площадь [63]. Связывание СВМ группы А с кристаллической целлюлозой характеризуется положительной энтропией связывания, демонстрируя, что термодинамические силы, которые управляют связыванием СВМ с кристаллическими субстратами, относительно уникальны [64]. Молекулы воды, вытесняемые из сайта связывания при связывании белка и лиганда, увеличивают энтропию системы. Этот положительный вклад оказывается больше отрицательного вклада, проистекающего из-за конформационных ограничений, накладываемых на лиганд при связывании.

Группа В. СВМ, связывающие отдельные полисахаридные цепи. Полученные 3D-структуры показывают, что сайты связывания у таких СВМ достаточно протяженные (>15А), представляют собой узкие борозды и содержат несколько субсайтов, способных принимать углеводные олигомеры полисахаридной цепи. Связывающая способность

такого сайта прямо пропорциональна степени полимеризации углевода. В ряде экспериментов показаны наибольшее сродство к пенто- и гексосахаридам и пренебрежимо малая аффинность к олигосахаридам со степенью полимеризации 3 и меньше. Глубина сайтов связывания полисахаридных цепей варьирует от очень мелких, до способных принять целиком всё кольцо пиранозы. Как и в случае группы А, ароматические аминокислотные остатки играют центральную роль в связывании полисахарида, а ориентация этих остатков - ключ, определяющий специфичность СВМ к определенным субстратам [65]. В отличие от группы А, прямые водородные связи также играют существенную роль в силе связывания и субстратной специфичности СВМ группы В [47,66,67]. Непрямые водородные связи, с водой в качестве медиатора, не играют существенной роли в связывании СВМ типа В с их лигандами [66].

Группа С. К этой группе относятся СВМ, связывающие малые олигосахариды. Этот класс СВМ имеет лектино-подобные свойства и связывает моно-, ди- и три-сахариды. Таким образом, СВМ не нуждаются в протяженном сайте связывания, типичном для СВМ группы В. Следует подчеркнуть, что различия между СВМ групп В и С могут быть достаточно тонкими. Например, СВМ семейства 6 ксиланазы из Clostridium stercorarium группы В имеет укладку, схожую с укладкой лектино-подобного СВМ семейства 32, группы С, но способен связывать более протяженные полисахаридные цепи [26]. Более того, СВМ семейства 6 целлюлазы Се15А Cellvibrio mixtus содержит два отдельных сайта связывания, которые демонстрируют характеристики модулей типа В и типа С [68,69]. Тем не менее, сеть водородных связей между СВМ и лигандом более интенсивная у СВМ типа С, чем у типа В, что подтверждает сходство с лектинами. Группа С в настоящий момент включает СВМ семейств 9, 13, 14, 18 и 32. Члены семейства 13, например рицин, семейства 14, например, тахицитин, и семейства 18, например агглютинин из зародышей пшеницы (Wheat Germ Agglutinin, WGA), были впервые идентифицированы как лектины с малой связывающей способностью, и только позднее были отнесены к СВМ вследствие

открытия их гомологов в составе гликозил-гидролаз. К ним следует отнести СВМ семейства 9 ксиланазы XynlOA Thermotoga maritima [31,56,70]. СВМ семейства 9 обнаружены преимущественно в ксиланазах, а вышеуказанный СВМ способен распознавать редуцирующие концы ксилана и целлюлозы. С-концевой СВМ семейства 32 сиалидазы Micromonospora viridifaciens имеет схожую укладку с лектином из Anguilla anguilla, специфичным к фукозе, и связывает галактозу [47,71]. В целом, идентификация и исследование СВМ группы С, отстает от групп А и В, возможно, из-за их ограниченного присутсвия в гликозил-гидролазах, активных на клеточной стенке растений. СВМ типа С, в частности семейств 13 и 32, более распространены в бактериальных токсинах и ферментах (гидролазах и трансферазах), которые атакуют поверхность эукариотических клеток и матриксные глюканы.

1.5 Молекулярный механизм связывания СВМ

Механизм связывания СВМ с углеводами был изучен с помощью ЗО-структур СВМ в комплексе с субстратами. Было выделено несколько определяющих факторов, влияющих на связывание.

Боковые цепи ароматических аминокислотных остатков - основные детерминанты, определяющие связывание. Боковые цепи триптофана, тирозина, и в меньшей степени фенилаланина гидрофобно взаимодействуют с пиранозными кольцами сахаридов, что наблюдается практически у всех СВМ.

Топология сайта связывания - сайт связывания определяется расположением и ориентацией ароматических аминокислотных остатков и конфигурацией петель белковой цепи. Сайты связывания СВМ чаще всего являются жесткими структурами, отображающими конформацию субстрата (рис. 7).

Рис. 7. Сайт связывания СВМ 22 семейства ксиланазы ХупЮВ С1оь1г1(1шт н1егсогаг 'шт. Указаны ароматические и полярные остатки, определяющие конформацию связываемых субстратов.

Форма сайта связывания бывает различна - от плоской платформы, связывающей кристаллические субстраты, до щели р-сандвича, приспособленного связывать отдельные полисахаридные цепи. В последнем случае ароматические остатки часто располагаются напротив друг друга, и, взаимодействуя с а- и (3-сторонами пиранозы. зажимают цепь в сайте связывания. Такой механизм характерен для СВМ 4, 6, 9 и 22 семейств. Также нередко наблюдается ненулевые углы между плоскостями ароматических групп для нескольких ароматических остатков в сайте связывания, вследствие чего он принимает «скрученную» форму, больше подходящую для связывания определенного типа

субстратов. Это характерно для СВМ семейств 2Ь, 15, 17, 27, 29, 34 и 36. Как скрученная платформа так и сандвич могут аккомодировать различные конформации растворимых полисахаридов. Например, известно, что полисахаридные цепи ксилана образуют спирали с осью симметрии 3 порядка [72]. Такая конформация цепи ксилана была обнаружена в ЗП-струкгуре СВМ семейства 15, которые имеют сайт связывания типа скрученной платформы [73], а также для СВМ семейства 6, которые также имеют сайт связывания -скрученную платформу [26,69]. Важность топологии сайта связывания была подтверждена при исследованиях СВМ семейства 2Ь Се11и1отопаз /7>ш, специфичных к ксилану. Хотя эти СВМ гомологичны по аминокислотной последовательности СВМ семейства 2а, аффинных к целлюлозе, их сайты связывания содержат два остатка триптофана, у которых плоскости ароматических групп боковых цепей расположены под прямым углом друг к другу (рис. 8А), что отражает спиральную конфигурацию ксилана. Мутация Аг§262—Ю1у приводит к разворачиванию одного из триптофанов в одну плоскость с другим триптофаном (рис. 8В), имитируя сайт связывания СВМ семейства 2а, таким образом, переключив специфичность модуля с ксилана на кристаллическую целлюлозу [65].

Рис. 8 Структура сайтов связывания СВМ семейства 2Ь и его мутанта (Arg262~»Gly) из Cellulomonas fimi. А - конфигурация ароматических остатков дикого протеина. В - то же для мутанта (Arg262—>Gly), С - связывание целлоолигосахарида с СВМ семейства 2b, D -наличие боковых петель не позволяет гомологу СВМ семейства 2Ь из Thermotoga neapolitana связывать прямые целлоолигосахариды, зато дает возможность связывать U-образные ламинариолигосахариды. Указаны ароматические группы связывающих остатков триптофана. Стрелками показаны боковые петли, определяющие изменение типа связываемого субстрата.

Различная конфигурация петель также может радикально менять углевод-связывающие свойства СВМ. Например, cfCBM 4 семейства из Cellulomonas fimi и tmCBM того же 4 семейства из Thermotoga maritima высоко гомологичны и имеют схожие 3 D-структуры. Основное различие - вставка двух петель в структуре tmCBM, вследствие чего он может

связывать изогнутые цепи ламинариолигосахаридов, но неспособен связать прямые цепи целлюлозы, которые связываются модулем сГСВМ (Рис. 8С и 813) [74]. Конформация лиганда. Известно, что в водном растворе ламинарисахариды принимают и-образную форму [75], сайт их связывания должен отражать именно нативную форму лиганда, для оптимизации связывания. Изучение ЗО-структур СВМ 4 семейства в комплексе с субстратом обнаружило сайт связывания в виде щели сандвича [74], а СВМ 17 и 29 семейств - сайт в виде скрученной платформы [47,76]. Конформации целло-олигосахаридов показывают, что связанная цепь полисахарида скручена, но не имеет симметрии ни 2-, ни 3-го порядка. Хотя в идеальном кристалле целлюлозы наблюдаются цепи с осью симметрии 2 порядка. Однако такие конфигурации лигандов соответствуют конформации целлоолигосахаридов в воде [75]. Чтобы максимизировать энергию связывания, СВМ имеют сайты связывания, отражающие водные конформации лигандов. Водородные связи. Углеводы - амфипатические молекулы, и, благодаря наличию большого числа гидроксильных групп, способны образовывать многочисленные водородные связи с полярными аминокислотными остатками белковой цепи. Например, у лектинов и других сахар-связывающих белков, таких как транспортеры моносахаров, при связывании образуется насыщенная сеть прямых и непрямых водородных связей между

белком и углеводом. У лектинов плотность водородных связей составляет около 3.5

2 2 связи/100А [27]. У СВМ сеть водородных связей менее плотная, около 2 связи/100А .

(Значение рассчитано на основе ЗБ-структур СВМ группы В в комплексе со связанным

углеводным лигандом). Меньшая плотность водородных связей у СВМ обусловлена

необходимостью связывать полисахариды, оснащенные большими боковыми группами,

присутствующие в стенке клетки растений. Относительная важность прямых водородных

связей варьирует в зависимости от типа субстрата, связываемого СВМ. Например, у СВМ

группы А, мутации (с заменой на аланин) полярных остатков сайта связывания, которые

могут устанавливать водородные связи с лигандом, почти не сказываются на константах

связывания. Т.е. у СВМ группы А водородные связи почти не играют роли в процессе распознавания субстрата [61]. У СВМ групп В и С аналогичные мутации могут приводить к значительному уменьшению силы связывания, от двухкратного [64,47,77] до почти полного исчезновения аффинности [67].

Ионы металлов. Многие сахар-связываюгцие белки являются металлопротеинами. Например, у лектинов кальций играет значительную роль во взаимодействии с лигандами, либо структурируя сайт связывания в правильной конформации, либо устанавливая координационные связи с лигандом. В этом СВМ похожи на лектины. Кальций у СВМ выполняет две функции - во-первых, стабилизирует структуру белка, во-вторых, взаимодействует с углеводным лигандом. Например, распознавание ксилана у СВМ семейства 35 из Се1ЫЬгю]аротст кальций-зависимое [78]. Также было продемонстрировано, что СВМ 36 семейства из РаетЬасШш ро1утуха распознают ксило-олигосахариды в присутствии кальция [46]. На рисунке 9 показано, как ион кальция играет роль посредника взаимодействия, устанавливая прямые связи между СВМ и ксилотриозой и стабилизируя связывание.

Рис. 9. Схема водородных связей при связывании ксилотриозы СВМ36 с ионом кальция в качестве посредника. Ион кальция изображен шариком, пунктирные линии показывают координирующие водородные связи между кальцием и атомами кислорода гидроксильных групп пираноз субстрата и аминокислотных остатков.

Аккомодация боковых цепей полисахаридов - полисахариды клеточной стенки, являющиеся лигандами большинства СВМ, очень гетерогенны по структуре. Часто они декорированы разнообразными сахар - и ацетат-полимерами. Степень декорирования и тип боковых цепей зависит от вида растения, типа клетки и стадии дифференцировки. СВМ часто способны связывать по-разному декорированные субстраты, демонстрируя «пластичность» связывания. Например, СВМ семейства 15 ксиланазы ЮС из Се1ЫЬпо ]аротст может взаимодействовать как с сильно замещенными арабиноксиланами, так и с почти неразветвленными формами Р-1,4-ксилана с приблизительно одинаковыми константами связывания. Арабиноксиланы сохраняют спиральную симметрию 3-порядка, которую имеет линейный ксилан, при этом группы арабинозы расположены в тех же плоскостях, что и ксилозы скелета полисахаридной цепи [73].

Рис. 10. ЗО-структура комплекса СВМ27 Thermotoga maritima с декорированным субстратом G2M5 (63,64-а-0-галактозил-маннопентаоза). Обозначены остатки триптофана, участвующие в связывании. Остатки маннозы нарисованы голубым цветом, остатки галактозы - желтым. Левый верхний остаток галактозы отклонен от своего равновесного положения в цепи галактоманнана, чтобы оптимизировать взаимодействие с W28, в то время как другие остатки галактозы не участвуют в связывании.

Белок образовывает относительно немного водородных связей с сахарами. 6 из 10 0-2 и 0-3 групп в ксилоолигосахариде окружены растворителем, поэтому боковые цепи, присоединенные в этих положениях, не будут мешать связыванию лиганда. Подобный механизм аккомодации а-1,6-связанных галактозных боковых цепей галактоманнана был обнаружен при анализе комплекса СВМ семейства 29 из Piromyces equi с манногексаозой [76]. В этом случае 0-6 группы чередующихся манноз в сайте связывания погружены в растворитель. Это позволяет СВМ взаимодействовать с теми областями полисахарида, в которых галактозные боковые цепи не присоединены к прилегающим сахарам скелета цепи. Изучение 3 D-структуры комплекса СВМ 27 семейства из Thermotoga maritima с декорированным субстратом G2M5 (63,64-a-D- галактозил-маннопентаоза) подтвердило эти выводы [79]. Галактоза в субсайте 4 отклонена от протеина, поэтому не влияет на связывание в этом субсайте, в то время как боковая цепь в субсайте 3 отклоняется триптофаном в плоскость, параллельную скелету манноз (рис. 10). Потеря энергии из-за этого конформационного изменения лиганда является причиной сильного ослабления аффинности СВМ к G2M5 по сравнению с линейной маннопентаозой и подтверждается наблюдениями, что связывание СВМ с галактоманнаном происходит только если замещения в полисахариде несмежные.

Разнородный скелет полисахарида. СВМ также способны связывать полисахариды с гетерогенным скелетом. Например, СВМ семейства 29 из Piromyces equi распознает ß-1,4-связанные полисахариды манноз и глюкоз, не связываясь с другими структурными полисахаридами растений. Структура СВМ в комплексах с манно- и целлогексаозой демонстрирует пластичность прямых взаимодействий белка с аксиальными и экваториальными гидроксильными группами маннозы и глюкозы [76]. Это находится в резком контрасте со свойствами маннанспецифичных СВМ 27 семейства из Thermotoga maritima, для которых экваториальные гидроксильные группы глюкоз интерферировали

бы с аминокислотными остатками в двух из пяти субсайтов, что делает невозможным связывание целлюлозы этими СВМ [79].

Конформационные изменения при связывании. Несмотря на наличие жесткого сайта связывания может быть ситуация, когда аминокислотные остатки и боковые цепи полисахарида меняют свои конформации в процессе связывания, тем самым оптимизируя энергию связывания.

I.6 Множественные взаимодействия СВМ.

Все углевод-связывающие белки можно разделить на две группы, исходя из значения их константы связывания [80]. В группу I входят белки, которые обладают сильным сродством к углеводам: Ка >106 М-1. При этом лиганд почти полностью входит в сайт связывания. К группе II относятся белки с низкой константой связывания: Ка <106 М '.В этом случае лиганд частично входит в сайт связывания, некоторые его участки взаимодйствуют не с белком, а с растворителем. В основном, СВМ принадлежат к группе

II, поскольку СВМ взаимодействуют с лигандами без насыщения связей. СВМ могли эволюционировать в сторону именно слабого связывания, т.к. для них может быть предпочтительнее иметь относительно низкое сродство к более широкому спектру субстратов, чем высокое к какому-то единичному субстрату. С другой стороны, слабое связывание может быть следствием ограничения числа прямых взаимодействий из-за стерических ограничений ввиду того, что связываемый лиганд является фрагментом сложного комплекса полисахаридов. Слабость взаимодействия отдельных СВМ часто компенсируются его множественными взаимодействиями. Существует два типа таких взаимодействий. 1 ,Ы-взаимодействия - СВМ взаимодействует с несколькими сайтами лиганда, например, за счет наличия нескольких сайтов связывания у СВМ. Невзаимодействия - несколько СВМ взаимодействуют с одним сайтом лиганда, например, за счет объединения в димер. В обоих случаях множественность взаимодействия

компенсирует слабость взаимодействия одиночного сайта связывания с одиночным сайтом лиганда.

В настоящее время обнаружены СВМ, которые входят в состав молекулы фермента в виде тандема из двух и более модулей, как относящихся к одному семейству, так и представителей разных семейств. Например, тандем из двух СВМ семейства 2Ь ксиланазы XynllА из Cellulomonasfimi [81], тандем трех СВМ семейства6 из Clostridium stercorarium [82] и тандем СВМ семейств 17 и 28 целлюлазы Се15 из Bacillus sp [83].

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Дворцов, Игорь Александрович

Выводы

1. Показано, что Ы-концевая область 1лс16А с неизвестными функциями, не имеющая гомологов среди известных модулей гликозил-гидролаз, содержит субстрат-связывающий модуль, который стал первым представителем вновь образованного семейства 54 СВМ. Найдены гомологи этого модуля, также включенные в семейство СВМ54.

2. Обнаружено, что СВМ54 содержит не менее двух сайтов связывания, один из которых, вероятно, локализован на Ы-конце СВМ54 и является кальций-независимым, второй расположен на С-конце, кальций-зависимый, с более широкой субстратной специфичностью, связывает помимо глюкозидов, глюкозаминозиды (хитин и хитозан) и пентозиды (ксилан).

3. Показано, что С-концевые модули 1лс16А способны связывать кристаллическую целлюлозу, что является нетипичным для модулей семейства 4.

4. Наибольшее сродство С-концевые модули проявляют к (3-глюкану клеточной стенки дрожжей, ксилану, бактериальной кристаллической целлюлозе и пустулану - тем субстратам, которые не гидролизуются каталитическим модулем 1лс16А. При этом отсутствует сродство к лихенану и ламинарину - основным субстратам фермента.

5. Обнаружен синергизм при связывании тандема С-концевых модулей с авицелом, (3-глюканом и пустуланом. Константа связывания тандема превышает константы связывания отдельных модулей на этих субстратах в 100-1000 раз.

Заключение

В результате проделанной работы изучены свойства 5 вспомогательных модулей, расположенных HaN и С- концах ламинариназы Lie 16А. Получены делеционные варианты ламинариназы, представляющие собой отдельный каталитический модуль и его тандемы с прилегающими модулями: Licl6A-LicAfull - полноразмерный Licl6A без лидерного пептида, LicA-xcat - тандем из X модуля и каталитического модуля, LicA-cat -изолированный каталитический модуль, LicA-catcbd - тандем каталитического модуля и СВМ4А-1. Активности делеционных производных на растворимых субстратах практически не отличались от активности исходного фермента. Определены температурные и рН оптимумы. Для LicA-full и LicA-xcat они равны 70° и рН 6.0. Соответствующие значения для LicA-cat и LicA-catcbd составляют 60°С и рН=6.5. Время полуинактивации LicA-full, LicA-xcat, LicA-cat и LicA-catcbd при 70°С составляет 40, 30, 20 и 20 мин, соответственно. Константы Михаэлиса ниже для тех конструкций, которые содержат N - концевой X модуль, то есть наличие в ферменте Х-модуля увеличивает его сродство к субстрату и повышает термостабильность. Х-модуль оказывает стабилизирующее действие на фермент. На основании данных, полученных при плавлении делеционных мутантов, мы пришли к выводу, что Х-модуль функционирует как самостоятельная единица.

При исследовании способности делеционных мутантов связываться с нерастворимыми полисахаридами были обнаружены углевод связывающие свойства у модуля X. Для дальнейшего изучения свойств этого модуля, мы получили рекомбинантный белок, представляющий собой изолированный модуль X. Обнаружена способность X модуля связываться с нерастворимыми углеводными субстратами - ксиланом, Р-глюканом дрожжевой стенки, ВСС, хитином, пустуланом, Авицелом и хитозаном. Определены константы связывания и субстратные емкости СВМХ. Наличие углевод-связывающих свойств у СВМХ и отсутствие гомологии с уже известными СВМ позволило нам определить его как представителя нового 54 семейства СВМ и зарегистрировать это семейство в базе данных СА2У. Нами найдены и гомологи этого модуля, также включенные в семейство СВМ54.

Эксперименты по изучению связывания СВМ54 показали, что белок, снимаемый в процессе элюции с субстратов, специфически гидролизуется. Фракция, снятая с субстрата после связывания, содержит две белковых зоны, с массами 25 кХ)а и 17 кГ)а. Тяжелая зона соответствует полноразмерному СВМ54. Чтобы проверить предположение о том, что легкий белок - это укороченный СВМ54, от которого отщеплена часть с массой 8 кБа, и определить место разрыва, мы определили Ы-концевую последовательность легкого белка. Последовательность из 10 аминокислот расположенных на М-конце легкой зоны является - БШРШТКШ. Место специфического протеолиза локализовано на последовательности СВМ54. Теоретически вычисленная масса укороченного белка, найденная по аминокислотной последовательности, совпала с массой, определенной по электрофорезу. Был получен рекомбинантный белок, соответствующий С-концевой части СВМ54. Исследовали его углевод-связывающие свойства, в частности влияние кальция на субстрат-связывающие свойства. Связывания СВМ54С с авицелом, пустуланом и хитозаном не происходит в отсутствии кальция. Константы связывания СВМ54С и СВМ54 с аморфными субстратами ниже, чем с кристаллическими. Из кристаллических константы выше для более плотно упакованных субстратов. Абсолютные значения констант связывания для всех использованных субстратов относительно невелики. Из данных по связыванию мы предположили существование, по меньшей мере, двух сайтов связывания у СВМ54.

Л I

Ы-концевая часть СВМ54, вероятно, содержит Са -независимый сайт, т.е. сайт, связывание в котором не зависит от наличия ионов кальция в растворе, а связывание с

2+ сайтами, расположенными в С-концевой части возможно в присутствии ионов Са . Обнаруженный и исследованный нами СВМ54 обладает широкой субстратной специфичностью к полисахаридам, в том числе, сродством к хитину и хитозану. Хитозан давно нашел широкое применение в медицине и косметике, поэтому СВМ54 может быть использован для создания поливалентных биотехнологических препаратов. В С-концевой области 1лс16А расположены тандемом четыре СВМ, относящиеся к 4 семейству углевод-связывающих модулей - СВМ41, СВМ4 2, СВМ4 3 и СВМ4 4. Их свойства, а также биологическая роль тандема - СВМз1-4, были не изучены. Нами изолированы С-концевые модули 1лс16А, а также тандем С-концевых модулей - СВМз1-4. Все 4 СВМ связывались с бактериальной кристаллической целлюлозой (ВСС), что является нетипичным для представителей СВМ 4 семейства. Обнаружено сродство к хитину, хитозану, авицелу и постулану. Тандем модулей СВМз1-4 показал более высокое сродство по сравнению с индивидуальными СВМ4 к авицелу, Р-глюкану клеточной стенки дрожжей и пустулану. Его константы связывания на этих субстратах примерно в 100 раз выше чем у отдельных модулей, то есть С-концевые СВМ4 действуют синергидно. Поскольку тандем С-концевых СВМ4 показал синергизм в отношении Авицела, нерастворимого Р-глюкана клеточной стенки дрожжей и пустулана, то, вероятно, роль тандема СВМ4 1лс16А - доставка фермента к лихенану и ламинарину, в природе локализованным в комплексе именно с этими углеводами. Известно, что в естественных условиях Clostridium thermocellum утилизирует полисахариды из остатков клеток растений и лишайников. Лихенан является компонентом клеточной стенки водорослей, ламинарин - ее резервным полисахаридом, ксилан, пустулан, ß-глюкан, хитин -компонентами клеточных стенок растений, грибов и водорослей. Таким образом, наличие синергизма между СВМ фермента, вероятно, способствует тесному связыванию с полисахаридами, которые сопутствуют лихенану и ламинарину и обеспечивают их оптимальный гидролиз.

Предложена схема челночной доставки Licl6A к природным субстратам. Licl6A после экспрессии транспортируется из клетки и закрепляется на S-слое с помощью SLH модулей и СВМ54. При некоторых условиях, фермент, вероятно, может сходить с поверхности клетки и дрейфовать к полисахаридным субстратам - клеточным стенкам водорослей и грибов, связывание с которыми уже обеспечивает С-концевой тандем. Причём на стенке может оставаться якорь из SLH и CBMN-компоненты СВМ54. Вероятно, к этому якорю фермент может снова прикрепляться, работая как челнок.

Работа поддержана грантами РФФИ: 03-04-48610-а «Изучение структуры и свойств новых мультимодульных гликозилгидролаз; исследование субстрат связывающих модулей и их использование в генной инженерии и биотехнологии»; 06-04-48351-а «Структура и функции бактериальных мультимодульных ферментов, гидролизующих растительные субстраты; изучение и использование изолированных модулей»; 09-04-00204-а «Поиск и исследование новых гликозид гидролаз; изучение свойств вспомогательных модулей мультимодульнх ферментов».

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Дворцов, Игорь Александрович, 2013 год

Список использованной литературы

1. Reese Е.Т., Siu R.G., Levinson H.S. The biological degradation of soluble cellulose derivatives and its relationship to the mechanism of cellulose hydrolysis. // J. Bacteriol. 1950. V. 59, P. 485-497.

2. Gilkes N.R., Warren R.A., Miller R.J., Kilburn D.G. Precise excision of the cellulose binding domains from two Cellulomonas fimi cellulases by a homologous protease and the effect on catalysis. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263, P. 10401-10407.

3. Tomme P., Van Tilbeurgh H., Pettersson G., Van Damme J., Vandekerckhove J., Knowles J., Teeri Claeyssens M. Studies of the cellulolytic system of Trichoderma ressei QM 9414. Analysis of domain function in two cellobiohydrolases by limited proteolysis. // Eur. J. Biochem. 1988. V. 170, P. 575-581.

4. Van Tilbeurgh H., Tomme P., Claeyssens M., Bhikhabhai R. Limited proteolysis of the cellobiohydrolase I from Trichoderma ressei. Separation of functional domains. // FEBS Lett. 1986. V. 204. P. 223-227.

5. Boraston A., Bray M., Burn E., Tomme P., Kilburn D.G. The structure and function of cellulose binding domains. / In Claeyssens M., Nerinkx W. and Piens K. (ed). Carbohydrate from Trichoderm aressei and other microorganisms. // The Royal Society of Chemistry, Cambridge, UK. 1998. P. 139-146.

6. Boraston A.B., McLean B.W., Kormos J.M., Kilburn D.G., Warren R.A.J. Carbohydrate-binding modules: diversity of structure and function. / In Gilbert H.J., Davies G.J., Henrissat B. and Svensson B. (ed). Recent advances in carbohydrate bioengineering. // The Royal Society of chemistry, Cambridge, UK. 1999. P. 202-211.

7. Coutinho P.M., Henrissat B. Carbohydrate-active enzymes: an integrated database approach. / In Gilbert H.J., Davies G.J., Henrissat B. and Svensson B. (ed). Recent advances in carbohydrate bioengineering. // The Royal Society of chemistry, Cambridge, UK. 1999. P. 3-12.

8. База данных углевод-связывающих модулей. // 2013.

URL:http://\vww.cazy.org/Carbohydrate-Binding-Modules.html. (Дата обращения 25.02.2013)

9. Ноша F.L., Hollander,Т., Lehman,D.J., Thomsen,D.R. and Elhammer,A.P. Isolation and expression of a eDNA clone encoding a bovine UDP-GalNAc polypeptide N-acetylgalactosaminyltransferase. // J. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 12609-12616.

10. Jiang Z., Dang W., Yan Q., Zhai Q., Li L., Kusakabe I. Subunit composition of a large xylanolytic complex (xylanosome) from Streptomyces olivaceoviridis E-86. // J Biotechnol. 2006. V. 126, P. 304-312.

11. Lairson L.L., Henrissat В., Davies G.J., Withers S.G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. // Annu Rev Biochem. 2008. V. 77. P. 521-555.

12. Lombard V., Bernard Т., Rancurel C., Brumer H., Coutinho P.M., Henrissat В. A hierarchical classification of polysaccharide lyases for glycogenomics. // Biochem. J. 2010. V. 432. P. 437-444.

13. Garron M.L., Cygler M. Structural and mechanistic classification of uronic acid-containing polysaccharide lyases. // Glycobiology. 2010. V. 20, P. 1547-1573.

14. van den Brink J., de Vries R.P. Fungal enzyme sets for plant polysaccharide degradation. // Appl Microbiol Biotechnol. 2011. V. 91. P. 1477-1492.

15. Yoshida S., Mackie R.I., Cann I.K. Biochemical and domain analyses of FSUAxe6B, a modular acetyl xylan esterase, identify a unique carbohydrate binding module in Fibrobacter succinogenes S85. // J. Bacteriol. 2010. V. 192. P. 483-493.

16. Shimon L.J., Bayer E.A., Morag E., Lamed R., Yaron S., Shoham Y., Frolow F. A cohesin domain from Clostridium thermocellum: the crystal structure provides new insights into cellulosome assembly. // Structure. 1997. V. 5, P. 381-390.

17. Lytle B.L., Volkman B.F., Westler W.M., Heckman M.P., Wu J.H. Solution structure of a type I dockerin domain, a novel prokaryotic, extracellular calcium-binding domain. J. Mol. Biol. 2001. V. 307. №3. P. 745-753.

18. Carvalho A.L., Dias F.M., Prates J.A., Nagy T., Gilbert H.J., Davies G.J., Ferreira L.M., Romao M.J., Fontes C.M. Cellulosome assembly revealed by the crystal structure of the cohesin-dockerin complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. V. 100. № 24. P. 13809-13814.

19. Adams J. J., Webb B.A., Spencer H.L., Smith S.P. Structural characterization of type II dockerin module from the cellulosome of Clostridium thermocellum: calcium-induced effects on conformation and target recognition. // Biochemistry. 2005. V. 44. P. 2173-2182.

20. Shoham Y., Lamed R., Bayer E. The cellulosome concept as an efficient microbial strategy for the degradation of insoluble polysaccharides. // Trends Microbiol. 1999. V. 7. P. 275-281.

21. Yoshida M., Igarashi K., Wada M., Kaneko S., Suzuki N., Matsumura H., Nakamura N., Ohno H., Samejima M. Characterization of carbohydrate-binding cytochrome b562 from the white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium. II Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 4548-4555.

22. Cosgrove D.J. Loosening of plant cell walls by expansins. //Nature. 2000. V. 407. P. 321 -326.

23. Barrel P., Suarezs C., Batanero E., Alfonso C., Alche J.D., Rodriguez-Garcia M.J., Villalba M., Rivas G., Rodriguez R. An olive pollen protein with allergenic activity, Ole e 10, defines a novel family of carbohydrate-binding modules and is potentially implicated in pollen germination. // Biochem. J. 2005. V. 390. P. 77-84.

24. Komath S.S., Kavitha M., Swamy M.J. Beyond carbohydrate binding: new directions in plant lectin research. // Org. Biomol. Chem. 2006. V. 4. P. 973-988.

25. Sharon N. and Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules. // Glycobiology. 2004. V. 14. P. 53-62.

26. Boraston A.B., Notenboom V., Warren R.A.J., Kilburn D.G., Rose D.R. and Davies, G. Structure and ligand binding of carbohydrate-binding module CsCBM6-3 reveals similarities with fucose-specific lectins and "galactose-binding" domains. // J. Mol. Biol. 2003. V. 327. P. 659-669.

27. Garcia-Hernandez E. and Hernandez-Arana A. Structural bases of lectin-carbohydrate affinities: comparison with protein-folding energetics. // Protein Sci. 1999. V. 8. P. 1075-1086.

28. Boraston A.B., Bolam D.N., Gilbert H.J. and Davies G.J. Carbohydrate-binding modules: fine-tuning polysaccharide recognition. // Biochem. J. 2004. V. 382. P. 769-781.

29. Bolam D.N., Ciruela A., Mcqueen-Mason S., Simpson P., Williamson M.P., Rixon J.E., Boraston A., Hazlewood G.P., Gilbert H.J. Pseudomonas cellulose-binding domains mediate their effects by increasing enzyme substrate proximity. // Biochem. J. 1998. V. 331. P. 775-781.

30. Buchanan Gruissem Jones. / Biochemistry & molecular biology of plants (1st ed.). // American society of plant physiology. 2000.

31. Boraston A.B., Creagh A.L., Alam M.M., Kormos J.M., Tomme P., Haynes C.A., Warren R.A.J., Kilburn D.G. Binding specificity and thermodynamics of a

family 9 carbohydrate-binding module from Thermotoga maritima xylanase 1 OA. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 6240-6247.

32. Notenboom V., Boraston A.B., Kilburn D.G., Rose D.R. Crystal structures

of the family 9 carbohydrate-binding module from Thermotoga maritima xylanase 1 OA in native and ligand-bound forms. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 6248-6256.

33. Carrard G., Koivula A., Soderlund H., Beguin P. Cellulose-binding domains promote hydrolysis of different sites on crystalline cellulose. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. V. 97, P. 10342-10347.

34. Din N., Damude H.G., Gilkes N.R., Miller Jr R.C., Warren R.A.J., Kilburn D.G. Cl-Cx revisited: intramolecular synergism in a cellulase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994. V. 91. P. 11383-11387.

35. Gao P.J., Chen G.J., Wang T.H., Zhang Y.S., Liu J. Non-hydrolytic disruption of crystalline structure of cellulose by cellulose binding domain and linker sequence of cellobiohydrolase I from Penicillium janthinellum. Shengwu Huaxue Yu Shengwu Wuli Xuebao. 2001. V. 33. P. 13-18.

36 Giardina Т., Gunning A.P., Juge N., Faulds C.B., Furniss C.S., Svensson В., Morris V.J., Williamson G. Both binding sites of the starch-binding domain of Aspergillus niger glucoamylase are essential for inducing a conformational change in amylose. // J. Mol. Biol. 2001. V. 313. P. 1149-1159.

37. Irwin D., Shin D.H., Zhang S., Barr B.K., Sakon J., Karplus P.A. and Wilson D.B. Roles of the Catalytic Domain and Two Cellulose Binding Domains of Thermomonospora fusca E4 in Cellulose Hydrolysis. //J. Bacteriol. 1998. V. 180. P. 1709-1714.

38. Araki R., Ali M.K., Sakka M., Kimura Т., Sakka K., Ohmiya K. Essential role of the family-22 carbohydrate-binding modules for L-l,3-l,4-glucanase activity of Clostridium stercorarium XynlOB. // FEBS Lett. 2004. V. 561. P. 155-158.

39. Kraulis J., Clore G.M., Nilges M., Jones T.A., Pettersson G., Knowles J., Gronenborn A.M. Determination of the three-dimensional solution structure of the C-terminal domain of cellobiohydrolase I from Trichoderma reesei: a study using nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical simulated annealing. // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 72417257.

40. Zhang S., Lao G., Wilson D.B. Characterization of a Thermomonospora fusca exocellulase. // Biochemistry. 1995. V. 34, P. 3386-3395.

41. Barr B.K., Hsieh Y.L., Ganem В., Wilson D.B. Identification of two functionally different classes of exocellulases. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 586-592.

42. Irwin D., Walker L., Spezio M. and Wilson D.B. Activity studies of eight purified cellulases: specificity, synergism, and binding domain effects. // Biotechnol. Bioeng. 1993. V. 42. P. 10021013.

43. Holm L., Sander C. Protein structure comparison by alignment of distance matrices. // J. Mol. Biol. 1993. V. 233. P. 123-138.

44. База данных пространственных структур белков. //2013. URL:http://ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server (дата обращения 12.04.2013)

45. Hashimoto H. Recent structural studies of carbohydrate-binding modules. // Cell. Mol. Life Sci. 2006. V. 63. P. 2954-2967.

46. Jamal-Talabani S., Boraston A.B., Turkenburg J.P., Tarbouriech N., Ducros V.M., Davies G.J. Ab initio structure determination and functional characterization of CBM36; a new family of calcium-dependent carbohydrate binding modules. // Structure. 2004. V. 12. P. 1177-1187.

47. Notenboom V., Boraston A.B., Chiu P., Freelove A.C., Kilburn D.G., Rose D.R. Recognition of cello-oligosaccharides by a family 17 carbohydrate-binding module: an X-ray crystallographic, thermodynamic and mutagenic study. // J. Mol. Biol. 2001. V. 314. P. 797-806.

48. Hashimoto H., Tamai Y., Okazaki F., Tamaru Y., Shimizu T., Araki T., Sato M. The first crystal structure of a family 31 carbohydrate-binding module with affinity to beta-1,3-xylan. // FEBS Lett. 2005. V. 579. P. 4324^1328.

49. Vaaje-Kolstad G., Houston D.R., Riemen A.H., Eijsink V.G., van Aalten D.M. Crystal structure and binding properties of the Serratia marcescens chitin-binding protein CBP21. // J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 11313-11319.

50. Abe A., Tonozuka T., Sakano Y., Kamitori S. Complex structures of Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase 1 with malto-oligosaccharides demonstrate the role of domain N acting as a starch-binding domain. // J. Mol. Biol. 2004. V. 335. P. 811-822.

51. Kamitori S., Kondo S., Okuyama K., Yokota T., Shimura Y., Tonozuka T., Sakano Y. Crystal structure of Thermoactinomyces vulgaris R-47 alpha-amylase II (TVAll) hydrolyzing cyclodextrins and pullulan at 2.6 A resolution. // J. Mol. Biol. 1999. V. 287. P. 907-921.

52. Rutenber E., Robertus J.D. Structure of ricin B-chain at 2.5A resolution. // Proteins. 1991. V. 10. P. 260-269.

53. Murzin A.G., Lesk A.M., Chothia C. P-Trefoil fold: patterns of structure and sequence in the Kunitz inhibitors interleukins-1P and la and fibroblast growth factors. // J. Mol. Biol. 1992. V. 223. P. 531-543.

54. Sweet R.M., Wright H.T., Janin J., Chothia C.H., Blow D.M. Crystal structure of the complex of porcine trypsin with soybean trypsin inhibitor (Kunitz) at 2.6A resolution. // Biochemistry. 1974. V. 13. P. 4212-4228.

55. Boraston A.B., Tomme P., Amandoron E.A., Kilburn D.G. A novel mechanism of xylan binding by a lectin-like module from Streptomyces lividans xylanase 10A. // Biochem. J. 2000. V. 350. P. 933-941.

56. Notenboom V., Boraston A.B., Williams S.J., Kilburn D.G., Rose D.R. High-resolution crystal structures of the lectin-like xylan binding domain from Streptomyces lividans xylanase 10A with bound substrates reveal a novel mode of xylan binding. Biochemistry. 2002. V. 41. P. 4246-4254.

57. Scharpf M., Connelly G.P., Lee G.M., Boraston A.B., Warren R.A.J., Mcintosh L.P. Site-specific characterization of the association of xylooligosaccharides with the CBM13 lectin-like xylan binding domain from Streptomyces lividans xylanase 10A by NMR spectroscopy. Biochemistry. 2002. V. 41. P. 4255-4263.

58. Fujimoto Z., Kuno A., Kaneko S., Kobayashi H., Kusakabe I., Mizuno H. Crystal structures of the sugar complexes of Streptomyces olivaceoviridis E-86 xylanase: sugar binding structure of the family 13 carbohydrate binding module. // J. Mol. Biol. 2002. V. 316. P. 65-78.

59. Baenziger J.U., Fiete D. Structural determinants of Ricinus communis agglutinin and toxin specificity for oligosaccharides. // J. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 9795-9799.

60. Tormo J., Lamed R., Chirino A.J., Morag E., Bayer E.A., Shoham Y., Steitz T.A. Crystal structure of a bacterial family-Ill cellulose-binding domain: a general mechanism for attachment to cellulose.//EMBO J. 1996. V. 15. P. 5739-5751.

61. McLean B.W., Bray M.R., Boraston A.B., Gilkes N.R., Haynes C.A., Kilburn D.G. Analysis of binding of the family 2a carbohydrate-binding module from Cellulomonas fimi xylanase 10A to cellulose: specificity and identification of functionally important amino acid residues. // Protein Eng. 2000. V. 13. P. 801-809.

62. Lehtio J., Sugiyama J., Gustavsson M., Fransson L., Linder M., Teeri T.T. The binding specificity and affinity determinants of family 1 and family 3 cellulose binding modules. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. V. 100. P. 484-489.

63. Nagy T., Simpson P., Williamson M.P., Hazlewood G.P., Gilbert H.J., Orosz L. All three surface tryptophans in Type Ha cellulose binding domains play a pivotal role in binding both soluble and insoluble ligands. // FEBS Lett. 1998. V. 429. P. 312-316.

64. Creagh A.L., Ong E., Jervis E., Kilburn D.G., Haynes C.A. Binding of the cellulose-binding domain of exoglucanase Cex from Cellulomonasftmi to insoluble microcrystalline cellulose is entropically driven. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. V. 93. P. 12229-12234.

65. Simpson P.J., Xie H., Bolam D.N., Gilbert H.J., Williamson M.P. The structural basis for the ligand specificity of family 2 carbohydrate-binding modules. // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 41137-41142.

66. Pell G., Williamson M.P., Walters C., Du H., Gilbert H.J., Bolam D.N. Importance of hydrophobic and polar residues in ligand binding in the family 15 carbohydrate-binding module from Cellvibrio japonicus XynlOC. // Biochemistry 2003. V. 42. P. 9316-9323.

67. Xie H., Gilbert H.J., Charnock S.J., Davies G.J., Williamson M.P., Simpson P.J., Raghothama S., Fontes C.M., Dias F.M., Ferreira L.M., Bolam D.N. Clostridium thermocellum XynlOB carbohydrate-binding module 22-2: the role of conserved amino acids in ligand binding. //Biochemistry. 2001. V. 40. P. 9167-9176.

68. Henshaw J., Bolam D.N., Pires V.M., Czjzek M., Henrissat B., Ferreira L.M., Fontes C.M., Gilbert H.J. The family 6 carbohydrate-binding module CmCBM6-2 contains two ligand-binding sites with distinct specificities. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 21552-21559.

69. Pires V.M., Henshaw J., Prates J.A., Bolam D., Ferreira L.M., Fontes C.M., Henrissat B., Planas A., Gilbert H.J., Czjzek M. The crystal structure of the family 6 carbohydrate-binding module from Cellvibrio mixtus lichenase 5A in complex with oligosaccharides reveals two

distinct binding sites with different ligand specificities. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 2156021568.

70. Winterhalter C., Heinrich P., Candussio A., Wich G., Liebl W. Identification of a novel cellulose-binding domain within the multidomain 120 kDa xylanase XynA of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima. II Mol. Microbiol. 1995. V. 15. P. 431-444.

71. Gaskell A., Crennell S., Taylor G. The three domains of a bacterial sialidase: a (3-propeller, an immunoglobulin module and a galactose-binding jelly-roll. // Structure. 1995. V. 3. P. 1197— 1205.

72. Atkins E.D.T. Three-dimensional structure, interactions and properties of xylans. / In Xylans and Xylanases (Visser, J., ed.) // Elsevier, Amsterdam. 1992. V. 7. P. 39-50.

73. Czabo L., Jamal S., Xie H., Charnock S.J., Bolam D.N., Gilbert H.J., Davies G.J. Structure of a family 15 carbohydrate-binding module in complex with xylopentaose: evidence that xylan binds in an approximate 3-fold helical conformation. // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 49061 -49065.

74. Boraston A.B., Nurizzo D., Notenboom V., Ducros V., Rose D.R., Kilburn D.G., Davies G.J. Differential oligosaccharide recognition by evolutionarily-related (3-1,4 and (3-1,3 glucan-binding modules. //J. Mol. Biol. 2002. V. 319. P. 1143-1156.

75. Sugiyama H., Hisamichi K., Usui T., Sakai K., Ishiyama J.-i. A study of the conformation of b-l,4-linked glucose oligomers, cellobiose to cellohexaose, in solutions. // J. Mol. Struct. 2000. V. 556. P. 173-177.

76. Charnock S.J., Bolam D.N., Nurizzo D., Szabo L., McKie V.A., Gilbert H.J., Davies G.J. Promiscuity in ligand-binding: the three-dimensional structure of a Piromyces carbohydrate-binding module, CBM29-2, in complex with cello- and mannohexaose. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002. V. 99. P. 14077-14082.

77. Kormos J., Johnson P.E., Brun E., Tomme P., Mcintosh L.P., Haynes C.A., Kilburn D.G. Binding site analysis of cellulose binding domain CBD(N1) from endoglucanase C of Cellulomonasfimi by site-directed mutagenesis. // Biochemistry. 2000. V39. P. 8844-8852.

78. Bolam D.N., Hefang X., Pell G., Hogg D., Galbraith G., Henrissat B., Gilbert H.J. X4 modules represent a new family of carbohydrate-binding modules that display novel properties. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 22953-22963.

79. Boraston A.B., Revett T.J., Boraston C.M., Nurizzo D., Davies G.J. Structural and thermodynamic dissection of specific mannan recognition by a carbohydrate binding module, TmCBM27. // Structure. 2003. V. 11. P. 665-675.

80. Quiocho F.A. Carbohydrate-binding proteins: tertiary structures and protein-sugar interactions. //Annu. Rev. Biochem. 1986. V. 55. P. 287-315.

81. Bolam D.N., Xie H., White P., Simpson P.J., Hancock S.M., Williamson M.P., Gilbert H.J. Evidence for synergy between family 2b carbohydrate binding modules in Cellulomonas fimi xylanase 11 A. // Biochemistry. 2001. V. 40. P. 2468-2477.

82. Boraston A.B., McLean B.W., Chen G., Li A., Warren R.A.J., Kilburn D.G. Cooperative binding of triplicate carbohydrate-binding modules from a thermophilic xylanase. // Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 187-194.

83. Boraston A.B., Kwan E., Chiu P., Warren R.A.J., Kilburn D.G. Recognition and hydrolysis of noncrystalline cellulose. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 6120-6127.

84. Jervis E.J., Haynes C.A., Kilburn D.G. Surface diffusion of cellulases and their isolated binding domains on cellulose. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 24016-24023.

85. Flint J., Nurizzo D., Harding S.E., Longman E., Davies G.J., Gilbert H.J., Bolam D.N. Ligand-mediated Dimerization of a Carbohydrate-binding Module Reveals a Novel Mechanism for Protein-Carbohydrate Recognition. // J. Mol. Biol. 2004. V. 337. P. 417-426.

86. Wright C.S. 2.2 A resolution structure analysis of two refined N-acetylneuraminyl-lactose-wheat germ agglutinin isolectin complexes. // J. Mol. Biol. 1990. V. 215. P. 635-651.

87. Linder M., Salovuori I., Ruohonen L. and Teeri T.T. Characterization of a double cellulose-binding domain synergistic high affinity binding to crystalline cellulose. // J. Biochem. 1996. V. 271, P. 21268-21272.

88. Bayer E.A., Morag E. and Lamed R. The cellulosome - a treasure-trove for biotechnology. // Trends Biotechnol. 1994. V. 12. P. 379-386.

89. Greenwood J.M., Ong E., Gilkes N.R., Warren R.A., Miller R.C. Jr., Kilburn D.G. Cellulose-binding domains: potential for purification of complex proteins. // Protein Eng. 1992. V. 5. P. 361-365.

90. Levy I. and Shoseyov O. Cellulose binding domains: industrial and biotechnological application. // Biotechnol. Adv. 2002. V. 20. P. 191-213.

91. Ong E., Greenwood J.M., Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C. Jr., Warren A. J. The cellulose-binding domain of cellulases: tools for biotechnology. // Trends Biotechnol. 1989. V.7. P. 239-243.

92. Tomme P., Boraston A., McLean B., Kormos J., Creagh A. L., Sturch K., Gilkes N.R., Haynes C.A., Warren R.A., Kilburn D.G. Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains. // J. Chromatogr. B. 1998. V. 715. P. 283-296.

93. Boraston A.B., McLean B.W., Guarna M. M., Amandaron-Akow E., Kilburn D.G. A family 2a carbohydrate-binding module suitable as an affinity tag for proteins produced in Pichia pastoris. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 21. P. 417-423.

94. Doheny J.G., Jervis E.J., Guarna M.M., Humphries R.K., Warren R.A., Kilburn D.G. Cellulose as an inert matrix for presenting cytokines to target cells: production and properties of a stem cell factor-cellulose-binding domain fusion protein. // Biochem. J. 1999. V. 339. P. 429434.

95. Kavoosi M., Meijer J., Kwan E., Creagh A.L., Kilburn D.G., Haynes C.A. Inexpensive one-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with the family 9

carbohydrate-binding module of xylanase 10A from T. maritima. II J. Chromatogr. B. 2004. V. 807. P. 87-94.

96. Rechter M., Lider O., Cahalon L., Baharav E., Dekel M., Seigel D., Vlodavsky 1., Aingorn H., Cohen I. R., Shoseyov O. A cellulose-binding domain-fused recombinant human T cell connective tissue-activating peptide-III manifests heparanase activity. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 255. P. 657-662.

97. Shani Z. and Shoseyov O. Process of expressing and isolating recombinant proteins and recombinant protein products from plants, plant derived tissues or cultured plant cells. // U.S. patent 6,331,416. 2001.

98. Haynes C.A., Tomme P., Kilburn D.G. Two-phase partition affinity separation system and affinity separated cell-containing composition. // U.S. patent 6,048,715. 2000.

99. McDonald J.K., Taylor C. M., Rafferty S. Design, preparation, and characterization of mixed dimers of inducible nitric oxide synthase oxygenase domains. // Protein Expr. Purif. 2003. V. 27, P.115-127.

100. Pfeifer T.A., Guarna M.M., Kwan E. M., Lesnicki G., Theilmann D.A., Grigliatti T.A., Kilburn D.G. Expression analysis of a modified factor X in stably transformed insect cell lines. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 23. P. 233-241.

101. Richins R.D., Mulchandani A., Chen W. Expression, immobilization, and enzymatic characterization of cellulose-binding domain-organophosphorus hydrolase fusion enzymes. // Biotechnol. Bioeng. 2000. V. 69. P. 591-596.

102. Rotticci-Mulder J.C., Gustavsson M., Holmquist M., Hult K., Martinelle M. Expression in Pichia pastoris of Candida antarctica lipase B and lipase B fused to a cellulose-binding domain. // Protein Expr. Purif. 2001. V. 21. P. 386-392.

103. Mordoccoa A., Kuek C., Jenkinsa R. Continuous degradation of phenol at low concentration using immobilized Pseudomonasputida. II Enzyme Microb. Technol. 1999. V. 25. P. 530-536.

104. Nigam J.N. Continuous ethanol production from pineapple cannery waste using immobilized yeast cells. // J. Biotechnol. 2000. V. 80. P. 189-193.

105. Kleinman H.K., Luckenbill-Edds L., Cannon F.W., Sephel G.C. Use of extracellular matrix components for cell culture. // Anal. Biochem. 1987. V. 166. P. 1-13.

106. Yamada K.M. Cell surface interactions with extracellular materials. // Annu. Rev. Biochem. 1983. V. 52. P. 761-799.

107. Gunneriusson E., Samuelson P., Uhlen M., Nygren P. A., Stahl S. Surface display of a functional single-chain Fv antibody on staphylococci. // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 1341-1346.

108. Samuelson P., Wernerus H., Svedberg M., Stahl S. Staphylococcal surface display of metal-binding polyhistidyl peptides. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 1243-1248.

109. Stahl S., Uhlen M. Bacterial surface display: trends and progress. // Trends Biotechnol. 1997. V. 15. P. 185-192.

110. Yang J.I., Petterson B., Eriksson K. E. Development of bioassays for the characterization of pulp fiber surfaces. I. Characterization of various mechanical pulp fiber surfaces by specific cellulolitic enzymes. //Nord. Pulp Paper Res. J. 1988. V. 42. P. 19-25.

111. McCartney L., Gilbert H.J., Bolam D.N., Boraston A.B., Knox J.P. Glycoside hydrolase carbohydrate-binding modules as molecular probes for the analysis of plant cell wall polymers. // Anal. Biochem. 2004. V. 326. P. 49-54.

112. Degani O., Gepstein S., Dosoretz C. G. A new method for measuring scouring efficiency of natural fibers based on the cellulose-binding domain-beta-glucuronidase fused protein. // J. Biotechnol. 2004. V. 107. P. 265-273.

113. Ofir K., Berdichevsky Y., Benhar I., Azriel-Rosenfeld R., Lamed R., Barak Y., Bayer E.A., Morag E. Versatile protein microarray based on carbohydrate-binding modules. // Proteomics. 2005. V. 5. P. 1806-1814.

114. Cavaco-Paulo A., Morgado J., Andreaus J., Kilburn D.G. Interactions of cotton with CBD peptides. // Enzyme Microb. Technol. 1999. V. 25. P. 639-643.

115. Gilkes N.R., Kilburn D.G., Miller R.C. Jr., Warren A. Methods and compositions for modification of polysaccharide characteristics. // U.S. patent 5,821,358. October 1998.

116. Волков И.Ю., Лунина H.A., Великодворская Г.А.. Перспективы практического применения субстрат-связывающих модулей гликозилгидролаз. // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Том 40. №5. С. 499-504.

117. Bender J., Vatcharapijarn Y., Jeffries T.W. Characteristics and adaptability of some new isolates of Clostridium thermocellum. II Appl Environ Microbiol. 1985. V. 49. P. 475-477.

118. Chuvilskaya N.A., Golovchenko N.P., Belokopytov B.F., Akimenko V.K. Isolation, identification and some physiological properties of Clostridium thermocellum. 11 Prikl. Biokhim. Mikrobiol. 1987. V. 22. P. 800-805.

119. Stainthorpe A.C., Williams R.A.D. Isolation and properties of Clostridium thermocellum from Icelandic hot springs. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1988. V. 38. P. 119-121.

120. Tailliez P., Girard H., Millet J., Beguin P. Enhanced cellulose fermentation by an asporogenous and ethanol-tolerant mutant of Clostridium thermocellum. // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 207-211.

121. Lynd L.R., Weimer P.J., van Zyl W.H., Pretorius I.S. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2002. V. 66. P. 506-577.

122. Nochur S.V., Roberts M.F., Demain A.L. Mutation of Clostridium thermocellum in the presence of certain carbon sources. // FEMS Microbiol. Lett. 1990. V. 71. P. 199-204.

123. Hernandez P.E. On the utilization of cellobiose and D-glucose by Clostridium thermocellum. II Rev Esp Fisiol. 1982. V. 38, P. 473^74.

124. Schwarz W.H., Bronnenmeier К., Staudenbauer W.L. Molecular cloning of Clostridium thermocellum genes involved in b-glucan degradation in bacteriophage Lambda. // Biotechnol Let. 1985. V. 7, P. 859-864.

125. Tuka K., Zverlov V.V., Bumazkin B.K., Velikodvorsakaya G.A., Strongin A.Y. Cloning and expression of Clostridium thermocellum genes coding for thermostable exoglucanases

(cello-biohydrolases) in Escherichia coli cells. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. V. 169. P. 1055-1060.

126. Fuchs K.P., Zverlov V.V., Velikodvorskaya G.A., Lottspeich F., Schwarz W.H. Licl6A of Clostridium thermocellum, a noncellulosomal, highly complex endo-b-l,3-glucanase bound to the outer cell surface. // Microbiology. 2003. V. 149. P. 1021-1031.

127. Finkelstein A.V., Ptytsin O.B. The Physics of Protein.// Moscow: Knizny Dom University. 2005.

128. Branden K., Tooze J. / Introduction to Protein Structure, 2nd edn. // New York: Garland Publishing. 1999.

129. Dobson C.M., Evans P.A., Radsford S.E. Understanding protein folding: the lysozyme story so far. // Trends Biochem. Sei. 1994. V. 19. P. 31-37.

130. Grepinet O., Chebrou M.C., Beguin P. Nucleotide sequence and deletion analysis of the xylanase gene (xynZ) of Clostridium thermocellum. II J. Bacteriol. 1988. V. 170. P. 4582^4588.

131. Lamed R., Bayer E.A. Characterization of a cellulose-binding cellulase-containing complex in Clostridium thermocellum. //FEMS Symp. 1988. V. 43. P. 101-116.

132. Hong T.Y., Meng M. Biochemical characterization and antifungal activity of an endo-l,3-b-glucanase of Paenibacillus sp. isolated from garden soil. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V. 61. P. 472-478.

133. Chauvaux S., Souchon H., Alzari P.M., Chariot P., Beguin P. Structural and functional analysis of the metal-binding sites of Clostridium thermocellum endoglucanase CelD. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 9757-9762.

134. Schwarz W.H., Zverlov V.V., Bahl H. Extracellular glycosyl hydrolases from Clostridia. // Adv. Appl. Microbiol. 2004. V. 56. P. 215-261.

135. Ezer A., Matalon E., Jindou S., Borovok I., Atamna N., Yu Z., Morrison M., Bayer E.A., Lamed R. Cell-surface enzyme attachment is mediated by family-37 carbohydrate-binding modules, unique to Ruminococcus albus. II J. Bacteriol. 2008. V. 190. P. 8220-8222.

136. Zverlov V., Volkov I., Velikodvorskaya G., Schwarz W. The binding pattern of two carbohydrate binding modules of laminarinase Laml6A from Thermotoga neapolitana: differences in beta-glucan binding within family CBM4. // Microbiology. 2001. V. 147. P. 621629.

137. Guerreiro H., Croda J., Flannery В., Mazel M., Matsunaga J., Galvao Reis M., Levett P.N., Ко A.I., Haake D.A. Leptospiral proteins recognized during the humoral immune response to leptospirosis in humans. // Infect. Immun. 2001. V. 69. P. 4958-4968.

138. Koizumi N., Watanabe H. Leptospiral immunoglobulin-like proteins elicit protective immunity. // Vaccine. 2004. V. 22. P. 1545-1552.

139. Croda J., Ramos J.G., Matsunaga J., Queiroz A., Homma A., Riley L.W., Haake D.A., Reis M.G., Ko A.I. Leptospira immunoglobulin-like proteins as a sérodiagnostic marker for acute leptospirosis. // J. Clin. Microbiol. 2007. V. 45. P. 1528-1534.

140. Справочные материалы по экспрессионным векторам pQE3x // 2012. URL:http://www.qiagen.com/products/protein/expression/qiaexpressexpressionsystem/n-terminuspqevectorset.aspx?ShowInfo=l (дата обращения 12.11.2012)

141. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. /Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition. // New-York: Cold Spring Harbor Laboratory Pr. 1989.

142. Miller G.L., Blum R., Glennon W.E., Burton A.L. Measurement of carboxymethylcellulose activity. // Anal. Biochem. 1960. V. 2. P. 127-132.

143. Bradford M.M. A rapid sensitive method for the action of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

144. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. //Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

145. Программа анализа электрофоретических гелей Phoretix ID. // 2013. UR:http://www.totallab.com/products/ld/default.aspx (дата обращения 12.04.2013)

146. Веб-сервис расчета молекулярного веса белков ComputePi. // 2013. URL:http://web.expasy.org/compute_pi (дата обращения 12.04.2013)

147. Bacon J.S.D., Farmer V.C., Jones D., Taylor I.F. The glucan components of the cell wall of baker's yeast (Saccharomyces cerevisiae) considered in relation to its ultrastructure. // Biochem. J. 1969. V. 114. P. 557-567.

148. Wood T.M. Preparation of crystalline, amorphous and dyed cellulase substrates. // Methods Enzymol. 1988. V. 160. P. 19-25.

149. Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M. / Lehninger principles of biochemistry. // New York: W.H. Freeman. 2005.

150. Программа анализа и визуализации научных данных OriginLab. //2013. URL:http://originlab.com (дата обращения 12.04.2013)

151. Tomme P., Creagh A.L., Kilburn D.G., Hayens С.А. Interaction of polysaccharides with the N-terminal cellulose-binding domain of Cellulomonas fimi CenC. I. Binding specifity and calorimetric analysis. // Biochemistry. 1996. V. 35. P. 13885-13894.

152. Carvalho A.L., Goyal A., Prates J.A.M., Bolam D.N., Hilbert H.J., Pires V.M.R., Ferreira L.M.A., Planas A., Romao M.J., Fontes C.M.G.A. The family 11 carbohydrate-binding module of Clostridium thermocellum Lic26A-Cel5E accommodates b -1,3- and b-l,3-l,4-mixed linked glucans at a single binding site. // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 34785-34793.

153. Веб-сервис локального поиска гомологов в базе данных аминокислотных последовательностей. // 2013. URL:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (дата обращения 12.04.2013)

154. Программа множественного выравнивания аминокислотных последовательностей. // 2013. URL:http://www.clustal.org (дата обращения 12.04.2013)

155. Веб-сервис визуализации филогенетических деревьев. // 2013. URL:http://itol.embl.de (дата обращения 12.04.2013)