Каталитические свойства глутамин (аспарагин) азы из Рseudomonas Aurantiаca BKM-548 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кабанова, Елена Алексеевна

• Кабанова, Елена Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кабанова, Елена Алексеевна

Список сокращений и обозначений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. Общие сведения о глутамин (аспарагин) азах

1.1. Методы выделения и очистки глутамин-(аспарагин)аз.II

1.2. Влияние физико-химических факторов на активность и стабильность дезамидаз

ГЛАВА 2. Исследования структуры дезамидаз

2.1. Молекулярная масса и субъединичное строение.

2.2. Аминокислотный состав и первичная структура.

2.3. функциональные группы активного центра и их модификация.

ГЛАВА 3. Субстратная специфичность и ингибиторы глутамин(аспарагин)аз

3.1. Реакции, катализируемые глутамин(ас-парагин)азами

3.2. Константы Михаэлиса.

3.3. Механизм действия.

3.4. Аффинные метки.

3.5. Обратимые ингибиторы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 4. Соединения, использованные в работе

4.1. Реактивы и их очистка

4.2. Очистка глутамин (аспарагин) азы. а) Источник выделения фермента. б) Культивирование микроорганизма в) Приготовление ацетонового порошка г) Выделение фермента. д) Доказательство гомогенности фермента с помощью диск-электрофореза.

ГЛАВА 5. Методы определения белка и активности фермента

5.1. Определение белка

5.2. Определение активности с помощью реактива Несслера.

5.3. Определение активности с помощью глутаматдегидрогеназы.

5.4. Определение активности в реакциях гидролиза и синтеза гидроксаматов дикарбоновых аминокислот

ГЛАВА 6. Исследование каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы

6.1. Субстратная специфичность.

6.2. Влияние концентрации субстратов на скорость реакций гидролиза и гидро-ксиламинолиза.

6.3. Влияние рН и температуры на активность и стабильность фермента

6.4. Действие Ь-глутамата на процесс тепловой инактивации фермента

6.5. Влияние катионов металлов и метаболитов на ферментативную активность.

6.6. Ингибирование фермента дикарбоновыми аминокислотами.

6.7. Кинетика инактивации глутамин(аспара-гин)азы под действием ДОН и азасерина.

6.8. Влияние рН и температуры на инактивацию фермента под действием

ДОН яр

6.9. Влияние лигандов на ингибирование фермента ДОН.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 7. Исследование оптимальных условий функционирования глутамин(аспарагин)азы

7.1. Влияние рН и температуры на активность и стабильность глутамин(аспарагин)азы ^ gg

7.2. Регуляция активности глутамин(аспарагин) азы .QQ а) Влияние метаболитов на активность фермента. б) Влияние катионов металлов на активность фермента. gj

ГЛАВА 8. Изучение взаимодействия фермента с эффекторами в условиях термоинактивации

8.1. Кинетика инактивации фермента при

50° в присутствии ь -глутамата

8.2. Влияние структуры эффекторов на тепловую стабильность фермента . . . юо

ГЛАВА 9. Субстратная специфичность глутамин(аспарагин) азы

9.1. Реакции гидролиза. Определение для ь-глутамина и l -аспарагина

9.2. Трансферазные реакции.

9.3. Влияние рН на гидролиз и синтез гидроксамовых кислот

9.4. Зависимость скорости трансферазной реакции от концентрации субстратов

ГЛАВА 10. Исследование каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы методами ингибиторного анализа

10.1. Влияние аналогов субстратов и продуктов на ферментативную активность.

10.2. Определение кинетики процесса ингибирования фермента ДОН и азасерином.

10.3. Изучение взаимодействия фермента с L-аспартатом в условиях инактивации ДОН.

10.4. Влияние структуры аналогов субстратов на инактивацию фермента под действием ДОН.

10.5. Влияние температуры и рН на ингибирование фермента ДОН

10.6. Влияние органических кислот и их аналогов на взаимодействие фермента с ДОН.

10.7. Стабилизация фермента от инактивации при низких значениях рН

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Каталитические свойства глутамин (аспарагин) азы из Рseudomonas Aurantiаca BKM-548»

Данная работа является частью исследования структуры и функций антиопухолевых ферментов, проводимого по заданию Госкомитета СССР по науке и технике и имеет номер государственной регистрации 01.830062362.

Глутамин(аспарагин)аза ( ь -глутамин-( ь -аспарагин) амидо-гидролаза, КФ 3.5.1.38)£TJ является перспективным антиопухолевым ферментом и представляет большой интерес для клинической онкологии. Предварительная положительная оценка пригодности фермента для клинических испытаний предполагает знание особенностей его каталитического действия. Изучение глутамин(аспарагин)азы имеет поэтому не только важное теоретическое значение с точки зрения зависимости между структурой и функцией, а также с точки зрения эволюционной биохимии микроорганизмов, животных и растений, но и несомненное прикладное назначение.

Целью настоящей работы было изучение особенностей каталитического действия глутамин(аспарагин)азы, выделенной из отечественного продуцента Ps. aurantiaea ВКМ-548.

Поставленная цель определила следующие основные задачи:

1. Определение оптимальных условий функционирования фермента.

2. Исследование регуляции активности фермента; поиск специфических активаторов и ингибиторов.

3. Изучение условий стабилизации фермента при тепловой инактивации.

4. Изучение субстратной специфичности фермента.

В качестве объекта исследования использовали гомогенный препарат глутамин(аспарагин)азы, полученный по разработанному ранее в лаборатории методу из Ps. aurantiaca ВКМ-548 /"34,35^7.

Научная новизна работы заключается в выяснении основных каталитических свойств глутамин(аспарагин)азы в соответствии с поставленными задачами, в том числе условий стабилизации и особенностей взаимодействия фермента с эффекторами. В работе приведены экспериментальные доказательства того, что ДОН и азасерин являются аффинными ингибиторами глутамин(аспарагин)азы. Установлено, что фермент удовлетворяет основным требованиям первичного отбора ферментов, пригодных для испытания на антиопухолевую активность: проявляет высокую каталитическую активность и стабильность при физиологических значениях рН, имеет низкие значения кт для ь-глу-тамина и l -аспарагина и относительно невысокое сродство к продуктам реакции. К особенностям действия фермента относятся высокий температурный оптимум (55-70°), отсутствие активации ионами металлов и метаболитами цикла Кребса. Показано, что повышение термостабильности фермента, вызванное рядом аминокислот, обусловлено связыванием заряженных -амино- и <х -карбоксильных групп эффекторов с молекулой фермента. Обнаружена способность глутамин (аспарагин) азы в кислой области рН связывать дикарбоновые оксикисло-ты (цитрат и dl -малат); получены доказательства, что dl-ма-лат присоединяется к активному центру фермента.

Установление этих важнейших свойств фермента служит основой для дальнейшего изучения структуры и механизма действия глутамин-(аспарагин)азы. Выяснение механизмов регуляции активности глутамин (аспарагин) азы в присутствии субстратов, аналогов субстратов и продуктов реакции несомненно будет способствовать решению проблемы клинического применения фермента в терапии опухолей.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кабанова, Елена Алексеевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что глутамин(аспарагин)аза из Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548 проявляет максимальную активность и стабильность в области физиологических значений рН; температурный оптимум действия фермента 55-70°.

2. Показано, что для субстратной специфичности фермента характерны следующие черты:

- фермент с высокой скоростью катализирует гидролиз ь -глута-мина (к^а 5,3-Ю"6 М) и L-аспарагина ( Кт= 5,7-Ю"6 М) и с несколько меньшей скоростью гидролиз их D-изомеров;

- субстратами фермента являются L -глутамил- ^-моногидрокса-мовая кислота и ь-аспартил- f>-гидроксамовая кислота;

- фермент с низкими скоростями катализирует гидролиз ь-^-глутамил-п-нитроанилида и 6-диазо-5-оксо- ь-норлейцина;

- фермент не катализирует гидролиз ряда N -карбобензоксии n-бутилоксикарбонильных производных ь-глутамина и ь-аспарагина, а также N-ацетил-ь-глутамина;

- в присутствии гидроксиламина фермент функционирует как трансфераза; субстратами трансферазной реакции являются дикарбо-новые аминокислоты и их амиды.

3. Испытано стабилизирующее действие дикарбоновых аминокислот и их аналогов на активность фермента в условиях тепловой инактивации. Показано, что структурной особенностью эффекторов, обуславливающей защитный эффект, является одновременное присутствие в молекуле o^-амино- и оС-карбоксильной групп.

4. Определены параметры и показан конкурентный характер ингибирования глутамин(аспарагин)азы продуктами ферментативной реакции:

L-глутаматом и L-аспартатом.

5. Изучена кинетика и определены параметры необратимого ингибирования фермента 6-диазо-5-оксо-L-норлейцином и азасерином. Установлено, что взаимодействие фермента с ингибиторами цротека-ет через стадию обратимого связывания. Защитный эффект субстрата и продуктов, высокая степень сродства к ингибитору указывают на модификацию групп в районе активного центра.

6. Показано, что дикарбоновые оксикислоты, а тленно цитрат и dl-малат, эффективно защищают глутамин(аспарагин)азу от инактивации 6-диазо-5-оксо-ь-норлейцином цри рН 5,6. Защита dl -малат ом осуществляется по конкурентному типу.

7. Установлено, что фермент удовлетворяет первичным требованиям, цредъявляемым к лекарственным ферментным ? препаратам и может быть рекомендован для испытаний на антиопухолевую активность. *

Выражаю глубокую благодарность за постоянную помощь, оказанную мне цри выполнении и написании данной работы, своему научному руководителю - заведующему кафедрой биохимии медицинского факультета Университета дружбы народов им. П.Лумумбы, доктору медицинских наук, академику АМН СССР Т.Т. Березову и старшему научному сотруднику, кандидату химических наук З.И. Лебедевой.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кабанова, Елена Алексеевна, 1984 год

1. Абдумаликов А.Х., Еременко В.В. Глютаминаза и изоглюта-миназа saccharamyces cerevisiae meyen KMY381. - Биохимия, 1967, т. 32, гё 2, с. 363-376.

2. Ауэрман Т.Л., Генералова Т.Г., Полоцкая И.А., Полоцкий М.А., Свядищ И.Ф. Кинетические параметры глутаминазы пекарских дрожжей. Прикл.биохимия и микробиол., 1982, т. 18, № 4, с. 525-528.

3. Ауэрман Т.Л., Карпиленко Г.П., Полоцкая М.В., Голубе-ва Л.И., Свядищ И.Ф. Выделение, очистка и некоторые кинетические свойства глутаминазы пекарских дрожжей. Прикл. биохимия и микробиология, 1984, т. 20, .1 3, с. 355-358.

4. Березов Т.Т. Ферментная терапия опухолей. Вестник АМН СССР, 1984, JG.8, с. 11-24.

5. Березов Т.Т., Занин В.А., Смирнова Й.П. Штамм Pseu-domonas aurantiaca ВКМВ-548 продуцент фермента глутаминазы-аспарагиназы. Авт. свидетельство В 739096, 17.II.80 г.

6. Биндука Л.Я., Шпрунка И.К., Бендерс Ю.А., Жагат Р.А. Химическая модификация ь -аспарагиназы е. coli, П. Тринитро-фенилирование. Биоорган, химия, 1980, т. 6, № 10, с. 15491553.

7. Блума Р.К., Вина И.А., Жагат Р.А. Химическая модификация остатков триптофана ь -аспарагиназы E.coli л -бром-сукцинимидов. Химия природа, соедин., 1975, № 2, с. 228-231.

8. Блума Р.К., Вина И.А., Жагат Р.А. Исследование каталитической роли карбоксильных групп L -аспарагиназы. Изв. АН Латв. ССР, Сер. хим., 1976, № I, с. 92-109.

9. Блума Р.К., Вина И.А., Кирстукас И.П., Милман И.А., Гейман И.И., Жагат Р.А. Химическая модификация ь-аспараги-назы I. Нитро- и аминотирозиласпарагиназы Е. coli . Биоорган. химия, 1978, т. 4, J& 9, с. I264-I27I.

10. Вша И. А., Юшке виц Э.А, Блума Р. К., Жагат Р. А. Частичная модель пространственной структуры активного центра ъ-аспарагиназы. Тезисы Ш Всесоюз.симп. "Структура и функции активных центров ферментов" Путцино на Оке, 1976,с!3.

11. Виноградов Б.Д. Дезамидазы ь-глутамина и i-аспарагина из Pseudomonas и их противоопухолевое действие.

12. Pseudomonas aurantiaea ИБФМ BrI4. Pseudomonas boreopolis. 526. Дис. канд. биол.наук - Москва, 1978.

13. Виноградов Б.Д., Чигалейчкк А.Г., Пириева Д.А., Ушаков В.М., Рылкин С.С. Образование дезамидаз L-аспарагина и

14. Ь-глутамина из Pseudomonas aurantiaea I БФМ B-I4. Микробиология, 1976, т. 45, }Ь I, с. 23-27.

15. Галаев Ю.В., Чуплыгина Е.Г., Клементьева Т.А. Иммобилизация Ъ-аспарагиназы из Citrobacter в полиакриламидном геле. Вопр. мед. химии, 1981, т. 27, №4, с. 534-537.

16. Давтян М.А., Степанян К.Р., Оганесян С.П. Очистка инекоторые физико-химические свойства аспарагиназы дрожжей

17. Candida guilliermondii BKM- Y-42. "Айастани инсапанакан антес, Биол. ж. Армении", 1977, т. 30, J5 2, с. 14-19.

18. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М.; 1982.

19. Евсеев Л.П., Николаев А.Я., Еременко В.В., Мардашев G.P. Индуцированный синтез аспарагиназы и гшотаминазы у Pseudomonas sp . Биохимия, 1967, т. 32, В 4, с. 873-875.

20. Жагат Р.А., Вша И.А., Блума Р.К., Платниеце Р.Ф. Некоторые аспекты строения активного центра фермента L -аспарагиназы. Химия природа. соедин., 1971, 16, с. 810-812.

21. Жагат Р.А., Карсакевич А.С., Дауварте А.Ж. Новые формы противолейкозного ферментного препарата ь -аспарагиназы. -Тезисы Ш Всесоюзного съезда фармацевтов, Кишинев, 1980, с. 132133.

22. Занин В.А., Смирнова И.П. Дезамидазы Pseudomonas fiuorescens 13. В сб.: Энзимология опухолей. М.; УДН, 1979, с. 37-44.

23. Кабанова Е.А., Смирнова И.П., Лебедева З.И. Штамм Ps . aurantiaca ВКМВ-548 продуцент бифункционального фермента глутамин (аспарагин) азы. В сб.: Энзимология опухолей. М.; УДН, 1979, с. 45-51.

24. Карсакевич А.С., Жагат Р.А. Иммобилизация ь -аспарагиназы. Изв. АН Латв. ССР, 1977, 1 12, с. II8-I28.

25. Карсакевич А.С., Шуличенко С.Н., Шилов Ю.И., Жагат Р.А. Иммобилизация фермента l -аспарагиназы е.coli на полисахаридах. Ш. Ковалентное связывание с 2-гидрокси-3-бромпропил- декс-траном. Химия природа, соедин., 1981, Л 2, с. 224-228.

26. Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов. М.; 1976, с. 84.

27. Коваленко Н.А., Козлов Е.А., Герасимова А.В. Изменение активности глютаминазы Clostridium welchii SR -12 под влиянием некоторых аналогов глютамина и реактивов на сульфгидрильные группы. Биохимия, 1970, т. 35, № 4, и. 670-674.

28. Коваленко Н.А., Козлов Е.А., Герасимова А.В., Марда-шев С.Р. Кинетические свойства глутаминазы Clostridium welchii

29. SR -12 и влияние некоторых ионов на ее активность. Биохимия, 1971, т. 36, №6, с. II98-I203.

30. Коваленко Н.А., Цветкова Т.А., Николаев А.Я. Некоторые данные о субстратной специфичности ингибиторах и кинетике дез-амидазы АГ (аспарагиназы-глутаминазы) из Pseudomonas fluorescens AT. Вопр. мед. химии, 1977, т. 23, № 5, с. 618-622.

31. Козлов Е.А., Коваленко Е.А. Глутаминазы. В сб.: Успехи биологической химии. ГЛ.; 1972, с. 49-79.

32. Козлов Е.А., Коваленко, Е.А., Мардашев С.Р. Очистка и некоторые свойства глутаминазы Clostridium welchii SR -12. -Биохимия, 1972, т. 37, I I, с. 56-64.

33. Козлов Е.А., Цветкова Т.А., Гребенщикова О.Г. Фотосен-сибилизированное окисление дезамидазы аспарагина-глутамина из Pseudomonas fluorescens « Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1982, т. ХС1У, J5 9, с. 41-42.

34. Корншп-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. М.;1979.

35. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. -М.; 1971, с. 325.

36. Лебедева З.И., Березов Т.Т., Орехович В.Н. Глутамин-(аспарагин)аза из Pseudomonas aurantiaea ВКМ-548. Биохимия, 1981, т. 46, JS I, с. 85-91.

37. Лебедева З.И., Кабанова Е.А., Зеленева Р.Н. Выделение и очистка глутамин(аспарагин)азы из Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548. В сб.: Энзимология опухолей. М.; УДН, 1979, с. 68-72.

38. Лебедева З.Й., Орехович В.Н., Березов Т.Т. Исследование четвертичной структуры глутамин(аспарагин)азы из Pseudomonas aurantiaca • . Тезисы У1 Всесоюзного симпозиума по химии белков и пептидов, Рига, 1983, с. 202-203.

39. Максимов В.И., Молодова Г.А., Беспалова Т.И., Денисов В.М. Влияние низких значений рН на активность и четвертичную структуру аспарагиназы в экстрактах Е. coli. Прикл. биох. и микробиол., 1975, т. II, №. 4, с. 539-545.

40. Мардашев С.Р., Николаев А.Я., Евсеев Л.П., Еременко В.В. Индукция аспарагиназной и глютаминазной активностей у Pseudomonas sp. аспарагиновой и глутаминовой кислота?.®. Биохимия, 1867, т. 32, § 5, с. 1093-1098.

41. Мардашев С.Р., Николаев А.Я., Коваленко Н.А., Раков С.С., Цветкова Т.А. Очистка дезамидазы АГ (аспарагиназы-глутаминазы)из Pseudomonas fiuorescens AT и некоторые физико-химические свойства фермента. Вопр. мед. химии, 1975, т. 21, й I, с. 29-35.

42. Мардашев С.Р., Николаев А.Я., Соколов Н.Н., Козлов Е.А., Куцман М.Е. Выделение и свойства гомогенного препарата l -аспарагиназы из Pseudomonas fiuorescens АГ. Биохимия, 1975, т. 40, №5, с. 984-989.

43. Мардашев С.Р., Соковнина Я.М. Синтез гидроксамовых кислот из дикарбоновых аминокислот и их амидов у Sac char omycescerevisiae . Микробиология, 1965, т. 34, $ I, с. 47-52.

44. Мардашев С.Р., Соколов Н.Н., Евсеев Л.П., Николаев А.Я. Влияние аминокислот на индуцированное образование аспарагиназы,глюташназы и глютаминсинтетазы у Pseudomonas sp • Биохимия, 1969, т. 34, 13, с. 529-534.

45. Маурер Г. Диск-электрофорез. М.; 1971, с. 60-61.

46. Милман И.А., Гейман И.И., Пинка У.А., Кирстукас И.П., Славинская В.А., Жагат Р.А. рН-Зависимость кинетических параметров нйтротирозиласпарагиназы. Химия природа, соедин., 1978, Л 3-4, с. 364-367.

47. Номенклатура ферментов. Приложение I: Исправления, добавления. М.; 1976.

48. Пехов А.А., Жукова О.С., Иванова Т.П., Занин В.А., Березов Т.Т., Добрынин Я.В. Влияние препаратов глутамин(аспарагин) азы из микроорганизмов на синтез ДНК в опухолевых клетках. -Билл, экспер. биол., 1983, т. ХСУ1, й 9, с. 83-84.

49. Полоцкая И.В. Глутаминаза пекарских дрогшей (выделение и свойства). Дис. канд. биол. наук. - М.; 1984.

50. Раков С.С., Прозоровский В.Н., Гребенщикова О.Г., Кондратьева Н.А. Физико-химические свойства дезашдазы из Pseudomonas fluorescens AT, обладающий противоопухолевой активное-тью. Вопр. мед. химии, 1977, т. 23, № 4, с. 503-508.

51. Силакова А.И., Труш Г.П., Явилякова А. Микрометод определения аммиака и глютамина в тканевых трихлоруксусных экстрактах. Вопр. мед. химии, 1962, т. 8, № 5, с. 538-544.

52. Смирнова И.П., Лебедева З.И., Березов Т.Т. Зависимость между составом питательной среды и биосинтезом глутаминазы-ас-парагиназы Pseudomonas sp. В сб.: Проблемы злокачественного роста. М.; УДН, 1977, с. 80-84.

53. Смирнова ИЛ., Кабанова Е.А., Лебедева З.И., Березов Т.Т. Биосинтез бифункционального фермента глутаминазы-аспара-гиназы Pseudomonas aurantiaca ВКМ-548. Прикл. биох. И МИ-едобиол., 1979, т.15, № I, с.258-261.

54. Соколов Н.Н., Николаев А.Я. Сульфгидрильные группы1.аспарагиназы А из Pseudomonas fiuorescens AT. Биохимия, 1976, т.41, jft 4, с.727-731.

55. Торчинский Ю.М. Сера в бежах. М.; 1977.

56. Фрейманис Я.Ф. Ордена Трудового Красного Знамени Институт Органического Синтеза: I957-I98I г.г. Рига; 1984

57. Чигалейчик А.Г., Виноградов Б. Д., Орлова B.C., Рылкин С.С. Биосинтез L-глутаминазы-аспарагиназы культурой Ps.boreopoiis526 в зависимости от условий культивирования. -Микробиология, 1978, т.47, № 3, с.409-413.

58. Abe Т., Takenaka О., Inada Y. Reinvestigation of the Physicochemical and Enzymic Properties of L-Glutaminase from Pseudomonas. Biochim. Biophys. Acta, 1974, v.358, Жо1, p.113--116.

59. Abe Т., Takenaka 0., Inada Y. Limited Proteolysis of Pseudomonas Glutaminase by Porcine Trypsin. FEBS Lett., 1975, v.55, Ko1, p.268-271.

60. Akira I., Seizi I* Extracellular asparaginase-glutami-nase of Tilachlidium humicola. Такэда кэнкюсё XO, J* Takeda Res. Lab., 1973, v.32, Жо2, p.140-151.

61. Arens A., Runenbusch E#, Irion E., Wayner 0., Bauer K., Kaufmann W« Isolation and Properties of L-Asparaginases from

62. E. coli. Z„ Physiol. Chem., 1970, v.351, No2, p.197-212.

63. Boyd J*W., Phillips A.W. Purification and Properties of L-Asparaginase from Serratia marcescens. -J. Bacteriol., 1971, v.106,No2, p.578-587.

64. Broome J.D. Evidence that L-asparaginase activity of guinea pig serum is responsible for its antilymphoma effects. Nature, 1961, v.191, Ho4793, p.1114-1115.

65. Broome J.D. Antilymphoma Activity of L-Asparaginase in vivo: Clearance Rates of Enzyme Preparations Prom Guinea Pig Serum and Yeast in Relation to Their Effect on Tumor Growth. J. Natl. Cancer Inst., 1965, v.35, No6, p.967-979.

66. Broome J.D., Schenkein I. Further studies on the tumor inhibitory activity of a bacterial glutaminase-asparaginase. -- Colloq. int. CURS, 1971, v.197, p.95-105.

67. Cammack K.A., Marlborough D.I., Miller D.C. Physical Properties and Subunit Structure of L-Asparaginase Isolated from Erwinia carotovora. Biochem. J., 1972, v.126, No2, p.361-379.

68. Campbell H.A., Mashburn L.T. L-Asparaginase EC-2 from Escherichia coli. Some Substrate Specificity Characteristics.- 154 - Biochemistry, 1969, v.8, No9, p.3768-3775.

69. Charlson A.J., Coman A.J., Karossi F.A., Stephens F.S., Vagg R.S. The effect of metal ions on the hydrolysis of L-aspara-gine by L-asparaginase. Inorg. Chim. Acta, 1978, v.28, No2,p.217-222.

70. Gitry N., Zyk N. Stereospecificity of the Catalytic Reaction of L-Asparaginase. Biochemistry, 1972, v.11, No11,p.2103-2109.

71. Cooney D.A., Rosenbluth R.J. Enzyme as therapeutic agents.- Adv. Pharmacol. Chemother. , 1974, v«12, p.185-289.

72. Davidson L., Brear D.R., Wingard P., Hawkins J., Kitto G. B. Purification and Properties of an L-Glutaminase-L-Asparaginase from Pseudomonas acidovorans. J. Bacteriol., 1977, v.129, No3, p.1379-1386.

73. Davidson L., Burkom M., Ahn S., Chang L-C., Kitto B. L-Asparaginases from Citrobacter frundii. Biochim. Biophys. Acta, 1977, v.480, No1, p.282-294.

74. Distasio J.A., Niederman R.A., Kafkewitz D., Goodman D. Purification and Characterization of L-Asparaginase with Antilym-phoma Activity from Vibrio*succinogenes. J. Biol. Chem., 1976, v.251, No22, p.6929-6933.

75. Esterhay R.J., Wiernik P.H., Grove W.R., Markus S.D., Wesley M.N. Moderate dose methotrexate, vincristine, asparaginase, and dexamethasone for treatment of adult acute lymphocytic leukemia. Blood, 1982, v.59, No2, p.334-345.

76. Frank B.H., Pekar A.H., Veros A.J., Ho P.P.K. Crystalline L-Asparaginase from Escherichia coli В. II. Physical properties, subunits, and reconstitution behavior. J. Biol. Chem., 1970, v.245, No14, p.3716-3724.

77. Glazer A.N., Smith E.L. Papain and Other Plant Sulfhydryl Proteolytic Enzymes. Enzymes, 1971, v.3, p.501-545»

78. Greenquist A.C., Wriston J.C. Chemical Evidence for Identical Subunits in L-Asparaginase from Escherichia coli B. Arch, Biochem. Biophys., .1972, v.152, No1, p.280-286.

79. Guy G.R., Daniel R.M. The purification and some properties of a stereospecific D-asparaginase from an extremely thermophilic bacterium Ihermus aquaticus. Biochem. J., 1982, v.203, No3,p.787-790.

80. Handschumacher R.E. Active Site of L-Asparaginase: Reaction with Diazo-4-oxonorvaline. Methods in Enzymol., 1977, v.46, p.432-435.

81. Handschumacher R.E., Bates C.J., Chang P.K., Andrews А.Т., Fisher G.A. 5-Diazo-4-0xo-L-Norvaline: Reactive Asparagine Analog with Biological Specificity. Science, 1968, v.161, Н0З8З6,p.62-63.

82. Hanka L.J. Introduction: Possibilities for Biochemically '-. -Rational Chemotherapy for Some Malignancies with Depleting Enzymes and Antimetabolites of Specific Amino Acids. Cancer Treatment Reports, 1979, v.63, N06, p.1009-1011.

83. Harris R.E., McCallister J.A., Provisor D.S., Weetman R.M., Baehner R.L. Methotrexate/L-asparaginase combination chemotherapy for patients with acute leukemia in relapse; a study of 36 children. Cancer, 1980, v.46, No9, p.2004-2008.

84. Hartman S.C. The Interaction of 6-Diazo~5-oxo-L-norleucine with Phosphoribosyl Pyrophosphate Amidotransferase. J. Biol. Chem., 1963, v.238, Ho9, p.3036-3047.

85. Hartman S.C. Glutaminase of. Escherichia coli. I. Purification and general catalytic properties. J. Biol. Chem., 1968, v.243, No5, p.853-863.

86. Hartman S.C. Glutaminase of Escherichia coli. III. Studi- 157 es on the reaction mechanism» J, Biol. Chem., 1968, v.243» No5, p. 870-878.

87. Hartman S.C., McGrath T. Glutaminase A of Escherichia co-li.Reactions with the Substrate Analogue, 6-Diazo-5-oxonorleucine. J. Biol. Chem., 1973, v.248, No24, p. 506-8510.

88. Hartman S.C., Stochaj E.M. Glutaminase A of Escherichia coli. Subunit Structure and Cooperative Behavior. J. Biol. Chem., 1973, v.248, Ho24, p.8511-8517.

89. Herrmann V», Rohm K-H., Schneider P. On the substrate specificity of ^asparaginase from E.coli. PEBS Lett., 1974, v.39,

90. Hess G.P. Chymotrypsin Chemical Properties and Catalysis. - Enzymes, 1971, v.3, p.213-248.

91. Hill G.M., Loeb E., MacLellan A., Khan A., Roberts J., Shields W., Hill U. Response to highly purified L-asparaginase during therapy of acute leukemia. Cancer Res., 1969, v.29, Ho8,

92. Holcenberg J.S. Enhanced effect of an L-glutamine antagonist, L-( S,5S)- -amino-3-chloro-4,5-dihydro-5-iaoxazolacetic acid, by Acinetobacter L-glutaminase-L-asparaginase. Cancer Treat. Reports, 1979, v.63, N06, p.1109-1114.

93. Holcenberg J.S. Enzyme therapy: problems and solutions.-Ann. Rev. Biochem., 1982, v.51, p.795-812.

94. Holcenberg J.S., Borella L.D., Camitta B.M., Ring B.J. Human pharmacology and toxicology of succinylated Acinetobacter glutaminase-asparaginase. Cancer Res., 1979, v.39, N08, p.3145--3151.

95. Holcenberg J.S*, Ericsson L., Roberts J. Amino Acid Sequence of the Diazooxonorleucine Binding Site of Acinetobacter and Pseudomonas 7A Glutaminase-Asparaginase Enzymes. Biochemistry, 1978, v.17, No3, p.411-417.

96. Ю4. Holcenberg J.S., Roberts J. Enzymes as drugs. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1977, v.17,p.97-116.

97. Holcenberg J.S., Roberts J., Dolowy W.C. Glutaminases as Antineoplastic Agents. In: Enzyme of Glutamine Metabolism.- New-York; 1973, p.227-292.

98. Holcenberg J.S., Schmer G., Teller D.S., Roberts J. Biologic and Physical Properties of Succinylated and Glycosylated Acinetobacter Glutaminase-Asparaginase. J. Biol. Chem., 1975, v.250, No11, p.4165-4170.

99. Holcenberg J.S., Teller D.S., Roberts J. Active enzyme sedimentation of antitumor asparaginase and glutaminase enzymes.- Arch. Biochem. Biophys., 1974, v.161, No1, p.306-312.

100. Holcenberg J.S., Teller D.S., Roberts J. Physical Properties of Antitumor Glutaminase-Asparaginase from Pseudomonas 7A. -J. Biol. Chem., 1976, v.251, No17, p.5375-5380.

101. Holcenberg J.S., Teller D.S., Roberts J., Dolowy W.C. Physical Poperties of Acinetobacter Glutaminase-Asparaginase with Antitumor Activily. J. Biol. Chem., 1972, v.247, No22, p.7750-7758.

102. Ho P.P.K., Milikin E.B. Multiple forms of L-asparaginase.- Biochim. Biophys. Actab, 1970, v.206, No1t p.196-198.

103. Ho P.P.K., Milikin E.B., Bobbit J.L., Grinnan E.L.,v

104. Burck P*J., Prank B.H., Boeck L.Y.D., Swuires R.W. Crystalline L-Asparaginase from Escherichia coli В. I. Purification and Chemical Characterization. J. Biol. Chem., 1970, v.245, No14, p.3708-3715.

105. Howard J.B., Carpenter F.H. L-Asparaginase from Erwinia carotovora. Substrate Specificity and Enzymatic Properties.- J. Biol. Chem., 1972, v.247, No4, p.1020-1030.

106. Jackson R.C., Handschumacher R.E. Escherichia coli L-as-paraginase. Catalytic Activity and Subunit Nature. Biochemistry, 1970, v.9, No18, p.3585-3590.

107. Jayaram H.N., Ramakrishan Т., Vaidyanathan C.S. L-Aspara-ginases from Mycobacterium tuberculosis Strains H^R.^. and H^R^ -Arch. Biochem. Biophys., 1968, v.126, No1, p.165-174.

108. Joner P.E. Purification and Properties of L-Asparaginase

109. В from Acinetobacter calcoaceticus. Biochim. Biophys. Acta, 1976, v.438, No1, p.287-295.

110. Joner P. E., Kristiansen Т., Einarsson M. Purification and properties of L-asparaginase A from Acinetobacter calcoaceticus. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.327, STo 1, p.146-156.

111. Kamisaki У., Wada H., Yagura Т., Matsushima A., Inada Y. Reduction in immunogenicitу and clearance rate of Escherichia coli1.asp&raginase by modification with monomethoxypolyethylene glycol. J. Pharmacol, and Exp. Ther., 1981, v.216, No2, p.410-414.

112. Katsumata H., Katsumata R., Abe Т., Takenaka 0., Inada Y. Purification and Physj-cochemical Properties of L-Glutaminase from Pseudomonas. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v.289, No2, p.405-409.

113. Kien C.L., Holcenberg J.S. Nitrogen utilization in mice bearing Ehrlich ascites tumor treated with Acinetobacter glutami-nase-asparaginase. Cancer Res., 1981, v.41, No6, p.2051-2055.

114. Kien C.L., Holcenberg J.S. Amino acid utilization and urine protein excretion in children treated with succinylated Acinetobacter glutaminase-asparaginase. Cancer Res., 1981, v.41, No6, p.2056-2062.

115. Lauinger C., Ressler C.Ji-Cyanoalanine as a Substrate for Asparaginase. Stoichiometry, Kinetics and Inhibition. Biochim. Biophys. Acta, 1970, v.198, ЕГо2, p.316-323.

116. Law A.S., Wriston J.G. Purification and Properties of Bacillus coagulans L-Asparaginase. Arch. Biochem. Biophys., 1971, v. 147, No2, p.744-752.

117. Lee В., Yang H.J. Crystallographic Studies on L-Asparaginase from Proteus vulgaris. I. Preliminary Crystal-Data. J.Biol.1. W?3

118. Chem.,Yv.248, No21, p.7620-7621.

119. Lee В., Yang H.J., Henry G.M., Seymour J.P. Crystallographic Studies on L-Asparaginase from Proteus vulgaris. II. Symmetry and Location of the Tetrameric Molecule. J. Biol. Chem., 1975, v.250, H0I6, p.6228-6231.

120. Liu F.S., Zajic J.E. Purification and properties of L-as-paraginase of Erwinia aroideae. Can. J. Microbiol., 1972, v.18,1. Ho12, p.1953-1957.

121. Liu Y.P., Handschumacher R.E. Uitroasparaginase. Subunit cross-Linkage Land Altered Substrate Specificity. J. Biol.Chem.,- 162 -1972, v.247, No1, p.66-69.

122. Maita Т., Matsuda G. The Primary Structure of L-aspara-ginase from Escherichia coli. Z. Physiol. Chem., 1980, v.361, No2, p.105-117.

123. Makino H., Inada Y. Photooxidation of histidine residues in asparaginase in relation to its enzymic activity. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.295, No2, p.543-548.

124. Marlborough D.T., Miller D.S., Cammack K.A. Comparative study on conformational stability and subunit interaction of two bacterial asparaginases. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v.386, Uo2, p.576-589.

125. Martell A.E., Smith R.M. Crtical stability constants. V.1 Amino Acids. Hew York-London; 1974.

126. Meister A., Levintow L., Greenfield R.E., Abendschein P.A. Hydrolysis and Transfer Reactions catalyzed by co-Amidase Preparations. J. Biol. Chem., 1955, v.215, No1, p.441-460.

127. Murthy U.S., Knox J.R. Small-angle X-ray scattering studies of Escherichia coli L-Asparaginase. J. Mol. Biol., 1976, v.105, No4, p.567-575.

128. Nagareyama Y.T., Takashi I., Mitsuharu P. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms mit etwa gleich grober Glutaminase- und Asparaginase-Aktivitat. Patentschrift 2051945.

129. Nakamura N. Effects of Acetylation with Acetic Anhydride.- Agr. Biol. Chem., 1973, v.37, No3, p.569-574.

130. Nickle E.C., Solomon R.D., Torchia Т.Е., Wriston J.C.Jr. Chemical modifications of Escherichia coli L-asparaginase and their effect on plasma clearance rate and other properties.- Biochim. Biophys. Acta, 1982, v.704, No2, p.345-352.

131. North A.C.P., Wade H.E., Cammack K.A. Physycochemical Studies of L-Asparaginase from Erwinia carotovora. Nature, 1969, v.224, No5219, p.594-595.

132. Novak E.K., Phillips A.W. L-Glutamine as a Substrate for L-Asparaginase from Serratia marcescens. J. Bacterid., 1974, v.117, No2, p.593-600.

133. Oettgen H.P., Old L.J., Boyse E.A., Campbell H.A., Philips P.S., Clarkson B.D., Tallal L., Leeper R.D., Schwartz M.K., Kim J.H. Inhibition of leukemias in man by L-asparaginase. Cancer Res., 1967, v.27, No12, p.2619-2631.

134. Ohshima M.,Yamamoto Т., Soda K. Further Characterizationof Glutaminase Isozymes from Pseudomonas aeruginosa, Agr. Biol, Chem,, 1976, v.40, No11, p.2251-2256.

135. Oki Т., Shirai M., Ohshima M.t Yamamoto Т., Soda K. Antitumor activities of bacterial leucine dehydrogenase and glutaminase A. PEBS Lett., 1973, v.33, ЖоЗ, p.286-288.

136. Pastuszak I., Szymona M. Purification and properties of L-asparaginase from Mycobacterium phlei. Acta Biochim. Pol., 1976, v.23, No1, p.37-44.

137. Paul J.H. Isolation and characterization of Chlamydomonas L-asparaginase. Biochem. J., 1982, v.203, No1, p.109-115.157» Perrin D.D. Stability constants of Metal-ion Complexes: Part B. Organic Ligands. Oxford; 1979.

138. Peterson R.G., Richards P.P., Handschumacher R.E. Structure of Peptide from Active Site Region of Escherichia coli L-as-paraginase* J. Biol. Chem., 1977, v.252, No6, p.2072-2076.

139. Petz D., Loffler H.^G., Schneider P. Inhibition of E.coli

140. Asparaginase by Reaction with 2,3-Butanedione. Chemical Modification of Arginine and Histidine Residues. Z. Naturforsch., 1979, v.34C, p.742-746.

141. Pinkus L.M. Glutamine Binding Sites. Methods in Enzy-mol., 1977, v.46, p.414-427.

142. Prusiner S., Davis J.П., Stadtman E.R, Regulation of Glutaminase В in Escherichia coli. I. Purification, Properties and Cold Lability. J. Biol. Chem., 1976, v.251, No11, p.3447-3456.

143. Prusiner S., Stadtman E.R. Regulation of Glutaminase В in Escherichia coli. II. Modulation of Activity by Carboxilate and Borate Ions. J. Biol. Chem., 1976, v.251, Ho11, p.3457-3462.

144. Prusiner S., Stadtman E.R. Regulation of Glutaminase В in Escherichia coli. III. Control by nucleotides and Divalent Cations. J. Biol. Chem., 1976, v.251, No11, p.3463-3469.

145. Ramadan M.E.A., El Asmar P., Greenberg D.M. Purification and Properties of Glutaminase and Asparaginase from a Pseudomonad.

146. Purification and Physical Chemical Properties. Arch. Biochem. Biophys., 1964, v.108, No1, p.143-149.

147. Roberts J., Holcenberg J.S., Dolowy W.C. Isolation, Crystallization and Properties of Achromobacteraceae Glutaminase-As-paraginase with Antitumor Activity. J. Biol. Chem., 1972,v.247, Ho1, p.84-90.

148. Roberts J., Schmid P.A., Rosenfeld H.J. Biologic and Antineoplastic Effects of Enzyme-mediated In Vivo Depletion of L-Glu-tamine, L-Tryptophane, and L-Histidine. Cancer Treat. Rep.,1979, v.69, No6, p.Ю45-Ю54.

149. Rohm K.-H., Schneider P. Kinetische Untersuchangen zum Mechanismus der Asparaginase aus E. coli (E.C. 3.5.1*1). Z. Physiol. Chem., 1971, v.352, No12, p.1739-1743.

150. Rohm K.-H., Schneider P. Modellreaktionen zum Mechanismus der Asparaginase aus E.coli. Chimia, 1972, v.26, No11,p.576-578.

151. Rosenfeld H., Roberts J. Enhancement of antitumor activity of glutamine antagonists 6-diazo-5-oxo-L-norleucine and acivicin in cell culture by glutaminase-asparaginase. Cancer Res*, 19S1, v»41, No4, p.1324-1328.

152. Sakamoto Т., Araki C., Beppu Т., Arima K. Partial purification and some properties of extracellular asparaginase from Candida utilis. Agr. and Biol. Chem., 1977, v.41, No8,p.1359-1364.

153. Schmid P.A., Roberts J. Antineoplastic and toxic effects of Acinetobacter and Pseudomonas glutaminases. Cancer Chemother. Rep., 1974, v.58, No6, p.829-840.

154. Schwartz J.H. Asparaginase II of Escherichia coli: bacterial physiology and enzymatic mechanism of action. Colloq. int CURS, 1971, ETo197, p.79-85.

155. Shifrin S., Grochowski B.J. L-Asparaginase from Escherichia coli B. Succinylation and subunit interaction. J. Biol. Chem., 1972, v.247, Ho4, p.1048-1054.

156. Shifrin S., Luborsky S.W., Grochowski B.J. L-Asparaginase from Escherichia coli B. Physicochemical Studies of the Dissociation Process. J. Biol. Chem., 1971, v.246, Uo24, p.7708-7714.

157. Shifrin S., Parrot C.L., Luborsky S.W. Substrate Binding and Intersubunit Interactions in L-Asparaginase. J. Biol. Chem., 1974, v.249, No5, p.1335-1340.

158. Shifrin S., Solis B.G. Reaction of U-Acetylimidazole with L-Asparaginase. Mol. Pharmacol., 1972, v.8, Uo5, p.561-564.

159. Soda K., Ohshima M., Yamamoto T. Purification and Properties of Isozymes of Glutaminase from Pseudomonas aeruginosa. Bio- 167 chem, Biophys. Res. Communs., 1972, v.46, ВД, p.1278-1284.

160. Soru E., Zaharia 0. Ь-Asparaginase from BCG-Strain of Mi-cobacterium bovis. Chemical Characterization. Rev. roum. biochim., 1973, v.10, Ho2, p.145-153.

161. Steckel J., Roberts J., Philips P.S., Chou T-C. Kinetic Properties and Inhibition of Acinetobacter Glutaminase-Asparaginase. Biochem. Pharmacol., 1983, v.32, N06, p.971-977.

162. Stern M.L., Phillips A.W., Gottlieb A.J. Physical Properties of L-Asparaginase from Serratia marcescens. Bacteriology, 1976,v.125, No2, p.719-727.

163. Takenaka 0., Tamaura P., Nishimura Y., Inada Y. DL-Aspartic acid j3-p-nitroanilide as a substrate for the assay of asparaginase . J. Biochem., 1971, v.69, N06, p. 1139-11.41.

164. Tioutrina G.V., Lebedeva Z.I., Berezov T.T. The active site of glutaminase(asparagine)ase from Pseudomonas aurantiaea BKMB-548. Abstr. of XII Intern. Congress of Biochemistry, Perth, 1982, p.837.

165. Todokoro K., Saito Т., Obata M.,Yamazaki S., Tamaura Y., Inada Y. Studies of Conformation and Antigenicity of Reduced S-Methylated Asparaginase. FEBS Lett., 1975, v„60, No2,p.259-262.

166. Tosa T#, Sano R., Yamamoto K., Uakamura M., Chibata I. L-Asparaginase from Proteus vulgaris. Purification, Crystallizazation, and Enzymic Properties» Biochemistry, 1972, v.11, No2, p.217-222,

167. Warrell R.P., Arlin Z.A., Gee T.S., Chou Т., Roberts J.,

168. Young C. W. Clinical Evaluation of Succinilated Acinetobacter Glutaminase-Asparaginase in Adult Leukemia. Cancer Treat. Rep., 1982, v.66, Ho7, p.1479-1485.

169. Weber K., Osborn M. The Reliability of Molecular Weight Determination by Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis. J. Biol. Chem., 1969, v.244, Ио1б, p.4406-4416.

170. Westerik J.O'C.,WQlfenden R. Aspartic--Semialdehyde:

171. A Potent Inhibitor of Escherichia coli L-Asparaginase. J. Biol. Chem., 1974, v.249, No19, p.6351-6353.

172. Whelan H.A., Wriston J.C. Purification and properties of asparaginase from E.coli B. Biochemistry, 1969, v.8, N06,p.2386-2393.

173. Whelan H.A., Wriston J.C. Purification and properties of L-asparaginase from Serratia marcescens. Biochim.Biophys. Acta, 1974, v.365, No1, p.212-222.

174. Wileman Т., Bennet M., Lilleyman J. Potential use of an asparaginase-dextran conjugate in acute lymphoblastic leukaemia.- J. Pharm. and Pharmacol., 1983, v.35, Fo11, p.762-764.

175. Wlodawer A., Hodgson K.O., Bensch K. Studies of Two Crystal Forms of Glutaminase-Asparaginase from Acinetobacter glutaminasificans. J. Mol. Biol., 1975, v.99, No2, p.295-299.

176. Wriston J.C.Jr. Asparaginase. Methods in Enzymol.,1970, v.17A, p.732-742.

177. Wriston J.C.Jr., Yellin Т.О. L-Asparaginase: A rewiew.- Adv. Enzymol., 1973, v.39, p.185-248.

178. Yamamoto S., Hirooka H. Partial purification and properties of glutaminase from Aspergillus sojae. Хакко когаку дзас-СИ, J. Ferment. Technol., 1974, v.52, No8, p.570-576.

179. Zyk H. Modification of L-asparaginase EC-2 by homologous antibodies. Biochim. Biophys. Acta, 1973, v.302, Ho2, p.420-428,