Характеристика эффекторного центра неорганической пирофосфатазы Escherichia Coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Ситник, Татьяна Сергеевна

• Ситник, Татьяна Сергеевна
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ситник, Татьяна Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. РОЛЬ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ПИРОФОСФАТАЗ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. пирофосфатазы-их роль, функционирование в клетке.

1.2. Первое семейство пирофосфатаз.

Свойства ионов металлов в центре Ml.

Свойства ионов металлов в ifenmpe М2.

Свойства ионов металлов в г\ентре МЗ.

Взаимодействие центров Ml и М2 и их роль в катализе.

Свойства иона металла в центре М4.

Свойства межтримерных ионов магния.

1.3. Второе семейство пирофосфатаз.

Влияние различных ионов металлов в центрах Ml и М2 на структуру и каталитические свойства пирофосфатаз семейства II.

Константы диссоциации ионов металлов в ifeitmpe высокого сродства.

Изучение функционирования и свойств РРаз семейства II с использованием мутантных вариантов.

Сравнение структур и механизмов гидролиза пирофосфатаз двух семейств.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА ЭФФЕКТОРНОГО ЦЕНТРА НЕОРГАНИЧЕСКОЙ

ПИРОФОСФАТАЗЫ ESCHERICHIA COLI.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ).

2.1. Характеристика мутантных вариантов неорганической пирофосфатазы

E.coli.

Получение мутантных вариантов.

Связывание Mg2+ с ферментами и с фермент-субстратными комплексами.

Кинетика гидролиза субстрата мутантными вариантами Е- РРазы.

Кинетические характеристики тримерной формы Lysl 12Gln-PPa3bi.

Влияние метилендифосфоната на гидролиз субстрата нашивной РРазой и ее мутантными вариантами.

Термическая и химическая денатурация.

2.2. Установление природы эффектора при ферментативном гидролизе MgPP,.

3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ЭФФЕКТОРНОГО ЦЕНТРА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

LAPP, В КАЧЕСТВЕ СУБСТРАТА.

3.1. Гидролиз LaPP, Е-РРазой и Y-РРазой.

3.2. Влияние метилендифосфоната на гидролиз LaPP,.

Проверка возможности комплексообразования La с РСР.

Гидролиз LaPPj в присутствии РСР.

3.3. Влияние F" на гидролиз LaPP,.

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.1. Исходные вещества.

4.2. Методы исследования.

Обессоливание растворов белка.

Определение концентраций веществ.

Определение ферментативной активности.

Определение олигомерных форм ферментов. Седиментационный анализ.

Спектрофотометрическое титрование.

4.3. Расчет концентраций компонентов реакционной смеси.

4.4. Изучение зависимости скорости гидролиза MgPP, от концентрации свободных ионов магния.

Определение константы связывания Mg2+ в центре М2.

Определение константы связывания Mg2+ в центре М4.

4.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

4.6. Химическая денатурация.

4.7. Получение тримерных форм Е-РРазы и изучение их свойств.

4.8. Гидролиза субстрата гексамерными формами мутантных вариантов Е-РРазы.

4.9. Влияние метилендифосфоната на гидролиз MgPP,.

4.10 Гидролиз LaPP, нативной и мутантными вариантами Е-РРазы.

Гидролиз LaPPj гексамерной и тримерной формами нативной Е-РРазы и Y

Р Раз ой.

Зависимость скорости гидролиза LaPPj от концентрации свободных ионов магния.

4.11. Влияние метилендифосфоната на гидролиз LaPP,.

Гидролиз фиксированной концентрации LaPPj в широком диапазоне концентраций

Влияние фиксированной концентрации РСР на гидролиз LaPPi.

4.12. Влияние F" на гидролиз LaPP,.

4.13. Влияние F'и метилендифосфоната на гидролиз LaPP, и MgPP,.

4.14. Попытки кристаллизации комплексов нативной Е-РРазы с LaPP, и MgPCP.

Кристаллизация Е-РРазы в присутствии LaPPj.

Кристаллизация Е-РРазы в присутствии РСР.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика эффекторного центра неорганической пирофосфатазы Escherichia Coli»

Синтез многих важнейших компонентов клетки протекает с образованием пирофосфата (PPj). К таким процессам относятся, например, синтез белков, нуклеиновых и жирных кислот. Эффективность протекаиия сиитеза обеспечивается смещением термодинамического равновесия за счет элиминирования PPj. Это достигается с помощью неорганических пирофосфатаз, которые с очень высокими скоростями гидроилуют пирофосфат и тем самым регулируют его концентрацию. Такая ключевая роль РРаз в метаболизме создает возможность их выделения практически из любого представителя царства живого.

Пирофосфатазы относятся к конститутивным ферментам, то есть регуляция их активности достигается не на уровне экспрессии генов, а на уровне уже синтезированного белка.

Цитоплазматические пирофосфатазы подразделяются па два семейства. Наиболее хорошо изученными представителями семейства I являются пирофосфтазы из дрожжей и из Escherichia coli (КФ З.6.1.1.; РРазы). Эти ферменты обладают сходным строением активных центров и механизмом действия. Однако отличаются олигомерпым строением (пирофосфатаза из E.coli - гексамер, а из дрожжей - димер), числом аминокислотных остатков в субъедипице (175 для E.coli и 286 для дрожжей), расположением функциональных групп па поверхности и строением межсубъединичных контактов. Для пирофосфатазы из E.coli главная роль в образовании контактов между тримерами отводится ионным парам Hisl36-Aspl43' и Aspl43 -Hisl36, а также гидрофобному контакту Hisl40-Hisl40'. Другая область контакта сформирована симметрично боковыми цепями участков Asn24, А1а25 и Asp26 двух соседних субъединиц, связывающих межтримерпый иоп магния. В дрожжевой пирофосфатазе межсубъедипичпый контакт образован за счет гидрофобных взаимодействий ароматических колец Trp52, His87, Тгр 289 с симметрично расположенными остатками в другой субъедипице.

Характерным для РРаз является способность к конформационным перестройкам высокоинтегрировапиой структуры белков. Действительно, известно, что введение мутационных замен приводит к изменению ряда важнейших свойств ферментов. При взаимодействии с обратимыми ингибиторами проявляется отрицательная кооперативпость активных центров. Уменьшение олигомеризации (диссоциация на тримеры или димеры), приводящее к спижешио активности, по-видимому, является также следствием перестройки структуры.

Одним путем регуляции активности неорганической пирофосфатазы из E.coli, является наличие эффекторного центра. Впервые он был обнаружен при гидролизе MgPPj тримерной формой фермента. Оказалось, что зависимость скорости гидролиза от концентрации субстрата невозможно описать уравнением Михаэлиса - Ментен, что было объяснено заполнением эффекторного центра за счет связывания с ним свободного пирофосфата. Существование этого центра было подтверждено данными равновесной гель-фильтрации, показывающими включение двух молей пирофосфата на моль субъединицы, и активацией гидролиза субстрата под действием негидролизуемого аналога - метилендифосфоната.

Важно также, что пирофосфатазы являются металл-зависимыми ферментами. Известно, что физиологический диапазон концентраций Mg2+B клетке составляет 1-1,5 мМ, а для насыщения активного центра Е-РРазы необходимо 5-6 мМ Mg2+. Поэтому in vivo, по-видимому, этот фермент не насыщен ионами магния, однако, высокая активность пирофосфатаз может указывать на существование некоего компенсаторного механизма.

В задачу настоящего исследования входила детальная характеристика эффекторных свойств РРазы из E.coli. Работа включала три части. В первой части были получены и изучены свойства ряда мутантпых форм Е-РРазы. Характерным для них оказалось нарушение эффекторного центра, перестройка структуры и изменение эффективных параметров химической и термической денатурации. Для мутантных вариантов, содержащих замену Lysl 12, действие эффектора проявлялось только при гидролизе LaPPj, но не MgPPj. Во второй части исследований установили природу эффектора, активирующего гидролиз субстрата, показали, что Е-РРаза является субстрат-активируемым ферментом. При использовании в качестве альтернативного субстрата - LaPPj в последней части работы была выявлена положительная ^оперативность активных центров в гексамерной Е-РРазе. Кооперативность была характерна также для димерной молекулы дрожжевого фермента. Связывание в эффекторпом центре негидролизуемого аналога субстрата - магний метилендифосфоната вызывает ускорение гидролиза LaPPj под действием не только Е-РРазы, ее мутантных вариантов и тримерной формы этого фермента, а также дрожжевой РРазы, причем удается достичь скорости гидролиза LaPPj близкой к той, с которой гидролизуется природный субстрат - MgPPj. В присутствии эффектора не только растет скорость гидролиза, но также происходит исчезновение асимметрии субъединиц и сильно возрастает сродство ферментов к LaPPj.

Обзор литературы посвящен роли ионов металлов в функционировании пирофосфатаз обоих семейств. Характерной особенностью этих ферментов является участие в катализе 3-4 ионов двух валентных металлов, среди которых наибольшая активность в семействе РРаз I проявляется в присутствии ионов магния, а в семействе II -ионов марганца.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Ситник, Татьяна Сергеевна

выводы

Показано, что в молекуле неорганической РРазы из E.coli в эффекторпом центре связывается еще одна молекула субстрата (MgPPj), что приводит к активации фермента. Таким образом, Е-РРаза является субстрат-активируемым ферментом. В эффекторпом центре могут также связываться другие активаторы гидролиза: MgPCP и РСР.

Изучен гидролиз LaPPj Е-РРазой, который выявил следующие свойства фермента и характеристики эффекторного центра:

- наличие эффекторного центра, связывающего негидролизуемый аналог субстрата;

- проявление положительной кооперативное™ тримеров при связывании LaPPj;

- исчезновение асимметрии субъединиц, увеличение скорости гидролиза и улучшение связывания субстрата при добавлении либо MgPCP, либо фторид-иона, либо высоких концентраций Mg2+.

Связывание LaPPi с Y-РРазой, как и с Е-РРазой приводит к асимметрии субъединиц и многократному увеличению скорости гидролиза при связывании MgPCP в эффекторпом центре.

Изучение мутантных вариантов Е-РРазы (Asp26Ala-, Arg43Gln-, Lysll5Ala-, Lysl48Gln-, Lysl 12Gln-, Lysl 12Gln/Lysl 15А1а- и Lysl 12/148Gln-) показало:

- замены Asp26, Arg43, Lysl 15 и Lysl48 приводят к уменьшению сродства к эффекторному центру; введение мутационных замен приводит к изменению активности, эффективных параметров термической и химической денатурации;

- Е-РРаза с заменой Lysl 12Gln и в гексамерной, и в тримерной формах имеет одинаковую активность, которая не увеличивается в присутствии эффектора при гидролизе MgPPj, но растет на два порядка при гидролизе LaPPj.

Высказано предположение о возможной локализации эффекторного центра.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ситник, Татьяна Сергеевна, 2006 год

1. Heinonen, J.К. (2001), Biological role of inorganic pyrophosphate, kluwer Academic Publishers, Inc., Boston., 123-177.

2. Kornberg, A. (1962) in Horizons in biochemistry, Kasha, H., Pullman, B. Academic Press, New York, 251.

3. Heikinheimo, P., Lehtonen, J., Baykov, A.A., Lahti, R., Cooperman, B.S., Goldman, A. (1996) The structural basis for pyrophosphatase catalysis. Structure, 4, 1491-1508.

4. Zyryanov, A.B., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2001) The Electrophilic and Leaving Group Phosphates in the Catalytic Mechanism of Yeast Pyrophosphatase. J. Biol. Chem.,216, 17629-17634.

5. Teplyakov, A., Obmolova, G., Wilson, K.S., Ishii, K., Kaji, H., Samejima, Т., Kuranova, I. (1994) Crystal structure of inorganic pyrophosphatase from Thermus thermophilic. Protein Sci., 3, 1098-1107.

6. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N. (1996) Effect of D42N substitution in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2+ binding. FEBS Letters, 392, 91-94.

7. Kankare, J.; Salminen, Т.; Lahti, R.; Cooperman, B. S.; Baykov, A. A.; Goldman, A. (1996) Crystallographic Identification of Metal-Binding Sites in Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase. Biochemistry, 35 (15), 4670-4677.

8. Heikinheimo, P., Lehtonen, J., Baykov, A.A., Lahti, R., Cooperman, B.S., Goldman, A. (1996) The structural basis for pyrophosphatase catalysis. Structure, 4, 1491-1508.

9. Harutyunyan, E.G., Kuranova, I.P., Vainstein, B.K., Hohne, W.E., Lamzin, V.S., Dauter Z., Teplyakov, A.V., Wilson, K.S. (1996) X-ray structure of yeast inorganic pyrophosphatase complexed with manganese and phosphate. Eur. J. Biochem.,. 239, 220-228.

10. Арутюнян, Э.Г., Оганесян, В.IO., Оганесян, Н.Н., Терзян, С.С., Попов, А.Н., Рубинский, С.В., Вайнштейн, Б.К., Назарова, Т.Н., Курилова, С.А., Воробьева,

11. Н.Н., Аваева, С.М. (1996) Структура неорганической пирофосфатазы Е. coli и ее комплекса с ионом Мп2+ при разрешении 2,2 А. Кристаллография, 41, 84-96.

12. Samygina, V.R., Popov, A.N., Rodina, E.V., Vorobyeva, N.N., Lamzin, V.S., Polyakov, K.M., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Avaeva, S.M. (2001) JMB, 314 (3), 633-645.

13. Heikinheimo, P., Tuominen, V., Ahonen, A.-K., Teplyakov, A., Cooperman, B.S., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2001) Toward a quantum-mechanical description of metal-assisted phosphoryl transfer in pyrophosphatase. PNAS, 98, 31213126.

14. Rodina, E.V. (2003) in Protein Structures: Kaleidoscope of Structural Properties and Functions (Uversky, V.N., ed.) Research Signpost, Kerala, India, 627-650.

15. Вайпоиеи, IO.П., Воробьева, H.H., Родина, Е.В., Назарова, Т.И., Курилова, С.А., Скоблов, Ю.С., Аваева, С.М. (2005) Свободный PPi активирует гидролиз MgPPi неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70, 85-96.

16. Alberts В., Bray D., Zewis Z., Raff M., Roberts K., Watson Z. D. (1983) Molecular biology of the cell. Garland Publishing, Ink., 286.

17. Smith D., (1995) Magbesium as the catalytic centre RNA enzymes. In The Biological Chemistry of Magnesium (Cowan, J.A., Ed). 111-137, VCH Publishers, Inc., New York.

18. Шафрапский, Ю.А., Байков, А.А., Апдрукович, П.Ф., Аваева, С.М. (1977) Сравнительное изучение кинетики Mg2+ активируемого гидролиза пирофосфата и триполифосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия, 42, 1244-1254.

19. Wong S.C.K., Hall D.C., Josse J., (1970) Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. 3. Molecular weight and physical properties of the enzyme and its subunits JBC, 245, 4335-4345.

20. Zyryanov, А.В., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2001) The Electrophilic and Leaving Group Phosphates in the Catalytic Mechanism of Yeast Pyrophosphatase. J. Biol. Chem., 276, 17629-17634.

21. Байков А.А., Аваева С.М., (1974) Влияние двухвалентных катионов на гидролиз АТР дрожжевой неорганической пирофосфатазой. Биохимия, 39, 342-347.

22. Tono, Н. Kornberg, А. (1967) Biochemical studies of bacterial sporulation. 3. Inorganic pyrophosphatase of vegetative cells and spores of Bacillus subtilis. JBC, 242,2375-2382.

23. Fabrichniy, I.P., Lehtio, L., Salminen, A., Zyryanov, А.В., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2004) Structural studies of metal ions in family II pyrophosphatases: the requirement for a Janus ion. Biochemistry, 43, 14403-14411.

24. Mercel, M.C., Fabrichniy, I.P., Salminen, A., Kalkkinen, N., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2001) Crystal structure of Streptococcus mutans pyrophosphatase: a new fold for an old mechanism. Structure, 9, 289-297.

25. Mercel, M.C., Fabrichniy, I.P., Salminen, A., Kalkkinen, N., Baykov, A.A., Lahti, R., Goldman, A. (2001) Crystal structure of Streptococcus mutans pyrophosphatase: a new fold for an old mechanism. Structure, 9, 289-297.

26. Avaeva, S., Ignatov, P., Kurilova, S., Nazarova, Т., Rodina, E., Vorobyeva, N., Oganessyan, V., Harutyunyan, E. (1996) Escherichia coli inorganic pyrophosphatase : site-directed mutagenesis of the metal binding sites. FEBS Letters, 399, 99-102.

27. Kankare, J., Neal, G.S., Salminen, Т., Glumoff, Т., Cooperman, В., Lahti, R., Goldman, A. (1994). The structure of E. coli soluble inorganic pyrophosphatase at 2.7 A resolution. Protein Eng. 7, 823-830.

28. Курилова С.А., Богданова А.В., Назарова Т.Н., Аваева С.М., (1984). Изменение активности неорганической пирофосфатазы из E.coli при взаимодействии с ионами магния, цинка, кальция и фтора. Биоорганическая химия, 10, 1153-1160.

29. Hyytia, Т.; Halonen, P.; Salminen, A.; Goldman, A.; Lahti, R.; Cooperman, B. S. (2001) Ligand Binding Sites in Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase: Effects of Active Site Mutations. Biochemistry, 40 (15), 4645-4653.

30. Baykov, A.A., Hyytia, Т., Turkina, M.V., Efimova, I.S., Kasho, V.N., Goldman, A., Cooperman, B.S., Lahti, R. (1999) Functional characterization of Escherichia coli inorganic pyrophosphatase in zwitterionic buffers. Eur. J. Biochem., 260, 308-317.

31. Pohjanjoki, P., Fabrichniy, I.P., Kasho, V.N., Cooperman, B.S., Goldman, A., Baykov, A.A., Lahti, R. (2001) Probing Essential Water in Yeast Pyrophosphatase by Directed Mutagenesis and Fluoride Inhibition Measurements. J. Biol. Chem., 276, 434-441.

32. Ridlington, J.W., Butler. L.G. (1972) Binding of pyrophosphate, metal ion, and ion-pyrophosphate complexes. JBC. 247, 7303-7307.

33. Baykov, A. A.; Hyytia, Т.; Volk, S. E.; Kasho, V. N.; Vener, A. V.; Goldman, A.; Lahti, R.; Cooperman, B. S. (1996) Catalysis by Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase: pH and Mg Dependence. Biochemistry, 35 (15), 4655-4661.

34. Аваева, C.M., Воробьева, H.H., Курилова, С.А., Назарова, Т.И., Поляков, К.М., Родина, Е.В., Самыгина, В.Р. (2000) Механизм ингибирования неорганической пирофосфатазы Escherichia coli ионами кальция. Биохимия, 65, 442-458.

35. Avaeva, S.M., Rodina, E.V., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Vorobyeva, N.N. (1996) Effect of D42N substitution in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase on catalytic activity and Mg2+ binding. FEBS Letters, 392, 91-94.

36. Kapyla, J., Hyytia, Т., Lahti, R., Goldman, A., Baykov, A.A., Cooperman B.S. (1995) Effect of D97E Substitution on the Kinetic and Thermodynamic Properties of Escherichia coli Inorganic Pyrophosphatase. Biochemistry, 34 (3), 792-800.

37. Rodina, E.V., Vainonen, Y.P., Vorobyeva, N.N., Kurilova, S.A., Nazarova, T.I., Avaeva, S.M. (2001) The role of Asp42 in Escherichia coli inorganic pyrophosphatase functioning. Eur. J. Biochem., 268, 3851-3857

38. Ting, Se-J., Dunaway ~ Mariano, D. (1984) Investigation of the role of the substrate metal ion in the yeast inorganic oyri\ophosphatease reaction. FEBS Lett, 165, 251-253.

39. Аваева, C.M., Воробьева, H.H., Курилова, С.А., Назарова, Т.Н., Поляков, К.М., Родина, Е.В., Самыгина, В.Р. (2000) Механизм ингибировапия неорганической пирофосфатазы Escherichia coli ионами кальция. Биохимия, 65, 442-458.

40. Baykov, A.A., Shestakov, A.S., Kasho, V.N., Vener, A.V., Ivanov, A.H. (1990) Kinetics and thermodynamics of catalysis by the inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli in both directions. Eur. J. Biochem., 194, 879-887.

41. Braga, E.A., Avaeva, S.M. (1972) The interaction of yeast inorganic pyrophosphatase with bivalent cations and pyrophosphate. FEBS Lett., 27. 251-255.

42. Petukhov, M., Pychkov, G., Firsov, L., Serrano, L. (2004) H-bonding in protein hydration revisited. Protein Science, 13, 2120-2129.

43. Zyryanov, A.B., Pohjanjoki, P., Kasho, V.N., Shestakov, A.S., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2001) The Electrophilic and Leaving Group Phosphates in the Catalytic Mechanism of Yeast Pyrophosphatase. J. Biol. Chem.,216, 17629-17634.

44. Zyryanov, А.В., Vener, A.V., Salminen, A., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2004) Rates of elementary catalytic steps for different metal forms of the family II pyrophosphatase from Streptococcus gordonii. Biochemistry, 43, 1065-1074.

45. Zyryanov, А.В., Vener, A.V., Salminen, A., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2004) Rates of elementary catalytic steps for different metal forms of the family II pyrophosphatase from Streptococcus gordonii. Biochemistry, 43, 1065-1074.

46. Ahn, S., Milner, A.J., Futterer, К., Konopka, M., Ilias, M., Young, M.W., White, S.A. (2001) The "open" and "closed" structures of the type-C inorganic pyrophosphatases from Bacillus subtilis and Streptococcus gordonii. JMB, 313 (4), 797-811

47. Zyryanov, А.В., Tammenkoski, M., Salminen, A., Kolomiytseva, G.Y., Fabrichniy, I.P., Goldman, A., Lahti, R., Baykov, A.A. (2004) Site-specific effects of zinc on the activity of family II pyrophosphatase. Biochemistry, 43, 14395-14402.

48. Аваева, C.M. (2000) Взаимодействие активных центров в олигомерных структурах неорганических пирофосфатаз. Биохимия, 65, 428-441.

49. Бакулева Н.П., Костенко Е.Б., Байков А.А., Аваева С.М. (1981) Обнаружение и характеристика дополнительного центра присоединения субстрата и его аналогов у неорганической пирофосфатазы. Биохимия, 46, 832-839.

50. Буробип, А.В., Ломонова, М.В., Склянкина, В.А., Аваева, С.М. (1997) Необратимое специфическое ингибироваиие неорганической пирофосфатазы E.coli аминами. Биоорг. химия, 23, 104-109.

51. Вайнонен, Ю.П., Воробьева, Н.Н., Родина, Е.В., Назарова, Т.Н., Курилова, С.А., Скоблов, Ю.С., Аваева, С.М. (2005) Свободный PPi активирует гидролиз MgPPi неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биохимия, 70, 85-96.

52. Satherland G.R.J., Aust S.D. (1997) Thermodynamics of binding of the distal calcium to manganese peroxidase. Biochemistry, 36, 8567-8573

53. Вайнонен, IO.П., Курилова, C.A., Аваева, С.М. (2001) Гексамерная, тримерная, димерная и мономерная формы неорганической пирофосфатазы Escherichia coli. Биооргаи. химия, 28, 426-433.

54. Sarakatsannis J.N., Duan Yo. (2005) Statistical chatacterization of salt bridges in proteins. Proteins-.structure, function and bioinformatis, 60, 732-739.

55. Sutherland, G.R.J, and Aust, S.D. (1997) Thermodynamics of binding of the distal calcium to manganese peroxidase. Biochemistry, 36, 8567-5873.

56. Raibekas A.A., Bures E.J., Siska C.C., Kohno Т., Latypov R.F, Kervvin B.A. (2005) Anion binding and controlled aggregation of human interleukin-1 receptor antagonist. Biochemistry, 44, 9871-9879.

57. Privalov, P.L. (1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv. Prot. Chem., 33, 167-241.

58. Cooperman, B.S. (1982) The mechanism of action of yeast inorganic pyrophosphatase. Methods Enzymol., 87, 526-548.

59. Tanford, C. (1970) Protein denaturation. C. Theoretical models for the mechanism of denaturation. Adv. Prot. Chem., 24, 1-95.

60. Morgan, C.J., Wilkins, D.K., Smith, L.J., Kawata, Y., Dobson, C.M. (2000) A compact monomeric intermediate identified by NMR in the denaturation of dimeric triose phosphate isomerase. J. Mol. Biol., 300, 11-16.

61. Березин И.В., Клесов А.А. (1976) Практический курс химической и ферментативной кинетики, Изд-во Московского университета, 113-114.

62. Smirnova I.N., Kudryavtseva N.A., Komissarenko S.V., Tarusova N.B., Baykov А.А. (1988) Diphosphonate are potent inhibitors of mammalian inorganic pyrophosphatase. Arch. Biochem. Biophys., 267, 280-284.

63. Josse, J. (1966) Constitutive inorganic pyrophosphatase of Escherichia coli. 1. Purification and catalytic properties., J. Biol. Chem., 241, 1938-1957.

64. Baykov, A. A.; Fabrichniy, I. P.; Pohjanjoki, P.; Zyryanov, А. В.; Lahti, R. (2000) Fluoride Effects along the Reaction Pathway of Pyrophosphatase: Evidence for a Second Enzyme-Pyrophosphate Intermediate. Biochemistry, 39 (39), 11939-11947.

65. Бакулева Н.П., Костенко Е.Б., Байков A.A., Аваева С.М. (1981) Обнаружение и характеристика дополнительного центра присоединения субстрата и его аналогов у неорганической пирофосфатазы. Биохимия, 46, 832-839.

66. Baykov A.A., Avaeva S.M., (1981) A simple and sensitive apparatus for continuous monitoring of orthophosphate in the presence of acid-labile compounds. Anal. Biochem., 116, 1-4.

67. Chervenka C.H. (1972) Methods for Analytical Ultracentrifuge, Spinco Division of Beckman Instruments Inc. Palo Alto.

68. Шафранский, Ю.А., Байков, A.A., Андрукович, П.Ф., Аваева, С.М. (1977) Сравнительное изучение кинетики Mg2+ активируемого гидролиза пирофосфата и триполифосфата неорганической пирофосфатазой. Биохимия, 42, 1244-1254.