Характеристика белок-белкового взаимодействия с учетом групповой принадлежности крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Шахнович, Елена Александровна

• Шахнович, Елена Александровна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Шахнович, Елена Александровна

Стр. 4

14

14

24 30

38

38

39

39 42

45

46

46 50

52

54

72

5.1. Визуализация антиген-антительного 87 взаимодействия методом проточнойцитофлуориметрии

5.2. Визуализация антиген-антительного 94 взаимодействия методом

конфокальной микроскопии

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 104

ВЫВОДЫ 116

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 119

ч

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика белок-белкового взаимодействия с учетом групповой принадлежности крови»

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.

В настоящее время существует потребность в фундаментальных исследованиях, раскрывающих молекулярные механизмы основных процессов жизнедеятельности, ключевыми из которых являются межмолекулярные взаимодействия. Они представлены на всех уровнях структурной и регуляторной иерархии в организме, определяющей специфику, направленность анаболизма и катаболизма, информационное взаимодействие молекул, клеток, органов и систем, устойчивость и динамичность биохимических и физиологических процессов [55, 69, 168, 89, 103,13, 16, 132, 45, 287, 262, 333, 349, 344, 244].

Благодаря успехам протеомики, внедрению высокотехнологичных методов раскрыты определенные закономерности структурной организации белков, получены достаточные доказательства того, что ключевыми звеньями в реализации функций организма являются белок-белковые взаимодействия, нарушение которых может привести к развитию патологических состояний [156, 12, 60, 6, 94, 118, 138, 46, 326, 247, 367, 214].

В литературе представлены разрозненные, несистематизированные сведения о предрасположенности к определенным соматическим и инфекционным заболеваниям лиц с различной АВО-групповой принадлежностью крови [26, 7, 143, 29, 35, 104, 23, 51, 68, 28, 246, 215, 315]. Молекулярная сущность этих явлений недостаточно аргументирована, в связи с этим создание теоретической базы данных о функциональной специфике антигенов системы ABO будет основой для выяснения причин индивидуальной реакции на экзогенные и эндогенные факторы обладателей различных групп крови, что имеет важное значение для развития превентивной медицины.

Немногочисленны сведения о структурной организации и функциях антигенов ABO системы. Известно, что детерминантной группой антигенов являются N-ацетилгалактозамин у антигена А и галактоза у антигена В [364. 360, 204, 348, 302]. Генный локус системы Н, предшественника антигенов

ABO, расположен на 19 хромосоме в позиции 19ql3.3 и кодирует синтез каталитического белка а1,2-фукозилтрансферазы, переносящей остатки фу козы на терминальную галактозу [101, 319, 224, 315, 289]. Гены белков, отвечающих за образование ABO системы антигенов, располагаются на 9 хромосоме в позиции 9q34.1 - 9q34.2 [126, 157, 20, 352, 221]. Кодируемые ими белки обладают гликозилтрансферазной активностью, обеспечивая доставку УДФ-N-ацетилгалактозамина, формируя гликопротеин А, или галактозы к терминальной фукозе, формируя гликопротеин В [74, 38, 364, 179, 203, 225, 186, 278, 200, 274]. Тем самым формируются фенотипы А и В [246]. Отсутствуют данные о поведении антигенов ABO системы как биомолекул, интеграция этих структур в каскад метаболических и физиологических процессов в организме.

Настоящее исследование выполнено в рамках Федеральной программы:

«Взаимодействие биологически активных веществ растительного и животного происхождения с системами жизнеобеспечения организма с учетом биологической вариабельности метаболизма, ассоциированной с групповой принадлежностью крови» (номер гос. регистрации 0120.0809698).

Цель исследования: выяснить молекулярную основу белок-белкового взаимодействия на модели гликопротеинов А и В и их лигандов, особенности ответа системы на воздействие биологически активных веществ.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать показатели белкового обмена практически здоровых лиц O(I) - AB(IV) групп крови, выявить ассоциированность направленности метаболизма с определенной группой крови.

2. Исследовать группоспецифические особенности поведения белков сыворотки крови в электрическом поле, используя капиллярный электрофорез, оценить влияние силистронга на физико-химические характеристики белков.

3. Изучить действие силистронга на антиген-антительную модельную систему в условиях in vitro, используя в качестве объектов гликопротеи-

ны А и В и моноклональные антитела, охарактеризовать скорость наступления и степень агглютинации.

4. Оценить эффект силистронга на естественные анти-А и анти-В антитела по характеру межмолекулярного узнавания между модифицированными антителами и стандартными эритроцитами, содержащими антигены ABO системы.

5. Дать качественную и количественную оценку белок-лигандных комплексов с помощью методов конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитофлуориметрии, выявив влияние силистронга на межмолекулярные процессы.

Методология и методы исследования.

Работа включала несколько этапов:

1. Определение показателей белкового обмена у 1300 лиц практически здоровых лиц в возрасте 19,6±1,5 лет, проживающих на территории Самарской области с O(I) -AB(IV) группами крови.

2. Оценка влияния силистронга на физико-химические свойства белков сыворотки крови здоровых лиц со А(И) (п=100) и В(Ш) (п=100) группами крови методом капиллярного электрофореза.

3. Изучение реакции системы антиген-антитело в различных условиях эксперимента, используя в качестве объектов гликопротеины А (п=60) и В(п=60), моноклональные антитела (п—60), естественные антитела (п=60).

4. Визуализация антиген-антительных комплексов методом проточной цитофлуориметрии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (п=200).

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора.

Достоверность результатов работы, обоснованность выводов и рекомендаций базируется на достаточном числе наблюдений и использовании современных методов исследования и статистической

обработки материалов с помощью пакета компьютерных программ SPSS 12.0, «ANOVA».

Результаты исследований были представлены на Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица (Челябинск, 2009); XIII Международной научной конференции «Здоровье семьи в 21 веке» (Хургада, 2009); научно-практической конференции «Лабораторная медицина в свете концепции развития здравоохранения России до 2020 года» (Москва, 2009); II международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (Новосибирск, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине «Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований» (Омск, 2011); научно-практической конференции «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011);Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые - медицине» (Самара, 2011, 2012); Международной Интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2011, 2012); научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2012); XVI международной научной конференции «Здоровье семьи в XXI веке» (Будапешт, 2012); I Всероссийской конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012); совместном заседании Самарского отделения Всероссийского биохимического общества, кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой и

кафедры общей, бионеорганической и биоорганической химии ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Самара, 2013).

Личное участие автора в получении научных результатов, изложенных в диссертации, состояло в проведении научно-информационного поиска, анализа и обобщения данных литературы по профилю диссертационного исследования, формулировке цели и задач; проведении определения показателей белкового обмена, групповой принадлежности крови у 1300 клинически здоровых лиц, экспериментов in vitro по оценке влияния препарата силистронг на физико-химические свойства белков, серии модельных экспериментов по изучению белок-белкового взаимодействия in vitro, визуализации антиген-антительных комплексов методами проточной цитофлуориметрии, конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Автором лично получены все первичные данные, самостоятельно произведена статистическая обработка материала, сформулированы положения, выносимые на защиту, выводы и выводы и практические рекомендации, написан текст диссертации.

Положения, выносимые на защиту:

1. Направленность белкового обмена, ассоциированная с АВ0-групповой принадлежностью крови. Для носителей антигена А - низкое содержание альбумина при высоком уровне у-глобулинов, Ig G, свидетельствующем о напряжении специфического иммунитета. Для носителей антигена В - высокое содержание альбумина при низком уровне Ig G, Ig М и конечных продуктов азотистого обмена.

2. Для изучения белок-белкового взаимодействия разработана новая модельная система, представленная антигенами А, В и анти-А-, анти-В- антителами. В различных условиях экспериментов in vitro методом молекулярного зондирования препаратом силистронг выявлены характерные особенности гликопротеина А и гликопротеина В.

3. Различия в конформационно-реакционных свойствах гликопротеина А и гликопротеина В, проявившихся в результате действия силистронга. Визуализация комплексов антиген-антитело методами проточной цитофлуори-метрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Научная новизна. Получены новые данные, которые служат основанием для индивидуализации параметров азотистого обмена, спектра белков плазмы крови по групповой принадлежности. Разница выявленных показателей, их ассоциированность с группой крови, позволила дифференцировать протеом, характерный для лиц типа А и В, содержащих соответственно гли-копротеин А А(П) группы крови и В - В(Ш) группы крови на эритроцитар-ной мембране.

Характерно, что в группе обследованных типа А самое низкое содержание альбумина, что свидетельствует о слабом уровне неспецифической защиты. Выявленный низкий уровень Ig А служит показателем незащищенности слизистых, доступности для организма различных бактериальных агентов. Подтверждением множественных контактов организма с патогенами является самое значительное содержание Ig G.

В противоположность этому тип В, т.е. носители В(Ш) группы крови характеризуются самым низким уровнем Ig М, Ig G, что свидетельствует об отсутствии иммунологической памяти о контакте с патогенами. Чистоту эндэк-ологии в группе лиц В типа характеризует низкое содержание С-реактивного белка.

В качестве модели для изучения белок-белкового взаимодействия, оценки динамики этого процесса в интактных условиях и под влиянием биологически активных веществ нами впервые использована антиген-антительная система группы крови ABO, а флаволигнансодержащий препарат силистронг в качестве фактора биозондирования. Установлено, что преимущественной мишенью для силистронга является гликопротеин А. Препарат замедляет узнавание и взаимодействие антигена с антителом, удлиняет время наступле-

ния агглютинации. Для гликопротеина В этот эффект не характерен. Мо-ноклональные анти-А и анти-В антитела модифицируются силистронгом, что увеличивает время белок-белкового взаимодействия с соответствующими антигенами. Установлены группоспецифические отличия реакции системы А(П) группы крови на воздействие силистронга: удлинение времени наступления агглютинации с гликопротеином А(П) группы крови и снижение степени агглютинации естественных анти-В антител, инертность системы В(Ш) группы крови гликопротеина В и анти-А антител.

Получены новые данные, свидетельствующие о том, что белки плазмы крови у лиц 0(1) - АВ(1У) групп крови отличаются по физико-химическим свойствам, о чем свидетельствуют результаты проведения капиллярного электрофореза. Выявлены отличия белкового спектра у обладателей А(И) группы крови: установлено наиболее высокое содержание фракции у-глобулинов, а у лиц с В(Ш) группой крови более низкий уровень а1-, (3- глобулинов, у-глобулинов, что подтверждено нами результатами исследований биохимических показателей. Силистронг также по-разному меняет электро-форетическую подвижность белков плазмы крови лиц 0(1) - АВ(1У) групп крови, выявлено изменение распределения белков плазмы крови по фракциям: перераспределение фракции (3-, у-глобулинов, «слияние» фракций (31- и (32-глобулинов. Установлены группоспецифические особенности влияния силистронга на белки плазмы крови - у людей А типа происходит перераспределение фракции а1- и а2-глобулинов.

Нами впервые использовано два высокотехнологичных метода исследования - проточная цитофлуориметрия и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия для качественной и количественной оценки антиген-антительных комплексов. Наибольшее влияние силистронг оказал на взаимодействие гликопротеина А с моноклональными анти-А антителами, мечеными флуоресцеинизотиоционатом, тогда как количество антиген-антительных комплексов, образованных гликопротеином В и моноклональными анти-В антителами, мечеными флуоресцеинизотиоционатом осталось неизменным.

Блок полученных результатов является новым фактическим материалом, характеризующим особенности белок-белкового взаимодействия у лиц А и В типов, раскрывающим молекулярные механизмы, лежащие в основе способности лиц типа А активно взаимодействовать с ксенобиотиками и патогенами.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в работе, имеют теоретическое и практическое значение. Выявленные группоспецифические особенности состава белков плазмы крови, продуктов катаболизма азотсодержащих соединений, специфика изменений белковых фракций сыворотки под влиянием силистронга, особенности межмолекулярного взаимодействия гликопротеина А, В с анти-В и анти-А антителами, модифицированных силистронгом, что является фактическим материалом для обоснования генетически детерминированной ассоциированности группоспецифических антигенов с характером белкового спектра крови, ме-таболомными признаками, формирующими биологический тип А и В в соответствии с презентированным антигеном А и В.

Результаты о характере белок-белковых взаимодействий антигенов и антител лиц А типа с флаволигнансодержащим препаратом силистронг в различных вариантах модельных экспериментов существенно отличаются от реакции системы, определяющей принадлежность к В типу, что раскрывает молекулярные предпосылки взаимодействия с различными патогенами, эко-токсикантами, приводящими к высокой заболеваемости лиц А(П) группы крови по сравнению с носителями В(Ш) группы крови. Эти данные позволяют проводить скрининг населения по групповой принадлежности, акцентируя внимание на лицах А(П) группы крови, формировать группы повышенного риска для проведения превентивных, персонализированных мер профилактики.

Такой подход предполагает целесообразность составления индивидуального группоспецифического «паспорта здоровья» лиц А и В типа для повы-

шения информативности диагностических процедур на доклинической стадии развития патологии и при мониторинге эффективности лечения.

Разработанная нами модель с визуализируемой качественной и количественной оценкой динамики межбелкового взаимодействия является продуктивным объектом для изучения межмолекулярного взаимодействия, тестирования индивидуального ответа на действие биологически активных веществ, лекарственных препаратов, различных ксенобиотиков - экотоксикантов.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты диссертационного исследования используются в работе клинико-диагностической лаборатории ГБУЗ СО «Самарская городская поликлиника № 3»; в учебном процессе кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; кафедры биологической химии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет имени профессора В.Ф.Войно-Ясенецкого» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Получены патенты:

• Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010611397 от 2010 г.

• «Способ оценки действия биологически активных веществ на антиген-антительное взаимодействие» Патент на изобретение № 2484480 от 10 июня 2013 г.

Конкурсная поддержка исследования.

Данная работа выполнена при поддержке грантов:

• Грант «У.М.Н.И.К.», проект № 8/14261 «Разработка группоспецифи-ческого метаболического, иммунологического паспорта в прогнозировании и диагностике заболеваний»;

• Губернский грант в области науки и техники за II полугодие 2012 г. «Способ визуализации антиген-антительного взаимодействия методом конфокальной микроскопии»;

• Грант РФФИ, проект 13-04-9712 «Модель визуализации белок-белкового взаимодействия».

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антигены ABO системы крови: строение, особенности белкового

и олигосахаридного компонентов

Несомненно, открытие групп крови является одним из крупнейших событий XX века. Сделанное венским врачом Карлом Ландштейнером открытие, обеспечило возможность появления новых отраслей медицины, таких как иммуногематология, трансфузиология, трансплантология [37, 39, 38, 101, 102, 127, 119, 92, 19, 8, 342, 340,364, 360, 221].

К настоящему времени известно более 280 антигенов эритроцитов, имеющих четкую генетическую характеристику, существует 25 антигенных систем групп крови, каждая из которых кодируется определенным хромосомным локусом [47, 101, 157, 126, 20, 38, 363, 210, 221]. Антигены системы ABO относятся к наиболее сильным и в наибольшем количестве экспрессированы на эритроцитах [114, 115, 176, 360, 341, 214, 268].

Антигены группы крови по системе ABO представляют собой близкие по строению олигосахариды, несущие общий структурный элемент — антиген Н. Он обнаруживается на эритроцитах людей с 0(1) группой крови, однако относится к групповой системе Н (ISBT № 018 001) и генетически от системы ABO не зависит. Генный локус системы Н расположен на 19 хромосоме в позиции 19ql3.3. Ген Н кодирует синтез а1,2-фукозилтрансферазы, переносящей остатки фукозы на терминальную галактозу [101, 230, 319, 224, 315, 289].

Групповые антигены системы ABO имеют трехаллельный кодоминантный механизм наследования. Генный локус, определяющий группу крови по системе ABO, располагается на 9 хромосоме в позиции 9q34.1 - 9q34.2 [127, 7, 164, 21, 366, 170, 364, 360, 204, 348, 302]. Генетически

возможны 6 вариантов комбинаций аллельных антигенов: 00, АО, АА, ВО, ВВ, АВ. Гетерозиготные и гомозиготные варианты обладают одинаковыми агглютинирующими свойствами и относятся к одной группе крови. Поэтому фенотипически различают 4 группы крови (таблица 1).

Таблица 1 - Формирование групп крови по системе АВО

Группа крови Антигены на Антитела

эритроцитах в сыворотке

0(1) — Анти-А и Анти-В

А(И) А Анти-В

В(Ш) В Анти-А

АВ(1У) А и В —

Гены А и В кодируют синтез ферментов гликозилтрансфераз: а1,ЗЫ-ацетилгалактозаминтрансфераза (КФ 2.4.1.40) обеспечивает формирование антигена А, доставляя УДФ-Ы-ацетилгалактозамин к терминальной фукозе, а а1,3-галактозилтрансфераза (КФ 2.4.1.37) - антигена В, транспортируя галактозу к терминальной фукозе (рисунок 1). Ген «0» не кодирует синтез специфической трансферазы, и Н-антиген остается неизменным, формируя группу крови 0(1). Функционирование сразу обоих ферментов формирует АВ-антиген, группа крови АВ [74, 38, 249, 250, 366, 170, 301, 355, 186, 266, 282,363,364,203,179, 278,225, 200,274].

Биосинтез антигенов ABO

А - антиген О - антиген В ■ антиген

Рисунок 1 - Биосинтез антигенов АВО (Льюис С.М. с соавт., 2009)

В экспериментальных исследованиях S.I. Patenaude et al. [351], Alfaro J.A. et al. [180], были выделены и изучены кристаллические структуры груп-поспецифических гликозилтрансфераз. Оказалось, что А- и В- гликози-лтрансферазы представляют собой высокогомологичные димеры, содержащие 354 аминокислотных остатка (рисунок 2). Между двумя доменами ферментов, разделенными широкой щелью, располагается активный центр — место присоединения УДФ и Н-антигена (ball-and-stick). К активному центру прилегает неупорядоченная петля, состоящая из аминокислотных остатков 179 -194, которая преобразует N- и С-терминальный полипептид (рисунок 3) [212, 346, 360, 337, 338, 242, 180, 297, 197, 362, 21, 303, 323].

Рисунок 2 - Димер А- и В-гликозилтрансферазы (Protein Data Bank, 2012)

Установлено, что А- и В-гликозилтрансферазы отличаются 4 аминокислотными остатками Gly/Arg 176, Gly/Ser 235, Leu/Met 266 и Ala/Gly 268. Выделение кристаллической структуры данных ферментов позволило установить, что за присоединение того или иного субстрата отвечают только две аминокислоты из четырех различных. А-трансфераза, переносящая N-ацетилгалактозамин, при замене лейцина на метионин в позиции 266 и ала-нина на глицин в позиции 268 превращается в В-трансферазу, переносящая галактозу с образованием В-антигена [101, 365, 324, 171, 184, 236, 226, 345, 334, 336, 337, 175, 177, 293, 305].

Таким образом, гены гликозилтрансфераз представляют собой семейство очень сходных между собой последовательностей, в котором одни нук-леотидные замены слабо сказываются на специфичности ферментов, а другие приводят к синтезу ферментов, сильно различающихся по своим свойствам [211, 353, 183, 364, 288, 174, 335, 322, 275, 196, 227, 237, 220, 354].

На эритроцитах плода и новорожденного находятся в основном нераз-ветвленные цепи i-поли-М-ацетиллактозы (i-антиген). Со временем на мембране эритроцита начинают преобладать разветвленные цепи 1-поли-Ы-

Рисунок 3 - 8ЕТОИ35 диаграмма группоспецифических гликозилтрансфераз (8.1.Ра1епаиёе ег а1, 2002)

ацетиллактозы (1-антиген) и к 18 месяцам устанавливается взрослый I-фенотип с минимальным содержанием ¡-антигена. На концах этих цепей формируются антигены АВН-системы [83, 290, 361, 329, 281, 288, 312, 360, 246, 214] . К терминальной галактозе цепи-предшественника присоединяется фукоза с образованием антигена Н. Антиген Н является предшественником для синтеза антигенов А или В. Так если к антигену Н присоединена галактоза, то образуется В-антиген (группа крови В). Если вместо галактозы присоединен К-ацетилгалактозамин, то это А-антиген (группа крови А). В том случае, когда организм не синтезирует ни А-трансфераз, ни В-трансфераз, цепь антигена Н остается нетрансформированной, что соответствует группе крови 0 [74, 38, 179, 266, 282, 363, 364, 195, 203, 313, 225, 186, 200, 274].

Различают 4 структурных типа цепи-предшественника антигенов АВО-системы. На цепях типа 1 находятся антигены системы Льюис. Наиболее распространен «второй тип» цепи (ГалР1-^4ГлзКАц(31—>ЗГалр1—»И.), на котором образуются антигенные детерминанты АВН (рисунок 4). На цепи типа 2 адсорбируются из плазмы цепи типа 1, которые секретируются эпителиальными клетками. Цепи типа 3 формируют А-детерминанту, которая находится

на эритроцитах А1 и А1В групп крови. Антиген А2 отличается от А1 отсутствием концевого Ы-ацетилгалактозамина и поэтому содержит только «внутреннюю» антигенную детерминанту цепи типа 2. Н-антиген на А и АВ-эритроцитах относится к типу 3, на эритроцитах 0(1) и В(Ш) групп крови - к типу 2 [101, 100, 295, 243, 276, 253, 339, 248].Тип 4 цепи называют «удлиненной глобо-серией»: глобо-Н (Н тип 4) и глобо-А (А тип 4). Эти типы цепей обнаруживаются в почках и урогенитальном эпителии [165, 284, 270]. В минимальных количествах антигены на цепи типа 4 находятся на А1 и А2 эритроцитах [361, 201].

Антигены А, В и Н содержатся не только на эритроцитах, но и в биологических жидкостях организма (плазме, лимфе) у 78 % людей, которые называются выделителями или секреторами. Способность трансформировать групповые антигены в секреты является наследственной характеристикой, которая контролируется двумя генами 8е и ее [7, 283, 251, 296, 201]. 8е для выделительства является доминантным, в то время как эе — рецессивным. Индивиды, имеющие 8е8е или 8езе гены, являются выделителями, а эеве — невыделителями. Секреторные гены действуют путем разрушения липидпо-лисахаридных связей в А и В тканевых антигенах, вследствие чего полисаха-ридная часть высвобождается в тканевые жидкости. АВО-антигены присутствуют во всех тканях, кроме хряща, хрусталика глаза и компактной кости [120, 365, 198, 231].

У большинства людей антигены А и В хорошо выражены на мембране эритроцитов, что позволяет достаточно уверенно их дифференцировать. В ряде случаев могут возникать трудности, обусловленные слабовыраженной способностью эритроцитов вступать в реакцию агглютинации с антисыворотками. Это связано с тем, что антигены А и В неоднородны по своей структуре и могут проявляться в ряде различных аллотипов: А1, А2, АЗ и т.д. Всего в настоящее время описано 12 субтипов антигена. У 88% людей с группой крови А встречается аллотип или разновидность А1, у 11% - аллотип А2 [133, 76, 32, 279, 181, 357, 325, 280, 350, 264] (рисунок 5).

4

т 1

«с

/•Фук

1_е

2 Т 1 а

4

г 1

о

/фукЧ^

Тиа 2: Л.ВН-»|Гал[р1 -»4 (ГпаИАц) р1 -»3 Разаетвлемный вариант АВН

Пал

рч—

Гая

Гал|р14(ГпзМАц) Р1 —

АВНГая

Тип 3; АН-* Гэл £>е1-*3

Гал

01 -+ГСЛ1

Тип 4; АН

Г^л

Гал

а1 -М

Гая

1-»ГСЛ

Рисунок 4 - Типы полисахаридных цепей-предшественников (Оловникова Н.И., Николаева Т.Л., 2001) Гал - галактоза, Фук - фукоза, ГлзЫАц - ацетилглюкозамин, ГaлNAц - ацетилгалактозамин.

По мнению С.М. Льюиса [74] частота встречаемости подгруппы А2 и А2В несколько выше и составляет 20% всей популяции. Антиген В не столь сложен и разнообразен по строению [87, 364, 279]. Однако благодаря развитию метода полимеразной цепной реакции стало возможным выделить до 15 субтипов антигена В [48, 49, 38, 269, 310, 254, 173, 311, 172, 356].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Шахнович, Елена Александровна, 2013 год

- - - О

+ - + А

- + + В

+ + + АВ

* Знаком плюс (+) обозначено наличие агглютинации, знаком минус (-) отсутствие.

видуальной чистой сухой стеклянной палочкой, а затем планшету периодически, циркулярно покачивали и регистрировали агглютинацию. Результаты учитывались не ранее, чем через 3-5 минут, для исключения неспецифической агглютинации добавляли 0,05 мл 0,9% раствора NaCI.

Степень агглютинации подсчитывалась по W. Marsh с индикацией степени агглютинации (бальная оценка интенсивности агглютинации - pt), согласно таблице 3.

ТаблицаЗ - Подсчет результатов в пробах с агглютинацией эритроцитов

Обозначения Описание

4+ Клеточный осадок образует один комок, осадок виден макроскопически

3+ Клеточный осадок представлен несколькими крупными комками, виден макроскопически

2+ Клеточный осадок представлен множеством мелких комочков, виден макроскопически

1+ Клеточный осадок представлен мельчайшими зернистыми комочками, макроскопически слабо заметен

(+) или W (слабая) Клеточный осадок представлен мельчайшими гранулами, видимыми только под микроскопом

- Отрицательный результат — все клетки свободно и равномерно распределены

Определение группы крови также проводилось с помощью жидкофазно-го метода на микропланшетах на автоматическом анализаторе для проведения иммуногематологических исследований «Хемос СП II» фирмы BIO-Rad с использованием коммерческих реактивов TransClone Anti-ABOl (А), TransClone Anti-AB02 (В), TransClone Anti-AB03 (AB) (BIO-Rad, США) (рисунок 1). Анализатор автоматизировано вносит и разводит реагенты и образцы в 96-луночных микропланшетах при помощи координированного робота-манипулятора с 4-хканальным дозатором для внесения образцов, контролей и реагентов. Микропланшеты с внесенными образцами, реагентами и стандартными эритроцитами инкубировали 15 минут, затем ресуспензировали на на перемешивающем устройстве PSU-2T . Полученные результаты реакции гемагглютинации в лунках регистрируются и интерпретируются с помощью фотометра для микропланшет PR 3100, который управляется компьютером с программным обеспечением HEMOS MR. Компьютер получает информацию о внесенных образцах и реагентах, данные анализа изображений микропланшета и, используя заранее запрограммированные алгоритмы интерпретации, выдает результат на принтер.

Рисунок 1 - Автоматический анализатор для проведения иммуногематологических исследований «Хемос СП II» (BIO-Rad, США)

2.2.3 Антиген-антительная система ABO -модель изучения белок-белкового взаимодействия

Моделью для изучения белок-белкового взаимодействия являлась система антиген-антитело, образованная антигенами и антителами ABO системы. В качестве внешнего стимула был выбран препарат силистронг, разработанный коллективом кафедры фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Минздрава России под руководством заслуженного деятеля науки РФ, доктора медицинских наук, профессора Ф.Н. Гильмияро-вой (Патент РФ № 2112020; ФСП 42-0211=0703-01), внесен в реестр лекарственных средств РФ (регистрационное удостоверение Р № 000605/01 от 23.08.2001). Силистронг представляет собой настойку расторопши с содержанием спирта не менее 42,5%, сухого остатка не менее 0,75%. Главным действующим началом препарата является сумма флаволигнанов плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum (L) Gaerth) семейства астровых Aster-асеае, содержание которых составляет 595,7 мг%. Настойка расторопши представляет собой прозрачную жидкость красновато-коричневого цвета со вкусом и запахом специфичным для расторопши. Относится к фармакологической группе метаболических средств, оказывающих стимулирующее влияние на метаболические процессы, повышает устойчивость к гипоксии, способствует увеличению физической работоспособности.

Были проведены три серии экспериментов: преинкубация силистронга в конечной концентрации 0,3 мМ с гликопротеинами А и В эритроцитов; мо-ноклональными антителами («Эритротест», Россия); изогемагглютининами плазмы на автоматическом анализаторе «Хемос СП II» («BIO-Rad», США) с использованием стандартных эритроцитов («ReversCell», США).

О степени влияния силистронга на антиген-антительное взаимодействие судили по двум параметрам: изменению степени и скорости наступления агглютинации.

Визуализация антиген-антительного взаимодействия осуществлялась нами с помощью метода проточной цитофлуориметрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

2.2.4.1.Проточная цитофлуориметрия

Проточная цитофлуориметрия - метод, основанный на проведении фотометрических и флуоресцентных измерений отдельных клеток, пересекающих одна за другой вместе с потоком жидкости лазерный луч монохроматического света.

Исследование проводилось на 2-х канальном проточном цитофлуори-метре FACS Calibur компании Beckton Dickinson (США) с анализом 2-х оптических и 4-х параметров флуоресценции. Настройка прибора производилась с применением калибровочных частиц «CaliBRAITE» в программном обеспечении «FACSComp». Полученные данные обрабатывались с помощью компьютерной программы «CellQuest pro». Применялись меченые флуо-ресцеинизотиоционатом (FITC) моноклональные антитела Blood group A antigen (Z2A), Blood group В antigen (89-F), фирмы Santa Cruz Biotechnology, Inc. (США). Для фенотипирования использовалась цельная кровь, взятая при помощи вакуумной системы с антикоагулянтом ЭДТА. Предварительный подсчет эритроцитов производился на автоматическом гематологическом анализаторе «Sysmex КХ 21» («Roch», Швейцария).

Принцип метода. Суспензия предварительно окрашенных флуоресцирующими красителями клеток помещается в контейнер для проб проточного цитометра. Через наконечник специальной конструкции под давлением клеточная суспензия впрыскивается в центр быстро движущегося в том же направлении потока жидкости. Клетки, подхваченные потоком жидкости, выстраиваются друг за другом, образуя «цепочку» - принцип гидродинами-

ческого фокусирования (рисунок 2), благодаря которому создаются условия ламинарного потока [67, 343, 327, 309, 358].

Измерения проходят в проточной кювете прибора при пересечении клеткой луча аргонового лазера, охлаждаемого воздухом (мощность 25мВт, длина волны 488 нм). Под воздействием луча лазера молекулы флюоресцентных красителей, связанные с клетками, переходят в возбужденное состояние. Возвращаясь в исходное состояние, молекулы испускают кванты света с другими длинами волн. Это вторичное излучение, проходя через оптическую систему прибора (линзы, фильтры, двухцветные зеркала), регистрируется фотоэлектронными умножителями, преобразующими его в электрические сигналы, подвергающиеся компьютерной обработке [158] (рисунок 3).

Иммуноцитофлуориметрический анализ клеток производится по ряду параметров:

• показатели светорассеяния клеток FSC (forward side scatter) - показатель прямого светорассеяния и SSC (90° side scatter) - показатель бокового светорассеяния;

Central core

Рисунок 2 - Принцип гидродинамического фокусирования

(Rahman M., 2008)

Fluidics system

/ 1 ✓I

SSC J

Filters Detectors

Detector

Рисунок 3 - Схематическое изображение стандартного проточного цито-флюориметра (Rahman М., 2008)

• три канала детекции специфического флюоресцентного сигнала красителей на разной длине волны.

Канал прямого светорассеяния (Р8С-канал) используется для регистрации рассеивания света от поверхности клеток под малыми углами (1-10°), что позволяет определять размеры клеток. Канал бокового светорассеяния (ЗБС-канал) позволяет регистрировать рассеиваемые клеточными структурами лучи под углами до 90°. Этот параметр характеризует оптическую плотность цитоплазмы, характер внутриклеточных структур и гранулярность клетки.

Флюоресцентный сигнал красителей позволяет изучить клеточные маркеры. Для этого используются моноклональные антитела, меченные различными флюорохромными красителями к мембранным и внутриклеточным компонентам клеток (белкам, ДНК, РНК). После окрашивания клеток мо-ноклональными антителами происходит их специфическое связывание с клеточными структурами и регистрация флюоресценции, индуцированной излучением лазера. Регистрацию флюоресценции проводят под прямым углом,

однако для монохроматического лазерного облучения это не является обязательным условием, так как испускаемый флюоресцентный свет всегда имеет большую длину волны, чем возбуждающий свет лазерного облучения. Полученные электрические сигналы преобразуются, дискредитируются и передаются в компьютер в виде гистограмм для вывода на дисплей и анализа [235, 234].

В связи с отсутствием доступных протоколов по фенотипированию эритроцитов нами был разработан протокол определения антигенов эритроцитов (заявка 2012108863 от 07 марта 2012г.). После подсчета количества эритроцитов на гематологическом анализаторе цельная кровь разводилась раствором FAXflow до примерного содержания 1 х 106 эритроцитов. Состав солевого раствора FAX flow: КН2Р04- 0,0215%, Na2H Р04 - 0,212%, NaCl -0,808%, КС1 - 0,0184%, Na2EDTA - 0,0331%, H20 - 98,907%. Перед постановкой реакции гемагглютинации 100 мкл эритроцитов инкубировали с 20 мкл биологически активных веществ в течение 5 минут. Инкубирование с антителами проводилось в полистироловой пробирке в течение 20 минут в темном месте. Для анализа использовалось 50 мкл разведенных эритроцитов и 10 мкл конъюгированных флуорохромным красителем антител. После инкубации комплекс антиген-антитело тщательно перемешивался на вортексе V3, добавляли 2 мл раствора FAX flow, затем пробирка помещалась в пробо-заборник проточного цитометра. Анализ антигенной экспрессии проводился в заданном нами гейте («регионе интересов»). Учет флуоренсценции осуществлялся при 512 - 547 нм на первом (FL1 - зеленом) фотоумножителе.

Были получены данные по прямому (FSC) и боковому (SSC) светорассеянию (рисунок 4), а также по флуоресценции эритроцитов, связавших флюо-рохром-конъюгированные антитела. Компенсация наложения флуоресценции осуществлялась средствами программного обеспечения. Позитивность окрашивания с антителом оценивалась при наложении квадрантов, определенных отрицательным изотопическим контролем. Интерпретация показателей флу-

оресценции производилась по модифицированному нами протоколу (заявка 2012108863 от 07 марта 2012г.).

Рисунок 4 - Результаты фенотипирования эритроцитов 0(1) группы крови с моноклональными анти-А антителами

2.2.4.2. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

В настоящее время конфокальные лазерные сканирующие микроскопы получили широкое распространение в практике биологических исследований и в методах медицинской диагностики. Достижения в области точной механики, оптики, вычислительной техники, флуоресцентной микроскопии, реализованные в конфокальной микроскопии, позволили значительно расширить возможности оптической микроскопии. В конфокальной лазерной сканирующей микроскопии оптическая система формирует светящееся пятно на заданной глубине микрообъекта, что дает возможность путем сканирования получать послойное изображение препарата с контрастированием внутренних структур. Программное обеспечение конфокальной микроскопии обеспечивает визуализацию изображения, трехмерную реконструкцию объекта (З-О), различные виды анализа внутриклеточных структур, автоматизацию работы всех систем [58, 59, 142, 161, 84, 216].

Исследования проводились при помощи экспериментального стенда (рисунок 5), который был реализован на базе конфокального оптического мик-

08-09-2011/2 003

08-09-2011/2 003

X 35

6

«8 ч-

О 200 400 600 800 1000 РвС-Н

10° 101 102 103 ЯП-Н

роскопа Olympus IX 71 («Olympus», Япония), конфокальный сканирующего блока и лазерного комбайна (фирма ANDOR) (9,10).

Экспериментальный стенд обеспечивал скорость сканирования до 25 слоев в секунду, такая скорость позволяет динамически получать 3D изображения образца. На рис. приведена блок-схема установки. Стенд обеспечивал два режима микросъемки: режим конфокальной микроскопии в видимом свете и режим лазерной флуоресценции. В первом случае в качестве источника излучения использовался широкополосный источник (галогеновая лампа), а во втором - лазерные излучатели мощностью 100 мВт на длинах волн 488 нм и 561 нм.

Рисунок 5 - Установка флуоресцентной конфокальной микроскопии: 1 - источник видимого света (галогеновая лампа), 2 - коллиматор, 3 - объект, 4 -объектив, 5 - поворотное зеркало, 6 - конфокальный сканирующий блок, 7 -блок фильтров, 8 - камера, 9 - компьютер, 10 - лазерный блок

В режиме конфокальной микроскопии свет от галогеновой лампы 1 (видимый диапазон) через блок фильтров поступает на систему фокусировки 2, которая фокусирует излучение на объекте 3. Прошедшее через объект (рассеянное вперед) излучение собирается объективом (20х или 40х) 4 и через систему зеркал и призм 5 вводится в сканирующий конфокальный блок 6. Ска-

нирующий конфокальный блок построен по принципу Нипкова (12, рисунок 5): вращающиеся диски с микродиафрагмами, реализующими конфокальный метод. Перемещение фокальной плоскости (выделение анализируемого слоя ткани) осуществляется за счет управляемого с компьютера пьезоэлектрического z-микросканера, с установленным на нем объектом исследования. Спектральная фильтрация излучения осуществляется в блоке 7, реализованным в виде системы сменных фильтров, установленных на вращающейся турели. Спектральная фильтрация позволяет повысить контрастность регистрируемого изображения. После блока 7 излучение вводится в камеру 8 (1024*1024, время экспозиции 40мс-10мин). Для снижения темновых токов (в среднем на 3 порядка) матрица камеры охлаждается до температуры -75 С.

В режиме флуоресценции галогеновая лампа выключена. Вместо неё используется либо 4х модульный блок лазеров 10 (в настоящей работе использовались каналы излучения с длинами волн 488 нм и 561нм), либо ртутная лампа. Фокусировка и согласование падающего излучения осуществляется в блоке 6.

2.2.5. Статистическая обработка результатов исследований

Статистическую обработку полученных результатов проводили на персональном компьютере с помощью пакета прикладных программ SPSS 12.0 (statistical package for social sciences) «ANOVA». Анализ включал методы статистического описания и проверки статистических гипотез. В пределах каждой выборки определяли среднее арифметическое (М), стандартную ошибку от средней арифметической (т), медиану (Me), квартили (Ql - Q3), среднее квадратичное отклонение, 95% доверительный интервал. Использование таких показателей, как медиана, верхний и нижний квартили необходимо для исключения влияния на среднюю арифметическую крайних членов ранжированного вариационного ряда.

Помимо статистической характеристики вариационных рядов нами проводилась сравнительная оценка генеральных параметров. Для оценки достоверности использовался ^критерий Стьюдента. Для сравнения здоровых лиц по группам крови применяли однофакторный дисперсионный анализ. Показатели со скошенной формой распределения (С-реактивный белок, ас-партатаминотрансфераза) предварительно логарифмировали для симметризации закона распределения. Апостериорные сравнения групп (попарные тесты) проводили методом Тьюки [25, 109, 85,81]. В случае если получаемые распределения значений изучаемых показателей отличались от классического Гауссовского распределения, для сравнения статистик двух выборочных распределений применяли непараметрические методы сравнения: критерий Колмогорова-Смирнова с поправкой Лилиефорса и Шапиро-Уилки. Критическое значение уровня значимости принимали равным 0,05.

ГЛАВА 3

ПОКАЗАТЕЛИ БЕЛКОВОГО ОБМЕНА, СООТНЕСЕННЫЕ С РАЗЛИЧНЫМИ ГРУППАМИ КРОВИ

Актуальной проблемой медицины является поиск новых, эффективных путей профилактики, а также донозологической диагностики заболеваний. В настоящее время на базе геномики, протеомики, метаболомики формируется база персонализированной медицины. Как известно, уникальность каждого человека и его набора генов определяет широкое варьирование физиологических и патофизиологических реакций в группе людей в ответ на воздействие одного и того же фактора. Это может быть и одной из причин клинического полиморфизма заболеваний. Информативность данных, получаемых при проведении диагностических исследований, является залогом качества диагностики и адекватности лечебных мероприятий. Следует отметить, что границы нормы и патологии зачастую очень условны. Именно поэтому чрезвычайно важным является изучение индивидуальных колебаний показателей обмена веществ.

Нами изучены показатели белкового обмена в крови лиц 0(1)-АВ(1У) групп крови, определены тенденции, характеризующие их биологическую вариабельность, выделены параметры, ассоциированные с групповой принадлежностью крови.

Уровень общего белка составил 73,1 г/л (73,8±0,76 г/л), стандартное отклонение 8,3 (таблица 1). У лиц с В(Ш) группой крови содержание общего белка является наименьшим - 71,6 г/л (72,8±1,51), далее по нарастанию медианы располагаются представители 0(1) группы крови - 72,2 г/л (74,4± 1,64), А(П) группы крови - 73,1 г/л (74,2±1,37), АВ(1У) - 75,3 г/л (73,7±1,19).

Группа крови М±т Ме 95% 01-Оз

0(1) 74,4± 1,64 72,2 8,9 71,1-77,8 67,7 - 79,6

А(И) 74,2± 1,3 7 73,1 8,7 71,4-77,0 67,7 - 80,5

В(Ш) 72,8± 1,51 71,6 8,7 69,7 - 75,8 67,3 - 77,2

АВ(1У) 73,7±1,19 75,3 4,8 71,2-76,2 70,8 - 76,7

Генеральная совокупность 73,8±0,76 73,1 8,3 72,3 - 75,3 67,7 - 78,1

Белковую фракцию плазмы составляют несколько сотен различных белков. По подвижности в электрическом поле белки плазмы крови можно разделить на две основные фракции: альбумины и глобулины. Альбумин составляет около 60% от общего количества белков плазмы крови. Альбумин играет большую роль в поддержании онкотического давления, приблизительно 80% онкотического давления плазмы крови обеспечивается альбумином. Также альбумин отвечает за транспорт кровью различных веществ, таких как билирубин, соли тяжелых металлов, жирные кислоты, фармакологические препараты. Альбумин, как и некоторые другие белки плазмы, обладает определенной буферной емкостью, хотя и не вносит существенный вклад в регуляцию кислотно-основного равновесия.

Содержание альбумина в сыворотке крови обследованных лиц составило 41,8 г/л (40,9±0,52). Наименьшее значение содержания альбумина отмечено у представителей А(П) группы крови - 40,8 г/л (39,8±0,96), что несколько ниже по сравнению с генеральной совокупностью (таблица 2). Далее по нараста- нию медианы располагаются представители 0(1) группы крови -41,0 г/л (40,3±1,23), В(Ш) группы крови - 41,9 г/л (42,2±0,73). Наиболее высокий уровень данного показателя у лиц с АВ(1У) группой крови - 43,9 г/л (42,1±1,31).

Группа крови М±ш Ме 95% (Ь-Оз

0(1) 40,3± 1,23 41,0 6,0 37,7 - 42,8 35,3 - 44,8

А(П) 39,8±0,96 40,8 5,5 37,8 - 41,7 36,9 - 43,5

В(Ш) 42,2±0,73 41,9 3,9 40,7 - 43,7 39,3 -45,1

АВ(1У) 42,1±1,31 43,9 4,9 39,2 - 44,9 39,6 - 45,9

Генеральная совокупность 40,9±0,52 41,8 5,2 39,9 - 42,0 37,0-45,1

Анализируя процентное содержание альбумина в крови обследованных можно отметить несколько другое соотношение данного показателя у лиц с различной групповой принадлежностью крови (таблица 3). Наименьшее значение данного показателя в крови отмечено у лиц с 0(1) группой крови -50,8% (50,0±1,03 %), далее следуют лица с А(П) группой крови 52,7 % (51,8±0,72) и АВ(1У) 53,6 % (54,2± 1,34). Наибольшее содержание альбумина наблюдалось у лиц с В(Ш) группой крови 54,3 % (54,6±0,92 %).

Таблица 3 - Содержание альбумина (%) в сыворотке крови

Группа крови М±т Ме 8Б 95% (Ь-Оз

0(1) 50,0± 1,03 50,8 4,0 50,3- 53,3 46,3- 53,4

А(И) 51,8±0,72 52,7 3,6 52,6- 56,5 49,2- 54,0

В(Ш) 54,6±0,92 рн,, =0,008 54,3 3,7 51,4- 57,6 51,5- 55,7

АВ(1У) 54,2±1,34 Pi-.iv =0,031 53,6 4,0 51,4- 53,5 52,3- 55,9

Генеральная совокупность 52,4±0,51 52,8 4,1 51,4- 53,5 49,9- 55,2

Глобулины представляют собой неоднородную фракцию и подразделяются на а-, Р" и у-глобулины. В генеральной совокупности значение медианы al - глобулинов белковых фракций составило 3,58 % (3,6±0,07 %), у лиц с 0(1) этот показатель наибольший 3,93 % (3,9±0,13 %), у лиц с В(Ш) наименьший 3,45 % (3,5±0,13 %) (таблица 4). В остальных группах крови отличия по среднему показателю, медиане и стандартному отклонению являются незначительными.

Таблица 4 - Содержание al - глобулинов (%) в сыворотке крови

Группа крови М±т Me SD 95% Q1-Q3

0(1) 3,9±0,13 3,93 0,5 3,33 - 3,87 3,45-4,19

А(П) 3,6±0,13 3,56 0,6 3,19-3,73 3,09 - 4,06

В(Ш) 3,5±0,13 3,45 0,5 3,14-4,23 3,08 - 3,83

AB(IV) 3,7±0,24 3,68 0,7 3,49 - 3,78 3,48-4,18

Генеральная совокупность 3,6±0,07 3,58 0,6 3,49 - 3,78 3,26 - 4,07

В крови клинически здоровых лиц содержание а2- глобулинов составило 9,06 % (9,4±0,21 %) (таблица 5). Наименьшее значение наблюдалось у лиц с АВ(ГУ) группой крови 7,85 % (8,6±0,43 %). Далее по возрастающей медианы идут лица с В(Ш) группой крови 8,85 % (8,9±0,31 %), А(Н) группой крови 8,95 % (9,2±0,35 %). Наибольшее значение медианы а2- глобулинов определяется у лиц с 0(1) группой крови 10,89 % (10,7±0,45 %), также у них наибольший показатель стандартного отклонения - 1,8.

Группа крови М±ш Ме 8Б 95% <21

0(1) 10,7±0,45 10,89 1,8 9,76- 11,70 9,79-11,35

А(П) 9,2±0,35 Р1_„ =0,028 8,95 1,7 8,51-9,98 8,13-10,33

В(Ш) 8,9±0,31 р1-ш=0,01 8,85 1,2 8,24 - 9,56 8,12-9,55

АВ(1У) 8,6±0,43 Рму =0,009 7,85 1,3 7,57 - 9,53 7,73 - 9,44

Генеральная совокупность 9,4±0,21 9,06 1,7 8,98 - 9,84 8,11 - 10,70

В генеральной совокупности значение медианы (3-глобулинов белковых фракций равно 15,09 % (15,7±0,38 %) (таблица 6). Наименьшее значение медианы (3-глобулинов отмечалось у лиц с В(Ш) группой крови - 14,85 % (15,0±0,66 %). Наибольшее значение медианы у лиц с 0(1) группой крови 16,16 % (16,3±1,03 %), в этой группе обследованных так же наибольший показатель стандартного отклонения, равный 4,0.

Таблица 6- Содержание (3-глобулинов (%) в сыворотке крови

Группа крови М±т Ме 95% (^-Оз

0(1) 16,3±1,03 16,16 4,0 14,06- 18,47 12,55- 17,53

А(П) 16,0±0,59 15,02 2,9 14,81- 17,26 13,79- 18,02

В(Ш) 15,0±0,66 14,85 2,6 13,61- 16,43 13,09- 16,40

АВ(1У) 15,1±0,85 14,93 2,6 13,08- 17,02 12,64- 15,91

Генеральная совокупность 15,7±0,38 15,09 3,1 14,93- 16,46 13,40- 16,85

Значение медианы у-глобулинов белковых фракций в генеральной совокупности составило 18,79 % (18,8±0,34%) (таблица 7). Наименьшее содержание у-глобулинов наблюдалось у лиц с АВ(1У) группой крови - 17,3% (18,2±0,74%). У обладателей В(Ш) и 0(1) группы крови значение медианы у-глобулинов соответственно составило 18,77% (18,1±0,55%) и 19,07% (19,1±0,91%). Наибольшее значение медианы у обладателей А(И) группы крови- 19,59% (19,4±0,55 %). У лиц с 0(1) группой крови отмечается наибольшее колебание содержания у-глобулинов белковых фракций - 3,5.

Таблица 7 - Содержание у-глобулинов (%) в сыворотке крови

Группа крови М±т Ме 80 95 % <31-Оз

0(1) 19,1±0,91 19,07 3,5 17,15-21,08 16,92-21,15

А(П) 19,4±0,55 19,59 2,7 18,21-20,51 17,68-21,09

В(Ш) 18,0±0,55 18,77 2,2 16,87- 19,24 16,44- 20,13

АВ(1У) 18,2±0,74 17,30 2,2 16,50- 19,90 16,64- 19,70

Генеральная совокупность 18,8±0,34 18,79 2,8 18,12- 19,50 16,92- 20,67

Иммуноглобулины представляют собой группу гликопротеинов, содержащихся в плазме крови и тканевой жидкости. Каждый иммуноглобулин выполняет две функции. Одна часть его молекулы предназначена для связывания с антигеном, другая осуществляет эффекторные функции. К ним относится связывание иммуноглобулина с тканями организма, различными клетками иммунной системы, определенными фагоцитарными клетками при активации иммунной системы по классическому пути. По размеру молекул, заряду, аминокислотному составу и содержанию углеводов иммуноглобулины классифицируются на пять классов — ^А, ^М, 1§0 и 1§Е, из которых три имеют наибольшее клиническое значение (1§0,1§А,

Иммуноглобулин А содержится в выделяемых секретах, таких как слюна, желудочный сок, моча и обеспечивает защиту организма от локальных респираторных и желудочно-кишечных инфекций. По мнению Р. Койко с со-авт. [56] защитный эффект А обусловлен способностью предотвращать прикрепление патогенных микроорганизмов к эпителию слизистых. Содержание иммуноглобулина А в крови практически здоровых лиц составляет 3,13 г/л (3,36±0,15 г/л). Наибольшее содержание иммуноглобулина А обнаружено у лиц с 0(1) и АВ(1У) группами крови 3,6 г/л (4,02±0,40 г/л) и 3,64 г/л (3,83±0,39 г/л) соответственно (таблица 8). Более низкий уровень иммуноглобулина А отмечен у лиц с В(Ш) и А(П) группами крови - 2,76 г/л (3,01±0,28 г/л) и 2,94 г/л (3,03+0,17 г/л). Наибольшее стандартное отклонение у обладателей 0(1) группы крови - 3,6, наименьшее - у лиц со А(П) группой крови - 0,96.

Таблица 8 - Содержание иммуноглобулина А (г/л) в сыворотке крови

Группа крови М±щ Ме 95% (Ь-Оз

0(1) 4,02±0,40 3,60 1,82 3,19- 4,85 2,84- 5,01

А(П) 3,03±0,17 2,94 0,96 2,69- 3,38 2,50- 3,60

В(Ш) 3,01±0,28 2,76 1,43 2,45- 3,58 1,94-3,51

АВ(1У) 3,83±0,39 3,64 1,46 2,98- 4,67 3,09- 4,96

Генеральная совокупность 3,36±0,15 3,13 1,44 3,07- 3,66 2,46- 4,07

Иммуноглобулин О содержится в крови, лимфе и цереброспинальной жидкости. Иммуноглобулин О обладает способность активировать систему комплемента, вызывает агглютинацию антигенных частиц, относится к опсо-низирующим антителам. Иммуноглобулин С обладает свойствами нейтрализовать токсины, вирусы, обездвижить бактерии [124, 96]. Содержание имму-

ноглобулина в в генеральной совокупности составляет 11,44 г/л (11,28±0,17 г/л). Наименьшее значение медианы иммуноглобулина в выявлено у лиц с В(Ш) группой крови - 11,01 г/л (10,78±0,27 г/л). В остальных группах крови колебания уровня иммуноглобулина в незначительны (таблица 9). Наибольшее стандартное отклонение отмечено у лиц со А(П) группой крови - 2,02.

Таблица 9 - Содержание иммуноглобулина G (г/л) в сыворотке крови

Группа крови М±т Ме SD 95% Q1-Q3

0(1) 11,45±0,33 11,55 1,53 10,75- 12,15 10,66-12,30

А(И) 11,62±0,35 11,56 Л АЛ 10,91- 12,34 10,24-12,70

В(Ш) 10,78±0,27 11,01 1,38 10,23- 11,32 9,71 - 11,95

AB(IV) 11,21±0,37 11,50 1,40 10,40- 12,01 9,98 - 12,33

Генеральная совокупность 11,28±0,17 11,44 1,68 10,94- 11,62 10,20-12,30

Иммуноглобулин М относится к антителам, связывающим и активирующим комплемент. Иммуноглобулины М не обладают многофункциональностью: в отличие от иммуноглобулина G они плохо нейтрализуют токсины и вирусы, однако являются высокоэффективными агглютинирующими антителами [124, 96]. Содержание иммуноглобулина М в крови практически здоровых лиц составило 0,95 г/л (1,10±0,05 г/л) (таблица 10). Наименьший уровень исследуемого показателя по медиане выявлен у лиц с В(Ш) группой крови - 0,84 г/л (0,96±0,08 г/л), далее по возрастанию медианы следуют лица с 0(1) - 0,88 г/л (1,09±0,12 г/л) и А(П) группами крови - 0,99 г/л (1,17±0,09 г/л). Наибольшее значение по медиане отмечено у обладателей AB(IV) группы крови - 1,16 г/л (1,24±0,12 г/л).

Группа крови М±ш Ме 95% 0]-Оз

0(1) 1,09±0,12 0,88 0,54 0,84-1,34 0,65 - 1,34

А(П) 1,17±0,09 0,99 0,50 0,99 - 1,34 0,86-1,51

В(Ш) 0,96±0,08 0,84 0,44 0,79-1,13 0,76-1,04

АВ(1У) 1,24±0,12 1,16 0,48 0,97- 1,51 0,95 - 1,30

Генеральная совокупность 1,10±0,05 0,95 0,49 1,00-1,20 0,75 - 1,34

С-реактивный белок, как и иммуноглобулины, входит в состав фракции у-глобулинов, участвует в стимуляции фагоцитоза, активирует систему комплемента, распознает и связывает потенциально токсичные вещества. Содержание С-реактивного белка в генеральной совокупности составило 3,2 мг/л (3,4±0,67 мг/л) (таблица 11). Наименьшее значение данного показателя отмечено у лиц с АВ(1У) группой крови - 0,9 мг/л (3,6±1,61 мг/л). У обладателей В(Ш) и А(П) групп крови значение С-реактивного белка по медиане составило 1,0 мг/л (1,6±0,39 мг/л) и 1,7 мг/л (2,5±0,41 мг/л) соответственно. Наибольшее значение С-реактивного белка по медиане выявлено у обследованных с 0(1) группой крови - 3,2 мг/л (7,2±2,61 мг/л), у них же наиболее сильно колеблется уровень исследуемого показателя - величина стандартного отклонения - 11,0.

Оценив содержание общего белка, отдельных фракций, иммуноглобулинов различных классов и С-реактивного белка, мы изучили содержание конечных продуктов азотистого обмена у лиц с 0(1) - АВ(1У) группами крови. Содержание мочевины в крови обследованных лиц составило 4,8 ммоль/л (4,81±0,12 ммоль/л) (таблица 12). Наименьшее значение мочевины наблюда-

Таблица 11 - Содержание С-реактивного белка (мг/л) в сыворотке крови

Группа крови М±т Me SD 95% Q1-Q3

0(1) 7,2±2,61 3,2 11,9 1,76-12,64 0,8 - 3,9

А(П) 2,5±0,41 PI-ii =0,04 1,7 2,3 1,68-3,33 1,1-3,2

В(Ш) 1,6±0,39 Pi—ш —0,01 1,0 2,0 0,79 - 2,38 0,2 - 1,9

AB(IV) 3,6±1,61 0,9 6,0 0,08 - 7,03 0,3 - 2,5

Генеральная совокупность 3,4±0,67 3,2 11,9 2,10-4,77 0,5 - 3,2

лось у лиц с АВ(1У) группой крови- 4,1 ммоль/л (4,54±0,27 ммоль/л), далее по возрастанию медианы следуют лица с В(Ш) группой крови - 4,5 ммоль/л (4,72±0,25 ммоль/л) и А(П) группой крови - 4,6 ммоль/л (4,66±0,22 ММОЛЬ/л). В крови практически здоровых лиц с 0(1) группой крови содержание мочевины было наибольшим - 5,3 ммоль/л (5,28±0,22 ммоль/л), что выше генеральной совокупности.

Таблица 12 - Содержание мочевины (ммоль/л) в сыворотке крови

Группа крови М±ш Me SD 95% Q1-Q3

0(1) 5,28±0,22 5,3 1,22 4,82 - 5,73 4,3 - 6,3

А(П) 4,66±0,22 4,6 1,42 4,20-5,11 3,7-5,8

В(Ш) 4,72±0,25 4,5 1,42 4,21 - 5,22 3,6 - 5,7

АВ(1У) 4,54±0,27 4,1 1,09 3,96-5,12 3,7 - 5,6

Генеральная совокупность 4,81±0,12 4,8 1,34 4,57 - 5,06 3,7 - 6,0

Креатинин образуется в результате неферментативного дефосфорилиро-вания креатинфосфата, играющего важную роль в обеспечении энергией работающей мышцы в начальный период. Суточное выделение креатинина у каждого индивидуума является постоянной величиной и зависит от мышечной массы. В генеральной совокупности значение медианы креатинина составило 89 мкмоль/л (88,14±1,21) (таблица 13). Среди мужчин наименьшее значение медианы креатинина наблюдалось у лиц с В(Ш) группой крови - 90 мкмоль/л (93,0±2,80). Далее по возрастающей медианы следуют лица со А(П) группой крови - 91 мкмоль/л (93,9±2,95), 0(1) группой крови - 92 мкмоль/л (93,8±2,20). Наибольшее значение медианы креатинина зафиксировано у лиц с АВ(1У) группой крови - 93 мкмоль/л (94,8±3,60). Наибольшие колебания содержания креатинина наблюдалось у мужчин с 0(1) группой крови, стандартное отклонение в данной группе обследованных 13,8. Похожие закономерности распределения содержания креатинина можно наблюдать в группе обследованных женщин с различной групповой принадлежностью крови по

Таблица 13 - Содержание креатинина (мкмоль/л) в сыворотке крови

Группа крови Пол М±т Ме

0(1) м 93,8±2,20 92 13,8 88-96

ж 84,3±2,97 88 7,6 75-94

А(П) м 93,9±2,95 91 8,5 85-101

ж 83,5±2,41 83 9,3 77-91

В(Ш) м 93,0±2,80 90 10,3 83-105

ж 76,8±3,23 75 8,8 67-86

АВ(1У) м 94,8±3,60 93 9,1 88-96

ж 85,6±5,01 91 8,1 81-94

Генеральная совокупность 88,14^1,21 89 13,15 85,8 - 90,5

системе ABO. Наименьшее значение медианы креатинина наблюдалось у лиц с В(Ш) группой крови -75 мкмоль/л (76,8±3,23). Далее по возрастающей медианы располагаются лица со А(П) группой крови - 83 мкмоль/л (83,5±2,41), O(I) группой крови -88 мкмоль/л (84,3±2,97). Наибольшее значение медианы креатинина зафиксировано у лиц с AB(IV) группой крови - 91 мкмоль/л (85,6±5,01). Наибольшее значение стандартного отклонения отмечено у обладательниц А(П) группы крови - 9,3-

Содержание мочевой кислоты в генеральной совокупности составило 253,5 мкмоль/л (261,6±7,11 мкмоль/л) (таблица 14). У мужчин наименьшее значение уровня мочевой кислоты наблюдалось у лиц с В(Ш) группой крови 255,8 мкмоль/л (267,2±14,78 мкмоль/л). У лиц с 0(1) и А(И) группой крови содержание данного показателя составило 265,8 мкмоль/л (260,9±18,79) и 292,4 мкмоль/л (308,0± 19,96 мкмоль/л). Наибольшее содержание мочевой кислоты выявлено у обладателей AB(IV) группы крови - 315,0 мкмоль/л (309,3±14,59 мкмоль/л).

Таблица 14 - Содержание мочевой кислоты (мкмоль/л) в сыворотке крови

Группа крови Пол М±ш Ме SD Q1-Q3

0(1) м 260,9±18,79 265,8 65,5 219,3-316,3

ж 237,6±15,38 211,7 58,3 185,9-308,7

А(И) м 308,0±19,96 292,4 80,3 252,9-343,5

ж 242,1±17,54 234,6 73,5 183,1 -290,0

В(Ш) м 267,2±14,78 255,8 76,2 226,5-316,2

ж 224,7±24,18 209,0 70,1 163,0-262,7

AB(IV) м 309,3±14,59 315,0 80,7 285,2-331,7

ж 223,2±17,16 214,0 60,4 198,9-239,3

Генеральная совокупность 261,6±7,11 253,5 77,2 247,6 - 275,8

У женщин с В(Ш) группой крови содержание мочевой кислоты было наименьшим - 209,0 мкмоль/л (224,7±24,18 мкмоль/л). Далее по возрастанию медианы следуют представители 0(1) и АВ(1У) групп крови - 211,7 мкмоль/л (237,6± 15,38 мкмоль/л) и 214,0 мкмоль/л (223,2±17,16 мкмоль/л). Наибольшее содержание мочевой кислоты отмечено у женщин с А(И) группой крови 234,6 мкмоль/л (242,1±17,54 мкмоль/л), в этой же группе обследованных выявлено наибольшее значение стандартного отклонения - 73,5.

Далее мы оценили активность ключевых ферментов трансаминирования у лиц с 0(1) - АВ(1У) группой крови. Активность аланинаминотрасферазы в крови практически здоровых лиц составила 15,7 Е/л (18,2±1,06 Е/л) (таблица 15). Наименьшая активность аланинаминотрансферазы выявлена у мужчин с В(Ш) группой крови - 15,7 Е/л, наибольшая - у лиц со А(П) группой крови -19,8 Е/л. Активность фермента у практически здоровых мужчин с АВ(1У) группой крови по медиане составила - 16,1 Е/л, с 0(1) группой крови - 16,1 Е/л. Наименьшая активность аланинаминотрансферазы наблюдалась у женщин с А(П) группой крови - 10,4 Е/л, далее по возрастанию медианы следуют обладательницы 0(1) группы крови - 14,4 Е/л, В(Ш) группы крови - 17,7 Е/л. В крови женщин АВ(1У) группы крови наблюдалась наибольшая активность фермента - 20,0 Е/л.

Таблица 15 - Активность аланинаминотрансферазы (Е/л) в сыворотке крови

Группа крови Пол М±щ Ме <}1-<Зз

0(1) м 22,8±8,49 16,9 14,1 14,0-37,3

ж 18,0±3,17 14,4 13,5 11,7- 19,2

А(П) м 23,5±3,58 19,8 14,2 12,4-29

ж 12,0±1,20 10,4 11,8 8,0-15,6

В(Ш) м 17,6±1,88 15,7 7,6 11,8-19,9

ж 17,2±1,81 17,7 7,5 14,2-20,9

АВ(ГУ) м 17,7±2,60 16,1 10,0 11,5-20,4

ж 21,0±6,01 20,0 10,3 8,0-33,7

Генеральная совокупность 18,2±1,06 15,7 11,5 16,1 -20,3

У практически здоровых лиц активность аспартатаминотрансферазы составила 23,6 Е/л (28,0±1,27 Е/л) (таблица 16). Наименьшая активность фермента выявлена у женщин со А(П) группой крови - 17,6 Е/л (23,1 ±2,65 Е/л). Наибольшая активность аспартатаминотрансферазы обнаружена у мужчин с 0(1) группой крови - 44,1 Е/л (40,4±7,50 Е/л) и женщин с АВ(1У) группой крови - 36,8 Е/л (32,6±6,12 Е/л).

Таблица 16 - Активность аспартатаминотрансферазы (Е/л) в сыворотке крови

Группа крови Пол м±ш Ме сь -СЬ

0(1) м 40,4±7,50 44,1 17,9-56,7

ж 22,3±2,07 19,8 15,3-24,8

А(П) м 34,7±4,11 28,8 22,1-42,9

ж 23,1±2,65 17,6 16,2-27,5

В(Ш) м 27,3± 1,94 28,2 21,8-32,2

ж 26,3±2,02 27,9 21,2-33,8

АВ(1У) м 25,0±1,57 23,6 21,9-28,5

ж 32,6±6,12 36,8 22,5 - 43,6

Генеральная Совокупность 28,0±1,27 23,6 18,1-34,2

Таким образом, выявлена ассоциированность направленности белкового обмена у мужчин и женщин с 0(1) - АВ(1У) группами крови. У лиц со А(П) группой крови наиболее резко выражены тендерные отличия. Для обладателей В(Ш) группы крови как у мужчин, так и у женщин, характерно однонаправленное распределение показателей белкового обмена (рисунок 1).

Мужчины

Креатинин

140

Женщины

АсАТ

Мочевая кислота

Креатин ин

АсАТ

Мочевая кислота

АлАТ

O(I)

Креатинин

АсАТ

АлАТ

АлАТ

А(И)

Креатинин

140

АсАТ

АлАТ

В(Ш)

AB(IV)

Рисунок 1 - Отклонения от генеральной совокупности показателей белкового обмена у мужчин и женщин с различными группами крови (100% - генеральная совокупность)

Анализируя блок полученных данных, мы выявили некоторые особенности в содержании показателей белкового обмена в зависимости от групповой принадлежности крови (таблица 17).

У обследованных с 0(1) группой крови обнаружено более высокое по сравнению с другими группами крови и генеральной совокупностью содержание al-, a2-, Р- глобулинов. По-видимому, эти данные отражают напряжение неспецифических и специфических защитных механизмов; системы антипротеазных ингибиторов, опсонинов, участвующих в формировании

Таблица 17 - Характеристика показателей белкового обмена у лиц с 0(1) - АВ(1У) группой крови

Группы крови

Показатели 0(1) А(П) В(Ш) АВ(1У)

Общий белок - в - ++

Альбумины в -- + +++

а1 +++ в - в

а2 ++ в в -

Р-глобулины + в — -

у-глобулины + +++ в —

1вА ++ — в в

О +++ -- -

- в -- в

СРБ о -- -- —

Мочевина ++ в в —

Мужчины

Креатинин в в о ++

Мочевая кислота + + в +++

Аланинаминотрансфераза + ++ в в

Аспартатаминотрансфераза +++ + + в

Женщины

Креатинин - - +

Мочевая кислота - - - -

Аланинаминотрансфераза в — + —

Аспартатаминотрансфераза - - + +++

* обозначение в соответствует генеральной совокупности обозначение «+» и «-» - степень отклонения от генеральной совокупности

острофазного ответа. Также в крови обладателей 0(1) группы крови повышено содержание иммуноглобулинов, за счет секреторного иммуноглобулина А. Интенсивный обмен азотсодержащих соединний характеризуют преобладание мочевины. У мужчин отмечен высокий уровень мочевой кислоты, более высокая активность аланин-, аминотрансферазы по сравнению с генеральной совокупностью.

У обладателей А(П) группы крови выявлен самый низкий уровень альбумина, наиболее высокое содержание фракции у-глобулинов, в этой фракции белков наименьшее содержание 1§ А и наибольшее - ^ С, что, вероятно, свидетельствует о частых иммунных реакциях организма на внешние инфекционные агенты. У представителей данной группы отмечен более низкий уровень С-реактивного белка по сравнению с другими группами крови и генеральной совокупностью. У мужчин со А(И) группой крови отмечен более высокий уровень активности ферментов аланин- и аспартатаминотрансфера-зы, тогда как у женщин активность данных ферментов снижена по сравнению с другими группами крови и генеральной совокупностью.

У обследованных с В(ПГ) группой крови определены следующие особенности белкового обмена: более низкий уровень общего белка, а1-, (3- глобулинов, С-реактивного белка, несколько повышенный уровень альбумина. В крови лиц с В(Ш) группой крови установлен самый низкий уровень О и ^ М, указывающий на низкий уровень иммунологической памяти, не столь частое, как у представителей А(П) группы крови столкновение с инфекционными агентами. Выявлена повышенная активность аспартатаминотрансфера-зы в группе обследованных мужчин и женщин.

У лиц с АВ(1У) группой крови выявлено более низкое содержание а2-, (3- и у-глобулинов, что указывает на снижение антипротеиназной составляющей белков плазмы крови, показателей иммунного ответа. У мужчин с АВ(1У) группой крови установлена относительная гиперурикемия, которая служит основанием для диетарных рекомендаций и наблюдения.

Выявленные особенности метаболического профиля у лиц с различными группами крови являются обоснованием индивидуализации нормативов для каждого человека. Использование комплексного подхода к установлению предрасположенности к заболеваниям с учетом генетических факторов и влияния фона внешней среды позволит разработать адекватную стратегию и тактику профилактических мероприятий полигенных, мультифакториальных заболеваний человека и сформировать группы клинического риска.

ГЛАВА 4

ВЛИЯНИЕ СИЛИСТРОНГА И ЕГО КОМПОНЕНТОВ НА ГЛИКОПРОТЕИНЫ АИВ

Установив различия в особенностях показателей белкового обмена у лиц с различной групповой принадлежностью крови по системе ABO, мы решили исследовать антиген-антительное взаимодействие гликопротеинов А и В и соответствующих антител. Созданная нами модель белок-белкового взаимодействия характерна для организма человека и соответствует следующим критериям: наглядность, доступность, возможность количественной оценки степени взаимодействия антигена и антитела. После проведенного теоретического и научно-экспериментального поиска в качестве молекулярного зонда, влияющего на систему антиген-антитело, нами был выбран природный экопротектор растительного происхождения - силистронг, представляющий собой водно-спиртовой экстракт плодов расторопши пятнистой. Действующим веществом силистронга является комплекс флаволигнанов (силибин, изосилибин, силикристин, кверцетин и др.), которые придают ему гепато-протекторные, мембранопротекторные, антирадикальные, нейропротектор-ные, антиоксидантные, противовирусные свойства и др. [95, 82, 22, 245, 285].

При действии силистронга на антиген А (II) группы крови время агглютинации увеличилось (А +75%), интенсивность агглютинации снизилась (таблица 1). Выявлены особенности действия силистронга на антиген В (III) группы крови: время и степень агглютинации практически не изменялись.

Таблица 1 - Влияние еилистронга на антигены АВО системы

Контроль Антиген А А (II) Антиген В В (III)

Время (сек.) Степень агглютинации (у.е.) Время (сек.) Степень агглютинации (у.е.) Время (сек.) Степень агглютинации (У-е.)

М±т 6,0±0 4,0±0 10,5+0,9 р=0,01 3,3+0,15 р=0,01 6,3+0,15 4,0+0

Ме 6,0 4,0 9,0 3,0 6,0 4,0

Д% + 75 + 5

0 0 3,13 0,48 0,48 0

Несколько по-другому ведут себя антигены А и В, локализованные на мембране эритроцита, образуя АВ (IV) группу крови. После инкубации эритроцитов с силистронгом время взаимодействия антигена А АВ(1У) группы с моноклональными антителами увеличилось (А +63%), интенсивность агглютинации снизилась (таблица 2).

Таблица 2 - Влияние силистронга на антигены А и В АВ(1У) группы крови

Контроль 1 Антиген А АВ (IV) Антиген В АВ (IV)

Время (сек.) Степень агглютинации (У-е.) Время (сек.) Степень агглютинации (У-е.) Время (сек.) Степень агглютинации (У-е-)

М+ш 6,0+0 4,0+0 9,8+0,71 р=0,005 3,1+0,27 р=0,01 6,6+0, 30 4,0+0

Ме 6,0 4,0 9,0 3,0 6,0 4,0

Д% + 63 + 10

0 0 2,25 0,87 0,96 0

Инкубирование эритроцитов АВ (IV) группы крови ведет к некоторому ускорению наступления агглютинации антигена В (Д+10 %) без изменения

интенсивности процесса. Таким образом, при взаимодействии с антигеном А (II) группы крови силистронг вызывает увеличение времени агглютинации и снижение ее степени. Для эритроцитов А (II) группы крови характерно более медленное наступление агглютинации и большая ее интенсивность, чем для антигена А AB(IV) группы крови. Антиген В в составе AB (IV)

группы крови под влиянием силистронга взаимодействует с антителом практически как в контроле.

Следующим этапом исследований являлось изучение влияния силистронга на моноклональные антитела. Моноклональные анти-А и анти-В являются продуктом гибридомных клеточных линий, полученных в результате слияния мышиных антителообразующих B-лимфоцитов с клетками мышиной миеломы. Индивидуальные гибридомные линии продуцируют гомогенные антитела только одного класса иммуноглобулинов, которые полностью идентичны по структуре и биологической активности. Лимфоциты, несущие агтлютиноген А, вырабатывают специфическое антитело анти-А; лимфоциты, несущие агтлютиноген В, вырабатывают специфическое антитело анти-В. Моноклональные анти-А и анти-В антитела представляют собой разведенную асцитную жидкость мышей-носителей соответствующей гибри-домы, в которой содержатся специфические иммуноглобулины класса М (IgM), направленные против группоспецифических антигенов А или В человека. Таким образом, моноклональные антитела не содержат антител иной специфичности и поэтому не вызывают неспецифической полиагглютинации эритроцитов. Авидность, то есть время наступления реакции агглютинации и ее выраженность, у моноклональных анти-А и анти-В антител выше, чем у изогемагглютинирующих АВО-сывороток, особенно в случае слабо выраженных антигенов эритроцитов [119, 39, 135, 77, 8, 144, 91, 222].

При действии силистронга на анти-А и анти-В моноклональные антитела время агглютинации увеличилось у лиц как со А(П), так и с В (III) группой крови (А +18% и А +11% соответственно), интенсивность агглютинации не изменилась и сопоставима с контролем (таблица 3). Преинкубация с сили-

стронгом моноклональных анти-А и анти-В антител при взаимодействии с эритроцитами АВ(1У) группы крови привела к увеличению времени наступления агглютинации (Д +35%) и снижению ее степени у анти-А и анти-В антител (таблица 4).

Таблица 3 - Влияние силистронга на моноклональные антитела

Контроль Анти- А А (II) Анти- В В (III)

Время (сек.) Степень агглютинации (У-е.) Время (сек.) Степень агглютинации (у.е.) Время (сек.) Степень агглютинации (у.е.)

М±т 6,0+0 4,0+0 7,1+0,28 р=0,003 3,7+0,18 6,7+0,15 р=0,001 4,0+0

Ме 6,0 4,0 7,0 4,0 7,0 4,0

Д% + 18 + 11

0 0 0,87 0,48 0,48 0

Наиболее исследованным свойством иммуноглобулинов является их способность связывать самые разнообразные по структуре соединения. Антитела связывают специфические антигены за счет образования большого числа специфических нековалентных гидрофобных, электростатических взаимодействий и ван-дер-Ваальсовых сил, а также водородных связей. Согласно классическим основам иммунологии принято считать, что антитела способны прочно связывать лиганды или антигены по принципу «ключ - замок». Однако в настоящее время установлено, что антитела являются конформа-ционно-активными соединениями и способны взаимодействовать не только со «своим» антигеном, но и с множеством неспецифических лигандов [56, 33]. Это взаимодействие сопровождается конформационными перестройками молекулы антитела от небольших сдвигов боковых цепей аминокислотных остатков до глобальных перестроек в третичной и четвертичной структуре РаЬ-фрагментов иммуноглобулина [137, 34, 99, 314, 209, 368, 223]. По-

видимому, силистронг способен связываться с РаЬ-фрагментами молекулы моноклональных антител, приводя к конформационным изменениям антител, что приводит к увеличению времени наступления агглютинации и снижению ее степени при взаимодействии с гликопротеинами А и В.

Таблица 4 - Влияние силистронга на моноклональные антитела при определении АВ (IV) группы крови

Контроль Анти-А AB (IV) Анти-В AB (IV)

Время (сек.) Степень агглютинации (У-е.) Время (сек.) Степень агглютинации (У-е.) Время (сек.) Степень агглютинации (У-е.)

М±ш 6,0+0 4,0+0 8,1±0,27 р=0,001 3,7+0,15 8,1+0,27 р=0,001 3,7+0,15

Ме 6,0 4,0 8,0 4,0 8,0 4,0

Д% + 35 + 35

SD 0 0 0,87 0,48 0,87 0,48

Изучение антиген-антительного взаимодействия проводилось также жидкофазным методом с использованием микропланшетов на автоматическом анализаторе для проведения иммуногематологических исследований «Хемос СП II» (BIO-Rad). В отличие данных, полученных нами при реакции преципитации на плоскости, изменений в интенсивности агглютинации антигенов ABO под влиянием силистронга не наблюдалось (таблица 5). Под влиянием силистронга изменилась степень агглютинации только у обладателей А (II) группы крови - 3,75. Во всех остальных пробах степень агглютинации одинакова.

Таблица 5 - Взаимодействие антигенов ABO системы с антителами при инкубации с силистронгом по степени агглютинации (в условных единицах)

Контроль Антиген А А (II) Антиген В В (III) Антиген А АВ (IV) Антиген В АВ (IV)

М±т 4,0±0 3,75±0,05 р=0,01 4,0±0 4,0±0 4,0±0

Ме 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

SE 0 0,5 0 0 0

Интересным является эффект, оказываемый силистронгом, на естественные анти-А и анти-В антитела (таблица 6). Под влиянием экопротектора растительного происхождения анти-А антитела, циркулирующие в крови лиц с В(Ш) группой крови, снизили свою агглютинирующую способность на 16,6%, значение степени агглютинации по медиане составило 2,5. А степень агглютинации анти-В антител, имеющихся у лиц со А(П) группой крови, составила 0,5, что на 70% ниже контроля.

Таблица 6 - Влияние силистронга на естественные антитела по степени агглютинации (в условных единицах)

Контроль Анти-А Контроль Анти-В

М±т 2,83±0,17 2,0±0,7 2,2±0,20 1,0±0,7 р=0,03

Ме 3,0 2,5 2,0 0,5

Д% -16,6 -70

SE 0,40 1,40 0,45 1,41

Таким образом, силистронг и комплекс входящих в него флаволигнанов оказывает существенное влияние на взаимодействие гликопротеинов А и В с соотвествующими антителами, увеличивая время наступления агглютинации и снижая ее степень. Почему же силистронг обладает воздействием на анти-

ген-антительное взаимодействие? Возможно, комплекс входящих в него фла-воноидов способен изменять конформацию белковой молекулы, увеличивая взаимодействие белков между собой, влияя на физико-химические свойства белковой молекулы.

Следующим этапом нашего исследования было проведение серии экспериментов in vitro с белками плазмы крови человека с использованием метода капиллярного электрофореза (таблица 7).

Наиболее чувствительными к воздействию силистронга и входящих в него флаволигнанов оказались лица со А(П) группой крови. После инкубирования с силистронгом содержание а 1-глобулинов у обладателей А(П) группы крови составило 5,3%, что на 23,6% выше контрольной группы, содержание а2-глобулинов возросло на 17,4% и составило 10,9% (таблица 8). Незначительно возросло содержание фракции а2-глобулинов у лиц с В(Ш) группой крови - 9,3% (А +5,4%). Установлено, что силистронг вызывает изменение распределения белков плазмы крови по фракциям, происходит снижение содержания (3-глобулинов, «слияние» фракций (31 и 02 глобулинов, увеличение содержания у-глобулинов (рисунок 1). Наименьшее значение медианы (3-глобулинов отмечено у лиц со А(П) группой крови - 5,4% (А-51,0%) (рисунок 2), далее по возрастанию медианы следуют лица с В(1П) группой крови -5,9% (А -39,8%) (рисунок 3), 0(1) группой крови - 6,05% (Д-46,5%). Наименее подверженными влиянию экопротектора растительного происхождения оказались обладатели AB(IV) группы крови, значение медианы (3-глобулинов у лиц с AB(IV) группой крови - 6,8% (А- 29,2%), медиана у-глобулинов -18,4% (А+12,5%) (рисунок 4). У лиц с 0(1) и В(Ш) группой крови уровень у-глобулинов составил соответственно 19,50% (Д+14,4%) и 19,9% (Д+18,1%).

У обладателей А(П) группы крови установлено наибольшее значение медианы данного показателя - 22,8% (Д+16,7%).

Таблица 7 - Содержание белков сыворотки в крови практически здоровых лиц 0(1) - АВ(1У) групп крови

Группа крови М±ш Ме 8Б (21-03

Альбумин (%)

0(1) 55,8±0,05 55,8 0,07 55,8-55,9

А(П) 59,0± 1,10 60,6 2,59 56,8 - 60,7

В(Ш) 59,5±2,00 61,1 4,04 56,9-62,1

АВ(1У) 60,7±0,70 60,6 1,33 59,7-61,7

а1 - глобулины (%)

0(1) 4,7±0,6 4,2 1,0 4,0-5,9

А(П) 4,0±0,1 4,05 0,24 3,8-4,2

В(Ш) 4,08±0,2 3,9 0,36 3,9-4,3

АВ(1У) 4,1±0,2 4,1 0,36 4,0-4,2

а2 - глобулины (%)

0(1) 9,7±0,35 9,7 0,5 9,7-10,0

А(П) 10,4±1,5 9,0 2,5 9,0-10,0

В(Ш) 9,02±0,5 8,8 1,2 8,7-9,2

АВ(1У) 8,5±0,2 8,5 0,3 8,4-8,5

(31 - глобулины (%)

0(1) 6,5±0,3 6,5 0,4 6,5 - 6,7

А(П) 6,0±0,3 6,3 Г 0,7 5,5-6,5

В(Ш) 5,6±0,2 5,7 0,3 5,4-5,6

АВ(1У) 5,3±0,2 5,1 0,4 5,0-5,2

(32 - глобулины (%)

0(1) 4,8±0,4 4,8 0,6 4,4 - 4,9

А(П) 4,5±0,5 4,7 0,9 3,9 - 4,4

В(Ш) 4,3±0,3 4,1 0,6 4,0 - 4,4

АВ(1У) 4,42±0,2 4,5 0,6 4,3 - 4,9

у- глобулины (%)

0(1) 17,4±0,9 16,7 2,0 16,3 - 19,2

А(И) 19,0±0,3 19 0,3 18,8-19,1

В(Ш) 16,5±0,8 16,3 1,4 13,6-15,9

АВ(1У) 15,9±0,5 16,1 0,9 16,0-16,4

Таблица 8 - Влияние силистронга на содержание белков сыворотки в крови практически здоровых лиц 0(1) - АВ(1У) групп крови

Группа крови М+т Ме 8Э 01-03 Д%

Альбумин (%)

0(1) 56,8+0,4 56,8 0,6 56,2 - 56,8

А(П) 59,2+3,5 59,2 5,0 51,4-59,25

В(Ш) 61,2±1,1 61,0 2,1 60,3-63,9

АВ(1У) 59,6+1,5 60,5 3,0 59,7- 61,9

а1 - глобулины (%)

0(1) 4,0+0,3 4,0 0,5 3,7-4,6

А(П) 5,3+0,6 5,3 0,9 4,0 - 5,35 +23,6

В(Ш) 4,0+0,1 4,0 0,3 3,9-4,4

АВ(1У) 4,0+0,2 4,0 0,3 4,0-4,1

а2 - глобулины (%)

0(1) 9,4+0,05 9,4 0,07 9,2 - 9,4

А(П) 10,9+2,2 10,9 3,2 7,8 - 10,9 +17,4

В(Ш) 9,2+0,2 9,3 0,4 9,1-9,6 +5,4

АВ(1У) 9,20±0,5 8,8 1,0 8,8-10,6

Р - глобулины (%)

0(1) 6,1+0,3 6,0* 0,5 5,9-6,8 -46,5

А(П) 5,4+0,2 5,4* 0,3 5,0 - 5,4 -51,0

В(Ш) 6,0±0,2 5,9* 0,3 5,9-6,4 -39,8

АВ(1У) 6,8±0,05 6,8* 0,07 6,7 - 6,8 -29,2

у— глобулины (%)

0(1) 21,1±1,9 19,50** 3,7 19,2-26,6 +14,4

А(И) 22,8±0,1 22,8** 0,2 22,7 - 22.8 +16,7

В(Ш) 19,6±1,1 19,9** 2,2 19,4-21,8 +18,1

АВ(1У) 18,4±0,1 18,4 0,2 18,3 - 18,5 +12,5

р - достоверность различия показателей 0(1) - АВ(1У) групп крови до и по-

сле влияния силистронга *р=0,04, **р=0,01

Рисунок 1 - Электрофореграмма белков плазмы крови у лиц с 0(1) группой крови а-контроль; б-под влиянием силистронга

а

/ \ / V ^

/ ' уч. / V ___' \

___/ ч ^X__/

Рисунок 2 - Электрофореграмма белков плазмы крови у лиц со А(И) группой крови а-контроль; б-под влиянием силистронга

Рисунок 3 - Электрофореграмма белков плазмы крови у лиц с В(Ш) группой крови а-контроль; б-под влиянием силистронга

Силистронг вызывает изменение распределения белков плазмы крови по фракциям: перераспределение фракции (3-, у-глобулинов, «слияние» фракций (31- и (32-глобулинов. У лиц с гликопротеином А происходит перераспределение фракции а1- и а2-глобулинов. По-видимому, силистронг переориентируя заряд молекулы, вызывает изменение изоэлектрической точки белков.