Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neu тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Маценко, Наталья Юрьевна

• Маценко, Наталья Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Маценко, Наталья Юрьевна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Рецептор HER2 - член семейства рецепторов эпидермального фактора роста.

1.1.1. Семейство рецепторов EGF.

1.1.2. Факторы роста - лиганды семейства рецепторов EGF.

1.1.3. Особенности строения рецептора НЕЮ.

1.2. Молекулярные механизмы увеличения экспрессии гена рецептора HER

1.2.1. Хромосомные перестройки.

1.2.2. Анеусомия.

1.2.3. Регуляция экспрессии гена HER2/neu транскрипционными факторами

1.2.4. Амплификация гена HER2/neu.22

1.3. Роль рецептора HER2 в неопластической трансформации клеток.

1.4. Особенности изменения клинических показателей у пациенток с повышенным уровнем экспрессии гена HER2/neu в клетках злокачественных опухолей различного типа.

1.5. Прогностическая значимость увеличения экспрессии и дозы гена HER2/neu.

1.6. Рецептор HER2 - мишень для противоопухолевой терапии.

1.7. Технологии анализа НЕК2-статуса опухоли.

1.7.1. Диагностика методом ИГХ.

1.7.2. Диагностика методом ИФА.

1.7.3. Диагностика методом FISH.

1.7.4. Метод ПЦР диагностики.

1.7.4.1. ПЦР-РВ.

1.8. Модели механизмов амплификации генов и фрагментов хромосом.

1.8.1. Амплификация является частым событием в опухолевых клетках.

1.8.2. Причины инициации амплификации.

1.8.2.1. Репликация ДНК.

1.8.2.2. Дисфункция теломеров.

1.8.2.3. Сайты ломкости.

1.8.3. Механизмы амплификации.

1.8.3.1. Внутрихромосомная амплификация по модели BFB цикла.

1.8.3.2. Внехромосомная амплификация фрагментов хромосом.

1.8.3.3. Альтернативный механизм амплификации онкогенов в районе хромосомы 17q21.

1.9. Доза генов, располагающихся вокруг гена HER2/neu, их функции и описанные случаи изменения активности в опухолях.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neu»

На сегодняшний день во всем мире продолжает увеличиваться заболеваемость злокачественными новообразованиями. Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. По данным ВОЗ, в мире ежегодно выявляется около 1 млн. новых случаев РМЖ, а к 2010 г. прогнозируется до 12.5 млн. заболевших РМЖ.

По последним данным, опубликованным Российским Онкологическим Научным Центром, ежегодно в России около 50 тыс. женщин ставится диагноз РМЖ, при этом отмечается снижение возраста заболевших. В настоящее время под наблюдением находятся около 500 тыс. женщин с диагнозом РМЖ. Статистика смертности от этого заболевания также неутешительна — около 24 тыс. женщин в год. Первый пик заболеваемости приходится на репродуктивный период от 30 до 40 лет. Число заболевших за этот период составляет 80-100 человек на сто тысяч женщин. В последующие годы жизни отмечается увеличение частоты РМЖ, в частности, если в 50 лет регистрируется 180 случаев, то после 65 лет - 250 случаев на сто тысяч женщин.

Новосибирск по заболеваемости злокачественными новообразованиями входит в десять самых неблагополучных регионов РФ. По данным ежегодной отчетной конференции онкологов в 2006 году в Новосибирске количество больных РМЖ составило 81.6 больных РМЖ на 100 тысяч женского населения. Только в 2006 году в Новосибирске диагностированы новые случаи РМЖ у 622 больных. Большинству пациенток выполнены калечащие операции - полное удаление молочной железы.

Значительным прогрессом в диагностике и лечении РМЖ стало открытие молекулярных маркеров, которые имеют прогностическое и предсказательное значение при определении их статуса у пациенток с РМЖ. В настоящее время одним из наиболее изученных молекулярных маркеров является рецептор эпидермального фактора роста человека второго типа (HER2)

Yang-Feng Т. et al, 1985; Di Fiore P. et al, 1987). Из общего числа пациенток страдающих РМЖ, увеличенная экспрессия гена HER2/neu, кодирующего рецептор HER2, в клетках опухоли встречается в 20-30% случаев (Slamon D. et al., 1987; 1989). Избыточное наличие этого рецептора на поверхности опухолевых клеток свидетельствует о наиболее агрессивной форме РМЖ, которая характеризуется быстрым ростом опухоли, высокой вероятностью метаста-зирования, снижением эффективности химио-, гормональной и лучевой терапии (Имянитов Е.Н с соавт., 1992; Masood S. и Bui М., 2002). В подавляющем большинстве случаев в основе увеличенной экспрессии рецептора лежит амплификация гена HER2/neu (Couturier J. et al, 1999; Jacobs T. et al, 1999a). Своевременная диагностика НЕ112-статуса опухоли позволяет назначить адекватное и эффективное лечение РМЖ.

На данный момент в России существуют проблемы с диагностикой РМЖ в целом и с определением НЕЯ2-статуса опухолей в частности, связанные как с плохим оснащением по всей стране диагностических лабораторий, так и с несовершенностью применяемых методов диагностики: иммуногистохими-ческого (ИГХ) анализа и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). На сегодняшний день, проблема отсутствия быстрого, точного и доступного для большинства диагностических лабораторий метода определения HER2-статуса пациенток с РМЖ имеет острую социальную важность. Знание НЕБ12-статуса пациенток и использование анти-НЕЯ2-направленной терапии - Герцептина® - позволяет назначить индивидуальное и оптимизированное лечение больных РМЖ, исключив назначение заведомо неэффективной терапии. Таким образом, поиск нового подхода к определению НЕЯ2-статуса опухолей РМЖ, который учитывал бы недостатки ныне использующихся методик определения и был доступен для большинства диагностических лабораторий в качестве рутинного анализа, является одной из актуальных проблем современной онкологии.

Амплификация генов — один из механизмов активации онкогенов в процессе развития опухоли. В большинстве случаев амплификация является не уникальным событием для одного гена и затрагивает целые фрагменты хромосом (Hyman Е. et al, 2002). В литературе описано несколько механизмов амплификации, предложенных для объяснения активации онкогенов в клеточных линиях опухолей разного типа, в том числе и для РМЖ (Savelyeva L. и Schwab М., 2001; Albertson D., 2006). Однако предложенные модели амплификации не дают ответа на вопрос о причинах ее возникновения. В каком случае этот процесс случайный, а в каком случае - селективное событие? Почему амплификация возникает в определенных локусах на хромосоме? Существуют ли закономерности амплификации, общие молекулярные основы и механизмы ее инициации? Если подобные закономерности и общие механизмы возникновения амплификации онкогенов существуют, то их открытие может послужить основой для разработки новых препаратов направленного действия для анти-раковой терапии, которые позволят контролировать и даже предотвращать развитие раковых опухолей у человека. В свете постоянного увеличения заболеваемости злокачественными новообразованиями актуальность данной темы не вызывает сомнений.

Изложенное выше, определило цель настоящей работы:

Картирование границ фрагмента ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21 в клетках опухолей РМЖ человека с увеличенной дозой гена HER2/neu и выявление структурных особенностей ДНК на данных границах.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ чувствительности, воспроизводимости и диапазона измерений двух протоколов ПЦР-РВ (SYBR Green и TaqMari) для определения дозы гена HER2/neu в клетках опухолей РМЖ.

2. Провести сравнительный анализ результатов определения дозы гена HER2/neu методом ПЦР-РВ с результатами методов ИГХ и FISH определения НЕК2-статуса опухолей РМЖ.

3. Определить дозу гена HER2/neu в панели образцов опухолей РМЖ человека методом ПЦР-РВ.

4. Провести определение дозы ряда соседних с HER2/neu генов.

5. Установить длину и границы амплифицированных районов ДНК, содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21.

6. Выявить возможные структурные особенности нуклеотидной последовательности ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21, вокруг гена HER2/neu.

7. Сопоставить взаимное расположение структурных особенностей нуклеотидной последовательности ДНК вокруг гена HER2/neu и границ амплифицированных районов хромосомы 17ql2-q21, содержащих ген HER2/neu.

Научная новизна работы.

В ходе выполнения диссертационного исследования впервые были получены следующие данные:

- Предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ для анализа дозы гена HER2/neu\

- Установлена высокая корреляция результатов (>=0.8, р<0,005), полученных с использованием предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu, с результатами определения НЕК2-статуса опухолей РМЖ с помощью методов ИГХ и FISH;

- Впервые продемонстрирована возможность использования TaqMan ПЦР-РВ для оценки длины амплифицированных фрагментов хромосомы, содержащих ген HER2/neu;

- Установлено наличие амплифицированных фрагментов ДНК разной длины (от 40 т.п.н. до 1 м.п.н и более), содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21, в разных образцах опухолей РМЖ;

- Впервые продемонстрировано наличие сайтов высокой флексибильно-сти в районе хромосомы 17ql2-q21;

- Впервые продемонстрировано, что в ряде опухолей РМЖ с увеличенной дозой гена HER2/neu границы амплифицированных фрагментов ДНК хромосомы 17ql2-q21 находятся в пределах одной из обнаруженных областей высокой флексибильности FlexZNF-2;

- На основе полученных данных выдвинуто предположение об участии районов высокой флексибильности в процессах инициации внутрихромо-сомной амплификации ДНК в клетках опухолей РМЖ.

Научно-практическая значимость.

По своему содержанию работа носит фундаментально-прикладной характер и представляет собой исследование, позволяющее говорить о том, что амплификация фрагментов хромосомы 17ql2-q21, содержащих ген HER2/neu, по крайней мере, в некоторых точках ассоциирована с наличием районов высокой флексибильности ДНК. Данные о связи сайтов высокой флексибильности с границами амплифицированных районов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, могут оказаться полезными для изучения механизмов амплификации данного онкогена в клетках РМЖ, а также для выявления общих закономерностей процессов амплификации онкогенов в опухолевых клетках. Кроме того, дальнейшее исследование подобных взаимосвязей, возможно, окажется полезным для поиска новых подходов при разработке таргетной терапии РМЖ.

Прикладное применение данной работы связано с возможностью выбора рациональных схем терапии при РМЖ в зависимости от длины амплифицированных фрагментов хромосомы 17q, содержащих ген HER2/neu. В ходе работы был предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ, на основе которого был создан прототип набора для определения дозы гена HER2/nen в опухолевой ткани РМЖ с дальнейшей возможностью применения его в диагностической практике (см. приложение 1).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Предложенный протокол TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu в образцах ткани опухоли РМЖ обладает более высокой чувствительностью (1 нг геномной ДНК), воспроизводимостью (КВ<5%) и более широким диапазон измерений (1-100 нг геномной ДНК), по сравнению с параллельно разработанным в данной работе, протоколом SYBR Green ПЦР-РВ.

2. Результаты определения дозы гена HER2/neu с помощью предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ хорошо коррелируют с данными методов ИГХ и FISH определения НЕЯЗ-статуса опухолей РМЖ (г = 0.8,р<0.005).

3. Увеличение дозы гена HER2/neu выявлено в 34.5% исследованных опухолей РМЖ.

4. В различных образцах опухолей РМЖ в районе хромосомы 17ql2-q21 обнаружены различные по протяженности амплифицированные фрагменты хромосомы, содержащие ген HER2/neu.

5. В районе хромосомы 17ql2-q21 (NT0107555 (1722059.1731701) Gene Bank), прилегающем к гену HER2/neu, располагаются нуклеотидные последовательности ДНК с высокой флексибильностью.

6. Расположение границ ряда амплифицированных фрагментов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, совпадает с локализацией одного из сайтов высокой флексибильности FlexZNF-2 в районе хромосомы 17ql2-q21, что свидетельствует об его возможном участии в процессах внутрихромосомной амплификации.

Апробация работы.

Результаты работы были представленны и обсуждены на VIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, Россия, 2004); на I Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, Россия, 2005); на 2-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, Россия, 2006); на XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007); на 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007); на 14-й Европейской конференции по Онкологии, ЕСС014 (Barcelona, Spain, 2007); на 5-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008).

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Маценко, Наталья Юрьевна

Выводы

1. Предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu в образцах ткани опухоли РМЖ, который обеспечивает более высокие чувствительность (1 нг геномной ДНК), воспроизводимость реакции (КВ<5%) и позволяет работать с большим диапазоном концентраций ДНК (1100 нг геномной ДНК) по сравнению с протоколом SYBR Green ПЦР-РВ.

2. Результаты определения дозы гена HER2/neu с помощью предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ хорошо коррелируют с результатами ИГХ и FISH методов определения НЕ112-статуса опухолей РМЖ (г = 0.8,/?<0.005).

3. Среди 162 образцов опухолевой ткани РМЖ увеличение дозы гена HER2/neu было зарегистрировано в 56-ти образцах (34.5%).

4. Продемонстрировано наличие амплифицированных районов хромосомы разной длины (от 40 т.п.н. до 1 м.п.н. и более), содержащих ген HER2/neu в районе хромосомы 17ql2-q21 в разных образцах опухолей РМЖ.

5. Фрагмент хромосомы 17ql2-q21 включающий ген HER2/neu, содержит районы высокой флексибильности FlexZNF-1 (292 п.н.) и FlexZNF-2 (1133 п.н.), которые обладают способностью формировать устойчивые вторичные структуры.

6. Границы амплифицированных районов в районе хромосомы 17ql2-q21 в ряде опухолей с увеличенной дозой гена HER2/neu, находятся в пределах области высокой флексибильности, длиной 9.6 т.п.н. {NT0107555 (1722059.1731701) Gene Bank). Предположено участие сайтов высокой флексибильности FlexZNF-1 и FlexZNF-2 в процессах внутрихромосомной амплификации в клетках опухолей РМЖ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Понимание биологической роли HER2 в нормальной физиологии клетки и при опухолевом росте произвело переворот представлений в научной и медицинской среде. Амплификация онкогена HER2/neu оказывает сильное влияние на развитие и прогрессию опухолевых клеток РМЖ. Одним из крупнейших достижений последнего десятилетия стало создание принципиально нового лекарственного препарата Герцептин для таргетной терапии опухолей РМЖ с НЕБ12-положительным статусом.

На сегодняшний день установлено, что амплификация HER2/nen является не уникальным, а комплексным событием и затрагивает целый ряд генов, располагающихся в районе хромосомы 17ql2-q21. Влияние ко-амплификации на развитие, биологию и поведение опухолевых клеток при ответе на различные виды противоопухолевого лечения является одной из актуальных проблем в современной онкологии и терапии. Однако природа механизма амплификации онкогена HER2/neu до сих пор не ясна. Несмотря на различные модели амплификации, описанные в литературе, общим для всех моделей начальным событием является двуцепочечный разрыв молекулы ДНК, фланкирующий одну из границ будущего ампликона неподалёку от исследуемого гена. Большую роль в понимании механизма возникновения двуцепочечных разрывов внесло открытие сайтов ломкости ДНК - определенных районов нуклеотидной последовательности, обладающих повышенной способностью к образованию разрывов, под воздействием ингибиторов репликации. Однако, возникновение разрывов ДНК в тех местах, где сайты ломкости не обнаружены, до сих пор не имеет однозначного объяснения.

Возможно, в подобных местах располагаются сайты ломкости, для которых исследователи еще не установили индукторов их экспрессии либо существуют другие причины, как то особенности нуклеотидного состава, вторичная структура ДНК в подобных местах. Установление причин возникновения разрывов ДНК в подобных районах поможет глубже понять природу ампли-фикационных событий в опухолевых клетках и, возможно, выявить некие общие закономерности процессов инициации амплификации в опухолевых клетках. Это, в свою очередь, может раскрыть новые перспективы в разработке подходов к таргетной терапии опухолей в онкологии.

Глава 2. Материалы и методы 2.1. Материалы

В работе были использованы следующие материалы и реактивы:

Этиловый спирт, изоамиловый спирт, хлороформ, фенол, ксилол, ацетат натрия (CH3COONa), хлорид магния (MgC^) - отечественного производства категории ОСЧ.

Трис, додецилсульфат натрия (SDS), ксиленцианол, бромфеноловый синий- «Sigma», США

Tween-20 — «Amresco», США.

Сульфат аммония (NtL^SO^ диметилсульфоксид (ДМСО) - «MP Biomedicals», США.

Флуоресцентный краситель тетраметилкарбоксиродамин (TAMRA), флуоресцентный интеркалирующий краситель SYBR Green I — «Molecular probes», США.

Агароза, - «BIORON», Германия.

Этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), TEMED, акриламид, N,N'-метилен бисакриламид, этидий бромистый - «Serva», Германия.

Протеиназа К - «Мегск», Германия

Линейный полиакрил-амид (ЛПАА), Smart Taq ДНК-полимераза, буфер для Taq ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ) - "Лаборатория Медиген", Россия.

Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные зонды были синтезированы в компаниях «Syntol» и «Лаборатории Медиген», Россия.

РНКаза А — «V-gene Biotechnology Limited», КНР.

57

2.2. Методы 2.2.1. Образцы ткани опухоли РМЖ

Образцы опухолевой ткани молочной железы были получены из операционного материала в ходе операции по удалению молочной железы от ста двадцати восьми женщин (возраст 39-77, средний возраст 59) с 2-й и 3-й степенью злокачественности РМЖ. Немедленно после мастэктомии, свежий образец ткани опухоли РМЖ помещали в емкость с жидким азотом до процедуры выделения ДНК. Тридцать четыре образца опухоли РМЖ были получены в виде архивных срезов.

Образец считали пригодным для исследования, если количество опухолевых клеток в образце превышало 60%. По гистологической структуре опухоли в 90% случаев имели место аденокарциномы молочной железы.

Контролем служила ДНК из образцов ткани молочной железы от восьми женщин, не имеющих злокачественных патологий молочной железы и пять образцов условно нормальной ткани молочной железы, взятых из прилегающей к опухоли ткани.

На проведение работ с клиническим материалом было получено разрешение от этического комитета ГУ НИИМББ СО РАМН от 8 июня 2005 г. (см. Приложение 2).

2.2.2. Выделение ДНК

2.2.2.1. Выделение ДНК из архивных срезов методом экстракции смесью фенол-хлороформ

Процедуру выделения ДНК производили в соответствие с протоколом, предложенным Сао с соавт. (2003).

Депарафинизация ткани. 50-100 мг образца опухолевой ткани измельчали ножницами и помещали в 1.5 мл пробирку Эппендорф с 500 мкл ксилола на 30 мин. при комнатной температуре. Затем ксилол аккуратно удаляли. При необходимости процедуру повторяли дважды. В пробирку к образцу ткани добавляли 500 мкл 96% этилового спирта, содержимое пробирки тщательно перемешивали в течение 15 мин. при комнатной температуре, этанол тщательно удаляли.

Фенол-хлороформная экстракция ДНК. Лизис депарафинизированно-го образца ткани проводили с помощью протеиназы К в 500 мл лизирующего буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА, 10% SDS, 500 мг/мл протеиназы К) в течение ночи при 60°С до полного растворения ткани. Полученный гомогенный раствор перемешивали на вортексе в течение 30 сек. Очистку ДНК от белков проводили с помощью добавления к содержимому пробирки равного объема смеси фенола с хлороформом и изоамиловым спиртом (25:24:1). Содержимое пробирки тщательно перемешивали в течение 5-10 мин и затем центрифугировали при 12000 g на центрифуге «Эппендорф» (Merck, Германия) в течение 20 мин. Верхнюю водную фазу отбирали в чистую 1.5 мл пробирку и добавляли равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1). Содержимое пробирки тщательно перемешивали и центрифугировали при 12000 g в течение 15 мин. Супернатант, содержащий нуклеиновые кислоты, переносили в чистую пробирку. Осаждение нуклеиновых кислот производили путем добавления к супернатанту 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия, 5 мкл ЛПАА и 3 объема 96% этилового спирта и инкубировании при -20 °С в течение не менее двух часов. Далее раствор центрифугировали при 12000 g в течение 20 минут. Супернатант тщательно удаляли. Осадок промывали 75 % раствором этилового спирта и снова центрифугировали при 12000 g в течение 20 минут. Супернатант тщательно удаляли и осадок ДНК подсушивали при комнатной температуре в течение 10 минут. ДНК растворяли в 50-100 мкл элюата (2.5 мМ Трис-HCl, рН 8.5) или стерильной воде.

2.2.2.2. Выделение ДНК из свежезамороженных образцов опухоли

Выделение геномной ДНК из свежих образцов ткани проводили при помощи набора «Animal Tissue Genomic DNA Isolation kit» фирмы V-gene

Biotechnology (Китай). 20-30 мкг ткани помещали в стеклянный гомогенизатор и тщательно суспендировали, добавив 200 мкл буфера G-A и 0,9 мкл РНКазы А. Затем, гомогенизированную ткань переносили в 1,5 мл пробирку, предварительно добавив 200 буфера G-A. Смесь инкубировали в течение 5 мин при 65°С в водном термостате, после чего добавляли 400 мкл буфера G-В и перемешивали на вортексе в течение 15 с. Затем добавляли 650 мкл буфера Р2 и центрифугировали 1 мин при 12000 g для разделения фаз. Убирали верхнюю фазу (содержащую белки, липиды и полисахариды) и переносили нижнюю (содержащую геномную ДНК) на фильтр, помещенный в 1.5 мл пробирку. Центрифугировали 1 мин при 12000 g, после чего фильтр убирали и к раствору добавляли 650 мкл буфера В. Раствор хорошо перемешивали, переносили на мембрану, помещенную в 2.0 мл пробирку, и центрифугировали в течение 1 мин при 3600 g для осаждения геномной ДНК на мембране. Затем добавляли 500 мкл буфера W1 и центрифугировали в течение 1 мин при 3600 g. Профильтрованную жидкость убирали и дважды промывали мембрану 700 мкл буфера W2, центрифугируя после каждого раза 1 мин при 3600 g. Мембрану переносили в 1.5 мкл пробирку и добавляли 60 мкл элюа-та (2.5 мМ Трис-HCl, рН 8.5). Оставляли на 3 мин при комнатной температуре и затем центрифугировали в течение 1 мин при 12000 g. Профильтрованный раствор содержал геномную ДНК, которую использовали в дальнейшей работе.

2.2.3. Определение концентрации ДНК в растворе

2.2.3.1. Оценка концентрации раствора нуклеиновых кислот по оптической плотности

Для оценки качества выделенной геномной ДНК измеряли оптическую плотность раствора (D) на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония) при длинах волн 260, 230 и 280 нм. О степени загрязненности смеси ДНК/РНК белками судили по величине отношения D26(/D2so■ Приемлемой степенью очистки считали D26(/D28o ~ 1.6 — 1.8. О степени загрязненности смеси

ДНК/РНК полисахаридами судили по величине отношения D26(/D23o• Приемлемой степенью очистки считали D260/D230 — 1.8. При соответствующей степени очистки концентрацию смеси ДНК/РНК в образце рассчитывали, исходя из значения оптической плотности раствора, измеренной при 260 нм. Оптическая плотность D260 = 1 о.е. соответствует 50 мкг/мл смеси ДНК/РНК. Оптическую плотность измеренных образцов пересчитывали в концентрацию по следующей формуле:

С (мкг/мл) = D260 х 50 (мкг/мл)

2.2.3.2. Определение концентрации растворов ДНК с помощью калибровочной прямой TaqMan ПЦР-РВ

Перед началом исследования образцов нормирование концентрации исследуемых растворов ДНК проводили методом калибровочных прямых. В основе данного способа определения концентрации ДНК в растворе лежит раститровка исследуемой матрицы и вычисление исходной концентрации ДНК на основании результатов амплификации в сравнении с калибровочной прямой. Интенсивность флуоресцентного сигнала пропорциональна концентрации конечного продукта ПЦР. В качестве прибора для ПЦР-РВ использовали iQ Cycler (Bio-Rad, США).

Для построения калибровочных прямых использовали серию двукратных разведений контрольного раствора ДНК с известной концентрацией (от 1.25 до 80 нг/мкл начального раствора ДНК). Каждая точка была повторена трижды. В качестве нормировочного гена был использован ген UBC.

Для определения концентрации исследуемых растворов ДНК использовали 1 и 2 мкл стокового раствора исследуемого образца ДНК с неизвестной концентрацией. В отдельных лунках проводили реакцию амплификации фрагмента гена UBC для исследуемых образцов ДНК и амплификацию фрагмента гена UBC для серийных разведений раствора контрольной ДНК с заведомо известной концентрацией для построения калибровочной прямой. Начальную концентрацию ДНК в исследуемом образце высчитывали путем экстраполяции полученных значений Ct (точка в которой кривая интенсивности флуоресценции для данного образца пересекает заданное пороговое значение флуоресценции) для исследуемого образца на калибровочную кривую, построенную в координатах «значение Ct - Log начальной концентрации ДНК» (рис. 10). По полученным данным все образцы исследуемой ДНК разводили до концентрации 5 нг/мкл. Полученные рабочие растворы геномной ДНК из опухолевой ткани использовали в дальнейшей работе для определения дозы исследуемых генов.

А.

В. trz-— Ij--1 —

P'l'"

T/tf .

- — e t itr h w

- — — & t ~ 3 r" f -" iZ", ь 4-L л. --

----

L. ~

Б. г. ----;

No образца

Т 2 3 "4

5" ~6~

Log начального кол-ва ДНК "1.35 1.14 1.1 ' 1.07" 0.63~

0,44 начальная концентрация ДНК(нг/мкп) 22.7 14 12.7 11,9 9,62

4,27 2.77

Рисунок 10. Определение концентрации образцов исследуемой ДНК с помощью калибровочной прямой для фрагмента гена UBC методом TaqMan ПЦР-РВ. (А) Кривые интенсивности флуоресценции для серийных двукратных разведений раствора контрольной ДНК с известной концентрацией: слева-направо от 2.5 до 40 нг/мкл: в реакцию ПЦР-РВ брали 1 мкл из каждого разведения. (Б) График калибровочной прямой в координатах «значение Ct - log начальной концентрации контрольной ДНК»: (•) - значения Ct для кривых интенсивности флуоресценции из пункта 12.А.; (х) - значения Ct для кривых интенсивности флуоресценции для 7-ми образцов исследуемой ДНК с неизвестной концентрацией в растворе из п. 12.В. (В) Кривые интенсивности флуоресценции для 7-ми образцов исследуемой ДНК с неизвестной концентрацией: в реакцию ПЦР-РВ брали 1 мкл раствора исследуемой ДНК. (Г) Таблица со значениями концентраций 7-ми образцов исследуемой ДНК, полученных по результатам обсчета данных из графика 12.Б. программой Bio-Rad iQ5 Standard Edition v. 2.0.

2.2.4. Олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентные TaqMan зонды

Последовательность специфических праймеров и флуоресцентных TaqMan зондов подбирали с использованием программного обеспечения Primer Express Software v2.0 (Applied Biosystems, США) (таб. 1).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Маценко, Наталья Юрьевна, 2008 год

1. Akiyama Т., Sudo С., Ogawara Н., Toyoshima К., Yamamoto Т. The product of the human cerbB-2 gene: A 185-kilodalton glycoprotein with tyrosine kinase activity. // Science. — 1986. — V. 232. — PP. 1644 1646.

2. Albertson D. Gene amplification in cancer. // Trends in Genetics. — 2006.1. V. 22.—PP. 447-454.

3. Albertson D., Collins C., McCormick F., Gray J. Chromosome aberrations in solid tumors. // Nat. Genet. — 2003. — V. 34. — PP. 369 376.

4. Anderson S., Gilkerson E., Klein P. Concordance between local labs and a central lab using FISH and IHC for HER2 testing. // Program and abstracts of the 25th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium. — 2002. — Abstract 235.

5. Arlt M., Miller D., Beer D., Glover T. Molecular characterization of FRAXB and comparative common fragil site instability in cancer cells. // Genes Chromosomes Cancer. — 2002. — V. 33(1). — PP. 82 92.

6. Bargmann C., Hung M., Weinberg R. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. // Nature. — 1986. — V. 319 — PP. 226 230.

7. Baselga J. // Slide presentation at the 43rd ASCO Annual Meeting. 2007.

8. Baulida J., Kraus M., Alimandi M., Di Fiore P., Carpenter G. All ErbB receptors other than the epidermal growth factor receptor are endocytosis impaired. // Biological Chemistry. — 1996. — V. 271. PP. 5251 - 5257.

9. Beverley S., Coderre J., Santi D., Schimke R. Unstable DNA amplifications in methotrexate-resistant leishmania consist of extrachromosomal circles which relocalize during stabilization. // Cell. — 1984. — V. 38. — PP. 431 439.

10. Bianco M., Vasef M. HER-2 gene amplification in Paget disease of the nipple and extramammary site: a chromogenic in situ hybridization study. // Diagn. Mol. Pathol. —2006. —V. 15(3). —PP. 131 135.

11. Bieche I., Tomasetto C., Regnier С. H., Moog—Lutz C., Rio M. C., Lidereau R. Two distinct amplified regions at 17ql l-q21 involved in human primary breast cancer. // Cancer Res. — 1996 — V. 56. — PP. 3886 3890.

12. Bishop J. Molecular themes in oncogenesis. // Cell. — 1991. — V. 64. — PP. 235 248.

13. Boldog F., Gemmill R., West J., Robinson M., Robinson L., Li E. Chromosome 3pl4 homozygous deletions and sequence analysis of FRA3B. // Hum. Mol. Genet. — 1997. — V. 6(2) — PP. 193 203.

14. Burden S., Yarden Y., Neuregulins and their receptors: a versatile signaling module in organogenesis and oncogenesis. // Neuron. — 1997. — V. 18. — PP. 847-855.

15. Cao W., Hashibe M., Rao J. Comparison of methods for DNA extraction from paraffin-embedded tissues and buccal cells. // Cancer Detect Prev. — 2003.1. V. 27. —PP. 397-404.

16. Carraway K. and Cantlley L. A neu acqintance for erb-B3 and erb-B4: role for receptor heterodimerization in growth signaling. // Cell. — 1994. — V. 78.1. PP. 5-8.

17. Chang S. Modeling chromosomal instability and epithelial carcinogenesis in the telomerase-deficient mouse. // Cancer Biol. — 2001. — V. 11. — PP. 227 -239.

18. Chenna Т., Ramu N., Sugawara G., Hideaki H., Koike L., Tadashi A. Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. // Nucleic Acids Res. — 2003. — V. 31. — PP. 3497 500.

19. Cohen S., Ushiro H., Stoscheck C., Chinkers M. A native 170.000 epidermal growth factor receptor-kinase complex from shed plasma membrane vesicles. // J. of Biological Chemistry. — 1982. — V. 257. — PP. 1523 1531.

20. Coquelle A. Expression of fragile sites triggers intrachromosomal mammalian gene amplification and sets boundaries to early amplicons. // Cell. — 1997. — V. 89. —PP. 215-225

21. Couturier J., Beuzeboc P., Vincent-Salomon A. High correlation between erbB2 amplification detected by FISH and gene overexpression. // Modern Pathology. — 1999. — V. 12. — PP. 186 199.

22. Di Fiore P., Pierce J., Kraus M., Segatto O., King C., Aaronson S. ErbB-2 is a potent oncogene when overexpressed in NIH/3T3 cells. // Science. — 1987.1. V. 237. —PP. 178- 182.

23. Dia J. Clinical utility of an automated serum HER-2/пеи assay in monitoring patients with metastatic breast cancer. // Amer. Assoc. Clin. Chem. — 1998.1. Abstract 208.

24. Downward. J., Yarden Y., Mayes E., Scrace G., Totty N., Stockwell P., Ullrich A. Close similarity of epidermal growth factor receptor and v-erb-B oncogene protein sequences // Nature. — 1984. — V. 307. — PP. 521 527.

25. Fakharzadeh S., Rosenblum-Vos L., Murphy M., Hoffman E., George D. Structure and organization of amplified DNA on double minutes containing the mdm2 oncogene. // Genomics. — 1993. —V. 15. — PP. 283 290.

26. Franklin M., Carey K., Vajdos F., Leahy D., de Vos A., Sliwkowski M. Insights into ErbB signaling from the structure of the ErbB2 pertuzumab complex. // Cancer Cell. — 2004. — V. 5(4). — PP. 317 - 328.

27. Gellibolian R., Bacolla A., Wells R., Triplet repeat instability and DNA topology: an expansion model based on statistical mechanics. // J. Biol. Chem. — 1997. — V. 272(27) — PP. 16793 16780.

28. Gilliland G., Perrin S., Blanchard K., Bunn H. F. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. // Proc. National Academy of Science. — 1990. — V. 87. — PP. 2725 -2729.

29. Gisselsson D. and Hoglund M. Connecting mitotic instability and chromosome aberrations in cancer can telomeres bridge the gap? // Semin. Cancer Biol. —2005. —V. 15. —PP. 13-23.

30. Glover T. and Stein C. Chromosome breakage and recombination at fragile sites. // Am. J. Hum. Genet. — 1988 — V. 43. — PP. 265 273.

31. Glover T. and Stein C. Induction of sister chromatid exchanges at common fragile sites. // Am. J. Hum. Genet. — 1987. — V. 41. — PP. 882 890.

32. Gorlick R., Huvos A.G., Heller G. Expression of HER2/erbB-2 correlates with survival in osteosarcoma. // Clinical Oncology. — 1999. — V. 17. — PP. 2781 2788.

33. Graus-Porta D., Beerli R., Daly J., Hynes N. ErbB-2, the preferred het-erodimerization partner of all ErbB receptors, is a mediator of lateral signaling. // EMBO Journal. — 1997. —V. 16. — PP. 1655 1659.

34. Graziano C. HER-2 breast assay, linked to Herceptin. wins FDA's okay // CAP Today. — 1998. — V. 12. — PP. 13 16.

35. Hahn P. Molecular biology of double-minute chromosomes. // Bioessays. — 1993. V. — 15. — PP. 477 484.

36. Han D. and Guan J. Association of focal adhesion kinase with Grb7 and its role in cell migration. // J. Biol. Chem. — 1999. — V. 274. — PP. 24425 -24430.

37. Hellman A., Zlotorynski E., Scherer S.W., Cheung J., Vincent J.B., Smith D.I. A role for common fragile site induction in amplification of human oncogenes. // Cancer Cell. — 2002. — V. 1 — PP. 89 97.

38. Hewett D.R., Handt O., Hobson L., Mangelsdorf M., Eyre H.J., Baker E. FRA10B structure reveals common elements in repeat expansion and hromosomal fragile site genesis. // Mol. Cell. — 1998. — V. 1. — PP. 773 781.

39. Hubbard S., Till J. Protein tyrosine kinase structure and function: Annual review. // Biochemistry. — 2000. — V. 69. — PP. 373 398.

40. Hudziak R., Schlessinger J., Ullrich A. Increased expression of the putative growth factor receptor pl85HER-2 causes transformation and tumorigenesis of NIH 3T3 cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. США. — 1987. — V. 84. — PP. 7159 -7163.

41. Hyman E., Kauraniemi P., Hautaniemi S., Wolf M., Mousses S., Rozen-blum E. Impact of DNA amplification on gene expression patterns in breast cancer. // Cancer Res. — 2002. — V. 62. — PP. 6240 6245.

42. Hyun C., Lee H., Kim K., Kim S., Kim J., Choe G., Park S. The effect of chromosome 17 polysomy on HER2/neu status in breast cancer. // J. Clin. Pathol. — 2008. — V. 61. — PP. 317 321.

43. Isola J., Tanner M., Holli K. Amplification of topoisomerase II alpha is a strong predictor of response to epirubicin-based chemotherapy in HER-2/пеи positive metastatic breast cancer. // Breast Cancer Res. Treat. — 2000. — V! 64. — P. 31.

44. Izumi Y., Xu L., di Tomaso E. Tumor biology. Herceptin acts as an anti-angiogenic cocktail. // Nature. — 2002. — V. 416 — PP. 279 280.

45. Jacobs Т., Barnes M., Yaziji H., Gown A., Scnitt S. Comparison of fluorescence in situ hybridization (FISH) and immunohistochemistry (IHC) for the evaluation of HER-2/neu in breast cancer. // Modern Pathology. — 1999a. — V. 12. —PP. 230-244.

46. Jacobs Т., Gown A., Yaziji H. Specificity of HercepTest in determining HER-2/пги status of breast cancers using United States food and Drug administration-approved scoring system. // J. Clin. Oncol. — 1999b. — V. 17(7). — PP. 1983- 1987.

47. Jacobson К., Morrison L., Henderson В., Blondin В., Wilber K., Legator M. Gene copy mapping of the ERBB2/TOP2A region in breast cancer. // Genes Chromosomes Cancer. — 2004. — V. 40. — PP. 19 31.

48. Jarvinen Т., Liu E. Simultaneous amplification of HER2 (ERBB2) and topoisomerase Ilalpha (TOP2A) genes-molecular basis for combination chemotherapy in cancer. // Curr. Cancer Drug Targets. — 2006. — V. 6(7). — PP. 579 -602.

49. Kaptain S. Lee K., Chen B. Her-2/neu and breast cancer. // Diagnostic Molecular Pathology. —2001. —V. 10. —PP. 139- 152.

50. Katoh M. and Katoh M. MGC9753 gene, located within PPP1R1B-STARD3-ERBB2-GRB7 amplicon on human chromosome 17ql2, encodes seven-transmembrane receptor with extracellular six-cystein domain. // Int. J. Oncol. — 2003. —V. 22. —PP. 1369- 1374.

51. Kauraniemi P., Barlund M., Monni O., Kallioniemi A. New amplified and highly expressed genes discovered in the ERBB2 amplicon in breast cancer by cDNA microarrays. // Cancer Res. — 2001. — V. 61. — PP. 8235 8240.

52. Kim Y., Choi J., Song K., Chong W., Lee H. Evaluation of HER2/neu status by real-time quantitative PCR in breast cancer. // Yonsei Medical Journal. — 2002. — V. 43. — PP. 335 340.

53. Klapper L., Glathe S., Vaisman N. The ErbB-2/HER2 oncoprotein of human carcinomas may function solely as a shared co-receptor for multiple stroma-derived growth factors. // Proc. Natl. Acad. Sci. — 1999. — V. 96 — PP. 4995 5000.

54. Klapper L., Waterman H., Sela M., Yarden J. Tumor-inhibitory antibodies to HER-2 / ErbB-2 may act by recruiting c-Cbl and enhancing ubiquitination of HER-2. // Cancer Res. — 2000. — V. 60. — PP. 3384 3388.

55. Klein B. Soluble cerbB-2 (pi85) in breast cancer patients in relation to prognosis. // Oncology Reports. — 1995. — V. 2(5). — PP. 759 761.

56. Ко Т., Kelly E., Pines J. CrkRS: a novel conserved Cdc2-related protein kinase that colocalises with SC35 speckles. // J. Cell. Sci. — 2001. — V. 114. — PP. 2591 2603.

57. Krajewski W. Alterations in the internucleosomal DNA helical twist in chromatin of human erythroleukemia cells in vivo influences the chromatin higher-order folding. // FEBS Lett. — 1995. — V. 361(2-3) — PP. 149 152.

58. Kuwahara Y. Alternative mechanisms of gene amplification in human cancers. // Genes, Chromosomes Cancer. — 2004. — V. 41. — PP. 125 132.

59. Lafage M., Pedeutour F., Marchetto S., Simonetti J., Prosperi M., Gaudray P. et al. Fusion and amplification of two originally nonsyntenic chromosomal regions in a mammary carcinoma cell line. // Genes Chromosomes Cancer.1992. — V. 5. — PP. 40 49.

60. Lai P., Salazar P., Ladanyi M., Chen B. Impact of polysomy 17 on HER-2/neu immunohistochemistry in breast carcinomas without HER-2/пеи gene amplification. // J. Mol. Diagn. — 2003. — V.5. — PP. 155 159.

61. Lastowska M., Van Roy N., Bown N., Speleman F., Lunec J., Strachan T. et al. Molecular cytogenetic delineation of 17q translocation breakpoints in neuroblastoma cell lines. // Genes Chromosomes Cancer. — 1998. — V. 23. — PP. 116-22.

62. Lax I., Bellot F., Howk R., Ullrich A., Givol D., Schlessinger J. Functional analysis of the ligand binding site of EGF-receptor utilizing chicken/human receptor molecules. // EMBO Journal. — 1989. — V. 8. — PP. 421 427.

63. Lenzini E., Leszl A., Artifoni L., Casellato R., Tenconi R., Baccichetti C. Partial duplication of 17 long arm. // Ann. Genet. — 1988. — V. 31. — PP. 175 -180.

64. Livasy C., Reading F., Moore D., Boggess J., Lininger R.A. EGFR expression and HER2/neu overexpression/amplification in endometrial carcinosarcoma.//Gynecol. Oncol. — 2006. — V. 100(1). —PP. 101 106.

65. Ma Y., Lespagnard L., Durbecq V., Paesmans M., Desmedt C., Gomez-Galdon M. et al. Polysomy 17 in HER-2/neu status elaboration in breast cancer: effect on daily practice. // Clin. Cancer Res. — 2005. — V. 11(12). — PP. 4393 -4399.

66. Maitra A., Wanzer D., Weinberg A.G., Ashfaq R. Amplification of the HER-2/neu oncogene is uncommon in pediatric osteosarcomas. // Cancer. — 2001.1. V. 92. —PP. 677-83.

67. Martins M., Sabatier L., Ricoul M., Pinton A., Dutrillaux B. Specific chromosome instability induced by heavy ions: a step towards transformation of human fibroblasts? // Mutat. Res. — 1993. — V. 285. — PP. 229 237.

68. Masood S., Bui M. Prognostic and predictive value of HER2/neu oncogene in breast cancer. // Microsc. Res. Tech. — 2002. — V. 59. — PP. 102 108.

69. Masood S., Bui M. Prognostic and predictive value of HER2/neu oncogene in breast cancer. // Microsc. Res. Tech. — 2002. — V. 59. — PP. 102 108.

70. Maurer В., Lai E., Hamkalo В., Hood L., Attardi G. Novel submicro-scopic extrachromosomic elements containing amplified genes in human cells. // 1987. — Nature. — V. 327. — PP. 434 437.

71. McClintock B. Chromosome organization and genie expression. // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. — 1954. — V. 16. — PP. 13 47.

72. McClintock B. The fusion of broken ends of chromosomes following nuclear fusion. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1942. — V. 28. — PP. 458 463.

73. McKeage K. and Репу С. Trastuzumab: a review of its use in the treatment of metastatic breast cancer overexpressing HER2. // Drugs. — 2002. — V. 62(1).—PP. 209-243.

74. Meric F., Hung M., Hortobagyi G., Hunt K. HER2/neu in the management of invasive breast cancer. 11 J. Am Coll. Surg. — 2002. — V. 194. — PP. 488 -501.

75. Miller C. Genomic amplification of MET with boundaries within fragile site FRA7G and upregulation of MET pathways in esophageal adenocarcinoma. // Oncogene. — 2006. — V. 25. — PP. 409 418.

76. Mishmar D., Mandel-Gutfreund Y., Margalit H., Kerem B. Common fragile sites: G-Band characteristics within an R—band. // Am. J. Hum. Genet. — 1999. — V. 64. — PP. 908 910.

77. Mitra A., Murty V., Pratap M., Sodhani P., Chaganti R. ERBB2 (HER2/neu) oncogene is frequently amplified in squamous cell carcinoma of the uterine cervix. // Cancer Res. — 1994. — V. 54(3). — PP. 637 639.

78. Molina R., Jo J., Filella X., Zanon G., Pahisa J., Munoz M., Farms В., Latre M.L., Gimenez N., Hage M. c-erbB-2 oncoprotein in the sera and tissue of patients with breast cancer. Utility in prognosis. // Anticancer Research. — 1996.

79. V. 16(4B). — PP. 2295 2300.

80. Mrozkowiak A., Olszewski W., Piascik A., Olszewski W. HER2 status in breast cancer determined by IHC and FISH: comparison of the results. // Pol. J. Pathol. — 2004. — V. 55. — PP. 165 171.

81. Muleris M. Almeida A., Gerbault-Seureau M., Malfoy В., Dutrillaux B. Identification of amplified DNA sequences in breast cancer and their organization within homogeneously staining regions. // Genes Chromosomes Cancer. — 1995.1. V.14.—PP. 155 163.

82. Murnane J., Sabatier L. Chromosome rearrangements resulting from telomere dysfunction and their role in cancer. // Bioessays. — 2004. — V. 26. — PP. 1164- 1174.

83. Murray J., Przepiorka D., Ioannides C. Clinical trials of HER-2/neu-specific vaccines. // Semin. Oncol. — 2000. — V. 27. — PP. 71-75.

84. Muss H., Thor A., Berry D., Kute Т., Liu E., Koerner F. et al. C-erbB-2 expression and response to adjuvant therapy in women with node-positive early breast cancer. // New England J. of Medicine. — 1994. — V. 330(18). — PP. 1260 1266.

85. Nathanson D., Culliford A., Shia J., Chen В., D'Alessio M., Zeng Z., Nash et al. HER 2/neu expression and gene amplification in colon cancer. // Int. J. Cancer. — 2003. — V. 20. — PP. 796 802.

86. Park K., Han S., Gwak G., Kim H., Kim J., Kim K. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat. — 2006. — V. 98(3). — PP. 337 342.

87. Paulson Т., Almasan A., Brody L., Wahl G. Gene amplification in a p53-deficient cell line requires cell cycle progression under conditions that generate DNA breakage.//Mol. Cell. Biol. — 1998. — V. 18. —PP. 3089-3100.

88. Pearson C. and Sinden R. Trinucleotide repeat DNA structures: dynamic mutations from dynamic DNA. // Curr. Opin. Struct. Biol. — 1998. — V. 8(3). — PP.321 330.

89. Pfaffl M. A new mathematical model for relative quantification in realtime RT-PCR. // Nucleic Acids Res. — 2001 V. 29(9). — PP. 45.

90. Pinkas-Kramarski R., Lenferink A., Bacus S., Lyass L., van de Poll M., Klapper L. The oncogenic ErbB-2 / ErbB-3 heterodimer is a surrogate receptor of the epidermal growth factor and betacellulin. // Oncogene. — 1998. — V. 16. — PP. 1249 1258.

91. Pipiras E., Coquelle A., Bieth A., Debatisse M. Interstitial deletions and intrachromosomal amplification initiated from a double-strand break targeted to a mammalian chromosome. // EMBO J. — 1998 — V. 17. — PP. 325 333.

92. Plowman G., Culouscou J., Whitney G., Green J., Carlton G., Foy L. Ligand-specific activation of HER4/pl80erbB4, a fourth member of the epidermial growth factor receptor family. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1993. — V. 90. — PP. 1746- 1750.

93. Portera C. Poster 1028 presented at the 43rd ASCO Annual Meeting. — 2007.

94. Press M. Bernstein L., Thomas P., Meisner L., Zhou J., Ma Y. HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization: poor prognosis in node negative breast carcinomas. // Clinical Oncology. — 1997. — Vol. 15. —PP. 2894-2904.

95. Rebollo A., Schmitt C. Ikaros, Aiolos and Helios: transcription regulators and lymphoid malignancies. // Immunol. Cell Biol. — 2003. — V. 81. — PP. 171 -175.

96. Riese II D., Stern D. Specificity within the EGF/ErbB receptor family signaling network. // BioEssays. — 1998. — V. 20. — PP. 41 48.

97. Rogalla P., Helbig R., Drieschner N., Flohr A.M., Krohn M., Bullerdiek J. Molecular-cytogenetic analysis of fragmentation of chromosome 17 in the breast cancer cell line EFM-19. // Anticancer Res. — 2002. — V. 22. — PP. 1987 1992.

98. Ross J., Fletcher J. The HER-2/пеи oncogene: prognostic factor, predictive factor and target for therapy. // Semin. Cancer Biol. — 1999. — V. 9. — PP. 125 138.

99. Sabatier L. Ricoul M., Pottier G., Murnane J. The loss of a single telomere can result in instability of multiple chromosomes in a human tumor cell line. // Mol. Cancer Res. — 2005. — V. 3. — PP. 139 150.

100. Saltman D., Morgan R., Cleary M., Lange T. Telomeric structure in cells with chromosome end associations. // Chromosoma. — 1993. — V. 102. — PP. 121 128.

101. Santin A., Bellone S., Van Stedum S., Bushen W., Palmieri M., Siegel E. et al. Amplification of c-erbB2 oncogene: a major prognostic indicator in uterine serous papillary carcinoma. I I Cancer. — 2005. — V. 104(7). — PP. 1391 1397.

102. Sauer Т., Wiedswang G., Boudjema G., Christensen H., Karesen R. Assessment of HER-2/пеи overexpression and/or gene amplification in breast carcinomas: should in situ hybridization be the method of choice? // APMIS. — 2003.1. V. 111(3). — PP. 444 450.

103. Savelyeva L. and Schwab M. Amplification of oncogenes revisited: from expression profiling to clinical application. // Cancer Lett. — 2001. — V. 167. — PP. 115-123.

104. Schimke R., Sherwood S., Hill A., Johnston R. Overreplication and recombination of DNA in higher eukaryotes: potential consequences and biological implications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1986. — V. 83. — PP. 2157 2161.

105. Schwartz M., Zlotorynski E., Kerem B. The molecular basis of common and rare fragile sites. // Cancer Lett. — 2006. — V. 232. — PP. 13 26.

106. Segatto O., Lonardo F., Pierce J. The role of autoposphorylation in modulation of erbB-2 transforming function. // New Biol. — 1990. — V. 2. — PP. 187- 195.

107. Shih C., Padhy L., Murray M., Weinberg R. Transforming genes of carcinomas and neuroblastomas introduced into mouse fibroblasts. //Nature. — 1981.1. V. 290. —PP. 261 -431.

108. Singer M., Mesner L., Friedman C., Trask В., Hamlin J. Amplification of the human dihydrofolate reductase gene via double minutes is initiated by chromosome breaks. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. — 2000. — V. 97. — PP. 7921 7926.

109. Slamon D., Clark G., Wong S., Levin W., Ullrich A., McGuire W. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/пеи oncogene. // Science. — 1987. — V. 235. — PP. 177 182.

110. Slamon D., Godolphin W., Jones L., Holt J., Wong S., Keith D. et al. Studies of the HER-2/пеи proto-oncogene in human breast and ovarian cancer. // Science. — 1989—V. 244. — PP. 707 712.

111. Sliwkowski M. Schaefer G., Akita R., Lofgren J., Fitzpatrick V., Nuijens A. et al. Coexpression of erbB2 and егЬВЗ proteins reconstitutes a high affinity receptor for heregulin // Biological Chemistry. — 1994. — V. 269. — PP. 14661— 14665.

112. Sliwkowski M., Lofgren J., Lewis G., Hotaling Т., Fendly В., Fox J. Nonclinical studies addressing the mechanism of action of Trastuzumab. // Seminars in Oncology. — 1999. — V. 26. — PP. 60 70.

113. Stahl O., Sullivan S., Wingren S. C-erbB2 expression and benefit from adjuvant chemotherapy and radiotherapy of breast cancer. // Eur. J. Cancer. — 1995. —V. 31. —PP. 2185 -2190.

114. Stark G., Debatisse M., Giulotto E., Wahl G. Recent progress in understanding mechanisms of mammalian DNA amplification. // Cell. — 1989. — V. 57. —PP. 901 -908.

115. Stark G. and Wahl G. Gene amplification. // Annu. Rev. Biochem. — 1984. — V. 53. — PP. 447 491.

116. Stein D., Wu J., Fuqua S., Roonprapunt C.: The SH2 domain protein GRB-7 is co-amplified, overexpressed and in a tight complex with HER2 in breast cancer. //EMBO J. — 1994. — V. 13—PP. 1331 1340.

117. Sutherland G., Baker E., Seshadri R., Heritable fragile sites on human chromosomes V. A new class of fragile site requiring BrdU for expression. // Am. J. Hum. Genet. — 1980. — V. 32 (4). — PP. 542 548.

118. Takanashi M., Yagi Т., Imamura T. Expression of the Ikaros gene family in childhood acute lymphoblastic leukemia. // Br. J. Haematol. — 2002. — V. 117. — PP. 523 -530.

119. Tanaka S., Mori M., Akiyoshi Т., Tanaka Y., Mafune K., Wands J.R. et al. Novel variant of human Grb7 is associated with invasive esophageal carcinoma. // J. Clin. Investig. — 1998. — V. 102. — PP. 821 827.

120. Tanaka S., Mori M., Akiyoshi Т., Tanaka Y., Mafune K., Wands J.R. et al. Coexpression of Grb7 with epidermal growth factor receptor or Her2/erbB2 in human advanced esophageal carcinoma. // Cancer Res. — 1997. — V. 57. — PP. 28-31.

121. Thor A., Berry D., Budman D., Muss H., Kute Т., Henderson I. et al. ErbB-2 p53 and efficacy of adjuvant therapy in lymph node-positive breast cancer. // National Cancer Institute. — 1998. — V. 90. — PP. 1346 1360.

122. Toledo F., Buttin G., Debatisse M. The origin of chromosome rearrangements at early stages of AMPD2 gene amplification in Chinese hamster cells. // Curr. Biol. — 1993. — V. 3. — PP. 255 264.

123. Tower J. Developmental gene amplification and origin regulation. // Annu. Rev. Genet. — 2004. — V. 38. — PP. 273 304.

124. Tsugawa K., Fushida S., Yonemura Y. Amplification of the c-erbB-2 gene in gastric carcinoma: correlation with survival. // Oncology. — 1993. — V. 50(6). —PP. 418-425.

125. Varshavsky A. On the possibility of metabolic control of replicon 'misfiring': relationship to emergence of malignant phenotypes in mammalian cell lineages. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1981. — V. 78. — PP. 3673 3677.

126. Villman K., Sjostrom J., Heikkila R., Hultborn R., Malmstrom P., Bengtsson N. et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. // Blomqvist Acta Oncol. — 2006. — V. 45(5).—PP. 590-596.

127. Von Hoff D., Needham-Van Devanter D., Yucel J., Windle В., Wahl G. Amplified human MYC oncogenes localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1988. — V. 85. — PP. 4804 -4808.

128. Wahl G. Effect of chromosomal position on amplification of transfected genes in animal cells. // Nature. — 1984. — V. 307. — PP. 516 520.

129. Wang N., Testa J., Smith D. Determination of the specificity of aphidi-colin-induced breakage of the human 3pl4.2 fragile site. // Genomics. — 1993. — V. 17. —PP. 341 -347.

130. Wang S., Hung M. Transcriptional targeting of the HER-2/пеи oncogene. // Drugs Today (Bare). — 2000. — V. 36(12). — PP. 835 843.

131. Wang Y.-H., Gellibolian R., Shimizu M., Wells R, Griffith J. Long CCG triplet repeat blocks exclude nucleosomes: a possible mechanism for the nature of fragile sites in chromosomes. // J. Mol. Biol. — 1996. — V. 263(4). — PP. 511 -516.

132. Watters A., Going J., Cooke Т., Bartlett J. Chromosome 17 aneusomy is associated with poor prognostic factors in invasive breast carcinoma. // Breast Cancer Res. Treat. — 2003. — V. 77. — PP. 109 114.

133. Willis S., Hutchins A., Hammet F., Ciciulla J., Soo W., White D. et al. Detailed gene copy number and RNA expression analysis of the 17ql2—23 region in primary breast cancers. // Genes Chromosomes Cancer. — 2003. — V. 36. — PP. 382-392.

134. Windle В., Draper В., Yin Y., O'Gorman S., Wahl G. A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation and amplicon integration. // Genes Dev. — 1991. — V. 5. — PP. 160 174.

135. Witton C. Structure of HER receptors and intracellular localisation of downstream effector elements gives insight into mechanism of tumor growth promotion. // Breast Cancer Res. — 2003. — V. 5. — PP. 206 207.

136. Wright M., Grim J., Deshane J., Kim M., Strong Т., Siegal G. et al. An intracellular anti-erbB-2 single-chain antibody is specifically cytotoxic to human breast carcinoma cells overexpressing erbB-2. // Gene Ther. — 1997. — V. 4. — PP. 317-322.

137. Young S., Liu W., Brock J., Smith S. ERBB2 and chromosome 17 centromere studies of ovarian cancer by fluorescence in situ hybridization. // Genes, Chromosomes Cancer. — 1996. —V. 16(2). — PP. 130 137.

138. Yu D., Hung M. Overexpression of ErbB2 in cancer and ErbB2-targeting strategies. // Oncogene. — 2000. — V. 19. — PP. 6115 6121.

139. Yu S., Mangelsdorf M., Hewett D., Hobson L., Baker E., Eyre H. Human chromosomal fragile site FRA16B is an amplified AT-rich minisatellite repeat. // Cell. — 1997. —V. 88(3) — PP. 367 374.

140. Zabrecky J., Lam Т., McKenzie S., Carney W. The extracellular domain of pl85/neu is released from the surface of human breast carcinoma cells, SK-BR03. // Journal of Biological Chemistiy. — 1991. — V. 266(3). — PP. 1716 -1720.

141. Zhang L., Chang C., Bacus S., Hung M. Suppressed transformation and induced differentiation of HER-2/neu-overexpress'mg breast cancer cells by emodin. // Cancer Res. — 1995. — V. 55. — PP. 3890 3896.

142. Zhang Y., Xia W., Shao R., Sorgi F., Hortobagyi G., Huang L. et al. The tumor suppression activity of El A in HER-2/nea-ovQrexprQss'mg breast cancer.// Oncogene. —1997. —V. 14.—PP. 561 568.

143. Zlotorynski E.} Rahat A., Sakaug J., Ben-Porat N., Ozeri E.} Herschberg R. Molecular basis for expression of common and rare fragile sites. // Mol. Cell. Biol. — 2003. — V. 23. — PP. 7143 7151.

144. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. //Nucleic Acids Res. — 2003. — V. 31. — PP. 3406 3415.

145. Имянитов E.H., Черница О.И., Иванова О.А. Амплификация онкогена ERBB-2 (.HER-2/пеи) в опухолях молочной железы прогностический маркер вероятности рецидива. // Экспер. онкол. — 1992. — Т. 14 (4). — СС. 25 -29.

146. Личиницер М., Степанова Е., Перевощиков А., Яншин А. Избыточная экспрессия HER-2/пеи и новые лечебные возможности герцептина. // Ме-ждунар. журн. мед. практики. — 2000. — № 9.

147. Маценко Н., Рыжикова В., Коваленко С. Сравнение SYBR Green I и TaqMan форматов ПЦР в реальном времени для анализа дозы гена her2 в опухолях молочной железы человека. // Бюлл. экспер. биол. и мед. — 2008. -Т. 145(2). —СС. 201 -205.