Катионизация альбумина и изучение его взаимодействия с очагами патологии с применением радиоактивной метки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.01, кандидат биологических наук Деева, Валентина Семеновна

• Деева, Валентина Семеновна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Деева, Валентина Семеновна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Заряд нормальных и опухолевых животных клеток

1.2. Использование катионизированных структур в качестве носителей диагностических и терапевтических препаратов

1.3. Катионизированные белки, их терапевтическое использование и значение в медицинской практике

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Синтезы меченных радиоактивными изотопами соединений

2.2.2. Методы катионизации альбумина

2.2.3. Методы изучения механизма катионизации бычьего сывороточного альбуминана на QAE-сефадексе А50

2.2.4. Методы изучения взаимодействия альбумина с опухолевыми клетками экспериментальных животных

2.2.5. Методы изучения действия катионизированного бычьего сывороточного альбумина в опытах in vivo

2.2.6. Расчетные методы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование механизма катионизации бычьего сывороточного альбумина на QAE-сефадексе А 50

3.2. Взаимодействие катионизированного альбумина с клетками in

vitro

3.2.1. Сравнительное связывание альбумина, катионизирован-ного различными способами с клетками асцитной карциномы Эрлиха

3.2.2. Взаимодействие катионизированного альбумина с клетками различных опухолей экспериментальных животных

3.2.3. Взаимодействие катионизированного бычьего сывороточного альбумина с клетками асцитной опухоли Эрлиха, подвернутыми тепловому воздействию и гамма-облучению

3.3. Поведение катионизированного альбумина в организме экспериментальных животных

3.3.1. Распределение катионизированного бычьего сывороточного альбумина по органам и тканям животных с лимфомета-стазирующей тератокарциномой Льюиса

3.3.2. Связывание катионизированного бычьего сывороточного альбумина с суставной поверхностью коленных суставов крыс с индуцированным ревматоидным артритом

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Катионизация альбумина и изучение его взаимодействия с очагами патологии с применением радиоактивной метки»

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ. Целенаправленная доставка химиотерапевтиче-ских и радиофармацевтических препаратов к очагам патологии в организме является до настоящего времени одной из самых актуальных задач в медицинской практике. Селективная химиотерапия снижает побочное вредное действие лекарственных препаратов и позволяет снизить их расход. За счет более длительного удержания фармпрепаратов в очагах патологии упрощается процедура и стоимость лечения. Предлагаемые в настоящее время способы доставки лекарственных форм заключаются в применении различных носителей, задерживающихся в пораженном органе в силу биологических, физических или химических свойств, например, антител, липосом и других корпускулярных частиц, таких как альбуминовые микросферы [53]. Все эти способы доставки имеют ограниченное применение из-за присущих им недостатков.

Ряд известных свойств катионизированных белков (КБ) позволяет рассматривать их в качестве потенциальных носителей для лекарств. В работах, посвященных исследованию возможности использования КБ в качестве транспортеров химиотерапевтических и радиофармацевтических препаратов, показана их способность преодолевать гемато-энцефалический барьер и проникать в живую клетку. Однако, не изучена способность КБ доставлять химиопрепараты в очаг поражения, хотя для этого есть некоторые необхо-

димые предпосылки. Установлено, что в организме имеются участки ткани, обладающие ярко выраженным отрицательным зарядом, например, в гломе-рулах почек, в суставах, причем, тем больше, чем сильнее воспалительный процесс [20, 23, 29, 92]. По данным авторов, исследовавших поверхность клеточных мембран [122, 124] более выраженный по сравнению с нормальными клетками отрицательный заряд имеют мембраны опухолевых клеток.

Учитывая, что электростатическое взаимодействие противоположных зарядов является одним из самых сильных в физическом плане, целесообразно исследовать возможность модифицированного по заряду природного белка в качестве носителя лекарственных и (или) диагностических препаратов, имея ввиду, что положительно заряженный белок вступит в электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженными участками ткани в живом организме. Не исключено, что КБ могут оказаться полезными для оценки тяжести лучевого поражения, так как известно, что на облученных клетках отрицательный заряд изменяется количественно и, следовательно, изменится степень взаимодействия катионизированного белка с такими клетками.

Поскольку в качестве носителей предпочтительно использование распространенных в животном мире, присутствующих в больших количествах и легковыделяемых белков, то в качестве модели в нашем эксперименте использован бычий сывороточный альбумин.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Выяснить возможность создания носителя хими-опрепаратов и радионуклидов на основе катионизированного белка, пригодного для лечения патологических процессов в органах и тканях, содержащих более выраженные, по сравнению с остальными отрицательно заряженные участки (например, при артритах и некоторых онкологических заболеваниях).

ОСНОВНЫМИ ЗАДАЧАМИ данного исследования были:

1. Получить катионизированный разными химическими способами БСА.

2. Получить катионизированный БСА, меченный радиоактивными изотопами до, в процессе и после катионизации.

3. Изучить взаимодействие меченого кБСА с известными отрицательно заряженными участками в организме и в опытах in vitro:

- с поверхностями суставов в норме и при развитии ревматоидного артрита;

- с клетками АКЭ;

- с клетками других видов опухолей.

4. Для изучения возможности нехимического способа катионизации белка исследовать механизм феномена приобретения способности альбумина, пропущенного через QAE-сефадекс, реагировать с отрицательно заряженными структурами.

5. Изучить поведение катионизированного белка, меченного радиоактивным изотопом в опытах in vivo.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Разработана методика введения радиоактивной метки С14 на основе процесса катионизации белка. Методика может оказаться полезной в тех случаях, когда мягкое бета-излучение предпочтительнее

/125т 131Т\

жесткого гамма-излучения ( 1, 1).

Проведен сравнительный анализ взаимодействия катионизированного альбумина с различными видами опухолевых клеток при разных способах катионизации, а также с интактными, облученными и инактивированными высокой температурой клетками АКЭ.

Установлен механизм катионизации альбумина при хроматографирова-нии на QAE-сефадексе. Показано, что катионизация альбумина на QAE-сефадексе происходит путем взаимодействия положительно заряженного четвертичного аммонийного основания из постоянно вымывающихся с се-фадекса полисахаридов с карбоксильными группами белка, что приводит к появлению на белке избыточного положительного заряда.

При сравнении взаимодействия катионизированного и нативного БСА с тканью коленного сустава крыс с индуцированным ревматоидным артритом установлено, что связывание кБСА многократно выше, чем связывание нативного БСА. Результаты могут оказаться полезными для создания лечебных препаратов пролонгированного действия.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Установленная in vitro и подтвержденная in vivo способность катионизиро-

ванного альбумина взаимодействовать с опухолевыми клетками является предпосылкой для создания носителей лекарств на основе КБ. Закономерности взаимодействия катионизированного альбумина с суставными тканями могут быть использованы при разработке транспортеров препаратов для лечения и диагностики воспалительных заболеваний суставов. Раскрытие механизма катионизации, свидетельствующего о том, что в процессе хроматографии на С)АЕ-сефадексе альбумин может химически взаимодействовать с ионообменником следует учитывать при интерпретации экспериментальных данных и при получении белковых препаратов, применяемых в лечебных целях, в частности, при получении иммуноглобулинов для внутривенного введения.

ПУБЛИКАЦИИ. Материалы, изложенные в работе, оформлены в виде Д. статей, приняты к опубликованию 4 статьй.

Заключение диссертации по теме «Радиобиология», Деева, Валентина Семеновна

выводы

1. Разработана методика получения катионизированного этилглициновым эфиром бычьего сывороточного альбумина, по которой одновременно с ка-тионизацией в молекулу альбумина можно вводить радиоактивный изотоп 14С.

125

2. Введение радиоактивного иода I в молекулу катионизированного альбумина сильно уменьшает степень его катионизации, что следует учитывать при использовании радиоактивной метки в других катионизированных белках.

3. Обнаружено, что бычий сывороточный альбумин катионизируется при ионообменной хроматографии на QAE-сефадексе А50, а степень катионизации прямо зависит от рабочего объема матрицы сефадекса.

4. Установлено, что в результате элюирования через ионообменник альбумин катионизируется посредством блокады его свободных карбоксильных групп четвертичными аминогруппами водорастворимых фрагментов матрицы.

5. Показано, что катионизированный БСА с изоэлектрической точкой 6,5 -9,0 связывается с опухолевыми клетками in vitro при 37° и 4° С при различных концентрациях альбумина, а нативный БСА при этих же условиях с опухолевыми клетками не связывается.

6. Установлено, что степень связывания инактивированными тепловым воздействием (65-90°С, 15 мин) и гамма-облучением (2,5 и 25 Гр) опухолевыми клетками катионизированного бычьего сывороточного альбумина существенно ниже, чем связывание его с интактными опухолевыми клетками.

7. Показано, что адсорбция катионизированного БСА, введенного внутривенно мышам-опухоленосителям, опухолевой тканью ЛМТК в 1,5-2 раза выше, чем мышечной, и существенно выше адсорбции обеими тканями нативного БСА. Отмечено повышенное сродство альбумина к тимусу, а так же существенная разница в накоплении кБСА и БСА в легких с множественными метастазами (в 3,5 раза) и в щитовидной железе (в 3 раза).

8. Радионуклидным методом показано более эффективное (в 10 раз) удержание катионизированного альбумина по сравнению с нативным при его внутрисуставном введении в коленные суставы крыс с индуцированным артритом.

9. Результаты проведенных исследований могут служить основанием для создания диагностических и терапевтических препаратов пролонгированного действия, основанных на электростатическом взаимодействии между положительно заряженным белковым препаратом и отрицательно заряженным очагом патологии в организме.

115

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены результаты экспериментальных исследований катионизированного альбумина как возможного носителя терапевтических и/или диагностических препаратов к очагу патологии в живом организме. В круг решаемых проблем была включена также задача изучения влияния различных факторов на взаимодействие между отрицательно заряженным объектом в опытах in vitro и in vivo и положительно заряженным белком. К таким факторам относится влияние вводимого в молекулу радиоактивного изотопа на степень катионизации белка, зависимость степени ка-тионизации от модифицирующего белок агента, взаимодействие катионизированного белка с инактивированными клетками, появляющимися со временем в процессе инкубации, а также под воздействием повышенной температуры и облучения и ряд других факторов. Для достижения поставленной цели нами были получены различные препараты катионизированного различными агентами и способами альбумина: при химическом взаимодействии с этилендиамином, этилглициновым эфиром, а также в результате хроматографии через ионообменник QAE-сефадекс. В результате проведенной работы установлен механизм катионизации альбумина на ионообменнике типа QAE-сефадекс, отличающийся от предложенного ранее другими авторами. В качестве модельного нами выбран бычий сывороточный альбумин, как широко распространенный в природе и легко доступный в изучении белок.

Основной предпосылкой данной работы послужил тот факт, что электростатическое взаимодействие противоположных зарядов является одним из самых сильных в физическом плане. Поскольку в некоторых очагах патологии в живом организме имеются структуры, несущие на себе избыточный отрицательный заряд, то положительно заряженный белок должен избирательно с ними взаимодействовать.

В результате проведенной работы нам удалось показать, что степень ка-тионизации белка зависит от нуклеофильных свойств катионизирующего агента, поэтому, этилендиамин способен катионизировать белок в большей степени, чем этилглициновый эфир, что подтверждено значением их изо-электрических точек равным соответственно 9,0 и 6,5, а также результатами экспериментов по связывающей активности с опухолевыми клетками.

125

Введение в молекулу кБСА атома I существенно уменьшает степень ка-тионизации белка по сравнению с немеченым белком, либо меченным изотопом 14С, что необходимо учитывать при введении радиоактивной метки в катионизированный белок.

В данной работе установлен механизм катионизации альбумина на ионообменной смоле (^АЕ-сефадекс. Хроматография на ионообменниках широко применяется для деления различных, в том числе, ДНК-связывающих белков из сыворотки крови людей. Ранее была высказана гипотеза по механизму катионизации белков, согласно которой, в результате прохождения через ионообменник, белки протонируются. Предпосылкой для предложенного нами механизма катионизации белков на QAE-сефадексе явился установленный ранее факт [2] вымывания полисахаридов при непрерывном элюировании с колонки, наполненной сефадексом. Химическое строение QAE-сефадекса такое, что наряду с альдегидными и спиртовыми группами сахаридов в его молекуле есть четвертичная аминогруппа, т.е. на атоме азота присутствует положительный заряд. При элюировании через колонку карбоксильные группы белка блокируются четвертичными аминогруппами непрерывно вымываемых с QAE-сефадекса полисахаридов в результате реакции нуклео-фильного присоединения, и, таким образом, белковые молекулы приобретают избыточный положительный заряд. Предложенный нами механизм катионизации белков подтвержден и прямыми физико-химическими методами (ИК-спектроскопией) и по ДНК-связывающей активности. Установлено, что при больших объемах сефадекса и большой концентрации наносимого на л колонку белка около 0,4 мг/см связывающая активность альбумина, катио-низированного абсорбционно-хроматографическим методом оказалась даже выше, чем у альбумина, катионизированного этилендиамином с pl 9,0, что также подтверждает факт вымывания из сефадекса водорастворимых фрагментов полисахаридов, которые вступают в реакцию с белками, катионизи-руя их. Представленные результаты следует учитывать при интерпретации экспериментальных данных, полученных с помощью хроматографии на

QAE-сефадексе, а также при получении белковых препаратов, применяемых в лечебных целях (в частности, иммуноглобулинов для внутривенного введения). Хотя модифицированные белки составляют небольшую часть белковых препаратов, следует учитывать, что в процессе хроматографии на QAE-сефадексе в раствор белков поступают фрагменты матрицы, которые, попадая внутрь организма, могут вызывать нежелательный эффект.

Из экспериментов, поставленных in vitro с опухолевыми клетками, установлено, что кБСА связывается с клетками различных видов злокачественных опухолей: АКЭ, тимомы, J1MTK. На примере асцитной карциномы Эр-лиха показано, что степень связывания с клетками прямо зависит от степени катионизации альбумина. При катионизации на QAE-сефадексе основную часть белка (по массе) снимают с ионообменника при помощи 0,6-1М раствора NaCl (кБСА (IV)). При этом обнаружено, что эта фракция катионизи-рованного белка связывается гораздо слабее, чем нативный белок. На первый взгляд отсутствие связывающей активности у кБСА (VI) с клетками АКЭ, противоречит его большей ДНК-связывающей активности. Как мы предполагаем, это связано с понижающим степень катионизации действием радиоактивного атома иода, вводимого в молекулу пептида, а также и тем, что постоянно вымываемые положительно заряженные водорастворимые фрагменты матрицы сефадекса конкурируют в электростатическом взаимодействии с катионизированным белком, и "забивают" отрицательно заряженные участки поверхности клеток АКЭ. В случае взаимодействия с ДНК ВФМ не мешают взаимодействию с катионизированным альбумином т.к. на молекуле ДНК гораздо больше активных отрицательно заряженных центров.

Для оценки вклада метаболической активности опухолевых клеток в эффект связывания с кБСА изучено взаимодействие последнего с клетками ЛМТК при температурах 4° и 37°С. В отличие от нативного БСА, который при этих температурах практически не реагирует с ЛМТК, у кБСА четко прослеживается зависимость степени связывания от концентрации альбумина, но увеличение метаболической активности клеток при более высокой температуре практически не изменяет их адсорбционную способность, так как величина отрицательного заряда поверхности клетки остается постоянной и не зависит от температуры взаимодействия.

В результате применения химиотерапевтических препаратов, а также облучения в организме появляются инактивированные клетки, которые также могут в какой-то степени взаимодействовать с катионизированными белками, введенными в организм в качестве носителей препаратов. В связи с этим, нами было изучено связывание клеток, инактивированных высокой температурой и гамма-облучением с кБСА. Была изучена также выживаемость клеток в процессе их инкубирования. Получены результаты, которые свидетельствуют, что инактивированные клетки практически не взаимодействуют с кБСА, а значит, эффективность применяемого препарата предположительно будет довольно высокой, т.к. весь введенный препарат будет взаимодействовать только с интактными клетками.

В опытах in vivo было изучено распределение кБСА по различным органам и тканям животных-опухоленосителей по сравнению с нативным БСА. Отмечено существенное накопление кБСА в легком, пораженном множественными метастазами, а также преобладание адсорбции препарата опухолевой тканью по сравнению с мышечной. Результаты проведенного исследования указывают на то, что кБСА связывается с опухолевыми клетками в количествах гораздо больших, чем нативный БСА. Однако, следует отметить, что степень связывания кБСА опухолевыми клетками in vivo не является столь значительной, чтобы рассматривать кБСА как потенциальный носитель для доставки химиотерапевтических препаратов к опухолевым клеткам при внутривенном введении. Надо учитывать, кроме того, что в организме млекопитающих имеются в некоторых органах отрицательно заряженные участки ткани. Поэтому, использование носителя, основанного на принципе электростатического взаимодействия с мишенью, по-видимому, может осуществляться только для усиления эффективности носителей, основанных на иных принципах. Не исключено, что катионизированные носители окажутся более эффективными при внутриартериальном и/или регионарном введении.

Установлено, что более всего исследуемые препараты накапливаются в щитовидной железе и тимусе. В тимусе разница в накоплении кБСА и БСА мала, вероятно, из-за высокого сродства самого БСА к этому органу, тогда как в щитовидной железе кБСА накапливается с явным преимуществом.

Возможность использования кБСА при локальном введении в орган или ткань с избыточным отрицательным зврядом оценена нами на модели индуцированного РА. При сравнении поведения препаратов БСА и кБСА, введенных внутрисуставно, видно достоверное различие как в количестве удерживаемого пораженным суставом катионизированного препарата, так и во времени удержания этого препарата. Эти результаты могут оказаться полезными при создании на основе катионизированного альбумина транспортеров препаратов для лечения и диагностики воспалительных заболеваний суставов, а также препаратов пролонгированного действия за счет длительного их удержания в очаге поражения при регионарном введении.

Открывается еще один аспект использования катионизированных белков. Известно, что почки являются местом электростатического депонирования положительно заряженных иммунных комплексов и аутоантител, которые выступают как патогенетическое звено аутоиммунных заболеваний. В таких случаях, катионизированные белки можно использовать для блокирования отрицательно заряженных участков ткани почек, вследствие того, что катионизированные носители могут оказаться эффективными конкурентами за места депонирования, уменьшая тем самым в итоге тяжесть таких заболеваний, как, например, системная красная волчанка.

113

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Деева, Валентина Семеновна, 1998 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Деев В.Б., Сингин A.C., Королев Т.К., Каинова М.В., Чернов В.А., Сафонова Т.С. Синтез и особенности распределения проспидина-14С, меченного по диспиротрипиперазинию // Хим.-фарм. ж. - 1980. - Т. XIV.-№ 1.-С. 7-10.

2. Детерман Г. Гель-хроматография. М.: Мир, 1970. С. 49, с. 224.

3. Казицина Л.А., Куплетская Н.Б. Применение УФ-, ИК- и ЯМР-спектроскопии в органической химии. М.,Высшая школа, 1971. 264 с.

4. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. М.: Мед-гиз, 1962.

5. Мэррей А., Уильяме Д.Л. Синтезы органических соединений с изотопами углерода, М.: Иностранная литература, 1962. Т. 2, С. 131.

6. Новиченко Н.Л., Струк В.И. Аналитический микроэлектрофорез клеток и пути его использования в онкологических исследованиях // Экспер. онкология. - 1985. - Т. 3. - № 7. - С. 21-26.

7. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983, С. 20-35.

8. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, С. 301-304.

9. Плохитский H.A. Дисперсионный анализ. Новосибирск, 1960.

10. Поверенный A.M., Ротт Г.М., Сулаева Н.И., Леках И.В.. Саенко В.А., Подгородниченко В.К., Насонов E.JL, Цебецауэр JL, Насонова В.А. Взаимодействие иммуноглобулинов с заряженными биополимерами: значение в регуляции гуморального иммунитета. // Мол. биология. -1989.-Т. 23.-С. 153-164.

11. Подгородниченко В.К., Поверенный A.M., Джумаев Д.Б., Ауелбеков С.А., Асланов Х.А. ДНК-связывающие белки сыворотки крови человека. // Вопросы мед. химии. - 1982. - № 5. - С. 63-67.

12. Регионарная химиотерапия злокачественных опухолей. Под ред. Островерхова Г.Е., Трапезникова H.H. М.: Медицина, 1967, С. 89.

13. Рокитский Н.Ф. Введение в биологическую статистику. Минск: Высшая школа, 1978.

14. Ротт Г.М.. Подгородниченко В.К., Рожинская И.В., Новикова И.С. Анионообменная хроматография белков приводит к индукции в них ДНК-связывающей активности. // Мол. биология. - 1994. - Т.28. -Вып.2. - С.383-391.

15. Семина О.В., Семенец Т.Н., Подгородниченко В.К., Деева B.C., Поверенный A.M. Ингибирование селезеночного колониеобразования катионизированным сывороточным альбумином. // Иммунология. -1992.-№3.-С. 32-34.

16. Сулаева Н.И., Леках И.В., Поверенный A.M. Иммуноглобулины приобретают способность взаимодействовать с ДНК после хроматогра-фирования на QAE-сефадексе. // Биохимия. - 1986. - Т. 51. - С. 574578.

17. Ackerman G.A., Surface differentiation of hemopoietic cells demonstrated ultrastructurally with cationized ferritin. // Cell Tissue Res. - 1975. - V. 159.-P. 23.

18. Agodoa L.Y., Mannik M. Removal of subepithelial immune complexes with excess unaltered or cationic antigen. // Kidney Int. - 1987. - V.32. -№1.-P. 13-18. i

19. Aston W.P., Ward T.L., Cooke T.D.V. The specific in vitro antibody mediated retention of bovin serum albumin by parcine hyaline articular cartilage. // Clin. exp. Immunol. - 1983. - V.52. - P. 280.

20. Badsford S.R., Takamiya H., Vogt A. A model of in situ immune complex glomerulonephritis in the rat employed cationized ferritin. // Clin. Nephrol. (Tokyo). - 1980. - V. 14. - P. 211-216.

21. Behr T.M., Sharkey R.M., Juweid M.E., Blumenthal R.D., Dunn R.M., Griffiths G.L., Bair H.J., Wolf F.G., Becker W.S., Goldenberg D.M. Reduction of the renal uptake of radiolabeled monoclonal antibody fragments by cationic amino acids and their derivatives. // Cancer Res. -1995 Sep 1. - V.55. - № 17. - P. 3825-3834.

22. Van den Berg W.B., van Lent P.L.E.M., van de Putte L.B.A., Zwarts W.A. Electrical charge of hyaline articular cartilage: its role in the retention of anionic and cationic proteins. // Clin. Immunopath. - 1986. - V. 39. - P. 187-197.

23. Van den Berg W.B., van de Putte L.B.A., Zwarts W.A., Joosten L.A.B. Electrical charge of the antigen determines intraarticular antigen handling and chronicity of arthritis in mice. // J. Clin. Invest. - 1984. - V. 74. - P. 1850-1859.

24. Bernard A., Ouled Amor A., Lauwerys R. Charge-dependent renal uptake of beta 2-microglobulin in concious rats. // Scand. J. Clin. Lab. Invest. -1992 Sep. - V. 52 - № 5. - P.415-423.

25. Bickel U., Lee V.M., Trojanovski J.Q.,Pardrige W.M. Development and in vitro characterization of a cationized monoclonal antibody against beta A4 protein: a potential probe for Alzheimer's disease. // Bioconjugate Chem. - 1994 Mar-Apr. - V. 5. - №2. - P.l 19-125/

26. Bolton E.A. Amersham, radiochemical reviews. - 1977 ( Radioiodination techniques, Rev. 18 ). - P.45-48.

27. Bolton A.E.,Hunter W.M. Bolton-Hunter-reagent for iodination of proteins. // Biochem. J. - 1973. - V. 133. - P. 529-539.

28. Border W.A.J., Ward H.J., Kamil E.S., Cochen A.H. Inducation of membranous nephropathy in rabbits by administration of an exogenous

cationic antigen. Demonstration of a role for electrical charge. // J. Clin. Invest. - 1969.-P. 451-461.

29. Border W.A., Ward H.I., Kamil E.S., Cochen A.H. Induction of membranous nephropathy in rabbits by administration of an exogenous cationic antigen. // J. Clin. Invest. - 1982. - V. 69. - P. 451-467.

30. Brackertz D., Mitchell G.F., Mackey I.R. Antigen-induced arthritis in mice. I. Induction of arthritis in various strains of mice. // Arthritis Rheum. - 1977. -V. 20. - P. 841-850.

31. Burger J J., Tomlinson E., Mulder E.M.A., Me Vie J.G. Albumine microspheres for intraarterial tumor targetting. I. Pharmaceutical aspects. // Int. J. Pharmaceutics. - 1985. - V. 23. - P. 333-344.

32. Burry R.W., Wood J.G. Contributions of lipids and proteins to the surface charge of membranes. // J. Cell Biol. - 1979. - V. 82. - P. 726.

33. Carter H.B., Partin A.W., Coffey D.S. Prediction of metastatic potential in an animal model of prostate cancer: flow cytometric quantification of cell surface charge. // J. Urology. - 1989 Nov.- V. 142. - № 5. - P. 1338-1341.

34. Chan E.K., Boyd N.D., Alexander F., Barabas A.Z., Lannigan R. Effect of cationic proteins on the glomerular deposition of anionic proteins and immune complexes. // Nephron. - 1986. - V. 43. - № 2. - P. 93-104.

35. Chen A., Chou W.Y., Ding S.L., Shaio M.F. Glomerular localization of nefritogenic protein complexes on a nonimmunologic basis. // Lab. Invest.

- 1992 Aug. - V. 67. - № 2. - P. 175-185.

36. Consder R., Doble A., Glynn L.E., Nind A.P. Production of chronic arthritis with ovalbumin. Its retention in the rabbit knee jont. // Ann. Rhuem. Dis. - 1971. - V. 30. - P. 107.

37. Cook T.D., Jasin H.E. The pathogenesis of chronic inflammation in experimental antigen-induced arthritis. I. The role of antigen on the local immune response. // Arthritis Rheum. - 1972. - V. 22. - P. 1416.

38. Currie G.A., Bagshawe K.D. The role of sialic acid in antigenic expession. Futher studies of Lanshutz ascite tumor. // Brit. J. Cancer. - 1967. - V.22. -№ 4. - P. 843-883.

39. Danon D., Goldstein L., Marikovsky Y., Skutelsky E. Use of cationized ferritin as a label of negative charges of cell surface. // J. Ultrastruct. Res.

- 1972.-V. 38.-P. 500-510.

40. Domen P.L., Muckerheide A.,Michael J.G. Cationization of protein antigens. III. Abrogation of oral tolerance. // J. Immun. - 1987 Nov. - V. 139.-№ 10.-P. 3195-3198.

41. Ekrami H., Kennedy A.R., Witschi H., Shen W.C. Cationized Bowman-Birk protease inhibitor as a targeted cancer chemopreventive agent. // J. Drug Targeting. - 1993. - V. 1. - № 1. - P. 41-49.

42. Faaber P., Capel PJ.A.,Rijke G.P.M., Vierwinden G., van de Putte L.B.A., Koene R.A.P. Cross-reactivity of anti-DNA antibodies with proteoglycans. // Clin. Exp. Immunol. - 1984. - V.55. - P. 502-508.

43. Farmer J.L., Roberts L.A., Rydzinski M.E., Hilty M.D. Human immune response to cationized protein. I. Characterization of the in vitro response to cationized diphtheria toxoid. // Cell. Immunol. - 1993 Jan. - V. 146. -№1. - P. 186-197.

44. Farmer J.L., Roberts L.A., Rydzinski M.E.,Hilty M.D. Humen immune response to cationized proteins. II. Characterization of interaction of cationized diphtheria toxoid with human mononuclear cells. // Cell. Immunol. - 1993. - V. 146. - № 1. - P. 198-209.

45. Fujita T., Nishikawa M., Ohno J., Takakura Y., Sezaki H., Hashida M. Control of in vivo fate of albumin derivatives utilizing combined chemical modification. // J. Drug Targeting. - 1994. - V. 2. - № 2. - P. 157-165.

46. Gallo G.R., Caulin-Glaser T., Lamn M.E. Charge of circulating immune complexes as a factor in glomerular basement membrane localizating. //J. Clin. Invest. -1981. - V. 67. - P. 1305.

47. Gauthier V.J., Mannik M., Striker G.E. Effect of cationized antibodies in preformed immune complexes on deposition and persistence in renal glomeruli. // J. Exp. Med. - 1982. - V. 156. - P.766-777.

48. Gauthier V.J., Mannik M. A small proportion of cationic antibodies in immune complexes is sufficient to mediate their deposition in glomeruli. // J. Immun. - 1990. - V. 145. - №> 10. - P. 3348-3352.

49. Geffner J.R., Trevani A.S., Malchiodi E., Serebrinsky G.P., Isturiz M.A. Neurophil cytotoxicity induced by immune complexes prepared with cationized antibodies. // Scand. J. Immunol. - 1993. - V. 37. - № 2. - P. 187-193.

50. Geffner J.R., Trevani A.S., Schatner M., Malchiodi E., Lopez D.H., Lazzari M. Activation of human neurophils and monocytes induced by immune complexes prepared with cationized antibodies or antigens. // Clin. Immunol. Immunopath. - 1993. - V. 69. - № 1. - P. 9-15.

51. Gell filtration. Theory and Practice. Uppsala, Pharmacia. 1984.

52. Gersten D.M., Bosmann H.B. // Exp. Cell Res. - 1975. - V. 96. - P. 215.

53. Ghassabian S., Ehtezazi T., Forutan S.M., Mortazavi S.A. Dexamethasone-loaded magnetic albumin microspheres: preparation and in vivo release. // Int. J. Pharmaceutics. - 1996. - V. 130. - №1.- P. 49-55.

54. Ghitescu L., Desjardins M., Bendayan M. Immunocytochemical study of glomerular permeability to anionic, neutral and cationic albumins. // Kidney Int. - 1992. - V. 42. - №1. - P. 25-32.

55. Granath K., James A.T., Morris L.J. ( Ed.). New biochemical separation. -London.- 1963.-P. 111.

56. Gregoriadis G. Targeting of druges. // Nature. - 1977. - V. 265. - P. 407411.

57. Habeeb A.T.S.A. Determination of free amino groups in protein by trinitrobenzen-sulfonic acid. // Anal. Biochem. - 1966. - V. 14. - P. 328333.

58. Helling F., Livingston P.O. Ganglioside conjugate vaccines. Immunotherapy against tumors of neuroectodermal origin. [Review]. // Mol. Chem. Neuropath. - 1994. - V. 21. - № 2-3. - P. 299-309.

59. Hirata M., Zhong J., Wright S.C., Larric J.W. Structure and functions of endotoxin-binding peptides derived from CAP 18. // Prog. Clin. Biol. Res. - 1995.-V. 392.-P. 317-326.

60. Hoare D.G., Koshland D.E. // J. Amer. Chem. Soc. - 1966. - V. 88. - P. 2057.

61. Hoare D.G., Koshland D.E. A metod for the quantitative modification and estimation of carboxylic acid groups in proteins. // J. Biol. Chem. - 1967. -V. 242. - №10. - P. 2447-2453.

62. Huang L., Farhood H., Serbina N., Teepe A.G., Barsoum J. Endosomolytic activity of cationic liposomes enhances the delivery of human immunodeficiency virus-1 trans-activator protein (TAT) to mammalian cells. // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1995. - V. 217. № 3. - P. 761768.

63. Hunter W.M., Greenwood F.C. Preparation of iodine-131-labelled human growth of high specific activity. // Nuture (London). - 1962. - V. 194. - P. 495.

64. Kaneko Y., Tsukamoto A. Structural characteristics of cationic liposomes with potent enhancing effect on retroviral transduction into human hepatoma cells. // Cancer Letters. - 1996. - V. 107. - № 2. - P. 211-215.

65. Kang Y.S., Pardridge W.M. Brain delivery of biotin to a conjugate of neutral avidin and cationized human albumin. // Pharmac. Res. - 1994. - V. 11.-№9.-P. 1257-1264.

66. Keystone E.C., Schalemmer H.U., Pope C., Allmon A.C. Zymozan-induced arthritis. A model of chronic proliferative arthritis following activation of the alternative pathway of cjmpliment. // Artha. and Rheum. -1977. - V. 20. - № 7. - P. 1396-1401.

67. Kikushi A., Sugnaya S., Ueda H., Tanaka K., Aramaki Y., Hara T., Arima H., Tsuchiya S., Fuwa T. Efficient gene transfer to EGF receptor overexpressing cancer cells by means of EGF- labeled cationic liposomes. // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1996. - V. 227. - №3. - P.666-671.

68. Kobayashi Y., Maniki M., Nakamura K. Cationic chlorophyl derivatives with SOD mimicking activity suppress the proliferation of human ovarian cancer cells. // Cancer Biother. Radiopharmac. - 1996. - V. 11. - № 3. - P. 197-202.

69. Koyama A., Inage H., Kobayashi M., Nakamura H., Narita M., Tojo S. Effect of chemical modification of antigen on characteristics of immune complexes and their glomerular localization in the murine renal tissues. // Immunol. - 1986. - V. 58. - № 4. - P. 535-540.

70. Koyama A., Inaga H., Kobayashi M., Ohta Y., Narita M., Tojo S., Cameron J.S. Role of antigenic chardge and antibody avidity on the glomerular immune complex localization in serum sickness of mice. // Clin. Exp. Immunol. - 1986. - V. 64. - № 3. - P. 606-614.

71. Koyama A., Inage H., Kobayashi M., Narita M., Tojo S. Effect of chemical cationozation of antigen on glomerular localization of immune complexes in active models of serum sickness nephritis in rabbits. // Immunol. - 1986. - V. 58. - № 4. - P. 529-534.

72. Krant J.D., Gauthier V.J., Mannic M. Deposition of immune complexes contaning cationized antibodies in myocardial small blood vessels of mice. // J. Clin. Immunol. - 1989. - V. 50. - P. 241-250.

73. Kubasova T., Koteles G.J., Varga L.P. // J. Radiat. Biol. - 1981. - V. 40. -P. 187.

74. Kubasova T., Koteles G.J., Varga L.P. In cell membrane probes as biological indicators in radiation accidets. // IAEA - TECDOC - 1982. - V. 273.-P. 113.

75. Kubasova T., Varga L.P., Koteles GJ. // Int. J. Radiat. Biol. - 1981. - V. 40.-P. 175.

76. Kubosawo H., Nakayama H., Sano T., Kondo Y. Morphological alterations of glomerulus induced by infusion of cationized ferritin. // Acta Pathol. Jap. - 1993. - V. - 43. - № 9. - P. 445-455.

77. Kumagai A.K., Eisenberg J.B.,Pardridge W.M. Absorptive-mediated endocytosis of cationized albumin and a beta-endorphin-cationized albumin chimeric peptide by isolated brain capillaries. Model system of blood-brain barrier transport. // J. Biol. Chem. - 1987. - V. 262. - № 31. -P.15214-15219.

78. Laemli V. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. //Nature. - 1970. - V. 277. - P. 680-685.

79. van Lent P.L.E.M., van den Berg W.B., van den Broek F.M., van de Putte L.B.A. The role of antigene electric charge in the development of chronic arthritis. // Agents and Action. - 1986. - V. 19. - № 5/9. - P. 325-327.

80. van Lent P.L., van den Berg W.B., Schalkwijk J., van de Putte L.B., van den Bersselaar L. Allergic arthritis induced by cationic antigens: relationship of chronicity with antigen retention and T-cell reactivity. // Immunol. - 1987. - V. 62. - № 2. - P. 265-272.

81. van Lent P.L., Dekker C., Mosterd J., van den Bersselaar L., van den Berg W.B. Allergic arthritis induced by cationic proteins: role of molecular weight. // Immunol. - 1989. - V. 67. - № 4. - P. 447-452.

82. Lloyd C.W. Sialic acid and socual behavior of cells. // Biol. Rew. - 1975. -V. 50.-№3.-P. 325-350.

83. Malamud D., Drysdale J.W. Isoelectric points of proteins: a table. // Anal. Biochem. - 1978. - V. 86. - P. 620-647.

84. Marikovsky Y., Resnitzky R., Reiman N. // J. Natl. Cancer Inst. - 1978. -V. 60.-P. 741.

85. Marikovsky Y., Wang L., Inbar M. // Exp. Cell Biol. - 1983. - V. 51. - P. 242.

86. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganismus. // J. Mol. Biol. - 1961. - V. 3. - P. 208-210.

87. Mehrishi J.N. Molecular aspects of the mammalian cell surface. // Prog. Biophys. Mol. Biol. - 1972. - V. 25. - P.l.

88. Muckerheid A., Apple R.J., Pesce A.J., Michael J.G. Cationization of protein antigens. I. Alteration of immunogenic properties. // J.Immunol. -1987. - V. 138. - № 3. - P. 833-837.

89. Muckerheide A., Domen P.L., Michael J.G. Cationization of protein antigens. II. Alteration of regulatory properties. // J. Immunol. - 1987. - V. 138.-№ 9.-P. 2800-2804.

90. Muckerheide A., Pesce A J., Michael J.G. Cationization of protein antigens. V. Effect of the degree of cationization on patterns of immune responsiveness. // Cell. Immunol. - 1990. - V. 127. - № 1. - P. 67-77.

91. Murphy B.F., d'Apice A .J., Becker G.J., Dowling J.P., Kincaid-Smith P.S. Serum sickness nephropathy in the rat using cationized albumin: effect of preimmunization and antigen dose. // Pathology. - 1987. - V. 19. - № 3. -P. 285-289.

92. Mutsaers S.E., Papadimitriou J.M. Surface charge of macrophages and their interaction with charged particles. // J. of Leukocyte Biol. - 1988. -V.44.-P. 17-26.

93. Myazawa T., Sato C., Kojima K. // Rad. Res. - 1979. - V. 79. - P. 622.

94. Oite T., Shimizu F., Kagami S., Morioka T. Hapten-specific cellular immune response producing glomerular injury. // Clin. Exp. Immunol. -1989. - V. 76. - № 3. - P. 463-468.

95. Pambakian S., Poston R.N. The binding of immunoglobulin Fc to cationic proteins. // Clin. Exp. Immunol. - 1987. - V. 68. - P. 402-408.

96. Papadimitrion J.M. An assesment of the surface charge of single resident and exudate macrophages and multinucleate giant cells. // J. Pathol. -1982.-V. 138.-P. 17.

97. Pardridge W.M., Bickel U., Buciak J., Yang J., Diagne A., Aepinus C. Cationization of a monoclonal antibody to the human immunodeficiency

virus REV protein enhances cellular uptake but does not impair antigen binding of the antibody. // Immunol. Letters. - 1994. - V. 42. - № 3. - P. 191-195.

98. Pardridge W.M., Bickel U., Buciak J., Yang J., Diagne A. Enchenced endocytosis and anti-human immunodeficiency virus typel activity of anti-REV antibodies after cationization. // J. Infect. Diseases. - 1994. - V. 169. -№ 1.- P. 55-61.

99. Pardridge W.M., Buciak J., Diagne A. Treatment of human immunodeficiency virus-infected lymphocytes with cationized human immunoglobulins. // J..Infect. Diseases. - 1994. - V. 170. - № 3. - P. 563569.

100. Pardridge W.M., Kang Y.S., Diagne A., Zack J.A. Cationized

hyperimmune immunoglobulins: Pharmacokinetics, toxicity evaluation

( 1

and treatment og human immunodeficiency virus-infected human-

Pharmac. Exp. Therap. - 1996. - V. 276. - № 1. - P. 246-252/ 101. Pardridge W.M., Kang Y.S., Yang J., Buciak J.L. Enhanced cellular uptake and in vivo biodistribution of a monoclonal antibody following cationization. // J. PWmac. Sci. - 1995. - V. 84. - № 8. - P. 943-948.

blood lymphocytes combined immune deficiency mice. // J.

102. Pardridge W.M., Triguero D., Buciak J. Transport of histone through the blood-bain barrier. // J. Pharm. Exp. Therap. - 1989. - V. 251. - № 3. - P. 821-826.

103. Pardridge W.M., Trieguero D., Buciak J., Yang J. Evalution of cationized rat albumin as a potential blood-brain barrier drug transport vector. // J. Pharmac. Exp. Therap. - 1990. - V. 255. - № 2. - P. 893-899.

104. Pearlstein E., Salk P.I., Yogeeswaran G., Karpatkin S. Correlation between spontaneous metastatic potential, plate-aggregating activity of cell surface extracts and cell surface sialylation in 10 metastatic-variant derivatives of a renal sarcoma cell line. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA -1980. - V. - 77. - № 7. - P. 4336-4339.

105. Purtell J.N., Pesce A.J., Clyne D.H., Miller W.C., Pollak V.E. Isoelectric point of albumin. Effect on the renal handling of albumin. // Kidney Int. -1979.-V. 16. - P.366-376.

106. Sato C., Kojima K., Nishizawa K. Target of irradiation and decrease of cell surface charge of erythrocytes. // Rad. Res. - 1977. - V. 69. - № 2. - P. 367-374.

107. Sato C., Kojima K., Nishizava K. Translocation of hyalurinic acid in cell surface of cultured mammalian cells after X-irradiation and its recovery by added adenosine triphosphate. // Biochim. Biophys. Acta. - 1977. - V. 470. . p. 446-452.

108. Sato C., Kojima K., Nishizawa K., Shimizu S., Inoue M. Translocation of hyaluronic acid in cell surface of cultured mammalian cells after X-irradiation and its recovery by added adenosine triphosphate. // Biochim. Biophys. Acta. - 1976. - V. 448. - P. 379.

109. Schattner M., Lazzari M., Trevani A.S.,Malchiodi E., Kempfer A.C., Isturiz M.A., Geffner J.R. Activation of human platelets by immune complexes prepared with cationized human Ig G. // Blood. - 1993. - V. 82. -№ 10. -P. 3045-3051.

110. Sephadex ion exchengers. A Guide to ion exchange chromatography. Pharmacia fine chemicals. - Uppsala. Sweden. - 1970. - P. 47.

111. Simionescu M., Simeonescu N., Silbert J.E., Palade G.E. Differentiated microdomains on the luminal surface of the capillary endothelium. II. Partial characterization of their anionic sites.'// J. Cell Biol. - 1981. - V. 90.-P. 614.

112. Smetana K. Jr., Vytasek R., Stol M. Electrostatic interaction influences ' cell adhesion? - // Int. J. Hematol. - 1992. - V. 56. - № 3. - P. 219-223.

113. Smith K.R., Borchardt R.T. Permeability and mechanism of albumin, cationized albumin, and glycozylated albumin transcellular transport across monolayers of cultured bovine brain capillary endothelial cells. // Pharmac. Res. - 1989. - V. 6. - № 6. - P. 466-473.

114. Somosy Z., Kubasova T., Ecsedi G.S., Koteles G.J. Radiation-induced of negative charge on the cell surface of primery human fibroblasts. // Int. J. Rad. Biol. Rel. Studies Phys., Chem., Med. - 1986. - V. 49. - № 6. - P. 969-978.

115. Somosy Z., Kubasova T., Koteles G.J. The effects of low doses of ionizing radiation upon the micromorphology and functional state of ceil surface. // Scan. Microscopy. - 1987. - V. 1. - № 3. - P. 1267-1278.

116. Stein G., Seaman G.V.F., Heard D.H. // Nature. - 1962. - V. 193. - P. 238.

117. Subjeck J.R., Hui S.W., Jonson R.J.R. A quantitative electron microscopic assay for radiation damage other cells plasma membrane.// Brit. J. Cancer. - 1980. - V. 41. - Suppl.IV. - P. 159.

118. Sungurov A.Yu., Tokalov S.V.,Petrov Yu.P., Sharlaeva T.M. // Stud. Biophys. - 1985. - V. 107. - P. 127.

119. Sungurov A.Yu., Tokalov S.V., Mazul V.M., Resunkova O.P., Sharlaeva T.M. // Stud. Biophys. - 1985. - V. 107. - P. 133.

120. Suzuki N., Harada T., Mihara S., Sakane T. Characterization of a germline Vk gene encoding cationic anti-DNA antibody and role of receptor editing for development of the autoantibody in patients with systemic lupus erythematosus. // J. Clin. Invest. - 1996. - V. 98. - № 8. - P. 1843-1850.

121. Szala S., Missol E., Sochanik" A., Stozyk M. The use of cationic liposomes DC-CHOL/DOPE and DDAB/DOPE for direct transfer of

Escherichia coli cytosine deaminase gene into growing melanoma tumors. //Gene Therapy.- 1996.-V.3.-№ 11.-P. 1026-1031.

122. Terasaki T., Izawa M.,Shimosato Y. // Cell Struct. Func. - 1986. - V. 11. -P. 43.

123. Terasaki T., Shimosato Y., Izawa M., Miyamoto K. // J. Clin. Invest. -1982.-V. 69.-P. 451.

124. Terasaki T., Shimosato Y., Izawa M., Miyamoto K. Negatively charged Rnase-susceptible molecules on the surface of ascites tumor cells. // Ctll StructFunc. - 1983. - V. 8. - № 3. - P. 233-244/

125. Thorsell A., Blomqvist A.G., Heilig M. Cationic lipid-mediated delivery and expression of prepro-neuropeptide Y cDNA after itraventricular administration in rat: Feasibility and limitations. // Regulatory Peptides. -1996.-V. 61.-№3.-P. 205-211.

126. Triguero D., Buciak J., Pardridge W.M. Capillary depletion method for quantification of blood-brain barrier transport of circulating peptides and plasma proteins. // J. Nephrochem. - 1990. - V. 54. - № 6. - P. 1882-1888.

127. Triguero D., Buciak J.B., Yang J., Pardridge W.M. Blood-brain barrier transport of cationized immunoglobulin G: enhanced delivery compared to native protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989. - V. 86.- № 12. - P. 4761-4765.

128. Urizar R.E., Cerda J., Reilly A. Glomerulitits induced by cationized bovin serum albumin in the rat. // Pediatr. Nephrol. - 1989. - V. 3. - № 2. - P. 149-155.

129. Vranska Ts. G., Pantev T.P., Nicolov I.T., Ryshov N.I., Popov V.I. // Int. J. Rad. Biol. - 1981. - V. 40. - P. 455.

130. Wadhwani K.C., Shimon-Hophy M., Rapoport S.I. Enchanced permeabilities of cationized-bovine serum albumins at the blood-nerve and blood-brain barriers in awake rats. // J. Neurosci. Res. - 1992. - V. 32. -№3. -P.407-414.

131. Wattiaux R., Jadot M., Laurent N., Dubois F., Deconinck S.W. Cationic lihides delay the transfer of plasmid DNA to lysosomes. // Biochem. Biophys. Res. Comm. - 1996. - V. 227. - № 2. - P. 448-454.

132. Weiss L. The cell periphery. // Int. Rev. Cytol. - 1969. - V. 26. - P. 63.

133. Wheeler C.J., Feigner P.L., Tsai Y.J., Marshall J., Sukhu L., Doh S.G., Hartikka J., Nietupski J., Manthorpe M., Nichols M., Plewe M., Liang X.W., Norman J., Smith A., Cheng S.H. A novel cationic lipid greatly enhances plasmid DNA delivery and expression in mouse lung. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1996. - V. 93. - № 21. - P. 11454-11459.