Характеристика молекулярной патологии в увеальных меланомах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат медицинских наук Манохина, Ирина Константиновна

• Манохина, Ирина Константиновна
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Манохина, Ирина Константиновна

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Характеристика увеальной меланомы

1.1.1 Клиническая характеристика заболевания

1.1.2 Клинико-патологические особенности и их прогностическая значимость

1.2 Хромосомные нарушения и идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез

1.2.1 Увеальная меланома и меланома кожи

1.2.2 Хромосомные перестройки в УМ

1.2.2.1 Потеря хромосомного материала в увеальных меланомах

1.2.2.2 Определение избыточного хромосомного материала в УМ

1.2.3 Идентификация генов, вовлеченных в канцерогенез

1.2.3.1 Анализ потери гетерозиготности в УМ

1.2.3.2 Поиск мутаций

1.2.3.3 Анализ метилирования в УМ

1.2.3.4 Изучение профиля экспрессии генов

1.3 Ассоциации молекулярных нарушений с клинико-патологическими факторами

1.4 Разработка ДНК-диагностических протоколов

1.4.1 Определение циркулирующих опухолевых клеток в общем кровотоке

1.4.2 Молекулярно-генетическое исследование операционного материала

1.4.3 Техника тонкоигольной аспирационной биопсии 45 РЕЗЮМЕ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Клинический материал

2.2 Забор крови и операционного материала

2.3 Выделение геномной ДНК

2.4 Анализ аллельного дисбаланса

2.5 Аллель-специфическая амплификация мутантиого аллеля В11АГ

2.6 Анализ метилирования методом метил-чувствительной ПЦР

2.7 Электрофорез в ПААГ

2.8 Ультратонкое окрашивание нитратом серебра

2.9 Программное обеспечение

2.10 Статистическая обработка

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Спектр молекулярных нарушений в увеальных меланомах

3.1.1 Анализ потери гетерозиготности в УМ

3.1.2 Анализ метилирования в УМ

3.1.3 Поиск мутаций

3.1.4 Профиль молекулярной патологии в исследованных образцах УМ

3.2 Анализ ассоциаций молекулярно-генетических нарушений в увеальных меланомах с клинико-патологическими факторами и факторами прогноза

3.3 Спектр молекулярной патологии в УМ и меланоме кожи

3.4 Разработка системы ДНК-маркеров для диагностики увеальной меланомы

3.5 Диагностика молекулярных маркеров УМ в биоптатах 82 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 86 ВЫВОДЫ 88 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 89 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АА - акриламид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

МЧ-ПЦР - метилчувствительная ПЦР

ОР - относительный риск п.н. - пар нуклеотидов

ПААГ - полиакриламидный гель

ПГ - потеря гетерозиготности

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ТИАБ - тонкоигольная аспирационная биопсия

УМ — увеальная меланома

ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

APS - аммония персульфат

CGH - сравнительная геномная гибридизация

CISH - хромосомная гибридизация in situ

DHPLC - denaturing high-performance liquid chromatography

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

SKY - спектральное кариотипирование

SRO - Smallest overlapping regions, наименьшие области перекрывания делеций ТВЕ - трис-боратный буфер: 89 шМ трис-борат, 89 шМ борная кислота, 2 шМ ЭДТА TEMED - тетраметилэтилендиамин

Аббревиатуры генов и их белковых продуктов, а также сокращения распространенных единиц измерения даны в соответствии с общепринятыми номенклатурами.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика молекулярной патологии в увеальных меланомах»

Увеальная меланома (УМ) является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью у взрослых, заболеваемость увеальной меланомой составляет 7-8 человек на 1 млн. населения в год в России, США и странах Западной Европы. УМ возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов сосудистой оболочки глазного яблока. Современные методы диагностики и лечения УМ направлены на повышение выживаемости пациентов и сохранение глаза как косметического и функционального органа.

Метастазы развиваются у значительной части пациентов с УМ. В частности, смертность в связи с увеальной меланомой достигает 53% в течение пятилетнего периода именно вследствие метастатической болезни. Несмотря на использование новейших достижений в области диагностики и лечения, этот показатель остается по-прежнему чрезвычайно высоким. Выявлены некоторые характерные клинические и гистологические факторы, совокупность которых позволяет условно разделить увеальные меланомы на более «спокойные», с невысоким риском метастазирования, и «агрессивные», для которых риск развития метастазов считается повышенным. Однако необходимость создания диагностической системы маркеров увеальной меланомы очевидна. Поиск и характеристика молекулярных маркеров диагностики и прогноза является, на сегодняшний день, одной из важнейших задач онкологии. Создание эффективных диагностических протоколов позволит в дальнейшем оценить прогноз заболевания и предпринять адекватные меры для выявления и лечения метастатической болезни у пациентов с увеальной меланомой. Необходимым этапом создания систем маркеров УМ является анализ наиболее характерных и часто встречающихся молекулярно-генетических нарушений в первичных увеальных меланомах.

Настоящая работа посвящена изучению структурных и функциональных генетических нарушений в увеальных меланомах, а также оценке диагностической значимости этих изменений как потенциальных маркеров УМ.

Актуальность работы определяется следующими факторами:

1). Увеальная меланома является наиболее частой первичной злокачественной внутриглазной опухолью, составляющей 12% от меланом всех локализаций, однако молекулярные механизмы ее патогенеза к настоящему моменту изучены недостаточно.

2). Эффективное лечение увеальной меланомы связано не только со своевременной диагностикой и лечением первичной опухоли, но также ранним выявлением и лечением метастатической болезни. Есть предположения, что ряд характерных молекулярных нарушений в увеальных меланомах может быть ассоциирован с опухолевой прогрессией и развитием метастазов.

3). Молекулярные методы диагностики увеалыюй меланомы в настоящее время в отечественной лабораторной практике не используются, хотя успешно применяются в медицинских центрах за рубежом.

Цель п задачи исследования

Целью настоящей работы является анализ молекулярно-генетических изменений, ассоциированных с развитием увеальной меланомы и изучение потенциала их использования в клинической практике для расширения возможностей диагностики, а также прогнозирования течения заболевания.

В соответствии с поставленной целью предполагается решить следующие задачи:

1. Исследовать аллельное состояние микросателлитных маркеров в локусах генов-супрессоров опухолевого роста и хромосомных районах, наиболее часто делетируемых в злокачественных опухолях.

2. Определить статус метилирования промоторных районов ряда генов-супрессоров опухолевого роста.

3. В увеальных меланомах провести анализ молекулярных нарушений в генах и хромосомных районах, наиболее часто повреждаемых в меланомах кожи.

4. Определить ассоциации молекулярно-генетических нарушений с клинико-патологическими данными.

5. Оценить возможность использования тонкоигольной аспирационной биопсии для скрининга молекулярных нарушений.

Научная новизна

Настоящая работа является первым широкомасштабным молекулярно-генетическим исследованием увеальных меланом на территории Российской Федерации и направлена на поиск молекулярных маркеров увеальных меланом с перспективой создания комплексной системы диагностических и прогностических маркеров, позволяющих врачу сделать правильный выбор в отношении тактики лечения и дальнейшего наблюдения пациентов.

Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование, включающее определение не только ранее описанных молекулярных нарушений, но и изучение состояния генов и сигнальных каскадов, связанных с регуляцией клеточного цикла, клеточной прогрессией и дифференцировкой.

Выявлено наличие характерных для увеальной меланомы генетических и эпигенетических нарушении (потеря одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), делеции 1р и 8р, метилирование ЯАЗЗРЫ). В исследовании обнаружены ассоциации моносомии 3 с характеристиками агрессивного течения меланомы, такими как эпителиоидный клеточный тип, цилиарная локализация и пигментация опухоли. Аллельные делеции 1р не могут рассматриваться как патогномоничное нарушение в увеальных меланомах, однако определена их достоверная ассоциация с экстрасклеральной инвазией опухоли, снижающей выживаемость пациентов. Метилирование гена КАББПА является неслучайным изменением, обнаруженным в увеальных меланомах: его отсутствие подтверждено в условно-нормальной хорнондее тех же пациентов. Также определена его ассоциация с отсутствием аллельных потерь по маркерам ЯА88Р1А в хромосоме 3.

Установлено, что основной спектр молекулярных нарушении, характерный для меланомы кожи, не играет важной роли в запуске патологических процессов в увеальной меланоме.

Практическая значимость

Проведено комплексное молекулярно-генетическое исследование 107 пациентов с диагнозом первичная увеальная меланома. Обнаружение моносомии 3 способствует дифференциальной диагностике УМ, так как это нарушение является специфическим, не характерным для другой онкопатолопш. Определена ассоциация структурных и количественных нарушений в хромосоме 3 н 1р36 с клинико-морфологическими характеристиками и факторами прогрессии опухоли, что позволит использовать анализ этих нарушений в качестве маркеров прогрессии на различных стадиях УМ. Показано, что тонкоигольная аспирационная биопсия (ТИАБ) представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа пациентов с увеальной меланомой. Результаты, получепиые в представленной работе, легли в основу разработки системы молекулярных маркеров УМ в дополнение к применяемым диагностическим методам — гистологическому и биохимическому. Внедрение таких систем расширяет возможности диагностики, в том числе дифференциальной, а также позволяет определить риск метастазирования опухоли и выбрать тактику терапии.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены на ежегодных Европейских конференциях по генетике человека в 2007 г. (Ницца, Франция) и 2008 г. (Барселона, Испания), на конгрессе Международного общества онкоофтальмологов в 2007 г. (Сиена, Италия), Всероссийской научно-практической конференции «Современные технологии в дифференциальной диагностике и лечении внутриглазных опухолей» в 2007 г. (Москва), конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» в 2008 году (Москва).

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику

На основании результатов проведенной работы разработаны новые медицинские ДНК-технологии «Молекулярно-генетическая методика выявления специфических молекулярных маркеров увеальной меланомы» и «Молекулярно-генетическая методика оценки прогрессии первичной опухоли при увеальной меланоме» (Поданы заявки на регистрацию новых медицинских технологий). Методические подходы, разработанные в диссертационной работе, используются в МНИИ Глазных Болезней им. Гельмгольца.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста, состоит из оглавления, введения, списка сокращений, обзора литературы, подробного изложения использованных материалов и методов, описания собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 153 ссылки. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 19 рисунками.

Положения, выносимые на защиту

1. Моносомия 3 является специфическим хромосомным нарушением, выявляемым не менее чем в 45% увеальных меланом и определяющим агрессивное течение заболевания. Для УМ также характерны аллельные делеции в локусах 1р36 и 8р22.

2. Метилирование КАББПА определяется преимущественно в меланомах, не имеющих моносомии 3 и не характерно для условно-нормальной хориоидеи.

3. Молекулярный патогенез УМ и меланомы кожи различен. Для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация Т1796А гена ВЯАГ, аллельные делеции в локусе РТЕЫ, а также потеря гетерозиготности и гиперметилирование промоторов генов пути регуляции СВШ2А^ЯВ1.

4. Разработаны системы ДНК-маркеров для выявления молекулярных нарушений в образцах увеальной меланомы, полученных в результате резекции опухоли и тонкоигольной биопсии.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Манохина, Ирина Константиновна

ВЫВОДЫ

1. Проведен анализ потери гетерозиготности хромосомных районов 1рЗб, 1р31.3, 3р25.3, 3р21.3, Зр14.2, 3ql2, 3q26.3, 3q28, 8р22, 9р(21.2-р21.3), 10(q23.2-q23.3), 13ql4. Наиболее частым специфическим изменением, выявленным в клетках увеальной меланомы, является потеря гетерозиготности по всем информативным маркерам хромосомы 3, определенная нами как моносомия 3 (45%). Выявлено наличие аллельных потерь в хромосомных локусах 1р (29,9%) и 8р22 (35,9%).

2. Проведен анализ метилирования генов CDKN2A, RBI, RASSF1A, MLH1, FHIT и VHL. Показано, что метилирование промоторной области RASSF1A определяется в 24,3% образцов УМ, а в условно нормальной хориоидее тех же пациентов метилирование отсутствует.

3. Показано, что для увеальной меланомы не характерны основные молекулярные нарушения, свойственные меланоме кожи, в том числе мутация Т1796А гена BRAF, аллельные делеции в локусе PTEN, а также ПГ и гиперметилирование промоторных районов генов пути регуляции CDKN2A —> RB1.

4. Обнаружены статистически достоверные ассоциации моносомии 3 с агрессивными характеристиками опухоли, такими как эпителиоидный клеточный тип (р<0,0001), цилиарная локализация (/7=0,001) и пигментация (¿>=0,018). Определена достоверная ассоциация аллельных делеций 1рЗб с экстрасклеральной инвазией опухоли (р=0,012), снижающей выживаемость пациентов, а также с увеличенным размером опухоли (р=0,012). Также определена ассоциация метилирования гена RASSF1A с отсутствием аллельных потерь по маркерам RASSF1A в хромосоме 3.

5. Разработана система диагностических маркеров увеальной меланомы, основанная па анализе молекулярно-генетических нарушений в образцах опухоли. Подтверждено, что ТИАБ представляет собой эффективный способ получения материала для генетического анализа для пациентов с увеальной меланомой, позволяющий провести микросателлнтный анализ не менее чем по 15 маркерам.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

В настоящей работе получены данные о характерных генетических и эпигенетических нарушениях при УМ, выявлены ассоциации структурных и численных хромосомных нарушений с прогрессией первичной опухоли. Комплексный анализ полученных данных и сопоставление их с данными литературы позволили предложить практические рекомендации по использованию результатов настоящей диссертационной работы в клинической практике.

1. Определение потери гетерозиготности по маркерам хромосомы 3 и 1р36 в материале первичной опухоли целесообразно проводить наряду с патоморфологическим исследованием для дифференциальной диагностики и оценки прогноза УМ.

2. Материал, полученный с помощью ТИАБ, может быть использован для комплексного исследования, включающего не только морфологический, но и молекулярно-генетический анализ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Манохина, Ирина Константиновна, 2009 год

1. Бабенко О.В, Саакян С.В, Бровкина А.Ф, Козлова В.М, Стрельников В.В, Залетаев Д.В, Немцова М.В. Спектр и частота структурной патологии гена RB1 при ретинобластоме // Молекулярная биология, 2002. - Том 36, № 4. - с.623-9.

2. Бровкина А.Ф, Жильцова М.Г, Каплина A.B. Тонкоигольная аспирационная биопсия в диагностике опухолей органа зрения. Пособие для врачей. М. 2000.

3. Васильев Е.В, Румянцев П.О, Саенко В.А, Ильин A.A., Полякова Е.Ю, Немцова М.В, Залетаев Д.В. Молекулярный анализ структурных нарушений генома папиллярных карцином щитовидной железы. Молекулярная биология. 2004. - Том. 38, №4.-С. 642-53.

4. Гришина Е.Е, Федотова О.Ф, Житенев В.П. Анализ офтальмоонкологической патологии у взрослого населения Москвы по данным МОКБ // Опухоли и опухолеподобные заболевания органа зрения. М, Медицина, 1998, стр. 28-31.

5. Залетаев Д.В, Немцова М.В, Стрельников В.В. Диагностика эпигенетической патологии при наследственных и онкологических заболеваниях // Молекулярная Биология.-2002. Том 38, №2.-С. 213-223.

6. Залетаев Д.В, Немцова М.В, Бабенко О.В. Система генетических и эпигенетических маркеров в ДНК-диагностике злокачественных новообразований. В кн.: Введение в молекулярную медицину, (под ред. Пальцева М.А.). М, Медицина, 2004, С. 35-93.

7. Землякова В, Жевлова А, Стрельников В. и др. Аномальное метилирование некоторых генов-супрессоров при спорадическом раке молочной железы. Молекулярная Биология. 2003. Том 37, №4, стр. 696-703.

8. Кекеева Т.В, Жевлова А, Подистов Ю и др. Аномальное метилирование генов-супрессоров опухолевого роста и микросателлитная нестабильность в предраковых состояниях шейки матки // Молекулярная биология. 2006. Том 40, С: 224-230.

9. Михайленко Д.С., Курынин Р.В., Попов A.M. и др. Инактивация гена VHL при спорадическом светлоклеточном раке почки. Молекулярная Биология. 2008. - Том 42, №1, стр. 71-77.

10. Саакян С.В., Бровкина А.Ф. Опухоли сосудистой оболочки глаза. В кн.: Офтальмоонкология: Руководство для врачей (под ред. Бровкиноп А.Ф.) // М., Медицина, 2002, -с. 235-298.

11. Саакян С.В. Достижения и перспективы онкоофтальмологии. Сборник научных трудов «Современные технологии в дифферециальной диагностике и лечении внутриглазных опухолей», М. 2007. - С. 1-17.

12. Склярова Н. В. Флюоресцентная ангиография в диагностике беспигментных меланом хориоидеи // Автореферат диссертации на соискаие ученой степени кандидата медиинских наук, Москва, 2004

13. Aalto Y, Eriksson L, Seregard S, Larsson O, ICnuutila S. Concomitant loss of chromosome 3 and whole arm losses and gains of chromosome 1, 6, or 8 in metastasizing primary uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2001. Vol. 42, № 2. - P. 313-7.

14. Abdel-Rahman MH, Yang Y, Zhou XP, Craig EL, Davidorf FH, Eng C. High frequency of submicroscopic hemizygous deletion is a major mechanism of loss of expression of PTEN in uveal melanoma // J Clin Oncol. 2006. - Vol. 24, № 2. - P.288-95.

15. Albert D.M., Polans A, Ocular Oncology, 1st edition // Informa Health Care 2003. ISBN-10: 0824740165,492 pages

16. Bakalian S, Marshall JC, Logan P, Faingold D, Maloney S, Di Cesare S, Martins C, Fernandes BF, Burnier MN Jr. Molecular pathways mediating liver metastasis in patients with uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2008. - Vol.14, № 4. - P. 951-6.

17. Baylin SB, Belinsky SA, Herman JG. Aberrant mcthylation of gene promoters in cancer-concepts, misconcepts, and promise // J Natl Cancer Inst. 2000. - Vol.92, № 18. - P. 1460-1.

18. Becher R, Korn WM, Prescher G.Use of fluorescence in situ hybridization and comparative genomic hybridization in the cytogenetic analysis of testicular germ cell tumors and uveal melanomas // Cancer Genet Cytogenet. 1997. - Vol. 93, № 1. - P. 22-8.

19. Bell DJ, Wilson MW.Choroidal melanoma: natural history and management options // Cancer Control. 2004. - Vol. 11, № 5. - P. 296-303.

20. Belmar-Lopez C, Mancheno-Corvo P, Saornil MA, Baril P, Vassaux G, Quintanilla M, Martm-Duque P. Uveal vs. cutaneous melanoma. Origins and causes of the differences 11 Clin Transl Oncol. 2008. - Vol. 10, № 3. - P. 137-42.

21. Blasi MA, Roccella F, Balestrazzi E, Del Porto G, De Felice N, Roccella M, Rota R, Grammatico P. 3pl3 region: a possible location of a tumor suppressor gene involved in uveal melanoma // Cancer Genet Cytogenet. 1999. - Vol. 108, № 1. - P. 81-3.

22. Brantley MA Jr, Harbour JW. Deregulation of the Rb and p53 pathways in uveal melanoma // Am J Pathol. 2000. - Vol. 157, № 6. - P. 1795-801.

23. Chan CC, Collins D, Chew EY. Molecular pathology of eyes with Von Hippel-Lindau (VHL) disease//Retina.-2007.-Vol. 27, №1.- P. 1-7.

24. Chin L, Garraway LA, Fisher DE. Malignant melanoma: genetics and therapeutics in the genomic era // Genes Dev. 2006. - Vol. 20, № 16. - P. 2149-82.

25. Choi CH, Lee KM, Choi JJ, Kim TJ, Kim WY, Lee JW, Lee SJ, Lee JH, Bae DS, Kim BG. Hypermethylation and loss of heterozygosity of tumor suppressor genes on chromosome 3p in cervical cancer // Cancer Lett. 2007. - Vol. 255, № 1. - P. 26-33.

26. Coupland SE, Campbell I, Damato B. Routes of extraocular extension of uveal melanoma: risk factors and influence on survival probability // Ophthalmology. 2008. - Vol. 115, № 10. -P. 1778-85.

27. Coupland SE, Sidiki S, Clark BJ, McClaren IC, Kyle P, Lee WR. Metastatic choroidal melanoma to the contralateral orbit 40 years after enucleation // Arch Ophthalmol. 1996. -Vol. 114,№6.-P. 751-6.

28. Croce CM, Sozzi G, Huebner K. Role of FHIT in human cancer // J Clin Oncol 1999, 17:1618-1624.

29. Cross NA, Ganesh A, Parpia M, Murray AK, Rennie IG, Sisley K. Multiple locations on chromosome 3 are the targets of specific deletions in uveal melanoma. // Eye. 2006. - Vol. -20, № 4. - P.476-81.

30. Cross NA, Murray AK, Rennie IG, Ganesh A, Sisley K. Instability of microsatellites is an infrequent event in uveal melanoma // Melanoma Res. 2003. - Vol. 13, № 5. - P. 435-40.

31. Damato B, Duke C, Coupland SE, Hiscott P, Smith PA, Campbell I, Douglas A, Howard P. Cytogenetics of uveal melanoma: a 7-year clinical experience // Ophthalmology 2007. -Vol. 114, № 10. - P.1925-31.

32. Davies H, Bignell GR, Cox C, et al., Mutations of the BRAF gene in human cancer // Nature. 2002. - Vol. 417, № 6892. - P. 949-54.

33. Diener-West M, Hawkins BS, Markowitz JA, Schachat AP. A review of mortality from choroidal melanoma. II. A meta-analysis of 5-year mortality rates following enucleation, 1966 through 1988 // Arch Ophthalmol. 1992. - Vol. 110, № 2. - P. 245-50.

34. Donninger H, Vos MD, Clark GJ. The RASSF1A tumor suppressor // J Cell Sci. 2007. -Vol. 120(Pt 18).-P. 3163-72.

35. Edmunds SC, Cree IA, Di Nicolantonio F, Hungerford JL, Hurren JS, Kelsell DP. Absence of BRAF gene mutations in uveal melanomas in contrast to cutaneous melanomas // Br J Cancer. 2003. - Vol. 88, № 9. - P. 1403-5.

36. Edmunds SC, Kelsell DP, Hungerford JL, Cree IA.Mutational analysis of selected genes in the TGFbeta, Wnt, pRb, and p53 pathways in primary uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sei. 2002. - Vol. 43, № 9. - P. 2845-51.

37. Egan KM, Seddon JM, Glynn RJ, Gragoudas ES, Albert DM. Epidemiologic aspects of uveal melanoma // Surv Ophthalmol. 1988. - Vol. 32, № 4. - P. 239- 51.

38. Ehlers JP, Harbour JW. Molecular pathobiology of uveal melanoma // Int Ophthalmol Clin. -2006. Vol. 46, № 1. - P. 167-80.

39. Ehlers JP, Harbour JW. NBS1 expression as a prognostic marker in uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2005. - Vol. 11, № 5. - P. 1849-53.

40. Ehlers JP, Worley L, Onken MD, Harbour JW. DDEF1 is located in an amplified region of chromosome 8q and is overexpressed in uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2005. - Vol. 11,№ 10.-P. 3609-13.

41. Ehlers JP, Worley L, Onken MD, Harbour JW.Integrative genomic analysis of aneuploidy in uveal melanoma // Clin Cancer Res. 2008. - Vol. 14, № 1. - P. 115-22.

42. Ellison AR, Lofmg J, Bitter GA. Human MutL homolog (.MLH1) function in DNA mismatch repair: a prospective screen for missense mutations in the ATPase domain // Nucleic Acids Res. 2004. - Vol. 32, №18. -P. 5321-5338.

43. Fernandes BF, Beifort RN, Di Cesare S, Burnier MN Jr. Circulating uveal melanoma cells: should we test for them? // Can J Ophthalmol. 2008. - Vol. 43, № 2. - P. 155-8.

44. Folberg R, Maniotis AJ. Vasculogenic mimicry. APMIS. 2004. - Vol. 112, № 7-8. - P. 50825.

45. Gambrelle J, Labialle S, Dayan G, Gayet L, Barakat S, Grange JD, Baggetto LG. Toward monosomy 3 as the main prognosis factor of uveal melanoma: current cytogenetic data // J Fr Ophtalmol. 2004. - Vol. 27(9 Pt 1). - P. 1061-7.

46. Gamis C, Buys TP, Lam WL. Genetic alteration and gene expression modulation during cancer progression. Mol Cancer. 2004. - Vol. 3 -P. 9.

47. Glatz K. Molecular heterogeneity of malignant melanomas // Pathologe. 2007. - Vol. 28, № 6. - P. 474-8.

48. Gündiiz K, Shields JA, Shields CL, Sato T, Mastrangelo MJ. Surgical removal of solitary hepatic metastasis from choroidal melanoma // Am J Ophthalmol. 1998. - Vol. 125, № 3. -P. 407-9.

49. Harbour JW. Molecular prognostic testing in uveal melanoma: has it finally come of age? // Arch Ophthalmol. 2007. - Vol. 125, № 8. - P. 1122-3.

50. Häusler T, Stang A, Anastassiou G, Jockel KH, Mrzyk S, Horsthemke B, Lohmann DR, Zeschnigk M. Loss of heterozygosity of lp in uveal melanomas with monosomy 3 // Int J Cancer. 2005. - Vol. 116, № 6. - P.909-13.

51. Hearle N, Damato BE, Humphreys J, Wixey J, Green H, Stone J, Easton DF, Houlston RS. Contribution of germline mutations in BRCA2, P16(INK4A), P14(ARF) and PI5 to uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sei. 2003. - Vol. 44, №2. - P. 458-62.

52. Henriquez F, Janssen C, Kemp EG, Roberts F. The T1799A BRAF mutation is present in iris melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sei. 2007. - Vol. 48, № 11. - P. 4897-900.

53. Hesson LB, Cooper WN, Latif F.The role of RASSFJA methylation in cancer // Dis Markers. 2007. - Vol. 23, № 1-2. - P. 73-87.

54. Honavar SG, Singh AD, Shields CL, Shields JA, Eagle Jr RC. Iris melanoma in a patient with neurofibromatosis. Surv Ophthalmol 2000. Vol. 45, № 3. - P. 231-6.

55. Houlston RS, Damato BE. Genetic predisposition to ocular melanoma // Eye 1999. Vol. 13(Pt 1). - P. 43- 6.

56. Hovland PG, Trempe C. Genomic investigations of posterior uveal melanoma // Semin Ophthalmol. 2005. - Vol. 20, № 4. - P. 231-8.

57. J. Sambrook. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. - P. 9.17-9.19

58. Janssen CS, Sibbett R, Henriquez FL, McKay IC, Kemp EG, Roberts F. The T1799A point mutation is present in posterior uveal melanoma // Br J Cancer. 2008. - Vol. 99, № 10. - P. 1673-7.

59. Kilic E, Briiggenwirth HT, Meier M, Naus NC, Beverloo HB, Meijerink JP, Luyten GP, de Klein A. Increased expression of p73Deltaex2 transcript in uveal melanoma with loss of chromosome lp // Melanoma Res. 2008. - Vol. 18, № 3. - P. - 208-13.

60. Kilic E, van Gils W, Lodder E, Beverloo HB, van Til ME, Mooy CM, Paridaens D, de Klein A, Luyten GP. Clinical and cytogenetic analyses in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006. - Vol. 47, № 9. - P. 3703-7.

61. Kumar R, Smeds J, Lundh Rozell B, Hemminki K. Loss of heterozygosity at chromosome 9p21 {INK4-pl4ARF locus): homozygous deletions and mutations in the pi 6 and pl4ARF genes in sporadic primary melanomas // Melanoma Res. 1999. - Vol. 9, № 2. - P.138-47.

62. Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, et al. Allele loss and promoter hypermethylation of VHL, RARbetci, RASSF1A, and FHIT tumor suppressor genes on chromosome 3p in esophageal squamous cell carcinoma // Cancer Res 2003. Vol. 63, № 13. - P. 3724—8.

63. Lamperska K, Mackiewicz K, ICaczmarek A, Kwiatkowska E, Starzycka M, Romanowska B, Heizman J, Stachura J, Mackiewicz A. Expression of pi 6 in sporadic primary uveal melanoma // Acta Biochim Pol. 2002. - Vol. 49, № 2. - P. 377-85.

64. Landreville S, Agapova OA, Harbour JW. Emerging insights into the molecular pathogenesis of uveal melanoma // Future Oncol. 2008. - Vol. 4, № 5. - P. 629-36.

65. Lee WH, Bookstein R, Hong F, Young LJ, Shew JY, Lee EY. Human retinoblastoma susceptibility gene: cloning, identification, and sequence // Science. 1987. - Vol. 235, № 4794. - P. 1394-9.

66. Loercher AE, Harbour JW. Molecular genetics of uveal melanoma // Curr Eye Res. 2003. -Vol. 27, № 2. - P. 69-74.

67. Lomas J, Martin-Duque P, Pons M, Quintanilla M.The genetics of malignant melanoma // Front Biosci. 2008. - Vol. 13. P. 5071-93.

68. Maat W, Kilic E, Luyten GP, de Klein A, Jager MJ, Gruis NA, Van der Velden PA. Pyrophosphorolysis detects B-RAF mutations in primary uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008. - Vol. 49, № 1. - P. 23-7.

69. Maat W, van der Velden PA, Out-Luiting C, Plug M, Dirks-Mulder A, Jager MJ, Gruis NA. Epigenetic inactivation of RASSFla in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. -2007. Vol. 48, № 2. - P. 486-90.

70. McLean IW, Foster WD, Zimmerman LE, Gamel JW Modifications of Callender's classification of uveal melanoma at the Armed Forces Institute of Pathology // Am J Ophthalmol. 1983. - Vol. 96, № 4. - P. 502-9.

71. McLean IW, Foster WD, Zimmerman LE. Uveal melanoma: location, size, cell type, and enucleation as risk factors in metastasis // Hum Pathol. 1982. - Vol. 13, № 2. - P. 123-32.

72. Meir T, Dror R, Yu X, Qian J, Simon I, Pe'er J, Chowers I. Molecular characteristics of liver metastases from uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007. - Vol. 48, № 11. - P. 4890-6.

73. Meir T, Zeschnigk M, Masshofer L, Pe'er J, Chowers I. The spatial distribution of monosomy 3 and network vasculogenic mimicry patterns in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007. - Vol. 48, № 5. - P. - 1918-22.

74. Melnikov AA, Ronald B. Gartenhaus, Anait S. Levenson, Natalia A. Motchoulskaia, and Victor V. Levenson (Chernokhvostov) MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation // Nucleic Acids Res. 2005. - Vol. 33, № 10. - P. e93.

75. Mensink HW, Kiliç E, Vaarwater J, Douben H, Paridaens D, de Klein A. Molecular cytogenetic analysis of archival uveal melanoma with known clinical outcome // Cancer Genet Cytogenet. 2008. - Vol. 181, № 2. - P. 108-11.

76. Mensink HW, Vaarwater J, Kiliç E, Naus NC, Mooy N, Luyten G, Biliggenwirth HT, Paridaens D, de Klein A. Chromosome 3 intratumor heterogeneity in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009. - Vol. 50, № 2. - P. 500-4.

77. Merbs SL, Sidransky D. Analysis of pi 6 (CDKN2/MTS-1/INK4A) alterations in primary sporadic uveal melanoma. // Invest Ophthalmol Vis Sci. 1999. - Vol. 40, № 3. - P.779-83

78. Merhavi E, Cohen Y, Avraham BC, Frenkel S, Chowers I, Pe'er J, Goldenberg-Cohen N. Promoter methylation status of multiple genes in uveal melanoma // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007. - Vol. 48, № 10. - P. 4403-6.

79. Midena E, Bonaldi L, Parrozzani R, Radin PP, Boccassini B, Vujosevic S. In vivo monosomy 3 detection of posterior uveal melanoma: 3-year follow-up // Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 2008. - Vol. 246, № 4. - P.609-14.

80. Mikhaïlenko DS, Kurynin RB, Popov AM, Kariakin OB, Enikeev ME, Aliaev IuG, Nemtsova MV, Zaletaev DV. Inactivation of the VHL gene in sporadic clear cell renal cancer // Mol Biol (Mosk). 2008. - Vol. 42, № 1, - P. 71-7.

81. Miller AJ, Mihm MC Jr. Melanoma. // N Engl J Med. 2006. - Vol. 355, № 1. - P.51-65.

82. Moulin AP, Clément G, Bosman FT, Zografos L, Benhattar J. Methylation of CpG island promoters in uveal melanoma // Br J Ophthalmol. 2008. - Vol. 92, № 2. - P. 281-5.

83. Mouriaux F, Maurage CA, Labalette P, Sablonniere B, Malecaze F, Darbon JM. Cyclin-dependent kinase inhibitory protein expression in human choroidal melanoma tumors // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000. - Vol. 41, № 10. - P. 2837-43.

84. Mouriaux F, Saule S, Desjardins L, Mascarelli F. Normal and malignant choroidal melanocytes: from cell to clinical approach. // J Fr Ophtalmol. 2005. - Vol. 28, № 7. -P.781-93.

85. Mudhar HS, Parsons MA, Sisley IC, Rundle P, Singh A, Rennie IG.A critical appraisal of the prognostic and predictive factors for uveal malignant melanoma // Histopathology. 2004. -Vol. 45, №1.-P. 1-12.

86. Onken MD, Ehlers JP, Worley LA, Makita J, Yokota Y, Harbour JW. Functional gene expression analysis uncovers phenotypic switch in aggressive uveal melanomas // Cancer Res. 2006. - Vol. 66, № 9. - P. 4602-9.

87. Onken MD, Worley LA, Ehlers JP, Harbour JW.Gene expression profiling in uveal melanoma reveals two molecular classes and predicts metastatic death // Cancer Res. 2004. -Vol. 64, № 20. - P. 7205-9.

88. Onken MD, Worley LA, Harbour JW. A metastasis modifier locus on human chromosome 8p in uveal melanoma identified by integrative genomic analysis // Clin Cancer Res. 2008. - Vol. 14, № 12. - P. 3737-45.

89. Parris CN, Harris JD, Griffin DK, Cuthbert AP, Silver AJR, Newbold RF. Functional evidence of novel tumor suppressor genes for cutaneous malignant melanoma // Cancer Res.1999.-Vol. 59.-P.516-520.

90. Pekarsky Y, Palamarchuk A, Huebner K, Croce CM, FHIT as tumor suppressor: mechanisms and therapeutic opportunities. //Cancer Biol Tlier. 2002. - Vol. 1, № 3. -P.232-6.

91. Pfeifer GP, Dammann R.Methylation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human tumors // Biochemistry (Mosc). 2005. - Vol. 70, № 5. - P. 576-83.

92. Poetsch M, Dittberner T, Woenckhaus C. Can different genetic changes characterize histogenetic subtypes and biologic behavior in sporadic malignant melanoma of the skin? // Cell Mol Life Sci. 2003. - Vol. 60, № 9. - P. 1923-32.

93. Ponder BAJ. Inherited cancer syndromes. Book: Genes and cancer. (Carney D, Sikora K, editor) New York, John Wiley and Sons. 1990. p. 99- 106.

94. Raoof N, Rennie IG, Salvi SM, Sisley K, Caine A, Mudhar HS. What is the significance of vortex vein invasion in uveal melanoma? // Eye. 2008. - Vol. 23, № 3. P. 549-555

95. Rastetter M, Schagdarsurengin U, Lahtz C, Fiedler E, Marsch WCh, Dammann R, Helmbold P. Frequent intra-tumoural heterogeneity of promoter hypermethylation in malignant melanoma // Histol Histopathol. 2007. - Vol. 22, № 9. - P. 1005-15.

96. Riquelme E, Tang M, Baez S, Diaz A, Pruyas M, Wistuba II, Corvalan A. Frequent epigenetic inactivation of chromosome 3p candidate tumor suppressor genes in gallbladder carcinoma // Cancer Lett. 2007. - Vol. 250, № 1. - P. 100-6.

97. Sandberg AA, Chen Z. Cytogenetics and molecular genetics of human cancer // Am J Med Genet. 2002. - Vol. 115, № 3. - P. 111-2.

98. Sandinha MT, Farquharson MA, Roberts F. Identification of monosomy 3 in choroidal melanoma by chromosome in situ hybridisation // Br J Ophthalmol. 2004. - Vol. 88, № 12. -P. 1527-32.

99. Scholes AG, Damato BE, Nunn J, Hiscott P, Grierson I, Field JK. Monosomy 3 in uveal melanoma: correlation with clinical and histologic predictors of survival // Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003. - Vol. 44, № 3. - P. 1008-11.

100. Schuster R, Bechrakis NE, Stroux A et al. Circulating tumor cells as prognostic factor for distant metastases and survival in patients with primary uveal melanoma // Clin Cancer Res.2007.-Vol. 13, №4.-P. 1171-8.

101. Shields CL.The hunt for the secrets of uveal melanoma // Clin Experiment Ophthalmol.2008. Vol. 36, № 3. - P. 277-80.

102. Singh AD, Damato B, Howard P, Harbour JW.Uveal melanoma: genetic aspects // Ophthalmol Clin North Am. 2005. - Vol. 18, № 1. - P. 85-97.

103. Singh AD, Shields CL, De Potter P, Shields JA, Trock B, Cater J, Pastore D. Familial uveal melanoma. Clinical observations on 56 patients // Arch Ophthalmol. 1996. - Vol. 114, № 4. - P. 392-9.

104. Singh AD, Shields CL, Shields JA.Prognostic factors in uveal melanoma // Melanoma Res. 2001. - Vol. 11, № 3. - P. 255-63.

105. Siprashvili Z, Sozzi G, Barnes LD, McCue P, Robinson AK, Eryomin V, Sard L, Tagliabue E, Greco A, Fusetti L, Schwartz G, Pierotti MA, Croce CM, Huebner K.

106. Replacement of Fhit in cancer cells suppresses tumorigenicity // Proc Natl Acad Sci USA — 1997. Vol. 94. - P. 13771-13776.

107. Sisley IC, Parsons MA, Garnham J, Potter AM, Curtis D, Rees RC, Rennie IG. Association of specific chromosome alterations with tumour phenotype in posterior uveal melanoma // Br J Cancer. 2000 Jan. - Vol. 82, № 2. - P. 330-8.

108. Smiraglia DJ, Plass C. The development of CpG island methylation biomarkers using restriction landmark genomic scanning // Ann N Y Acad Sci -2003. Vol.983. - P.l 10-119.

109. Smith DI, McAvoy S, Zhu Y, Perez DS. Large common fragile site genes and cancer // Semin Cancer Biol. 2007. - Vol. 17, № 1. - P. 31-41.

110. Speicher MR, Prescher G, du Manoir S, Jauch A, Horsthemke B, Bornfeld N, Becher R, Cremer T. Chromosomal gains and losses in uveal melanomas detected by comparative genomic hybridization // Cancer Res. 1994. - Vol. 54, № 14. - P. 3817-23.

111. Spugnardi M, Tommasi S, Dammann R, Pfeifer GP, Hoon DS. Epigenetic inactivation of RAS association domain family protein 1 (RASSF1A) in malignant cutaneous melanoma // Cancer Res. 2003. - Vol. 63, № 7. - P. 1639-43.

112. Thorburn A. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) pathway signaling // J Thorac Oncol. 2007. - Vol. 2, № 6. - P. 461-5.

113. Tsai T, O'Brien JM.The future promise and the current reality of genetic prognostication inpatients with uveal melanoma//Arch Ophthalmol. 2008. - Vol. 126, № 3. - P. 413-5.

114. Virgili G, Gatta G, Ciccolallo L, et al. EUROCARE Working Group. Incidence of uveal melanoma in Europe // Ophthalmology. 2007. - Vol. 114, № 12. - P. 2309-15.

115. Virgili G, Gatta G, Ciccolallo L, et al. EUROCARE Working Group. Survival in patients with uveal melanoma in Europe // Arch Ophthalmol. 2008. - Vol. 126, № 10. - P. 1413-8.

116. White VA, McNeil BK, Horsman DE. Acquired homozygosity (isodisomy) of chromosome 3 in uveal melanoma // Canccr Genet Cytogenet. 1998. - Vol. 102, № 1. - P. 40-5.

117. Wistuba II, Ashfaq R, Maitra A, Alvarez H, Riquelme E, Gazdar AF. Fragile liistidine triad gene abnormalities in the pathogenesis of gallbladder carcinoma // Am J Pathol. 2002. -Vol. 160, №6.-P. 2073-9.

118. Yang Q, Nakamura M, Nakamura Y, et al. Two-hit inactivation of FHIT by loss of heterozygosity and hypermethylation in breast cancer // Clin Cancer Res. 2002. - Vol. 8, №9. - P.2890-3.

119. Ye H, Pungpravat N, Huang BL, et al. Genomic assessments of the frequent loss of heterozygosity region on 8p21.3-p22 in head and neck squamous cell carcinoma // Cancer Genet Cytogenet. 2007. - Vol. 176, № 2. - P. 100-6.

120. Zabarovsky ER, Lerman MI, Minna JD. Tumor suppressor genes on chromosome 3p involved in the pathogenesis of lung and other cancers // Oncogene. 2002. - Vol. 21, № 45. -P. 6915-35.

121. Zochbauer-Muller S, Fong KM, Maitra A, et al. 5' CpG Island Methylation of the FHIT Gene Is Correlated with Loss of Gene Expression in Lung and Breast Cancer // Cancer Res 2001. Vol. 61:3581-5.

122. Zuidervaart W, van Nieuwpoort F, Stark M, et al. Activation of the MAPK pathway is a common event in uveal melanomas although it rarely occurs through mutation of BRAF or RAS // Br J Cancer. 2005. - Vol. 92, № 11. - P. 2032-8.