Характеристика дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. finitimus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Левитин, Евгений Ильич

• Левитин, Евгений Ильич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Левитин, Евгений Ильич

Содержание

Введение

Обзор литературы: Регуляция синтеза дельта-эндотоксинов и формирование энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis

I Общая характеристика Bacillus thuringiensis

II Факторы, ответственные за энтомоцидную активность В. thuringiensis

III Структурная организация Cry

белков

IV Мобильные генетические элементы Bacillus thuringiensis

V Регуляция экспрессии cry

генов

1. Транскрипционные механизмы регуляции экспрессии cry генов: а) Экспрессия cry генов, зависимая от споруляции

б) Экспрессия cry генов, независимая от споруляции

2. Механизмы посттранскрипционной регуляции экспрессии дельта-эндотоксинов

3. Механизмы посттрансляционной регуляции синтеза дельта-эндотоксинов

4. -Влияние белок-белковых взаимодействий и шаперон-подобных белков на фолдинг дельта-эндотоксинов

5. Пространственная организация экспрессии генов дельта-эндотоксинов и механизмы, принимающие участие в

кристаллообразовании

Материалы и методы

Результаты

I. Морфологическое исследование штамма Bacillus thuringiensis подвида finitimus В-1166 VKPM и получение сегрегантов, отличающихся расположением кристаллических тел включения

1) Микроскопическое изучение морфологии штамма Bacillus thuringiensis подвида finitimus В-1166 VKPM

2) Получение сегрегантов штамма штамма Bacillus thuringiensis подвида finitimus В-1166 VKPM

II. Изучение белкового состава кристаллов исходного штамма

III. Определение N-концевой аминокислотной последовательности истинных токсинов

IV. Изучение белкового состава кристаллов сегрегантов со свободными и сцепленными кристаллами

V. Исследование генома штамма В-1166 VKPM Bacillus thuringiensis ssp. finitimus при помощи универсальных праймеров

для выявления cry генов

VI. Конструирование геномного банка и клонирование гена cry26Aal

VII. Анализ последовательности клонированного фрагмента и структура геномного локуса гена сгу26Аа

VIII. Определение уникальности геномного окружения гена cry26Aal

IX. Экспрессия гена cry26Aal в E.coli

Обсуждение результатов

Выводы

Заключение

БЛАГОДАРНОСТИ

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика дельта-эндотоксинов Bacillus thuringiensis ssp. finitimus»

ВВЕДЕНИЕ

Род Bacillus и близкие группы грамположительных бактерий широко распространены в природе. Эти микроорганизмы используются в производстве антибиотиков, ферментов и других биологически активных веществ. Изучение регуляции процессов роста и

споруляции представителей рода Bacillus (в частности Bacillus

]

subtilis) стало основой выявления механизма долговременного переключения системы промоторов, представляющего собой первый детально изученный на молекулярном уровне случай необратимой дифференциации клетки. Некоторые бациллы (такие как Bacillus antracis) могут вызывать инфекционные заболевания человека и животных. Один из видов бацилл, Bacillus thuringiensis, известен -своими энтомоцидными свойствами и широко используется^ для создания биопестицидов с высокой избирательностью в отношении различных видов насекомых.

Среди энтомоцидных факторов, вырабатываемых клетками В.thuringiensis, наиболее важную роль играет группа родственных белков, называемых Cry белками или дельта- эндотоксинами. В ходе споруляции или, как в случае белков CryЗА, в поздней стадии вегетативного роста дельта- эндотоксины формируют видимые в световой микроскоп кристаллические тела включения, расположенные обычно рядом со спорой внутри материнской клетки. После лизиса материнской клетки смесь кристаллических включений и спор ■высвобождается во внешнюю среду.

Кристаллические включения В.thuringiensis, могут составлять ... более 25% от сухого веса спорулирующей клетки В. thuringiensis. Подобный синтез требует участия в нем значительной доли клеточных ресурсов и, тем не менее, споруляция и связанные с ней клеточные процессы проходят параллельно с синтезом дельта-эндотоксинов (Aronson,1993). Высокая продукция Cry- белков является уникальным случаем природной суперэкспрессии. Механизм, обеспечивающий столь высокий уровень устойчивой продукции интересен с точки зрения разработки эффективных систем гетерологической экспрессии.

Несмотря на интенсивное изучение регуляции синтеза дельта-эндотоксинов, механизм формирования кристалла все еще не ясен. Экспрессия cry генов в гетерологичных системах хотя и дает кристаллоподобные тела включения, тем не менее не приводит к образованию столь упорядоченной структуры, как кристаллы, образующиеся в результате экспрессии cry генов в штаммах В.thuringiensis (Baum and Malvar1995). Формирование

энтомоцидных кристаллов у бацилл, не воспроизводит

кристаллизацию белков in vitro, так как на всем протяжении процесса роста кристаллов концентрация находящегося в растворе эндотоксина ничтожно мала (Baum and Malvar1995). В ряде

работ (Sramervilie et al.,1971, Somerville, 1971) показано, что в самом н/ачале своего образования кристалл связан с мембраной экзоспориума, хотя впоследствии утрачивает эту связь и свободно располагается в цитоплазме материнской клетки. Эти и некоторые другие данные позволяют предположить существование структуры, выполняющей роль инициатора образования кристаллов эндотоксинов.

В настоящее время клонировано и секвенировано большое количество cry генов (см.ниже таблицу!.), в результате чего появилась реальная возможность создавать штаммы В.thuringiensis с комбинированными энтомоцидными свойствами. Для создания таких штаммов необходимо обеспечивать эффективную продукцию рекомбинантных белков в спорулирующих клетках В.thuringiensis. Это важная практическая задача,, вызывающая повышенный интерес исследователей к проблемам регуляции синтеза дельта-эндотоксинов В. thuringiensis.

У большинства представителей вида В. thuringiensis белковые •..-кристаллы образуются только с внешней стороны экзоспориальной оболочки и освобождаются в среду при автолизе спорангиев (Aronson and Fitz-James, 1976 ). Тем не менее, существуют подвиды В.thuringiensis, образующие кристаллические включения как снаружи, так и внутри экзоспориума. Кристаллы, сформированные с внутренней стороны экзоспориума, после лизиса материнской клетки остаются связанными со спорой, в то время как кристаллы с обычным местом закладки остаются «свободными». Такой способ закладки кристаллов встречается у В.thuringiensis ssp.

finitimvs, у B.thuringiensis ssp. lewin и у некоторых других (Debro et al.,1986).

В работе Debro et al.1986) указывалось на связь локализации кристаллов внутри экзоспориума с наличием 98-МДа плазмиды. В этой же работе сообщалось о том, что эндотоксины, образующие свободные и связанные кристаллы, обладают уникальными антигенными свойствами, отличаясь при этом друг от друга. Влияние плазмидной ¡локализации' гена на характер распределения токсина в клетке предполагается также в некоторых новых работах (Srinivas et al.,

Целью настоящей работы сравнительная характеристика белкового состава сцепленных (закладывающихся под экзоспориумом) и сво/бодных (образующихся вне экзоспориальных оболочек) кристаллических включений в штамме Bacillus thuringiensis подвида finitimus ВКПМ В-1166, а также характеристика особенностей организации геномного локуса одного из cry генов, изучаемого штамма с точки зрения возможных причин специфики локализации его продукта в клетке.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Регуляция синтеза дельта-эндотоксинов и формирование энтомоцидыых кристаллов Bacillus thuringiensis

I I. Общая характеристика Bacillus thuringiensis

¡

Bacillus thuringiensis характерна для многих природных местообитаний. Штаммы Bacillus thuringiensis были изолированы пыли продуктовых складов, хвои и листьев деревьев, почвы, насекомых, листового опада. В соответствии с каталогом Коллекции

Пастеровского Института (Institut Pasteur) выделяются 63 группы

\

изолятов В. thuringiensis. Среди них различают -55 форм, отличающихся жгутиковыми антигенами (Н-антигенами). Обычно данным группам (биотипам) придается ранг подвида. Имеется также 8 не имеющих жгутиков групп (Schnepf, 1998). Существующие данные не позволяют сделать вывод о предпочтительной экологической нише В.thuringiensis - является ли она в массе энтомопатогенным организмом или же в основном это обитатель поверхности листьев и подстилки (Meadows, 1993). Тем не менее, есть данные, что В.thuringiensis чаще выделяется из трупов насекомых и пыли продуктовых складов, чем из почвы (Bernhard, 1997, Bravo г~ - et al.,1998).

'Размер генома Bacillus thuringiensis составляет от 2.4 до 5.7 миллионов пар нуклеотидов (Lovgren i et al. 1998). Физическая карта построена для двух штаммов Bacillus thuringiensis. Сравнение построенной карты с картами геномов штаммов Bacillus cereus показало сходство в пределах половины хромосомой ДНК, прилегающей к участку ориджина репликации. В области наиболее далеко отстоящей от ориджина наблюдается большая изменчивость физической и генетической карты (Carlson 1996). Большинство

изолятов несут несколько экстрахромосомных элементов, среди которых встречаются как кольцевые, так и линейные. В большинстве случаев белки, образующие параспоральные кристаллические тела

включения, кодируются генами, располагающимися на больших прлазмидах(Carlson, 1996). Последовательности, гибридизующиеся с ДНК-пробами cry генов, встречаются также и на хромосоме, хотя до сих пор неизвестно в какой степени они могут участвовать в контроле синтеза белка, откладывающегося в кристалле (Dodd et al.,1987).

II. Факторы, ответственные за энтомоцидную активность

В. thuringiensis.

Предположительно наиболее типичная экологическая стратегия В.thuringiensis - это размножение в личинках насекомых, погибших или погибающих в результате контакта с токсичными продуктами, продуцируемыми бациллами (Schnepf, 1998). Как правило, В.thuringiensis попадают в кишечник личинки при питании и вызывают перфорацию эпителиальных клеток и общую интоксикацию а также, проникая в гемоцель насекомого, размножается там, вызывая септемию. Для нескольких штаммов B.cereus также показаны энтомопатогенные свойства (Heierson, 1986).

Дельта-эндотоксины - не единственный энтомоцидный агент, найденный у В. thuringiensis. Было показано, что энтомоцидными свойствами могут также обладать фосфолипазы В.thuringiensis (Zhang, 1993), протеазы (Kumar, 1998а, Kumar, 1998b, Lovgren, 1990), хитиназы (Schnepf, 1998), так называемые бета-экзотоксины - низкомолекулярные ингибиторы транскрипции эукариот (Levinson, ■1990) и секретируемые на вегетативной стадии Vip белки (Estruch, -1996) .

До недавнего времени считалось, что способность синтезировать дельта-эндотоксины свойственна только

В.thuringiensis. В настоящее время Cry-белки обнаружены в нескольких других микроорганизмах: Bacillus popiliae (Zhang et al) и Clostridium bifermentum, (Barloy • et al.1997) также характерных своей энтомопатогенностью.

Почти все известные дельта-эндотоксины в спорулирующих клетках В.thuringiensis формируют кристаллические включения, видимые в световой микроскоп..После лизиса спорангиев кристаллы

высвобождаются во внешнюю среду и вместе со спорами могут заглатываться личинками насекомых. В состав кристаллических включений входят предшественники активных белков (протоксины). При попадании в кишечник насекомого происходит растворение кристаллов и процессинг протоксинов протеолитическими ферментами кишечного сока, в результате чего формируется устойчивый к протеолизу «истинный токсин» - активная форма дельта-эндотоксина с молекулярной массой от 55 до 65кДа (Aronson,1995).

Протоксины могут сильно различаться по молекулярной массе, обычно это белки двух типов - 1) с молекулярной массой 60-7ОкДа или 2) с молекулярной массой 130-140кДа. Во втором случае С-концевая половина молекулы не существенна для токсического действия и полностью расщепляется при формировании «истинного токсина», а N-концевая половина соответствует бОкДа варианту протоксина. Предполагается, что С- концевая половина 130кДа белков необходима для правильного формирования кристаллов. Есть данные, что для образования кристаллов из бОкДа протоксинов необходимы шапирон-подобные белки (Crickmore et al., 1992).

Уровень сходства первичных последовательностей дельта-эндотоксинов достаточно высок: две белковых последовательности содержат обычно не менее 30% идентичных аминокислотных остатков. Консервативные положения аминокислотных остатков распределены в Cry- белках неравномерно, формируя Интересно, что действие

секретируемых на вегетативной стадии белков, называемых Vip, по внешним проявлениям сходно с действием белков Cry: Vip белки также вызвают лизис эпителиальных клеток кишечника насекомых и приводят к параличу (Yu, 1997). К настоящему времени клонировано , по крайней мере три ' гена vip: viplA, vip2A и vip3A. Соответствующие им белки не родственны белкам Cry, не образуют кристаллических структур и секретируются на стадии вегетативного роста. Похоже, что генами класса vip3A обладают как B.thuringiensis так и B.cereus (Estruch, 1996).

Из всех разнообразных энтомоцидных агентов B.thuringiensis Cry-белки принято считать наиболее важными агентами из-за высокой степени их токсического действия. Кроме того, синтез дельта-эндотоксинов в клетках бацилл имеет ярко выраженное

внешнее проявление. Морфологический признак - образование энтомоцидных кристаллов при споруляции - послужил поводом для разделения двух видов бактерий - B.thuringiensis и B.cereus. Тем не менее, современные исследования не поддерживают гипотезу о принадлежности B.thuringiensis и .B.cereus к разным видам (Schnepf et al. 1998) Сравнение проводили многими современными •молекулярными методами, включающими гибридизацию хромосомной ДНК,; анализ жирных кислот и фосфолипидов, анализ длины амплифицирующихся фрагментов (Keim, 1997), рестриктный анализ геномной ДНК (Carlson, 1994), сравнение последовательностей 16S рибосомной РНК (Schnepf, 1998).

Таким образом, способность синтезировать параспоральные кристаллические включения является недостаточным критерием для таксономического разграничения. Действительно, было обнаружено, что геномная ДНК некоторых штаммов B.cereus гибридизуется с crylА-специфическими ДНК-зондами (Carlson et al., 1994, Dodd et al.,1987 Prefontaine et al., 1987). Несмотря на то, что современные молекулярные исследования подтверждают гипотезу о принадлежности обоих организмов к одному таксономическому виду (B.cereus sensu lato), в современной научной литературе продолжают использоваться два различных видовых названия, что представляется более удобным для практических целей (Schnepf, 1998),.

B.thuringiensis - не единственный вид бацилл, обладающих энтомопатогенными свойствами: уже сравнительно давно выявлены ■энтомопатогенные свойства B.popiliae и В.sphaericus. (Schnepf, 1998),

III. Структурная организация Cry белков.

Cry белки или дельта- эндотоксины семейство родственных белков, проявляющих токсическое действие на личинках многих насекомых, причем спектр видов насекомых-мишеней для разных Cry белков различен. В настоящее время имеются также сведения о возможной токсичности дельта-эндотоксинов для некоторых других

групп беспозвоночных, а также на культурах клеток млекопитающих (Potvin et al., 1998, Thomas et al., 1983),. Экологическая значимость дельта-эндотоксинов остается недоказанной в прямых экспериментах.

вариабельные и консервативные участки. В настоящее время принято выделять 8 консервативных районов (блоков): 5 в N-концевой «половине» и 3 - в С-концевой (Hofte, 1989, Schnepf, 1998).

Первая предложенная классификация дельта- эндотоксинов практически не учитывала степени сходства аминокислотных последовательностей, основываясь только на различиях в энтомоцидных свойствах Cry белков (Hofte, 1986). По типу специфичности белки Cry разбивались на четыре класса: класс Cryl включал/ токсины, специфичные только для отряда Lepidoptera, CryII 4 Lepidoptera и Díptera, CryIII - только для Coleóptera, CryIV - только для Díptera. В первое время это деление до некоторой степени соответствовало сходству аминокислотных последовательностей. Но с увеличением числа известных дельта-эндотоксинов стало ясно, что близкородственные белки могут иметь сильно отличающиеся спектры насекомых-мишеней, а некоторые новые токсины не укладываются в существующую систему классификации (Bradley, 1995, Schnepf, 1998). В результате старая классификация была пересмотрена и предложена новая система, построенная на анализе аминокислотных последовательностей Сгу-белков (Crickmore 1997).

За основу новой классификации была выбрана методика, •использованная при создании номенклатуры цитохромов Р-450. В соответствии с этой системой белки объединяются в семейства на .. основании их филогенетических отношений. Степень дивергенции вычисляется с помощью стандартного пакета программ (CLUSTAL W, PHYLIP) и строится филогенетическое дерево (Crickmore, 1998), (рис.1). Присвоение соответствующих рангов происходит при уровне сходства менее 95, 78 и 45% (для существующего состояния системы). Выделение новых семейств и присвоение названий новым последовательностям регулируется Комитетом по номенклатуре Сгу-белков. Номенклатура для уже известных токсинов в новой и

: / старой классификации приведены Комитетом в соответствие друг с другом {табл.1) . : , :

Предложенная система классификации разработана для последовательностей протоксинов - ■ предшественников активных белков. В работе Bravo (1997) был- использован несколько иной подход - для филогенетического анализа были выбраны ■последовательности «истинных токсинов» и была сделана попытка связать эволюционные процессы с существующей моделью третичной структуры Cry- белков.

В таблице 1 представлен полный список известных к настоящему времени генов 5-эндотоксинов Bacillus thuringiensis и соответствие оригинальных названий, данных исходя из требований старой номенклатуры, с новыми.

\

Таблица 1. Полный список генов 8-эндоаюксинов Bacillus thuringiensis.

название старое номер в авторы год ссылки координа

название базе ты

данных кодирую-

EMBL щей обла-

сти

crylAal cryIA(a) Ml 1250 Schnepf et al 1985 JBC 260 6264-6272 527-4054

crylAa2 crylA(a) M10917 Sliibano et al 1985 Gene 34 243-251 153-

>2955

сгу!АаЗ crylA(a) D00348 Shimizu et al 1988 ABC 52 1565-1573 73-3603

ciylAa4 crylA(a) X13535 Masson et al 1989 NAR17 446-446 1-3528

ciylAa5 crylA(a) D17518 Udayasuriyan et al 1994 BBB 58 830-835 81-3611

ciylAa6 crylA(a) U43605 Masson et al 1994 Mol Micro 14 851-860 1->1860

ciylAbl caylA(b) M13898 Wabiko et al 1986 DNA 5 305-314 142-3606

ciylAb2 cryIA(b) M12661 Thome et al 1986 J Bact 166 801-811 155-3625

crylAb3 oyIA(b) M15271 Geiser et al 1986 Gene 48 109-118 156-3623

ciylAM cry!A(b) D00117 Kondo et al 19 87 ABC 51455-463 163-3630

ciylAb5 aylA(b) X04698 Hofteetal 1986 EJB 161 273-280 141-3605

ciylAb6 cryIA(b) M37263 Hefford et al 1987 J Biotech 6 307-322 73-3540

ciylAb7 csylA(b) X13233 Haider & Ellar 1988 NAR 16 10927-10927 1-3465

crylAbB eiyIA(b) Ml6463 Oedaetal 1987 Gene 53 113-119 157-3624

crylAb9 oylA(b) X54939 Chak&Jen 1993 PNSCRC 17 7-14 73-3540

ciylAel ciyIA(c) Ml 1068 Adang et al 1985 Gene 36 289-300 388-3921

ciylAc2 crylA(c) M35524 Von Tersch et al 1991 AEM 57 349-358 239-3772

crylAc3 ctylA(c) X54159 Dardenne et al 1990 NAR 18 5546-5546 339-

>2192

ciylAc4 ciyIA(c) M73249 Payne et al 1991 USP 4990332 1-3537

ciylAc5 ciylA(c) M73248 Payne et al 1992 USP 5135867 1-3534

crylAc6 crylA(c) U43606 Masson et al 1994 Mol Micro 14 851-860 1 -> 1821

ciylAdl crylA(d) M73250 Payne & Sick 1993 USP 5246852 1-3537

crylAel ciylA(e) M65252 Lee & Aronson 1991 JBact 173 6635-6638 81-3623

crylBal crylB X06711 Brizzard & Whiteley 1988 NAR 16 2723-2724 1-3684

crylBa2 X95704 Soetaert 1996 unpublished 1-4074

ciylBbl ET5 L32020 Donovan & Tan 1994 USP 5322687 67-3753

ciylBcl ciylb(c) Z46442 Bishop et al 1994 unpublished 141-3839

crylCal crylC X07518 Honee et al 1988 NAR 16 6240-6240 47-3613

ciylCa2 crylC XI3620 Sanchis et al 1989 Mol Micro 3 229-238 241-

>2711

ciylCa3 crylC M73251 Payne & Sick 1993 USP 5246852 1-3570

crylCa4 crylC A27642 Van Mellaert et al 1995 EP 0400246 234-3800

ciylCa5 crylC X96682 Strizhov 1996 unpublished l->2268

ciylCa6 crylC X96683 Strizhov 1996 unpublished l->2268

ciylCa7 ciylC X96684 Strizhov 1996 unpublished l->2286

ciylCbl crylC(b) M97880 Kalman et al 1993 AEM 59 1131-1137 296-3823

crylDal crylD 54160 Hofte et al 1990 NAR 18 5545-5545 264-3758

crylDbl prtB Z22511 Lambert 1993 unpublished 241-3720

ciylEal crylE X53985 Visser et al 1990 JBact 172 6783-6788 130-3642

crylEa2 crylE X56144 Bosse et al 1990 NAR 18 7443-7443 1-3516

ciylEa3 crylE M73252 Payne & Sick 1991 USP 5039523 1-3516

crylEbl crylE(b) M73253 Payne & Sick 1993 USP 5206166 1-3522

ciylFal crylF M63897 Chambers et al 1991 Bact 173 3966-3976 478-3999

ciylFa2 crylF M73254 Payne & Sick- 1993 USP 5188960 1-3525

crylFbl prtD Z22512 Lambert 1993 unpublished 483-4004

ciylGal prtA Z22510 Lambert 1993 unpublished 67-3564

ciylGbl cryH2 U70725 Chak 1996 unpublished

ciylHal prtC Z22513 Lambert 1993 unpublished 530-4045

ciylHbl U35780 Koo et al 1995 unpublished 728-4195

ciyllal cryV X62821 Tailor et al 1992 Mol Micro 6 1211-1217 355-2511

ciylla2 cryV M98544 Gleave et al 1993 AEM 59 1683-1687 1-2160

crylla3 ciyV L36338 Shin et al 1995 AEM 61 2402-2407 279-2438

ciylla4 ctyV L49391 Kostichka et al 1996 JBact 178 2141-2144 61-2217

ciyllaS cryV159 Y08920 Selvapandiyan 1996 unpublished 524-2680

cryllbl cryV U07642 Shin et al 1994 AEM 61 2402-2407 237-2393

crylJal ET4 L32019 Donovan & Tan 1994 USP 5322687 99-3519

aylJbl ET1 U31527 Von Tersch & Gonzalez 1994 USP5356623 177-3686

crylKal U28801 Kooetal 1995 FEMS 134 159-164 451-4098

crylLal CrjEl U70726 Chak 1996 unpublished

cry2Aa 1 «vIIA M31738 Donovan ct al 1989 JBC 264 4740-4740 156-2054

cry2Aa2 ctyJIA M23723 Widner & Whiteley 1989 J Bact 171 965-974 18403741

cry2Aa3 D86064 Sasaki 1996 unpublished 20073911

cry2Abl ciyllB M23724 Widner & Whiteley 1989 J Bact 171 965-974 1-1899

cry2Ab2 cryllB X55416 Dankocsik et al 1990 MolMicr 4 2087-2094 874-2775

cry2AcI I cryllC X57252 Wuetal 1991 FEMS 81 31-36 21253990

cry3Aal ciylllA M22472 Herrnstadt et al 1987 Gene 57 37-46 25-1956

cry3Aa2 cryllLA J02978 Sekar et al 1987 PNAS 84 7036-7040 241-2175

cry3Aa3 ciyEHA Y00420 Hofteetal 1987 NAR 15 7183-7183 566-2497

ciy3Aa4 cry III A M30503 McPherson et al 1988 Bio/technology 6 61-66 201-2135

cry3Aa5 crylllA M37207 Donovan et al 1988 MGG 214 365-372 569-2503

cry3Aa6 erylllA U10985 Adams et al 1994 Mol Micro 14 381-389 569-2503

cry3Bal crylUB X17123 Sick et al 1990 NAR 18 1305-1305 25->1977

cry3Ba2 crylUB A07234 Peferocn et al 1990 EP 0382990 342-2297

ciy3Bbl eryHIBb M89794 Donovan et al 1992 AEM58 3921-3927 202-2157

cry3Bb2 cryHICb U31633 Donovan et al 1995 USP 5378625 144-2099

ciy3Ca 1 crylllD X59797 Lambert et al 1992 Gene 110 131-132 232-2178

cry4Aal crylVA Y00423 Ward & Ellar 1987 NAR 15 7195-7195 1-3540

cry4Aa2 eryiVA D00248 Senetal 1988 BC 52 873-878 393-3935

cry4Bal CFvIVB X07423 Chungjatpomchai et al 1988 JB 173 9-16 157-3564

cry4Ba2. crylVB X07082 Tungpradubkul et al 1988 AR 16 1637-1638 151-3558

cry4Ba3 crvIVB M20242 Yamamoto ct al 1988 Gene 66 107-120 526-3933

cry4Ba4 crylVB D00247 Sen et al 1988 ABC 52 873-878 461-3868

cry5Aal cryVAa L07025 Sick et al 1994 USP5281530 1->4155

cry5Abl cryVAb L07026 Narva et al 1991 EP 0462721 l->3867

crySBal PS86Q3 U19725 Payne & Michaels 1995 USP 5427786 l->3735

cry6Aal cry VIA L07022 Narva et al 1993 USP 5236843 1->1425

cry6Bal cryVIB L07024 Narva et al 1991 EP 0462721 1->1185

ciy7Aal cayltiC M64478 Lambert et al 1992 AEM 58 2536-2542 184-3597

cry7AbI cryHICb U04367 Payne & Fu 1994 USP 5286486 1->3414

cry7Ab2 crvIIICc U04368 Payne & Fu 1994 USP 5286486 1->3414

cty8Aal crylllE U04364 Foncerrada et al 1992 EP 0498537 1->3471

ay8Bal crylllG U04365 Michaels et al 1993 WO 93/15206 l->3507

cry8Cal aylllF U04366 Ogiwara et al. 1995 Curr Micro 30 227-235 1-3447

ciy9Aal caylG X58120 Smulevitch et al 1991 FEBS 293 25-28 522-3989

cry9Aa2 crylG X58534 Gleave et al 1992 JGM 138 55-62 385-3837

ciy9Bal aylX X75019 Shevelev et al 1993 FEBS 336 79-82 26-3488

cry9Cal crylH Z37527 Lambert et al 1994 WO 94/05771 20965569

cry9Dal N141 D85560 Asano 1996 unpublished 47-3553

ciylOAal crylVC MI2662 Thome et al 1986 JBact 166 801-811 941-2965

cryllAal crvIVD M31737 Donovan ct a! 1988 J Bact 170 4732-4738 41-1969

сгу11Аа2 crylVD M22860 Adams et al 1989 JBact 171 521-530

cryl2Aal cryVB L07027 Narv a et al 1991 EP 0462721 1->3771

cryl3Aal cryVC L07023 Schnepf et al 1992 WO 92/19739 1-2409

cryl4Aal cryVD U13955 Payne & Narva 1994 WO 94/16079 1-3558

cryl5Aal 34кДа M76442 Brown & Whitcley 1992 J Bact 174 549-557 1036-

2055

cryl6Aal cbm71 X94146 Barloy et al 1996 JBact 178 3099-3105 158-1996

ciylTAal cbm72 Delecluse 1996 unpublished

cryl8Aal ciyBPl X99049 Zhang et al 1996 unpublished 743-2860

cryl9Aal Jeg65 У07603 Delecluse 1996 unpublished

cytlAal cytA X03182 Waalwijk et al 1985 NAR 13 8207-8217 140-886

cytlAa2 cytA X04338 Ward & Ellar 1986 JMB191 1-11 509-1255

cytlAa3 cytA Y00135 Earp & Ellar 1987 NAR 15 3619-3619 36-782

cytl Aa4 cytA M35968 Galjart et al 1987 Curr Micro 16 171-177 67-816

cytlAbl cytM X98793 Delecluse 1996 unpublished

. cytlBal U37196 Narva et al 1996 USP 5436002 1-795

cyt2Aal cytB Z14147 Koni& Ellar 1993 JMB 229 319-327 270-1046

cyt2Bal "cytB" U52043 Guerchicoff 1996 unpublished 287-655

cryC35 X92691 Juarez-Perez et al 1995 unpublished 1-981

ciyC53 X98616 Juarez-Perez et al 1996 unpublished 1-1005

ip3A(a) L48811 Estruch et al 1996 PNAS 93 5389-5394 739-3105

ip3A(b) L48812 Estruch et al 1996 PNAS 93 5389-5394 118-2484

Приведенный список отражает соответствие названий опубликованных последовательностей к началу1997 года. С этого времени было дополнительно клонировано несколько генов квалифицированных как новые таксономические единицы. Классификация Cry белков на апрель 1999 года приведен на рисунке 1.

Современная модель третичной структуры эндотоксинов предложена на основании данных рентгеноструктурного анализа двух Cry- белков: СгуЗА и CrylAa (Li, 1991, Grochulski, 1995). В обоих случаях анализу подвергалась кристаллическая структура активированного токсичного фрагмента, в результате чего было показано (Grochulski, 1995), что обе исследованные структуры обладают значительным сходством, несмотря на разные типы предшественников активных молекул. Протоксин СгуЗА имеет молекулярную массу 70кДа и не содержит С- концевой «половины», в то время как протоксин CrylAa является 130кДа белком. Сходство данных рентгеноструктурного анализа для активных токсинов СгуЗА

Рисунок 1. Дендрограмма максимального? сходства первичной структуры Cry белков, клонированных к апрелю 1999г. (D. Zeigler, личное сообщение) Цифры указывают первичный, вторичный и третичный таксономический ранг" группы.

-i

- CrylAa

- CrylAg

- Cry 1 Ad

- CrylAb

- CrylAe

- CryJAf

- Cry I Ac

- Cry! Fa

- CrylFb

- CrylGa

- CrylGb

- CrylDa

- CrylDb

- Cry] Ha

- CrylHb

- CrylEa

- CrylEb

- Cryija

- Cryljb

- Cryljc

- CryICa

- CrylCb

- Cry 18b

- CrylBc

- CrylBd

- CrylBa -CiylBe\

- CrylKa -Cryllc

- Ciyllb

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Левитин, Евгений Ильич

Выводы

1. Получены два сегреганта штамма Bacillus thuringiensis ssp. finitimus, отличающиеся локализацией кристаллов дельта

• эндотоксинов (преимущественно внутри или вне экзоспориальных оболочек). Показана наследуемость признака расположения кристаллов эндотоксина.

2. Установлено, что кристаллы обоих типов имеют качественно одинаковый белковый состав. Обнаружено по крайней мере три новых эндотоксина, отличающихся от ранее известных. Выявлено различие в количественном содержании одного из дельта-эндотоксинов в кристаллах с разной локализацией.

3. Из геномного банка Bacillus thuringiensis ssp. finitimus 1166 ВКПМ, клонирован фрагмент 6930 bp, содержащий открытую рамку считывания, кодирующую полипептидную' цепь размером 1163 аминокислотных остатков и соответствующую дельта-эндотоксину (номенклатурное название Cry26Aal), значительно отличающемуся от известных в настоящее время и вследствие этого, выделенного в отдельную группу. Белок Cry26Aal идентифицирован как один из токсинов исследуемого штамма (Fin2), обнаруженный в равных количествах в свободных и сцепленных кристаллах.

4. Показана уникальность геномного окружения локуса, содержащего ген cry26Aal. Это позволяет предположить, что синтез дельта-эндотоксина Сгу26Аа1 в клетках обоих типов сегрегантов осуществляется под контролем одного геномного локуса с промотора неизвестного типа.

Заключение.

Кристаллические тела включения Bacillus thuringiensis, состоящие из белковых дельта-эндотоксинов, являются одним из примеров крупных организованных белковых структур. Вместе с тем, механизм, обуславливающий строгую пространственную организацию кристаллических тел включения дельта-эндотоксинов остается неясным. Можно надеяться, что данная работа внесет некоторый вклад в изучение механизма фолдинга и укладки белков в макромолекулярные комплексы. Кроме того, исследование новых групп токсинов Bacillus thuringiensis подвида finitimus представляет интерес с точки зрения поиска новых белковых инсектицидов.

Более ранние исследования специфичности пространственной закладки кристаллов в клетках штаммов Bacillus thuringiensis ssp. finitimus постулировали соответствие природы дельта-энодотоксина и локализации сформированных им кристаллических тел включения. В представляемой работе впервые показана возможность образования двух типов белковых кристаллов (свободных и сцепленных), обладающих качественно одинаковым составом. При этом, по крайней мере один из эндотоксинов синтезируется под контролем одного и того же геномного локуса, то есть под воздействием одних и тех же цис-действующих элементов. Это говорит о том, что сам по себе белок или ген, под контролем которого он синтезируется, не определяет тип пространственного расположения кристалла, который он формирует, и предполагает существование иных механизмов пространственной детерминации закладки кристаллов.

БЛАГОДАРНОСТИ

I \

Автрр хотел 1 бы выразить благодарность Л.П.Ревинои, И.А.Залуиину, Я.А.Войцеховскай за помощь в работе, Д.Цайглеру за помощь в анализе последовательности клонированого гена и А.Б.Шевелеву и другим сотрудникам Лаборатории Химии Белка ГосНИИгенетика за ценные советы при обсуждении.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Левитин, Евгений Ильич, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.Ревина Л.П., Залунин И.А., Кригер И.В., Тулина Н.М., Войцеховская Я.А., Левитин Е.И., Честухина Г.Г. Два типа энтомоцидных кристаллов Bacillus thuringiensis ssp finitimus имеют одинаковый набор уникальных эндотоксинов. Биохимия, 1999

. (в печати).

2.Север И.С., ДубейковаЗ.А. ТрофименкоА.Ф.Асланян Е.М.Хачатурян С.В.,Добрица А.П. Экспрессия гена дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis var.berliner 1715 в клетках Escherichia coli и Bacillus megaterium.Мол. Ген. Микроб, и Вирусол. 1990;(6):24-8

3.Adams L.F., Visick J.E. and Whiteley H.R. A 20-kilodalton protein is required for efficient production of the Bacillus thuringiensis subsp. israelensis 27-kilodalton crystal protein in Escherichia coli. J Bacterid, 1989, 171: 521.

4.Agaisse H and Lereclus D,-SD: a Shine-Dalgarno sequence in the 5' untranslated region is a determinant of mRNA stability. 1996 Mol Microbiol. 20(3):633-43.

5.Agaisse, H., Lerecluse, D. How does Bacillus thuringiensis produce so much insecticidal crystal protein.(1995) ,J. Bacterid., 177, 6Q27-6032

6. al-Yahi/aee SA, et al. Cell targeting of a pore-forming toxin, CytA clelta-endotoxin from Bacillus thuringiensis subspecies israelensis, by conjugating CytA with anti-Thy 1 monoclonal antibodies and insulin. Bioconjug Chem. 1996 Jul-Aug;7(4) : 45160.

7.Aronspn A.J. The two faces of Bacillus thuringiensis: insecticidal proteins and post-exponential survival. Mol. Microbiol., 1993, 7(4):489-496.

B.Aronson, A.I. and Fitz-James, P., Structure and morphology of bacterial spore coat. (1976) Bacterid. Rev. 40, 360-402.

9.Banerjee-Bhatnagar N. Modulation of cry IV A toxin protein expression by glucose in. bacillus thuringiensis israelensis. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Nov 18;252(2):402-6.

10.Bar E, et al. Expression of chromosomally inserted bacillus thuringiensis israelensis toxin genes in Bacillus sphaericus. J Invertebr Pathol. 1998 Nov;72(3):206-13.

11.Barloy F, Delecluse A, Nicolas L, Lecadet MM. Cloning and expression of the first anaerobic toxin gene from Clostridium bifermentans subsp. malaysia, encoding a new mosquitocidal protein with homologies to Bacillus thuringiensis delta- endotoxins. J Bacteriol. 1996 Jun;178(11):3099-105.

12.Barloy F, Lecadèt MM, Delecluse Distribution of clostridial cry-like genes among Bacillus thuringiensis andClostridium strains.A Curr Microbiol 1998 Apr;36{4):232-7

13.Baum JA, and Malvar,T., Regulation of insecticidal crystal protein production in Bacillus thuringiensis. Mol Microbiol. 1995 Oct; 18(1):1-12. ■

14. . I

15.Baum , J.A. and Gawron-Burke C. Genetic manipulation of

Bacill

js thuringiensis insecticidal crystal proteins in

bacteria. Genetic Engeneering., 1991, 13: 237-263

16.Bernnard K.E Jarett M. Meadows J Butt, Ellis J, RobertsS, Pauli P, Rogers and Burges Natural isolates of Bacillus thuringiensis world wide isolation distribution and activity against inserct pest. 1997 J. Inver. Pathology 70;59-68.

17.Bietlot HP, Carey PR, Pozsgay M, Kaplan H Isolation of carboxyl-terminal peptides from proteins by diagonal electrophoresis: application to the entomocidal toxin from Bacillus thuringiensis. Anal Biochem 1989 Sep;181(2):212-5

18.Bosch, H.J., Schipper, H., van der Klei, H., de Maagd, R.A., and Stieckema, W.J. Recombinant Bacillus thuringiensis crystal proteins with new properties: possibilities for resistance

• management.(1994) Biotechnol. 12,

.19.Bravo A, Sarabia S, Lopez L, Ontiveros H, Abarca C, Ortiz A, Ortiz M, Lina L, Villalobos FJ, Pena G,Nunez-Valdez ME, Soberon M, Quintero R Characterization of cry genes in a Mexican Bacillus thuringiensis strain collection. Appl Environ Microbiol 1998 Dec;64(12):4965-72

20.Bravo A. Phylogenetic Relationship of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. 1997, J. Bacteriol. 179: 2793-2801

21.Brown KL, Whiteley HR. Isolation of the second Bacillus thuringiensis RNA polymerase that transcribes from a crystal protein gene promoter. J Bacterid 1990 Dec;172(12):6682-8

22.Brown KL, Whiteley HR Isolation of a Bacillus thuringiensis RNA polymerase capable of transcribing crystal protein genes. Proc Natl Acad Sci USA 1988 Jun;85{12):4166-70

23.Carlson CR, Johansen, M.M Lecadet and A.B Colsto.The chromosome map of Bacillus thuringiensis subsp. canadensis HD224 is highly similar to that of the Bacillus cereus type strain ATCC 14579. FEMS Microbiol Lett. 1996 Aug 1;141(2-3):163-7.

24.Carroll J, Wolfersberger MG, Ellar DJ. The Bacillus thuringiensis CrylAc toxin-induced permeability change in Manduca sexta midgut brush border membrane vesicles proceeds by more than one mechanism. J Cell Sci. 1997a Dec;110 ( Pt 24)-.3099-104.

25.Carroll J, Convents D, Van Damme J, Boets A, Van Rie J, Ellar DJ Intramolecular proteolytic cleavage of Bacillus thuringiensis Cry3A delta-endotoxin may facilitate its coleopteran toxicity. J Invertebr Pathol 1997b Jul;70(1):41-9

26.Cheng P, Wu L, Ziniu Y, Aronson A Subspecies-dependent regulation of bacillus thuringiensis protoxin genes .Appl Environ Microbiol 1999 65(5):1849-53

27.Chestukhina, G.G., Kostina, L.I., Zalunin, I.A., Revina, L.P., Mikhailova, A.L. and Stepanov, V.M. Production of multiple delta-endotoxins by Bacillus thuringiensis: delta-endotoxins produced by strains of the subspecies galleriae and wuhanensis. Can .J. Microbiol., 1994, 40, 1026-1034

28.Chestukhina, G.G., Kostina, L.I., Mikhailova, A.L., Tyurin, S.A., Klepikova, F.S., and Stepanov, V.M. (1982) Arch. Microbiol., 132, 159-162

29.Crickmore N, Zeigler DR, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Dean DH Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal

30.crystal proteins.Microbiol Mol Biol Rev 1998 Sep;62(3):807-13

31.Cooper MA, et al. Bacillus thuringiensis CrylAc toxin interaction with Manduca sexta aminopeptidase N in a model membrane environment. Biochem J. 1998 Aug 1;333 ( Pt 3):677-83.

32.De Rocher EJ, et al. Direct evidence for rapid degradation of Bacillus thuringiensis toxin mRNA as a cause of poor expression in plants. Plant Physiol. 1998 Aug;117(4):1445-61.

33.Debro L.-J., Fitz-James P.C., Aronson A. The different parasporal inclusions are produced by Bacillus thuringiensis ssp finitimus. J. of Bacteriol., 1986, 165: 258-268.

34.Delecluse A, et al. Cloning and expression of a novel toxin gene from Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan encoding a highly mosquitocidal protein. Appl Environ Microbiol. 1995

. Dec;61(12):4230-5.

35.Delecluse, A., Charles, J.-F., Klier, A. and Rapoport, G. Deletion by in vivo recombination shows that the 28-kilodalton cytolyticpolypeptide from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis is not essential for mosquitocidal activity.(1991) J. Bacteriol., 173, 3374-3381

36.Delecluse A., Bourgouin C., Klier A. and Rapoport G.

. Nucleotide sequence and characterization of a new insertion

element, IS240, from Bacillus thuringiensis israelensis. Plasirdd, 198$, 170: 71-78.

37.Delecluse A., Bourgouin C., Menou G., Lereclus D., Klier A. and Rapoport G. IS240 associated with the crylVA gene from Bacillus thuringiensis israelensis belongs to a family of Gram(+) and Gram(-) IS elements. Genetics and Biotechnology .of Bacilli, 1990, vol j 3: ' 181-190'.

38.Denolc P, et al.j Cloning and characterization of Manduca sexta and Plutella xylostella midgut aminopeptidase N enzymes related to Bacillus thuringiensis toxin-binding proteins. Eur J Biochem. 1997 Sep 15;248 (3):748-61.

39.Derbyshire K.M. and Grindley N.D.F. Binding of the IS903 transposase to its inverted repeat in vitro. EMBO J, 1992, 11: 3449-3455.

40.Derbyshire K.M., Hwang L. and Grindley N.D.F. Genetic analysis of the interaction of the insertion sequence IS903 transposase with its terminal inverted repeate. Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84: 8049-8053.

41.de Souza MT, Lecadet MM, Lereclus D Full expression of the • crylllA toxin gene of Bacillus thuringiensis requires a distant upstream DNA sequence affecting transcription J Bacterid 1993;175{10):2952-60 42..

43.Dodd I.B. and Egan J.B. Systematic method for the detection of potential 1 Cro-like DNA-binding regions in proteins. J Mol Biol, 1987, 194: 557-564.

44.Donovan WP, Gonzalez JM Jr, Gilbert MP, Dankocsik C 45.Isolation and characterization of EG2158, a new strain of Bacillus thuringiensis toxic to coleopteran larvae, and

nucleotide sequence of the toxin gene. Mol Gen Genet. 1988 Nov;214(3):365-72.

46.Donovan WP, Dankocsik C, Gilbert MP.,Molecular characterization of a gene encoding a 72-kilodalton mosquito-toxic crystal protein from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. J Bacterid. 1988 (b) Oct; 170 (10) : 4732-8 .

!

47.Estruch JJ, Vip3A; a novel Bacillus thuringiensis vegetative

1

insecticidal protein with a wide spectrum of activities against lepidopteran insects. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 May 28;93(11):5389-94.

48.Ge AZ, Rivers D, Milne R, Dean D Functional domains of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins. Refinement . of Heliothis virescens and Trichoplusia ni specificity domains on CrylA(c). Biol Chem 1991 Sep 25;266(27):17954-8

49.Glatron M.F., Rapoport G. Biosynthesis of the parasporal inclusions of Bacillus thuringiensis: half-life of its corresponding mRNA. Biochmie, 1972, 54: 1291-1301.

50.Gonzalez J.M. and Carlton B.C. A large transmissible plasmid is required for crystal toxin production in Bacillus

• thuringiensis var. israelensis. Plasmid, 1984, 11: 28-38.

51.Gonzalez Jr., J.M., DuImage H.T. and Carlton B.C. Correlation between specific plasmids and d-endotoxin production in Bacillus thuringiensis. Plasmid, 1981, 5: 351-365.

52.Grochulski P.I, Maason S., Borisova, M., Pusztai-Carey.J., L., Schwartz, R., Brousseau and M.Cygler.Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation. J Mol Biol. 1995 Dec 1;254(3):447-64.

53.Haldenwang W.G., The sigma factors of Bacillus thuringiensis.1995. Micob.Rev.59,1: 1-30 "I

54.Hallet B., Rezsohazy R. and Delcour J. IS231A from Bacillus thuringiensis is functional in Escherichia coli: transposition and insertion specifity. J Bacteriol, 1991, 173: 4526-4529.

55.Haniford D.B., Chelouche A.R. and Kleckner N. A specific class of IS10 transposase mutants are blocked for target site interactions and promote formation of an excised transposon fragments. Cell, 1989, 59: 385-394.

56.Heffron F. 1983 Identification of a transposon Tn3 sequence required for transposition immunity. In Shapiro, J.A. (ed) , Mobile Genetic Elements. Academic Press, New York, pp. 223-260.

57.Hierson, A.I, Sieden A., Kivaisi and H.G.Boman. Bacteriohage resistant mutants of Bacillus thuringiensis with, decreased virulense in nupae of Hyalophora cecropia.J. Bacteriologyl67:18-24

58.Hodgman J., Zinin Y., Shen J. and Ellar D.J. Identification of a cryptic gene associated with an insertion sequence not previously identified in Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol. Lett., 1993, 114: 23-30.

59.Hofte H. and Whiteley H.R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiol Rev, 1989, 53: 242-255.

60.Ibarra, J.E., Federici, B.A. Isolation of a relatively

nontoxic 65-kilodalton protein inclusion from the parasporal

body of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. (1986) J. Bacteriol., 165, 527-533

61.Juarez-Perez V.M., Ferrandis M.D. and Frutos R. PCR-based approach for detection of novel Bacillus thuringiensis cry genes. Appl. Environ. Microbiol. (1997) 63 (8), 2997-3002

62.Keim P, Kalif A, Schupp J, Hill K, Travis SE, Richmond K, Adair DM, Hugh-Jones M, Kuske CR, Jackson P Molecular evolution and diversity in Bacillus anthracis as detected by amplified fragment length j polymorphism markers Bacteriol 1997 Feb;17 9(3):818-24 1

63.Kasmap LM, et al. Phage display of a biologically active Bacillus thuringiensis toxin. Appl Environ Microbiol. 1998 Aug;64(8):2995-3003.

64.KlecKner N. Transposon TnlO. In Shapiro, J.A. (Ed.), Mobile Genetic Elements. Academic Press, New York, 1983, pp. 261-298.

i

65.Kostichka, K., Warren G.W., Mullins M., Mullins A.D., Craig J.A, Kotziel MG and Esturchl996 Cloning of cry-V type gene from Bacillus thuringiensis: hte cry-V encoded protein is expressed early in stationary phase J Bacteriology.178:2141-2144.

66.Kronstad J.W., Schnepf H.E. and Whiteley H.R. Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes. J. of Bacteriol., 1983, 154(1): 419-428.

67.Kumar NS, et al. Endogenous protease-activated 66-kDa toxin from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki active against Spodoptera littoralis. FEMS Microbiol Lett. 1998 Feb 1;15 9(1):113-20.

68. Kumar NS, et al. Analysis of 66 kDa toxin from Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki reveals differential amino terminal processing of protoxin by endogenous protease(s).

- Biochem Mol Biol Int. 1998 Jul;45(4):769-74.

69.Lee MK, et al. Aminopeptidase N purified from gypsy moth brush border membrane vesicles is a specific receptor for Bacillus thuringiensis CrylAc toxin. Appl Environ Microbiol. 1996 Aug;62(8):2845-9.

70.Lee MK, et al. Inconsistencies in determining Bacillus thuringiensis toxin binding sites relationship by comparing competition assays with ligand blotting. Biochem Biophys Res Commun. 1996 Mar 27;220(3):575-80.

71.Lee MK, et al. Involvement of two amino acid residues in the loop region of Bacillus thuringiensis CrylAb toxin in toxicity and binding to Lymantria dispar. Biochem Biophys Res Commun. 1996 Dec 4;229{1):139-46.

; \

72.Lee, C.S., Aronson, A.J. Cloning and analysis of delta-endotoxin genes from Bacillus thuringiensissubsp. alesti. (1991) J. Bacterid., 173, 6635-6638.

73.Lereclus D., Bourgouin C., Lecadet M.-M., Klier A. and Rapoport G. Role structure and molecular organization of the genes coding for parasporal delta-endotoxin in Bacillus

. thuringiensis. In Regulation of Procaryotic Development, I. Smith, R.A. Slepecky, and P. Setlow, eds. 1989.

74.Lereclus D., Delecluse A. and Lecadet M.-M. Diversity of Bacillus thuringiensis toxins and genes. Microbiol. Rev. 1997,3: 2561-2567.

75. .

76.LerecXus D., Mahillon J., Menou G. and Lecadet M.-M. Identification of Tn4430, a transposon of Bacillus thuringiensis functional in E.coli. Mol. Gen. Genet., 1986, 204: 52-57.

77.Lereclus D., Ribier J., Klier A., Menou G. and Lecadet M.-M. A transposone-like structure related to the d-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis. EMBO J., 1984, 3: 2561-2567. [

78.Levinson BL, Kasyan KJ, Chiu SS, Currier TC, Gonzalez JM Jr Identification of beta-exotoxin production, plasmids encoding beta-exotoxin, and a new exotoxin in Bacillus thuringiensis by using high-performance liquid chromatography. J Bacteriol 1990 Jun;172(6):3172-9

79.E.I.Levitin, A.B. Shevelev S.I. Novikova, Ya.A. Wojciechowskaja, E.A.Usacheva. A new universal PCR-based approach for a fast search of Bacillus thuringiensis strains for new delta-endotoxin genes and cloning of crylGal gene from Bacillus thuringiensis ssp. galleriae. International Symp. Molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses.1997,Helsinki,Finland

80.Li J., Carroll J. and Ellar J.D. Crystall structure of insecticidal 8-endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution. Nature, 1991, 353.

81.Lorence A, Darszon A, Bravo A Aminopeptidase dependent pore formation of Bacillus thuringiensis CrylAc toxin on Trichoplusia ni membranes. FEBS Lett. 1997 Sep 8;414(2):303-7.

82.Lovgren A, Carlson CR, Eskils K, Kolsto. AB. Localization of putative virulence genes on a physical map of the bacillus thuringiensis subsp. gelechiae chromosome. Curr Microbiol. 1998 Oct;37(4):245-50.

83.Mahillon J, Rezohazu R, Hallet B. and Delcour J. IS231 and other Bacillus thuringiensis transposable elements: a review. Genetica. 1994;93(1-3):13-26.

84.Mahillon J., Lereclus D. Structural and functional analysis of Tn4430 identification of an integrase-like protein involved into co-integrate-resolution process. EMBO J., 1988, 7: 15151526.

85.Mahillon J., Seurinck J., Delcour J. and Zabeau M. Cloning and nucleotide sequence of different iso-IS231 elements and their structural assotiation with the Tn4430 transposon in Bacillus thuringierjsis. Gene, 1987, 51: 187-196.

8 6.Mahil Zabeau

i

Ion J., Seurinck J., Van Rompuy L., Delcour J. and M. Nucleotide sequence and structural organisation of an

insertion sequence element (IS231) from Bacillus thuringiensis strain berliner 1715. EMBO J, 1985, 4: 3895-3899.

87.Makris J.C., Nordmann P.L. and Reznikoff W.S. Mutational analysis of insertional sequence 50 (IS50) and transposon 5 (Tn5) ends. Proc Natl Acad Sei USA, 1988, 85: 2224-2228.

88.Marzari R, et al. Phage display of Bacillus thuringiensis CrylA(a) insecticidal toxin. FEBS Lett. 1997 Jul 7;411(1):27-31.

89.Malvar Tand Baum J.A. Tn5401 disruption of the spoOF gene, identified by direct chromosomal sequencing, results in

' CrylllA overproduction in Bacillus thuringiensis.

90.J Bacteriol. 1994 Aug;176(15):4750-3.

91.Meadows M.P., Bacillus thuringiensis in the environmental ecology and risk assessment.1993, In Entwistle P.F., Cory M.G., Bailey M.G., and Higgs Bacillus thuringiensis an environmental biopesticide:theory and practice.Wiley.NY.

92.Menou G., Mahillon J., Lecadet M.-M. and Lereclus D. - Structural and genetic organization of IS232, a new insertion

sequence of Bacillus thuringiensis. J Bacteriol, 1990, Vol 172, 12: 6689-6696.

93.Mollet B., Iida S. and Arber W. An active variant of procaryotic transposable element IS903 carries an amber stop codon in the middle of an open reaing frame. Mol. Gen. Genet., 1985, 199: 534-536.

.i

94.Mollet B., Iida, S. Shepherd J. and Arber W. Nucleotide sequence of IS26, a new procaryotic transposable element. Nucl. Acids Res., 1983, 11: 6319-6330.

95.Nicholls CN, Ahmad W, Ellar DJ Evidence for two different types of insecticidal P2 toxins with dualspecificity in Bacillus thuringiensis subspecies. J Bacteripl ^1989 Sep;171 (9):5141-7

96.0jcius DM, Young JDCytolytic pore-forming proteins and peptides: is there a common structural motif? Trends Biochem Sci 1991 Jun;16(6):225-9

97.Parker MW, Pattus F Rendering a membrane protein soluble in water: a common packing motif in bacterial protein toxins. Trends Biochem Sci 1993 Oct;18(10):391-5

98.Perani M, Bishop AH, Vaid A. Prevalence of beta-exotoxin, diarrhoeal toxin and specific delta-endotoxin in natural isolates of Bacillus thuringiensis. FEMS Microbiol Lett. 1998 Mar 1;160(1):55-60.

99.Poncet S, Bernard C, Dervyn E, Cayley J, Klier A, Rapoport G Improvement of Bacillus sphaericus toxicity against dipteran larvae by integration, via homologous recombination, of the CryllA toxin gene from Bacillus thuringiensis subsp.

-israelensis. Appl Environ Microbiol. 1997 Nov;63(11):4413-20.

100.Poncet S, Dervyn E, Klier A, Rapoport G. SpoOA represses transcription of the cry toxin genes in Bacillus Microbiology.1997,143: 1843-2751.

101.Potvin L, Laprade R, Schwartz JL CrylAc, a bacillus thuringiensis toxin, triggers extracellular Ca2+ influx and Ca2+ release from intracellular stores in Cfl cells. J Exp Biol. 1998 May 21;^01 (Pt 12}:1851-8.

102. Preflontaine G. ujse of Oligonucleotide Probes to Study the Relatepness of Delta-Endotoxin Genes Among Bacillus thurir.giensis Subspecies and Strains. Appl. and Enviromental Microbiol., 1987 53(12): 2808-2814.

103.Restrepo N, et al. Cloning, expression and toxicity of a mosqujrtocidal toxin gene of Bacillus thuringiensis subsp. medellin. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1997 Mar-Apr;92(2):257-62.

104.Rezsohazy R., Hallet B. and Delcour J. IS231D, E and F, three new insertion sequences in Bacillus thuringiensis: extention of IS231 family. Mol Microbiol, 1992, 6: 1959-1967.

105.Rezsohazy R., Hallet B., Delcour J. and Mahillon J. The IS4 family of insertion sequences: evidence for a conserved transposase motif. Mol Microbiol, 1993a, 9(6): 1283-1295.

106.Rezsohazy R., Hallet B., Mahillon J. and Delcour J. IS231V and W from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis, two distant members of the IS231 family of insertion sequences. Plasmid, 1993b, 30: 141-149.

107.Salamitou S, Agaisse H, Bravo A, Lereclus D. Genetic analysis of crylllA gene expression in Bacillus thuringiensis Microbiology 1996Aug;142 ( Pt 8}:2049-55.

■ i

108.Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning; 2nd edn., Cold Spring Harbor Laboratory Press,- Cold Spring Harbor, NY

109.Sanchis V., Lereclus D., Menou 6., Chaufaux J., Guo, S. and Lecadet M.-M. Nucleotide sequence and analysis of the N.' terminal coding region of the Spodoptera-active d-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis ssp. aizawai 7.29. Mol. Microbiol., 1989, 3(2): 229-238.

llO.Sanchis V, Lereclus D, Menou G, Chaufaux J, Lecadet MM Multiplicity of delta-endotoxin genes with different insecticidal

111. specif icities in Bacillus thuringiensis aizawai 7.2'9. Mol . Microbiol 1988 May;2(3):393-404 \

112.Schimmel, G., Elektronmikroskopische Methodik., Heidelberg, 1969.

113.Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J.,- Feitelson, J., Zeigler, D. and Dean, D. Bacillus thuringiensis and its pesticidal protein. 1998, Microbiol.Mol.Biol.Rev., 62, 775-806.

114.Schnepf H.E., Wong H.C. and Whiteley H.R. Expression of a

. cloned Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherechia coli. J. of Bacterid..', 1987, 169: 4110-4118.

115.Shevelev A.B., Lewitin E., Novikova S.I., Wojciechowska Ya.A., Usacheva E.A., Chestukhina G.G., and Stepanov V.M. A new universal PCR-based approach for fast search of Bacillus thuringiensis strains for cryl, cry4 and' cry9 genes. MMBI,1998,Vol.45.No.6.

116.Shevelev A.B., Kogan Ya.N., Bushueva A.M., Voronina E.J., Rebrikov D.V,, Novikova S.I., Chestukhina G.G., arid Kuvshinov V., Pehu E.,Stepanov V.M. A novel delta-endotozin gene crylM from Bacillus thuringiensis ssp.wuhanensis (1997), FEBS Lett., 404, 148-152

117.Shevelev A.B., Karasin A.I., Svarinskii M.A., Kadyrov R., Kogan Ya.N., S.I., Chestukhina G.G., V.M. A novel delta-endotozin gene crylM from Bacillus thuringiensis ssp.wuhanensis (1997), FEBS Lett., 404, 148-152

118.Somerville, H.J. (1971) Formation of the parasporal inclusions of Bacillus thuringiensis Eur. J. Biochem., 18, 226-237.

119.Srinivas G, Vennison SJ, Sudha SN, Balasubramanian P, Sekar. Unique regulation of crystal protein production in Bacillus thuringiensis subsp. yunnanensis is mediated by the cry protein-encoding 103-megadalton plasmid V Appl Environ Microbiol 1997 Jul;63(7):2792-7

120.Strizhov N, et al. Mapping of the entomocidal fragment of Spodoptera-specific Bacillus thuringiensis toxin CrylC. Mol Gen Genet. 1996 Nov 27;253(1-2):11-9.

■121.Thomas W.E. and Ellar D.J. Bacillus thuringiensis var. israelensis crystal 8-endotoxin: effects on insects and mammalian cells in vitro and in vivo. J. Cell Sei., 1983, 60: 181-197.

122.Tojo, A., Samasanti, W., Yoshida, N., Aizawa, K. (1986) Agric. Biol. Chem., 50, 575-580.

123.Vieira, J. and Messing, J. New pUC-derived cloning vectors

- with different selectable markers and DNA replication origins. (1991) Gene 100, 189-194.

124.Visser B. A screening for the presence of four different crystal protein gentypes in 25 Bacillus thuringiensis strains. FEMS Microbiol. Lett., 1989, 58: 121-124.

125.Von Tersch MA, Slatin SL, Kulesza CA, English LH Membrane-

■ permeabilizing activities of Bacillus thuringiensiscoleopteran-active toxin CryIIIB2 and CryIIIB2 domain Appl Environ Microbiol 1994 Oct;60(10):3711-7 I peptide.

126.Von Tersch, M., Robbins, H., Jany, C., Jonson, T. nsecticidal toxins from Bacillus thuringiensis subsp. kenyae: gene cloning and characterization and comparison with B. thuringiensis subsp. kurstaki CrylA(c) toxins. (1991) Appl. Environ. Miocrobiol., 57, 349-358. . V

127.Walters FS, Slatin SL, Kulesza CA, English LH Ion channel activity of N-terminal fragments from CrylA(c) delta-endotoxin. Biochem Biophys Res Commun 1993 Oct 29;196(2):921-6

128.Ward E.S. and Ellar D.J. Bacillus thuringiensis var. israelensis d-endotoxin - nucleotide sequence and characterization of the transcripts in Bacillus thuringiensis and Escherechia coli. J. ofMol. Biol., 1986, 191: 1-11.

129.Whiteley H.R. and Schnepf H.E. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis. Ann. Rev. Microbiol., 198 6, 4: 54 9-576.

130.Widner WR, Whiteley HR Two highly related insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki possess different host range specificities. J Bacteriol 1989 Feb;171(2):965-74

131.Wojciechowska J.A., Lewitin E.,.Revina L.P,.Zalunin I.A, Chestukhina G.G. Two novel genes families of delta-endotoxin

cry26 and cry28 from Bacillus thuringiensis ssp. finitimus. FEBS, 1999(in press).

132.Wong HC, et al. Identification of a positive retroregulator that stabilizes mRNAs in bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 May;83(10):3233-7.

133.Yaoi K, et al. Aminopeptidase N from Bombyx rnori as a candidate for the receptor of Bacillus thuringiensis CrylAa toxin. Eur J Biochem. 1997 Jun 15;246 (3):652-7.

134. Yool AJ Block of the inactivating pot assium channel by clofilium and hydroxylamine depends on the sequence of the pore region. Mol Pharmacol 1994 Nov;46(5):970-6

135.Yu CG, Mullins MA, Warren GW, Koziel MG, Estruch JJ The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelium cells of susceptible insects. Appl Environ Microbiol 1997 Feb;63(2):532-6

136..Zhang J, Hodgman TC, Krieger L, Schnetter W, Schairer HU Cloning and analysis of the first cry gene from Bacillus popilliae J Bacteriol 1997 Jul; 179(13):4336-4 1

137.Zheng, L. , Donovan, W.P., Fitz-James, P.C., and Losick, R.

Gene encoding a morphogenic protein required in the assembly of the outer coat of the Bacillus subtilis endospore. (1988) Genes and Development, 2, 1047-1054.