Изыскание ускоренного метода определения общей бактериальной обсеменности сырого молока тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.03, кандидат ветеринарных наук Бабунова, Вероника Сергеевна

• Бабунова, Вероника Сергеевна
• кандидат ветеринарных наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат ветеринарных наук Бабунова, Вероника Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

I. ВВЕДЕНИЕ

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные показатели, характеризующие качество сырого молока • (технологические, физико-химические, биологические,

санитарно-гигиенические)

2. Факторы, влияющие на качество молока и изменение его бактериального состава в зависимости от общего

состояния организма и молочной железы коров. -

3. Современные методы определения общей бактериальной обсемененности (ОБО) сырого молока :

3.1. Прямые методы (подсчет КОЕ и бактериальных клеток);

3.2. Непрямые (косвенные) методы

4. Биолюминесцентные методы определения

общей бактериальной обсемененности

5. Государственные стандарты на качество молока при

сдаче-приемке его на молокоперерабатывающие предприятия

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Организация опытов и методы проведения исследований

2. Сравнительное изучение наиболее распространенных,

ускоренных методов по определению ОБО молока

3. Разработка биолюминесцентного метода определения

ОБО сырого сборного молока

3.1 Изыскание метода дифференциальной химической

обработки пробы для устранения небактериального

АТФ при биолюминесцентном методе определения ОБО молока;

3.2 Изучение влияние различных ПАВ на целостность бактериальных и соматических клеток с учетом

их количественного содержания;

4. Анализ проведенных экспериментальных исследований по разработке ускоренного метода определения ОБО

сырого сборного молока

5. Разработка биолюминесцентного метода с применением фильтрации через бактериальные мембранные фильтры, обеспечивающей его высокую чувствительность и

стабильность при определении ОБО сырого сборного молока. 98 6. Разработка методических рекомендаций по определению ОБО сырого сборного молока, их апробация в полупроизводственных условиях и проведение комиссионных испытаний

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

V. ВЫВОДЫ

VI. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

VIII. ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изыскание ускоренного метода определения общей бактериальной обсеменности сырого молока»

ВВЕДЕНИЕ

Молоко й молочные продукты занимают значительное место в пищевом рационе людей. Они служат основной пищей для детей раннего возраста и входят в состав лечебных диет при многих заболеваниях (42).

Молоко содержит все питательные вещества : полноценные белки, углеводы, минеральные вещества, в том числе микроэлементы, а также витамины, ферменты. Усвояемость питательных веществ молока высокая : белков - 96%, жира - 95%, углеводов - 98%. Молоко стимулирует усвоение питательных веществ из других пищевых продуктов. И.И.Павлов писал : "Между сортами человеческой еды в исключительном положении находится молоко . . . как пища, приготовленная самой природой". Такая высокая оценка академиком И.И.Павловым справедлива лишь к молоку высокого качества, получаемому с соблюдением санитарно-гигиенических правил (45).

Молоко - скоропортящийся продукт, его химические и физические свойства не стабильны и могут меняться под воздействием различных факторов. К таким факторам относятся порода и возраст животных, стадия лактации, условия кормления и содержания, техника доения, состояние здоровья, индивидуальные особенности, ферменты, находящиеся в молоке, бактерии, а также механические примеси и другие факторы из-за нарушения санитарно-гигиенических правил в помещениях, где содержат скот и где производится доение коров, нарушение условий первичной обработки и хранения молока.

В выдоенном молоке происходят различные процессы : окисление и гидролиз, биохимические изменения (реакции ферментов и антител),

микробиологические изменения (использование кислорода и питательных веществ, увеличение углекислого газа и других продуктов обмена, общего количества бактерий) (56).

А если молоко станет благоприятной средой для развития болезнетворной микрофлоры (например, Е. coli, S. dublin, М. tuberculosis, Br. bovis и др.), то это может оказаться причиной не только пищевого отравления, но и вызвать тяжелое заболевание.

Из всего комплекса санитарно-гигиенических мероприятий, обеспечивающих получение молока высокого санитарного качества, особая роль принадлежит методам контроля. Безусловно, анализ на содержание белка, жира, Сахаров важен для определения полноценности молока, но для санитарного контроля при разделении молока по сортам большое значение имеет определение следующих показателей : органолептические свойства, содержание соматических клеток, степень чистоты, наличие посторонних веществ, кислотность, общая бактериальная обсемененность, содержание в нем некоторых патогенных микроорганизмов, а так же микрофлоры, опасной с точки зрения технологии производства молочных продуктов (4, 36, 21, 8).

Для получения молока высокого качества необходимо строгое соблюдение на молочно-товарных фермах санитарных и ветеринарных правил, технологии доения, санитарного состояния доильного оборудования и молочной посуды, первичной обработки и хранения молока, а также необходимо иметь горячую воду, молокоприемные помещения и осуществлять контроль за качеством молока со стороны руководителей и специалистов хозяйств.

По бактериальной обсемененности молока можно судить о санитарно-гигиенических условиях его получения, первичной обработки, хранения и

транспортировки. Уровень общей бактериальной обсемененности определяет не только санитарное качество молока, но и его стойкость при хранении. Этот показатель является одним из наиболее распространенных в нормировании санитарно-гигиенического качества молока. В настоящее время в большинстве стран мира существуют национальные нормы микробиологического качества заготовляемого молока.

Так, в рекомендациях специальной комиссии стран общего рынка отмечено, что молоко, подлежащее пастеризации, не должно содержать более 500 тысяч КОЕ/ см3 .

Высокая, бактериальная обсемененность молока и наличие в нем

и о и 1

посторонней, не свойственной ему микрофлоры, делают его малопригодным для производства полноценных молочных продуктов (21).

Таким образом, ключевым звеном в цепи санитарно-гигиенических показателей является общая бактериальная обсемененность (ОБО), от которой зависит санитарное состояние молока. Это главный показатель, по которому определяют его качество при сдаче-приемке на молзаводе. Поэтому очень важно своевременное и достоверное определение данного показателя в лабораторно-производственных условиях. Успешное решение данной задачи невозможно без применения простых, быстрых и чувствительных методов контроля данного показателя.

Из всего арсенала существующих методов самыми быстрыми, простыми, доступными и наиболее распространенными являются редуктазные пробы. Однако данные методы не полностью отвечают современным требованиям в силу ряда недостатков.

Разделение молока на высший и первый сорта согласно ГОСТу 13264-88 по бактериальной обсемененности (т.е. до 300 тыс. КОЕ/см3 и от 300 до 500

тыс. КОЕ/см3) является не совсем целесообразным, поскольку в настоящее время достоверно установить данную разницу редуктазным методом, да и чашечным тоже, не представляется возможным. К тому же редуктазная проба с резазурином часто дает необъективные результаты из-за нестабильности выпускаемого препарата по оптической плотности и широкой цветовой гаммы при восстановлении индикатора. Низкая обеспеченность лабораторий индикаторами для данной пробы так же ограничивает ее применение, что является одной из причин изыскания более доступных и эффективных методов контроля.

В связи с этим большую значимость преобретает разработка быстрого и надежного по своей специфичности и чувствительности метода определения ОБО молока. Это и стало целью нашей работы.

Вышеизложенное обосновывает поставленную нами цель по разработке ускоренного метода определения ОБО сырого молока, соответственно которой на разрешение были поставлены следующие необходимые задачи:

1. Изучить в сравнительных исследованиях современные, ускоренные методы определения ОБО молока.

2. Разработать биолюминесцентный метод определения ОБО сырого сборного молока с изысканием отечественных реагентов.

3. Изучить влияние различных ПАВ на целостность бактериальных и соматических клеток сырого молока в зависимости от их количественного содержания.

4. Разработать условия для постановки биолюминесцентного метода, обеспечивающие стабильность, чувствительность и специфичность в сравнении с классическим методом прямого подсчета КОЕ/см3.

5. Разработать методические рекомендации по определению ОБО биолюминесцентным методом, апробировать их в полупроизводственных условиях и провести комиссионные испытания.

В результате проведенных исследований нами был разработан усовершенствованный метод определения ОБО сырого молока, с помощью которого можно определять молоко высшего сорта согласно ГОСТ 13264-88 "Молоко коровье. Требования при закупках."

На основании предложенного метода были разработаны "Методические рекомендации по определению общей бактериальной обсемененности сырого молока биолюминесцентным методом". Данный метод определения ОБО сырого сборного молока с помощью фильтрации пробы через бактериальные мембранные фильтры имеет существенные преимущества по сравнению с тестированными методами по своей специфичности (определяется только АТФ всех живых бактериальных клеток, исходно присутствующих в молоке), чувствительности (позволяет определять бактериальное качество молока с ОБО в 0,5х104 КОЕ/см3) и скорости получения результатов (30-35 мин для одной пробы, 1,5 ч. для 10 проб). Предлагаемый метод прошел комиссионные испытания. В настоящее время "Методические рекомендации по определению общей бактериальной обсемененности сырого молока биолюминесцентным методом" утверждены академиком-секретарём РАСХН, академиком А.М.Смирновым.

II.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОСНОВНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩИЕ КАЧЕСТВО СЫРОГО МОЛОКА ( ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ, БИОЛОГИЧЕСКИЕ, САНИТАРНО-ГИГИЕНИЧЕСКИЕ)

Молоко и молочные продукты употребляет в пишу повседневно все население. Это основная пища для детей раннего возраста. Из молока готовят различные полезные продукты : кефир, простоквашу, варенец, сливки, масло, сметану, сыр, творог, сгущенное молоко, мороженное и т.д.

Поэтому к качеству молока и молочных продуктов предъявляются особые требования. Они должны быть не только вкусными, питательными, красиво оформленными, но и безопасными для здоровья, то есть их употребление не должно вызывать заболеваний человека (42).

Молоко - сложный продукт не только из-за того, что оно содержит около 250 отдельных компонентов, но также вследствие изменчивости относительного содержания этих компонентов.

Химические, физические, биологические и функциональные свойства молока многообразны и сложны ввиду множества компонентов молока, биологической изменчивости их содержания и типов обработки, которым оно подвергается при производстве, переработке, доставке и реализации. Биологическая изменчивость является причиной того, что молоко любой

коровы отличается по свойствам от молока другой коровы и даже от собственного молока от дойки к дойке (47).

Питательная ценность молока иллюстрируется тем фактором, что ежедневное потребление 1 литра удовлетворяет в среднем всю суточную потребность взрослого человека в жире, кальции, фосфоре и рибофлавине, 50 % потребности в протеине, 33 % потребности в витамине А, аскорбиновой кислоте и тиамине, 25 % потребности в энергии (калориях) и, за исключением железа, меди и магния, удовлетворяет всю потребность во всех минеральных веществах. Молоко содержит также значительное количество никотиновой кислоты и холина (47).

Белки молока состоят, главным образом, из казеина, лактальбумина и лактглобулина. На свойстве казеина свертываться под воздействием ферментов и молочно-кислых микроорганизмов основано производство творога и сыра.

Альбумин молока играет важную роль в обеспечении процессов роста, глобулин - в образовании иммунных (защитных) тел.

Белки молока относятся к биологически наиболее полноценным, так как содержат все жизненно необходимые аминокислоты, в том числе полный комплекс незаменимых. Особенно благоприятно в молоке соотношение лизина, метионина и триптофана; хорошо представлены содержащие серу аминокислоты - метионин и цистин, играющие важную роль в профилактике атеросклероза.

Молочные жиры отличаются от других животных жиров особым вкусом и высокой усвояемостью. Используются как самостоятельный пищевой продукт - сливки и масло. Витамин А впервые был открыт именно в молочном жире. Роль данного витамина, которого в молочном жире много, в улучшении остроты зрения хорошо известна.

Углевод молока - лактоза, или молочный сахар, легко подвергается различным формам брожения, что используют в технологии производства молочнокислых продуктов, сыров. Интересно, что молоко является единственным источником лактозы в природе. Лактоза усиливает всасывание кальция, фосфора, магния и бария из кишечника. Благодаря этому уникальному свойству лактозы молоко является также превосходным антирахитическим продуктом питания, который предотвращает заболевание рахитом, если даже содержание витамина В в молоке низкое. Благодаря лактозе микроорганизмы кишечника синтезируют никотиновую кислоту. Поэтому молоко - превосходный антипеллагрический продукт.

Минеральные вещества находятся в виде солей органических и неорганических кислот. В золу молока входят Са, Р, К, М§, Б, С1 и другие. Высокое содержание легкоусвояемого кальция делает молоко особенно ценным продуктом питания, так как большинство других продуктов бедно кальцием. К микроэлементам молока относятся Хп, Со, Си, Мп, I, Бе, А1, Сг, РЬ, Тх, А§ и др. Ценность минерального состава молока - сбалансированность элементов, обеспечивающая нормальное развитие костной и других систем, особенно детского организма.

В молоке содержится большинство известных витаминов, которыми наиболее богато летнее молоко. Особенно богато молоко рибофлавином. В состав молока входит свыше 60 ферментов (лактоза, протеаза, липаза, амилаза, каталаза), способствующих пищеварению и играющих важную роль в процессах переработки молока в молочные продукты. В молоке содержатся гормоны (окситоцин, пролактин, фолликулин, адреналин, инсулин и др.), иммунные тела, способствующие созданию иммунитета к заболеваниям (антитоксины, агглютинины, опсонины и др.).

Молоко обладает буферной способностью, которая поддерживает его pH около 6,5-6,7. Свежее молоко имеет кислотность 16-18°Т. При 28-30°Т молоко сквашивается. Вязкость нормального молока колеблется от 1,5 до 2,0 сантипауз при 20°С. Казеин - основной компонент молока, влияющий на его вязкость.

В целом наличие в молоке клеточных компонентов нежелательно. Клеточные компоненты состоят, главным образом, из лейкоцитов и бактерий. Однако если бы лейкоциты в молоке не проявляли фагоцитарной активности, то инфекционные микроорганизмы заполнили весь организм коровы (47).

Различные отклонения вкуса, цвета, запаха и консистенции молока от нормальных критериев классифицируются как пороки. Причем причины пороков могут быть разнообразными : скармливание недоброкачественных кормов (например, большая примесь на пастбище дикого лука придаст молоку луковый вкус), обсеменение молока микроорганизмами (затхло-мыльный вкус от размножения психрофильных микроорганизмов Pseudomonas, Achromobacter, Alealigens, Serratia), заболевания животных (например, гнойный или кровянистый осадок при мастите, или своеобразный запах ацетона при ацетонемии), нарушение правил получения, хранения и транспортировки молока и т.д. (2, 33).

Таким образом, молоко обладает многочисленными свойствами: технологическими, физико-химическими, биологическими. В то же время одним из главных показателей качества молока является его санитарно-гигиеническое состояние, связанное с процессом выдаивания, дальнейшей переработки и хранения молока.

К примесям, имеющим значение с точки зрения охраны здоровья человека и обнаруживаемым в молоке, относятся антибиотики, пестициды, радиоактивные изотопы, механические примеси и различные другие

ингибирующие. вещества. Причиной загрязнения молока антибиотиками, например, обычно является неправильное их употребление, несоблюдение сроков невыдаивания молока от коров, получавших лечение, в общий удой (47).

Вопросам получения молока высокого санитарного качества и методам его контроля уделяется большое внимание как со стороны отечественных, так и зарубежных исследователей.

Молоко является хорошей питательной средой для всех видов микроорганизмов. Они, попадая в него с различных объектов внешней среды, быстро развиваются и количественно увеличиваются. В молоке имеется достаточное количество питательных веществ (белков, жиров и углеводов) в легко усвояемом для бактерий виде. Солевой состав молока также является оптимальным для бактерий. Образование слоя сливок при отстаивании молока создает хорошие условия для роста и размножения анаэробных микроорганизмов (18). Учитывая общее качество и соотношение компонентов, можно сказать, что ни один вид натуральной пищи не удовлетворяет столь полно потребность человека в питательных веществах, как молоко. Однако сотни видов микроорганизмов имеют сходные с человеком потребности в питательных веществах, и молоко является прекрасной средой для их роста. Бактериальное обсеменение молока является одним из главных факторов, приводящих к снижению его качества.

Одним из основных показателей, включенным в государственный стандарт (ГОСТ 13264-88) по определению качества молока является его общая бактериальная обсемененность (ОБО), разделяемая на классы.

Под общей бактериальной обсемененностью (ОБО) понимают наличие в молоке бактерий любых видов, в том числе сапрофитных (35, 38, 84, 86, 141).

Доказано, что существует тесная взаимосвязь между общей бактериальной обсемененностью и другими показателями санитарно-гигиенического качества молока. Увеличение содержания в нем ОБО отрицательно влияет и на органолиптические свойства молока, что делает малопригодным применение его для пищевых целей (37, 38, 89, 144, 171).

Одним из основных условий сохранения хорошего санитарно-гигиенического качества молока является его охлаждение. Снижение температуры получаемого молока до низких плюсовых значений задерживает развитие большинства групп микроорганизмов, особенно мезофильных (6, 14, 41, 52, 84, 119, 154).

Многие исследователи указывают на факт негативного влияния на санитарно-гигиенические показатели молока примеси молока коров, больных маститом, с повышенным содержанием соматических клеток (2, 36, 47, 53, 64, 80, 92, 134). Попадание в молоко механических примесей, таких как шерсть, частицы подстилки, навоз, корм так же ведет к увеличению ОБО (2, 9, 36).

Развивающиеся микроорганизмы разрушают биологически активные вещества, присущие молоку. При концентрации микроорганизмов от 200 до 500 тыс. КОЕ/см3 качество его быстро снижается, так как начинается разрушение белка и жира. Поэтому, с точки зрения гигиены питания присутствие в заготовляемом молоке более 1 миллиона микроорганизмов в 1 см3 недопустимо (21).

Объективные методы оценки санитарно-гигиенического качества молока и плата за него в зависимости от качественных показателей влияют на условия и способы получения, первичной обработки и хранения продукта на фермах. Оплата за молоко с учетом его качества стимулирует соблюдение санитарно-гигиенических условий при его получении (79).

Для определения показателя ОБО молока при его приемке в мировой лабораторной практике используются различные прямые и косвенные методы, более детальное изложение которых будет освящено в последующих главах обзора литературы.

Таким образом, молоку присущи самые многочисленные свойства, которые обеспечивают его исключительную ценность как пищевого продукта. Но полноценным можно считать только молоко, полученное с соблюдением санитарно-гигиенических правил. Только из такого молока можно выработывать высококачественные различные продукты питания.

Из приведенных данных следует, что сырое молоко должно соответствовать многочисленным показателям, которые обеспечивают его качество. Многие из них связаны с кормлением, выполнением различных технологических операций в процессе содержания и эксплуатации животных, сезонами года. В то же время исследователи наибольшее внимание уделяют санитарно-гигиеническим показателям, по которым осуществляли контроль качества молока, определение условий получения его на ферме, с точки зрения доения и состояния вымени коров и других факторов, прямо или косвенно отражающихся на качестве молока. Учитывая, что молоко является скоропортящимся продуктом, методы для его контроля должны быть в основном экспрессными, которые бы позволяли в кратчайшие сроки определять класс молока или его сортность.

2. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА КАЧЕСТВО МОЛОКА И ИЗМЕНЕНИЕ ЕГО БАКТЕРИАЛЬНОГО СОСТАВА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОБЩЕГО СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА И МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ КОРОВ.

В процессе получения, первичной обработки, хранения и транспортировки молока, полученного от здоровых коров, как правило, формируется его микробиологический состав. В силу своих исключительно высоких питательных свойств, молоко является превосходной средой для размножения микроорганизмов (6, 8, 31, 35). Поэтому процесс контаминации различными микроорганизмами происходит на всем пути прохождения от вымени животного и заканчивается автомолцистерной.

Молоко в вымени коров не является абсолютно стерильным и первые порции такого молока содержат большое количество бактерий, численность которых за время дойки постепенно уменьшается (70, 74, 111). Большинство авторов считает, что микроорганизмы, которые были обнаружены в молоке, полученном в асептических условиях, попадают внутрь молочной железы извне через сосковый канал. В свою очередь, источниками загрязнения поверхности сосков и вымени является подстилка, корм, фекалии, вода и т.п. (134).

На первоочередное значение "соскового пути" в проникновении микроорганизмов внутрь молочной железы указывает тот факт, что количество микроорганизмов в сосковом и паренхимном молоке сильно отличаются друг от друга. В первых струйках молока почти в 12 раз больше микробов, чем в последующих (5). Контаминация молока внутри молочной железы возможна гематогенным путем, или при поражении лимфатических узлов.

Количественный состав микрофлоры молока в момент его получения из вымени состоит из весьма ограниченного числа видов. В основном это сапрофиты - непатогенные микрококки, коринебактерии, коагулазоположительные стафилококки, проникшие в сосок из окружающей среды (3, 32, 134). По данным Н.К.Оксамитного (55), микрофлора паренхимного молока здоровых коров представлена исключительно кокковыми формами. При этом в 18% случаев была обнаруженна непатогенная, а в 3,4% -патогенная микрофлора (стафилококки и стрептококки). В противоположность сапрофитной микрофлоре загрязнение молока в вымени патогенными бактериями происходит большей частью через кровь. Однако имеется ряд патогенных и условно патогенных микроорганизмов, которые также как и сапрофиты, попадают с кожи вымени, загрязненной подстилки через сосковый канал в молочную цистерну и крупные молочные ходы. К их числу относятся главным образом возбудители мастита (36, 132, 134). Л.А.Маббит с соавторами экспериментально доказали, что добавление молока из одной клинически больной четверти вымени в общий удой от стада в 50 голов, приводит к увеличению содержания микроорганизмов от 103 до 105 на 1 см3 молока (48). Поэтому строгое и неукоснительное выполнение ветеринарно-санитарных требований по использованию молока от коров, больных маститом, направлено на снижение ОБО сборного молока, сохранение его высоких санитарно-гигиенических и питательных свойств.

На количество и состав микрофлоры секрета вымени коров влияют различные факторы, такие как : порода и возраст животного, физиологическое состояние вымени, стадия лактации, сбалансированность рациона питания, условия содержания животных и сезон года (22, 23, 64).

После выдаивания молоко контактирует с предметами внешней среды, в результате чего оно обсеменяется различными микроорганизмами. От состояния гигиены доения, некоторых других факторов внешней среды зависит количество микроорганизмов, попадающих в молоко. Большинство исследователей считают основными источниками микрофлоры сырого молока после его выдаивания следующие : доильное оборудование, кожные покровы коров, неудовлетворительное санитарно-гигиенические условия содержания животных (3, 29, 40, 52, 77, 174).

Доильная аппаратура и молочная посуда при недостаточном уходе за ними являются источником многих видов микроорганизмов, но среди них преобладают молочнокислые кокки, БГКП, псевдомонады (34, 83).

Наряду с доильным оборудованием, важным источником бактериальной контаминации является также и плохо обработанные емкости для охлаждения и транспортировки молока, за счет чего ОБО увеличивается в 3-4 раза (12, 29, 70, 84, 115 ).

Обсеменение молока из всех указанных источников определяет первоначальный количественный и качественный состав его микрофлоры. Последующая динамика развития микрофлоры зависит от условий дальнейшего хранения и транспортировки.

На развитие микрофлоры после получения молока основное влияние оказывают такие факторы как : время года, температура охлаждения, условия хранения и транспортировки (14, 52, 60, 84, 174).

Видовой состав свежевыдоенного молока, полученного в хороших ветеринарно-санитарных условиях, мало отличается по микробиологическим показателям от внутривымянного. Микрофлора такого молока стабильна и представлена, в большинстве случаев, стрептококками, коринебактериями и

микрококками (42, 127). Различия между данными авторов наблюдаются преимущественно в количественном содержании перечисленных групп микроорганизмов. Микрофлора сырого молока имеет в среднем следующий состав в процентах : молочнокислые стрептококки - 50-95, БГКП - около 10, микрококки - до 10, коринебактерии - до 10% (190). Молоко, полученное в плохих санитарных условиях, содержит более значительное количество БГКП, маслянокислых и гнилостых бактерий (15, 158).

В результате исследований О.Н.Якубчак (82) было установлено, что состав микроорганизмов молока высшего, I и II классов неодинаков. Так, в молоке высшего класса преобладают лактококки (82,1% к общему числу микроорганизмов), в молоке I класса по сравнению с высшим их количество уменьшается до 78,03%, а II - до 58,15%. Увеличение микробного числа в молоке I класса происходит в основном за счет БГКП, энтерококков и коринебактерий, в молоке II класса микробная обсемененность увеличивается также вследствие появления в большом количестве стафилококков, стрептококков, микрококков, дрожжей и плесеней.

Таким образом, в процессе периода лактации необходимо создавать такие условия, которые бы оказывали позитивное влияние на общее состояние здоровья животного и молочную железу. Из приведенных литературных источников можно заключить, что под воздействием неблагоприятных факторов изменяется не только микрофлора молока, но и его клеточный состав, биохимические свойства. Об этом свидетельствуют и применяемые разнообразные методы контроля на молочных предприятиях, позволяющие направить молоко для выработки определенных молочных продуктов. В этой связи можно констатировать трудности, встречающиеся у авторов при разработке экспрессных методов контроля качества молока.

3. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБСЕМЕНЕННОСТИ (ОБО) СЫРОГО МОЛОКА

В предыдущих разделах обзора литературы мы уже отмечали, что ОБО молока является важнейшим показателем его санитарно-гигиенического качества (36). ОБО определяют регулярно при сдаче-приемке молока.

Все методы определения ОБО молока можно разделить на две большие категории. Прямые методы - первая категория - это те , которые базируются либо на подсчете колоний после выращивания в питательной среде, либо подсчете количества бактерий путем микроскопии подкрашенных клеток. Непрямые методы - вторая категория - это те, которые базируются на измерении метаболической активности или ее продуктов (161).

Все описанные в литературе методы представлены в таблице 1.

Заключение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Бабунова, Вероника Сергеевна

V. выводы

1). Разработан биолюминесцентный метод определения ОБО сырого сборного молока с помощью фильтрации пробы через бактериальные мембранные фильтры, который имеет существенные преимущества по сравнению с методами государственного стандарта по своей специфичности (определяется только АТФ всех живых бактериальных клеток, исходно присутствующих в молоке), чувствительности (позволяет определять бактериальное качество г молока с ОБО в 0,5x10 КОЕ/см3) и скорости получения результатов (30-35 мин для одной пробы в трёх повторностях, 1,5 ч. для 10 проб);

2). Предлагаемый биолюминесцентный метод при полупроизводственных испытаниях на 163 пробах сырого молока показал высокую степень корреляции с контрольным , чашечным методом - 11=0,8. При этом установлено, что тип люминометра не оказывает влияния на показания биолюминесцентного определения уровня бактериального АТФ в пробах молока.

3). Установлено, что метод дифференциальной химической обработки пробы неоногенным ПАВ с периодатом натрия с целью разрушения небактериального АТФ не достаточно эффективен при биолюминесцентном определении ОБО сырого молока (11=0,37).

4). При сравнительном изучении редуктазных методов установлена их невысокая совпадаемость с классическим - подсчетом КОЕ/см3.

5). Отработаны методические приёмы при постановке чашечного метода, позволяющие получать более точные и стабильные результаты, что очень важно для классического, прямого метода, являющегося базовым при разработке новых ускоренных или усовершенствованния существующих методов определения ОБО молока.

6). Определено, что из испытанных семи детергентов Неонол-10 в отработанном нами режиме (1% концентрация в смеси с панкреатином медицинским, экспозиция 10 мин. при 45°С) придаёт молоку фильтруемость вследствие липолиза молочных жиров, обладает литическим действием на соматические клетки, не разрушая при этом бактериальные.

7). Установлено, что бактериальные мембранные фильтры с размером пор от 0,22 до 0,65 мкм задерживают в среднем около 99% микроорганизмов сырого молока. Экспериментально доказано, что бактериальные мембранные фильтры МФФКГ-4 с размером пор 0,6 мкм ("Владипор", Россия) имеют преимущества перед другими испытанными отечественными и зарубежными фильтрами так как: через этот тип фильтруется до 10 см3 смеси молока с детергентом и протеазой, не разрушается под действием ДМСО и легко смачивается водными растворами.

8). Разработанны "Методические рекомендации по определению общей бактериальной обсемененности сырого молока биолюминесцентным методом", которые позволяют проводить контроль молока в лабораториях, осуществляющих контроль по ОБО молока в любой момент его получения.

VI. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

На основании проведенной работы разработаны: "Методические рекомендации по определению общей бактериальной обсемененности сырого молока биолюминесцентным методом", утвержденные академиком-секретарём РАСХН, академиком АМ.Смирновым "11" ноября 1998 г. Данный метод определения ОБО сырого сборного молока с помощью фильтрации пробы через бактериальные мембранные фильтры имеет существенные преимущества по сравнению с тестированными методами по своей специфичности (определяется только АТФ всех живых бактериальных клеток, исходно присутствующих в молоке), чувствительности (позволяет определять бактериальное качество молока с ОБО в 0,5х104 КОЕ/см3.) и скорости получения результатов (30-35 мин для одной пробы, 1,5 ч. для 10 проб).

Список литературы диссертационного исследования кандидат ветеринарных наук Бабунова, Вероника Сергеевна, 1999 год

VIL СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Алышева Г.А., Брусиловский Л.П., Семенихина В.Ф. Про качество молока. // Тр. ВНИИ молочной промышленности, 1975, Вып.40, с 66-69.

2. Архангельский И.И. Санитария производства молока. - М.: Колос, 1974. -256 с.

3. Архангельский И.И. Методы санитарной оценки молока и доильного оборудования // Ветеринария, 1973, N6. - с.31.

4. Архангельский И.И., Карташова В.М. Гигиена молока и контрольего качества.М., Колос, 1966. - 247 с.

5. Асафей И.И., Мельдер А.Э., Олконен А.Г. Некоторые проблемы повышения качества молока // Животноводство, 1975, N5. - с. 68-72.

6. Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства. - М.: Агропромиздат, 1987. - 399 с.

7. Барабанщиков Н.В. Контроль качества молока на ферме. М.: Колос, 1977, 176 с.

8. Барабанщиков Н.В. Контроль качества молока и молочных продуктов. - М.: Колос, 1980. - с. 254.

9. Барабанщиков Н.В. Контроль качества молока на ферме. - М.: Агропромиздат, 1986. - 159 с.

10. Барабанщиков Н.В. Молочное дело. - М.: Агропромиздат, 1990. - 350 с.

11. Бек С.Ж., Хехир А.Ф. Метод быстрого подсчета бактерий в молоке. // Материалы XXI Междунар. молоч. конгр.- М., 1985, Т1, кн. 1. - с. 126.

12. Беленький Н.Г. Санитарно-гигиеническое качество заготовляемого молока и пути его улучшения // Научн. тр. ВАСХНИЛ.- 1980.- с. 27-31.

13. Беленький Н.Г., Королева Н.С., Даниленко И.П., Молочников В.В. Проблемы повышения санитарно-гигиенического качества заготовляемого молока // Молочная промышленность, 1982, N9. - с. 38-41.

14. Блоке Р., Вейс-Понсе JI. Охлаждение и бактериологическое качество сырого молока класса А // Материалы XXI Междунар. молоч. конгр.- М., 1985, Т1, кн. 1. - с.96.

15. Богданов В.М. Микробиология молока и молочных продуктов. - М.: Пищепромиздат, 1962. - 307 с.

16. Богданов В.М. Микробиология молока и молочных продуктов. - М.: Пищепромиздат, 1969. - 316 с.

17. Бровко Л.Ю., Трдатян И.Ю., Угарова H.H. Оптимизация биолюминесцентного метода определения микробной биомассы // Прикладная биохимия и микробиология. - Т.27, Вып.1, 1991. - с 134-141.

18. Вершигора А.Е. Санитарная микробиология. Клев, Здоровье, 1967, 199 с.

19. Винничук Д.Т. Белок жировых шариков молока коров. // Влхник аграрно! науки, Украина, 1994, N7. - с. 43-52.

20. Гаврилова Е.М. Люминесцентный иммуноанализ // Биотехнология (Итоги науки и техники ВИНИТИ), Т.З. - с. 6-55.

21. Глухих В.Л., Золотницкая В.Г. Технология производства молока и его бактериальная обсемененность // Пути и методы повышения продуктивности сельско-хозяйственных животных. - Пермь, 1991, с. 84-87.

22. Горинова Л.П., Карпусь Л.А. Санитарное качество молока и источники бактериального обсеменения его при разных способах содержания коров // Межведомств, сборн. Вет. наука - производству, Минск, 1983, Вып.20. - с. 160.

23. Горинова JI.П., Скибо В.Н. Бактериальная обсемененность молока при привязном стойлово-пастбшцном содержании // Тр. НИЭВ, Минск, 1977, Т. 15. - с.127.

24. ГОСТ 23454-88 Молоко. Методы определения ингибирующих веществ. Переиздан - 1997 год. - 4 с.

25 ГОСТ 13264-88. Молоко, молочные продукты и консервы молочные. Методы анализа. Часть вторая. - с. 152-176.

26. ГОСТ 27930-88. Молоко и молочные продукты. Биокалориметрический метод определения общего количества бактерий . Введен впервые . Введен с 01.01.90.- Издан ноябрь 1988. - 5 с.

27. ГОСТ 9225-84. Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа. Взамен ГОСТ 9225-68. Введен с 01.01.86.-Переиздан сентябрь 1984. - 25 с.

28. Гостищева Н.М., Карликанова С.Н. Использование сухих питательных сред для микробиологического контроля в молочной промышленности. М., ЦНИИТЭИ мясомолпром СССР, 1983 - 47 с.

29. Гусева A.C. Показатели санитарного состояния молока и доильного оборудования // Ветеринария, 1976, N3 .- с.45.

30. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. - М., Мир, 1991. - 544 с.

31. Житенко П.В. Оценка качества продуктов животноводства. - М.: Россельхозиздат, 1987. - 207 с.

32. Жмурко Т.В. Источники обсеменения микрофлорой молока и пути улучшения его санитарного качества // Научн. записки БЦСХИ, Б.Церковь, 1968, Т.16. - с.96.

33. Ивашура А.И. Гигиена производства молока. М.: Росагропромиздат, 1989.

34. Калина Г.П., Чистович Г.Н. Санитарная микробиология. - М.: Медицина, 1969. - 409 с.

35. Карташова В.М. Индикация патогенных бактерий в молоке и молочных продуктах . М.,Колос, 1973 - 222 с.

36. Карташова В.М. Гигиена получения молока. JL: Колос, 1980, с. 172-176.

37. Карташова В.М. Пути повышения санитарного качества молока // Пробл. вет. санитарии и зоогигиены в пром. животноводстве. М., 1985 - с. 59-67.

38. Карташова В.М. Получать молоко на фермах только высшего качества // Ветеринария , 1989 - с. 18-20.

39. Карташова В.М., Якубчак О.Н. // Докл. РАСХН, 1995, N5, с. 15-16.

40. Королева Н.С. Основы микробиологии и гигиены молока и молочных продуктов. - М.: Легкая пром.-ть, 1984. - 167 с.

41. Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Влияние температуры и продолжительности хранения на микрофлору и физико-химические показатели сырого молока // Молочная промышленность, - 1975, N6, с. 13.

42. Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Санитарная микробиология молока и молочных продуктов. - М., Пищевая промышленность, 1980 - 670 с.

43. Кочемасова З.И., Ефремова С.А., Рыбакова А.М. Санитарная микробиология и вирусологияю Мю: Медицина, 1987, 247 с.

44. Кравченко Ю.М., Теречик Л.Ф. Новые приборы для контроля состава и качества молока // Молочная промышленность., 1987, N 2, с. 39.

45. Кугенов П.В. Молочное дело. М.: Колос, 1974.

46. Кузин A.A., Гудков A.B., Щергин H.A. Обсемененность сырого молока психротрофами // Молочная промышленность , 1992, N 5 - с. 31-34.

47. Кэмпбелл Дж. Р., Маршалл Р.Т. Производство молока. М., Колос, 1980 -670 с.

48. Маббит Л.Н., Маккинон К.Х., Брамлей А.Дж. Санитарно-гигиенические аспекты производства молока // Материалы XXI Междунар. молоч. конгр.- М., 1982, Т2. - с.65.

49. Медди Э., Данн М. Биохимическое исследование мембран. М.: Мир, 1979, с. 160-175.

50. Методы контроля молочных продуктов : Сб. науч. тр. / ВНИИ маслодельной и сыродельной пр.-ти ; Под ред. Н.П.Захаровой. - Углич, 1985 -85 с.

51. Миляновский А. Г. Антисептические средства в современных технологиях ветеринарии и животноводства. М., 1998.

52. Мюнх Г.Д. Микробиология продуктов животного происхождения. - М.: Агропромиздат, 1985, 590 с.

53. Наурызбаев И.Б., Асильбеков Б.А. Изучение бактериальной обсемененности молока коров при субклиническом мастите .. Сб. науч. тр., Алма-Ата, 1983, с. 101-105.

54. Озол Я.Н., Рога И.Ф. Определение окислительно-восстановительной способности молока // Тр. ЛСХА. - Елгава, 1980 - с. 92-93.

55. Оксамитный Н.К. Микрофлора вымени здоровых коров // Тр. ВНИИВС, 1969, Т.34. - с.131.

56. Олконен А.Г. Производство высококачественного молока. М., Колос, 1982 -172 с

57. Олконен А. Г. Редуктазная проба с резазурином для определения бактериальной обсемененности молока. // Животноводство, 1984, N 3 - с 4344.

58. Патратий А.П., Шидловская В.П. Критерии качества молока для расчета с поставшиками // Обзор, информ. ЦНИИТЭИММП. - М.,1982. - 16 с.

59. Патратий А.П., Шидловская В.П., Аристова В.П. Системыоценки качества сырого молока и оплаты за него в разных странах // Обзор, информ. ЦНИИТЭИММП. - М.,1974. - 20 с.

60. Поникарова Э.Ф. Изменение микрофлоры сырого молока по сезонам года // Исслед. микробиол. процессов при произ.-ве молоч. продуктов и молоч. консервов. - М., 1983. - с. 3-5.

61 Пяткин К.Д. Микробиология. - М., Медицина, 1980 - 520 с.

62. Петтифер Г.Л., Родригес И.М. Прямое флуоресцентное микроскопирование - новый метод ускоренного бактериологического контроля молока и молочных продуктов // Материалы XXI Междунар. молоч. конгр.- М., 1982, Т1, кн. 2, с. 259.

63. Романова H.A., Бровко Л.Ю., Угарова H.H. Сравнение методов экстракции внутриклеточного АТФ микроорганизмов различного типа для биолюминесцентного определения клеток микроорганизмов // прикладная биохимия и микробиология, 1997, Т.ЗЗ, N 3. - с 344-349.

64 Рыкшина 3., Смунева В. Источники бактериальной обсемененности молока // Молочное и мясное скотоводство, 1982, N11. - с.42.

65. Сюди Е., Сурен Г., Хешен В., Толлс А. Разработка Люмулюс-теста для определения количества грамотрицательных бактерий в молоке и молочных продуктах // Материалы XXI Междунар. молоч. конгр.- М., 1982, Т1, кн. 2, с. 309-310.

66. Тепел А. Химия и физика молока. М., Пишевая промышленность, 1979, 624 с.

67. Угарова H.H. Биоаналитические применения люциферазы светляков (Обзор). // Прикладная биохимия и микробиология , Т. 29, вып. 2, 1993 - с. 180-192.

68. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Лебедева O.B. Иммобилизованные биолюминесцентные системыв аналитической биохимии и биотехнологии // Биотехнология (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР), М., 1986, т.6, -

с 88-163.

69. Угарова H.H., Бровко Л.Ю., Трдатян И.Ю., Райнина Е.И. Биолюминесцентные методы анализа в микробиологии // Прикладная биохимия и микробиология, Т. XXIII, 1987, Вып. 1, с 14-24.

70. Унгер А., Бабела Ж. Изменение общей бактериальной обсемененности молока, полученного на фермах промышленного типа, в процессе транспортировки на молочный завод // Материалы XXI Междунар. молоч. конгр.- М., 1982, Т1, кн. 1, с. 122.

71. Фостер Э.М., Нельсон Ф.Ю., Спекк М.Л., Детч Р.Н., Ольсон Дж.С. Микробиология молока. М., Пищепромиздат, 1961, 536 с.

72. Хинкл П., Мак-Картни Р. Как клетки делают АТФ / Молекулы и клетки. М.: Мир, 1982, Вып.7. - с 191-220.

73. Хоменко В. И. Гигиена получения и ветсанконтроль молока по Государственному стандарту. К.,Урожай, 1985 - 256 с.

74. Хоменко В. И. Гигиена получения и ветсанконтроль молока по Государственному стандарту. К.,Урожай, 1990 - 400 с.

75. Цветков Е.И., Гулюкин Н.В. Изучение чувствительности к антибиотикам микрофлоры, выделенной из молока клинически здоровых коров // Матер, докл. - Рига, 1979 - с.36.

76. Чужова З.П., Белова Т.Н. Ускоренный метод посева молока при определении количества бактерий // Тр. ВНИИ маслодельн. и сыродельн. пр.-ти, 1978, N2 - с. 10-12.

77. Шалбурова Н.П., Руденко А.В. Технология производства и санитарное качество молока // Сб. науч. работ, М., 1988. - с. 61-66.

78. Шидловская В.П. Тесты для определения вторичного бактериального обсеменения пастеризованного молока // Молочная промышленность, N7, 1997. - с 36-37.

79. Шидловская В.П., Давыдова И.Р., Волокитина З.В. Качество молока и методы его определения в различных странах. М., АгроНИИТЭ-ИММП, 1988 -45 с.

80. Ширшов Ю.И. Количественный показатель соматических клеток в молоке и его влияние на качество молочной продукции .. Материалы XXI Межд. мол. конгр. по мол. делу. М., 1982. Т.1, кн. 1. - с.49 .

81. Шлегель Г.Общая микробиология. М.: Мир, 1987, 566 с.

82. Якубчак О.Н. Контроль санитарного качества молока по общей бактериальной обсемененности // Ветеринария, 1995, N12, с. 44-46.

83. Яндаров А. Д. Санитарное качество молока на фермах с децентрализованным водоснабжением / Тр. ВНИИВС, 1973, Т.45. - с. 100-105.

84. Agger P. The bacteriological influence on raw milk during collection and storage // Kieler Milchwirtschaftliche Forschungeberichte, 1981, V. 33, N4, p. 363-368.

85. Alexander D.N., Egerer G.M., Matsen J.M. // J. Clin. Microbiol. 1976, V.3, N 1, p.42-46.

86. Алексиева В., Крушев Б. Проучване върху качествовато на суровато раве мляко // Ветеринарномед. науки., 1981, Г. 18, N 3, с. 65-70.

87. Antila U., Kyla-Siurola A.L. Determination of milk quality by means of the Lactocult method. // Milchwissenscaft , N 31, 1976.

88. Arold W. Modelluntersuchungen zur pyruvatbidung durch psuchrotrophe microorganismen.// Dairy Sciena Abstracts, 1977, N 41, p. 39-49.

89. Auclair J., Grappin R., Lapied L. Ricaard la paietment du lait suivant qualité hygiénique et sa composotion aux Paus Bas // Rev. lait, franc., 1970, N 27(8), s. 511-515.

90. Bautista D.A., Mclntyre L., Laleye L., Griffits M.W. The aplication of ATP bioluminescence for the assesment of milk guaüty and factory hygiene // J. of rapid methods and automation in microbiology, 1992, 1, p. 179-193.

91. Beck C.G., Hehir A.F. The rapid fluorescence method for counting bacteria in milk // Austral. J. Dairy Technol., 1982, 37, N 2, p. 66-67.

92. Bennet R.H. Milk quality and mastitis: the managment connection Proc 26 Ann. meet, Nation, mastitis council., Orlande, 1987, p. 133-150.

93. Bigerre B. Payment for milk according to bacteriological quality // XVIII Intern. Daily Congress. - Sydney, 1970, V. IE, B 9, p. 658.

94. Bossoyt R. Determination of the bacteriological quality of raw milk by an ATP assay technique // Milcliwissenscaft 36, 1981, p. 257-260.

95. Bossoyt R. A 5-minute ATP platform test for jodging the bacteriological quality of raw milk // Netli. Milk Dairy J., 36, 1982, p. 355-364.

96. Botha W.C., H. Luck, P.J.Jooste. The applicability of the adenosine triphospate method as a rapid bacteriological platform test // S. Afr. J. Dairy Technol., 17, 1985, p. 59-64.

97. Brander M. rA.T.P. bacterien en industrie laitiere // Rev. enil., 1985 , N 102, 24-29.

98. Breed R.S. The determination of the member of bacteria in milk by direct microscopic examination // Zentralblatt für Bactériologie, 1911, 30, p. 337-340.

99. Britz T.J., Bezuidenhount J.J.,Dreyer J.M., Steyn P.L. Use of adenosine triphospate as an indicator of the microbial counts in milk // S. Afr. J. Dairy Technol., 12, 1980, p. 257-260.

100. Brodscy M.H., Ciebin B.W. Collaborative evaluation of the plate loop technique for determining viable bacterial counts in raw milk // J. of Food Protection, 1980 , 43 , p. 287-291.

101. Catoir M., Gerbin R., Goy A. Essais du "Coulter Counter " pour le dénombrement de la flore totale du lait cru. // Lait, 1974, 54, 22-30.

102. Chappelle E.W., Picciolo G.L. US Patent 3, 745, 090, 1973.

103. Chappelle E.W., Picciolo G.L. Analitical applications of bioluminescence and chemiluminescence, NASA, Washington, 1975, Doc. SP-388.

104. Chappelle E.W., Picciolo G.L., Curtis C.A., Knust E.A., Nibley D.A., Vance R.B. Laboratoy procedures manual for the firefly luciferase assay for ATP. // Goddard Space Flight Centre, Greenbelt, MD, 1975, Doc. N. X-726-75-1.

105. Conningham J.D., Seunders C.L. Collaboraitive study of the Bactoscan - an automated method for determination of total bacteria in raw milk // Can. Inst. Food Sei. and Technol. J. , 1988, v. 21, N 5, p. 464-466.

106. Connor F. An impedance method for the determination of the bacteriological quality of raw milk // Kiel, milchwirt. Forschunaber, 1982, v. 34, N 1, p. 123-128.

107. Cordellaha C., Michel J.P. Une novelle techique pour l'estimatio de la qualité bactériologique du lait cru réfrigéré. // Rev. lait, franc., 1976, N343, 369, 371-372, 375.

108. Cornett J.B., Shockman G.D. Cellular lysis of Streptococcus faecalis induced with Triton-X-100.// J. of bacteriology, 1978, 135, p. 153-160.

109. Desfleurs Maurice, Desfleurs Marcel. Evaluation de la teneur en germes, gram négatifs des laits et ses consequences. // Lait, 1977, 57, N 567, 375-583.

110. Donnelly C.B., Peeler J.T., Campbell J.E. Spiral plate count method for the examination of raw and pasteurized milk // Applied and Environmental Microbiology, 1976, 32, p. 21-27.

111. Dorner W. The bacterial flora of asseptically drown milk // Agr. Exp. Sta. Techn. - Geneva. - 1930. - p. 165.

112. Elbertzhägen H. Zur Problematik der enzymatishen Pyruvat estimmung // Rohmilch. Dairy Sei. Abstracts , 1979 , 42, 2135.

113. Firstenberg-Eden R., Tricario M.K. Impedimetric determination of total , mesephilic and psychrophilic counts in raw milk //J. Food Sei., 1983, v. 48, N 6, p. 1750-1754.

114. Firstenberg-Eden R., Eden G. Impedance microbiology // Res. Studies Press Ltd, Letchworth, Hertford hire, England , 1984 , 356.

115. Fluchinger E. Bacterial contamination and miltiplocation during the trenaport of milk from the farm to the dairy and during the storage in the dairy / Inaited Paper IDF Symp. on Bact. Qu. of Haw Milk., Kiel., 1981. - 347-354.

116. Fowller J.L., Clark Jr. W. S., Foster J.F., Hopkins A. Analyst variation in doing the standart plate count as dascribed in "Standard methods for the examination of dairy products"// J. of Food Protection, 1978, 41, 4-7.

117. Fruin J.T., Hill T.M., Clarkl J.B., Fowller J.L. Accuracy and speed in counting agar plates. // J. of Food Protection, 1977, 40, 596-599.

118. Fung D.Y.C., LaGrange W.S. Microtitre Method for enumirating viable bacteria in milk // J. of Milk and Food Technology, 1969, 32, 144-146.

119. Gehriger G. Manipulation of bacteria in milk during farm storage // Kiel. Milchvirt. Forschungaber, 1981, V. 33, N 4, p. 317-323.

120. Gering M. Wo liegen die Schwerpunkte der Beratung im Hinblick auf die EG-Hugiene-Rechtlinien? // Die Milchpraxis, 1987, Bd.25, N 4, s. 194-195.

121. Gibbs B., Freame B. Method for the recovery of Clostridia from foods // J Appl. Bacter., 1965, v. 28, p. 95-111.

122. Griffiths M. ATP to detect bacteria in dairy products // J. Soc. Dairy Technol., 1989, V.42, N 3, p. 61-62.

123. Gunstheim R. Untersuchungen zur eignung do electroniscen microkoloneizählung für die keim Zahlbestimmung von milch. // Tierärziliche Hochschule, 1971, 36, 2721.

124. Han S.H., C.H.Kim, J.B.Kim, H.K.Shin, S.B.Lee. Determination of bacterial number in milk by ATP assay monitored by luciferin-luceferase bioluminescence reaction // Korean J. Anim. Sei., 27, 1985, 782-784.

125. Hancs J.H., James D.F. The enumiration of bacteria by the microscopic method // J. of Bacteriology , 1940, 39, 297-305.

126. Hausler W.J. Standard methods for the examination of dairy products. 13th ed., American Public Health Association, Washington , D.C., 1972.

127. Heescen W., Tolle A., Sucrin C., Reichmuth J. The development of an automated system of analysis for the determination of the bacteriological quality of milk // Berichte über Landwirtschaft Sonderheft, 1975, N190, 179-214.

128. Heeschen W., Suhrin C, Reichmuth J. On the possibility of measuring the quality of milk and of milk products // Kieler Milchwirtschaftliche Forschungeberichte, 1987, Bd. 39, N1, s. 3-26.

129. Heinemann R., Rohr M.R. A bottle agar method for bacterial estimates // J. of Milk and Food Tech., 1953, 16, p. 133-135.

130. Huhtanen C.N., Brazis A.R., Arleidge W. L., Donnelly C.B., Ginn R.E., Randolph H.E., Koch E.J. Temperature equilibration times of plate count agar and a comparison of 50 versus 45°C for recovery of raw milk bacteria // J. of Milk and Food Tech., 1975, 38, p. 319-322.

131. IDF (1991) Milk and Milk Products (Enumeration of Microorganisms. Colony Count Technique at 30°C), IDF Standart 100B: 1991, IDF, Brussels, Belgium/

132. Jeffrey D.C., Wilson J. Effect of mastitis - related bacteria on total bacterial count of milk supplies // J. Soc. Dairy Technol., 1987, V.40, N2. - p. 23-26.

133. Johus C.K. Use of counts after preliminary incubation to improve raw milk quality for a Denver Plant // J. Milk and Food Tech., 1975, v.38, N8, p. 481-482.

134. Jorgensen R. The microflore of the udder : interior and surface // Kiel, milcherrt. Forsehungeber, 1981, V.33, N4. - p. 289-297.

135. Kang H.M., Chung C.I., Jeong D.X. The impedimetric measurment of total and psychrotrophic microorganisms in raw milk using bactometr // Korean J. of Dairy Sei., 1994, v. 16, N4. p. 361-368.

136. Kampmann W. Rohmilchqualität - ein Wettberwerbsargument // Deutshe Milchlirtschaft, 1987, Bd. 38, N. 35, s. 1200-1202.

137. Kazimir L., Tokarova E. Suitability of resazurin and reductase tests for the evaluation of microbiological quality of milk //Acta Zootechn., 1986, 41, p. 107-121.

138. Kazimir L., Tokarova E. Vhodnost resazurinovej a reduktazovej sküsky kvality mlieka // Acta Zootechn., 1986, N XLI, p. 117-121.

139. Kielwein G. Experiences in enumeration of microorganisms in raw milk by Bactoscan // Kieler Milchwirtschaftliche Forschungeberichte, 1982, Bd. 34, N1, s. 74-77.

140. Klima H. Field trials of the dip slide method for determining the bacterial content of pasteurized milk and milk products, // Dairy Sei. Abstracts, 1974, 37, p. 3600.

141. Koterske B., Koppe K., Hnetoweka M. Metody microbiologicane stosowene w Klesifikacii mleke // Pkreglad Mlecsazeki, 1076, R. 24, N 8, s. 11-12.

142. Kwse W.S., Domnett T.W., Vos A.C. Application of membrane filtration method for the detection of Gram-negative bacterial contamination in pasteurized milk // Austral. J. Dairy Technol., 1988, v. 43, N2, p. 54-57.

143. Kyriakides A. ATP rapid microbiology: experiences in the dairy industry // J. of Bioluminescence and Chemiluminescence, Vol. 7, 1992, p.257.

144. Law B.A. Review of progress of Dairy Science. Enzymes of psychrotrofic bacteria and their effect on milk and milk product // J, of Dairy Sei., 1979, V. 41.

145. Levin J., Band F.B. The role of endotoxin in the extracellular coagulation of Limulus blood // Bulletin of J. Hopkins Hospital, 1964, v. 115, p. 265-274.

146. Levewitz D. An inquiry into the usefulness of the standard methods durect microscopic count // J. of Milk Food Technol., 1957, v. 20, p. 288-293.

147. Lim S.D., Kim KS., Kim H.S., Chung S.H., Kang T.S. Studies on rapid microbiological testing method of raw milk by applied resazurin reduction tast (RRT) method. // Korean J. of Dairy Sei., 1994, v. 16, N1, p. 92-98.

148. Lim S.D., Kim K.S., Kim H.S., Chung S.H., Suh J. H., Choi J.P. Studies of rapid bacterial counting method, for raw milk using the Bactoscan // Korean J. of Dairy Sei., 1995, v. 17, N2, p. 123-128.

149. Luck H. Reduction test for determination of the bacteriological quality of raw milk //Inv. Paper IDF Sym. on Bacteriol. Qu. of Raw milk, Kiel., 1981, p. 108-114.

150. Lundin A. Analitical applications of bioluminescence: the firefly system. / In L.J. Kricka and J.N.Carter (eds.) Clinical and biochemical luminescence. Dakker. New York. 1982, p. 43-74.

151. Lundin A. Application of firefly luciferase. / In M. Serio and M.Pazzagli (eds.) Luminescent assays: perspectives in endocrinology and clinical chemistry. Raven Press N 4, 1982, p. 43-74.

152. Lundin A., Thore A. Analitical applications of bioluminescence. // Appl. Microbiol., 1975, 30, N.5, 713-721.

153. McKinnon C.H., Pettipher G.L. A survey of sources of heatresistant bacteria in milk with particular reference to psychrotrophic sporeforming bacteria // J. Dairy Sci., 1983, V.50, N 2, p. 163-170.

154. Marshall R.T. Relationship between the bacteriological quality of raw milk and final products. A review of basic information and practical aspects // Kiel. Milchwirt. Forschungaber, 1982, V. 34, N 1, p. 149-157.

155. Mello Filho Alexandre, Agostineti Gentian Jair, Xavier Antonio Jose, Celso de Castro Luiz. Dulpa redutase na determinacao da verdadeira qualidade do leite de consumo. // Rev. microbiol., 1977, 8, N2. - 43-45.

156. Mossel D.A. The suitability of certain obligately anaerobic nonsporeforming enteric bacteria as part of more extended bacterial association, as indicators of faecal contamination of foods. // J. of Appl. Bacter., 1959, v. 20, N2, p. 184-192.

157. Myers R.P., Pence J.A. A simplitied procedure for the laboratory examination of raw milk supplies. // J. of Milk Tech., 1941, 4, p. 18-25.

158. Neave F.K. In the control of bovine mastitis // Reading, 1971. - p. 19-63.

159. Nieuwcnhof F.F.J., Hoolwerf G.D. Suitability of Bactoscan for the estemation of the bacteriological quality of raw milk // Milchwissenschaft, 1988, V.43, N 9, p. 577-586.

160. O'Connor F. Rapid test for assessing microbiological quality of milk // Austral. J. Dairy Technol., 1984, V.39, N 2, p. 61-65.

161. O'Toole D.K. Methods for the direct and indirect assesment of the bacterial content of milk. // J. of Appl. Bacter., 1983, 55, p. 187-201.

162. Palaniswami K.S. Limulus amoebolysate test in assesment of bacteriel quality of milk // Indian J. Microbiol., 1988, V.28, N 3-4, p. 238-239.

163. Peeler J.T., Lister J.R., Danillson J.W., Messer J.W. Replicaate counting errors by analysts and bacterial colony counters. // J. of Food Protection, 1982, 45, p. 238240.

164. Peterson O., Jorgrnsen J. Development in the quality of milk as influenced by the payment for milk // XVIII Intern. Dairy Congress. - Sydney, 1970, V. IE, B 9, p. 676.

165. Pettipher G.L. The direct epifluorescent filter technique. // Kiel. Milchwirt. Forschungsber., 1982, 34, N1, p. 67-73.

166. Pettipher G.L. The DEFT for the rapid enumeration of bacteria in milk. // Dairy Ind. Int., 1983, 48, N5, pp. 21, 23, 25-26.

167. Pettipher G.L., Fulford R.J., Mabbitt L.A. Collaborative trail of the direct epifluorescent filter technique (DEFT) a rapid method for counting bacteria in milk // J. of Appl. Bacter., 1983, V.54, p. 177-182.

168. Pettipher G.L., Mansell R., McKinnon C.H., Cousins C.M. Rapid membrane filtration - epifluorescent microscopy techique for direct enumeration of bacteria in raw milk. // Appl. Environ. Microbiol. , 39, 1980, 423-429.

169. Prekoppova J., Boros V., Krcal Z. Zhodnotenie resazurinoveho testu. // Pram. Potravin, 1983, 34, N8. - 417-420.

170. Purnendu C. Vasavada. Rapid methods and Automation in Dairy Microbiology //J. Dairy Sei., 76, 1993, 3101-3113.

171. Rashed A., Buday P. Hidegen traolt nyers tejbol izdalt posychrotrol mikroorganizmusek identifikalase es anyagescre - sktivisanok visagalata // Tejipet., 1081, V. 30, N 3, 54-57.

172. Reinheimer J.A. Iinpiego del seggio di ridusiond del bleu di metilene per la valutasione della qualita microbiologica del latte crudenrefrigerate // Sei. e tech. latt. - casearia, 1988, 39, N 2, c. 102-111.

173. Reybroeck W., Schräm E. Improved filtration method to assess bacteriological quality of raw milk based on bioluminescence of adenosine triphospate // Netherlands Milk and Dairy J.,49 (1), 1995, 1-19.

174. Richard J. Bacteriological diagnosis of hygienic shortcomings at the farm level // Kiel. Milchwirt. Forschungsber., 1982, 34, N1, p. 101-104.

175. Richardson G.H., Yuan J.T.C., Sisson D.V., Stokes B.O. Enumeration of total bacteria in raw and pasteurized milk by refrectance colorimetry : collaborative study. // I. of AOAC International, 1994, 77 N3. - p. 623-627.

176. Senyk G.F., Shipe W.F.,Ledford R.A. Measurment of pyruvate content in milk ultrafiltrates for evaluation of bacteriological quality. // J. Dairy Sei., 1984, 67, N8. -p. 1660-1665.

177. Славчев Георги. Проучване въерху приложението на пируватния тест за определяне бактериалната активност в млякотою . // Ветеринарномед. науки, 1979, 6, N 5. - 41-47.

178. Sondhi H.S., Neelakantan S., Мог S., Kishan S. Pyruvate as an indicator of hydienic status of milk. // Indian J. of Microbiology, 1996, 36, N1. - p. 57-59.

179. Stadhouders J. The Polarographie Measurement of the dissolved oxygen in milk as an index of the bacteriological quality of milk // The Netherl. milk, Dairy J., 1965, V. 19, N 22, P. 25-32.

180. Stadhouders J. Een orienterend onderzoek omtrent de bacteriologische kwaliteit van rauwe melk en het polarografisch bepaalde gehalte aan zuurstof // Ede, 1965, 7882.

181. Stahlhut-Klipp H., Rojahn I. Unter suchungen zum Gehalf und sur Bedeuting von Phospholyruvat in rohmilch // Daits. Milchwissenschaft, 1987, N 38, 978-983.

182. Stanley P. Introduction to ATP rapid microbiology // J. Bioluminescence and Chemiluminescence, 1992, Vol.7, p.255.

183. Suhren G. Determination of pyruvate and other metabolites // Kiel. Milchwirt. Forschungsber, 1982, V. 34, N 1, s. 117-123.

184. Suhren G. Zur Messung der bacteriologischen qualitat der rohmilch mit der Bactoscan-Verfahren / Bactoscan III 8000 // Molkerei-Ztg. Weit Mich., 1989, N 19, 598-602.

185. Suhren G., Heeschen W. Impedance assays and the bacteriological testing of milk and milk products // Milchwissenschaft, 1987, V.42, N 10, p. 619-627.

186. Suhren G., Heeschen W., Tolle A. Macrokolonien, microcolonien and pyruvat in rohmilch. // Deutsche Molkerei - Zeitung, 1981, N102, 1716, 1718, 1721-1722.

187. Sutherland A.D., Bell C., Limond A., Deacin J. // J. Soc. Dairy Technol., 1994, V.47, N. 4, p. 117-120.

188. Teger S.G. Study of automated epifluorescent microscopy for evaluation of bacteriological quality of raw milk.//Sodobno Kmetystvo, 1985, V28, N6, p.267-269.

189. Theron D.P., B.APrior, P.M.Lategan. Effect of temperature and media on adenosine triphospate cell content in Enterobacter aerogenes // J. Food Prot., 46, 1983, p. 196-198.

190. Thomas S.B. The influence of the regrigerated farm bulk milk tank of the quality of milk at the processing dairy // J. Soc. Dairy Tech., 1974, V.27. p. 180-189.

191. Thompson D.L., Donnelly C.B., Black L.A. A plate loop method for determining viable count of raw milk. // J. of Milk and Food Tech., 1960, N 23, p. 167-171.

192. Thompson D.L., Sherman G., Mykleby R.W., Weber M., Moats W.A. Direct microscopic count. In Standard Methods for the Examination of Dairy Products, 13th edn. ed. Hausler J., Washington , p. 158-176.

193. Tolle A. Pyruvate as a central key substance in the bacterial catabolism of milk. // Dairy Sei. Abstracts, 1973, N36. - p. 229.

194. Tolle A., Heeschen W. Pyruvate determination - a new means of measuring the bacteriological quality of milk. // Milchwiserschaft, 1972, V. 27, N6. - s. 343-352.

195. Tolle A., Zeidler H., Heeschen W. New methods for evaluating the hygiene quality of raw milk. // Milchwiserschaft, 1969, 21, 757-763.

196. Ukeda H., Goto Y., Sawamura M., Kusunose H., Kamei T. Estimation of microbial count in raw milk based on a colorimetric reaction with vitamin K3 and tetrazolium salt. // J. of the Japonese Society for Food Sei. and Tech., 1995, 42, N9. - p. 627-633.

197. Uysae H.R., Kavas G. // Ege univ. ziraat fak derg., 1995, 32, N 3, 141-148.

198. Vaara M. // Microbiol. Rev., 1992, V.56, N 3, p. 395-411.

199. Van Heddeghem A., Reybroeck W., Van Crombrugge J. De bruikboarheid van de bactoscan 2/87 bij de bepaling van het kiemgetal van rauwe melk // Rev. Agr., 1990, An. 43, N6, p. 1039-1051.

200. Waes G., J. Van Crombrugge, W.Reybroek. The ATP-F test for estemation of bacteriological quality of raw milk // Neth. Milk Dairy J., 43, 1989, 347-354.

201. Waes G., J. Van Crombrugge, W.Reybroek. The ATP test for estemation of bacteriological quality of raw milk // Bui. Intern. Dairy Federation., N 256, 1991, p.53-60.

202. Webster J.A.J., Hall M.S., Rich C.N., Gilliland S.E., Ford S.R., Leach F.R. Improved Sensitivity of the bioluminescent determination of numbers of bacteria in milk samples // J. of Food Protection, V.51, N 12, 1989, p. 949-954.

203. White C.H. Rapid method for estimation and prediction of shelf-life of milk and milk and dairy products. // J. Dairy Sei, 1993, 76, p. 3126-3132.

204. WintererH. Microbiologische Methoden sur Erfassung der Rohmilchquelitat // Milchw. Ber., 1976, 31, s. 637.

205. Wiesner H.V. Bewertung der Anlieferungsmilch nach Keimzahe und in Zukunft // Deutsche Milchwirtscaft, 1987, Bd.38, N 18, s. 557-563.

206. Wiesner H.V., Tschischale R., Zimmer C. Hygiensce und Sinnfällige Beschaffenheit der Anlieferungsmich in Dänemark // Deutsche Milchwirtscaft, 1988, Bd.39, N 16, s. 521-523.