Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами на разных стадиях транскрипционного цикла тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Членов, Марк Михайлович

• Членов, Марк Михайлович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Членов, Марк Михайлович

Введение.

Обзор литературы.

Общее строение бактериальной РНК-полимеразы.

Структурные элементы кор-фермента.

Неконсервативные домены больших субъединиц кор-фермента РНКП.

Основные этапы прокариотической транскрипции.

Взаимодействия холофермента РНКП с однонитевыми фрагментами ДНК. .26 . Взаимодействие холофермента РНКП с гибридным промоторным фрагментом, имитирующим открытый комплекс.

Материалы и Методы.

Питательные среды и антибиотики:.

Получение компетентных клеток и их трансформация.

Ферменты, использованные для клонирования.

Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР).

Очистка фрагментов ДНК.

Электрофорез белков и нуклеиновых кислот.

Нативный электрофорез ДНК в агарозном геле.

Денатурирующий электрофорез ДНК и РНК.

Нативный электрофорез белков и белок-ДНКовых комплексов.

Денатурирующий электрофорез белков в ПААГ.

Клонирование и очистка белков.

Очистка и выделение РНКП.

Клонирование и экспрессия большого неконсервативного домена РНКполимеразы.

Очистка НКД (3 '-субъединицы.

Клонирование и очистка РНКП с мутациями в (3 -субъединице.

Клонирование и очистка НКД (3 '-субъединицы Е.соИ.

Перманганатный и эндонуклеазные футпринты.

Химические сшивки и картирование.

Получение ДНК-матрицы с фотоактивной сшивающей группой.

Фотоактивная ковалентная ДНК-белковая сшивка.'.

Картирование ДНК-белковых сшивок.

Кристаллизация и разрешение структуры НКД (3 '-субъединицы Е.соИ. Кристаллизация белка.

Сбор данных рассеяния.

Построение трехмерной модели структуры НКД.

Результаты и обсуждение.

Изучение ДНК-белковых взаимодействий в промоторном комплексе с помощью олигонуклеотидов с фотохимическими сшивающими группами. .48 Общее распределение фотохимических сшивок из матричного и нематричного олигонуклеотидов в субъединицы РНКП.

Картирование контактов ст-субъединицы с олигонуклеотидами нематричной цепи ЬасиУ5 промотора.-.

Картирование контактов ¡3 - су бъ единицы с олигонуклеотидами нематричной цепи ЬасиУ5 промотора.

Картирование контактов ß '-субъединицы с олигонуклеотидами нематричной цепи LacUV5 промотора.

Анализ распределения фотохимических пришивок в субъединицы холофермента РНКП.

Мутации С-консервативного района ß-субъединицы E.coli и их эффект на взаимодействие РНКП с промоторной ДНК.

Мутации консервативного района С ß-субъединицы E.coli.

Определение границ промоторного комплекса РНКП с мутацией DRV. 71 Изучение чувствительности промоторного комплекса РНКП DRV к низкой температуре.

Изучение свойств промоторного комплекса РНКП с точечной мутацией

4348.

Структурный контекст мутаций промоторного комплекса и предполагаемый механизм их воздействия на ДНК-белковые взаимодействия.

Структура и функции НКД ß'-субъединицы РНКП E.coli.

Мутации и делеции НКД ß'-субъединицы E.coli.

Получение кристаллов НКД ß'-субъединицы E.coli.

Сбор данных рассеяния.

Построение трехмерной модели структуры НКД.

Общая архитектура молекулы НКД ß '-субъединицы РНКП E.coli.

Построение модели элонгационного комплекса с учетом структуры НКД ß

-субъединицы.

Выводы.