Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Емельянов, Максим Олегович

• Емельянов, Максим Олегович
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Емельянов, Максим Олегович

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Окислительный стресс.

1.1.1. Понятие окислительного стресса.

1.1.2. Активные формы кислорода.

1.1.2.1. Общее понятие активных форм кислорода.

1.1.2.2. Супероксидный анион-радикал.

1.1.2.3. Пергидроксильный радикал.

1.1.2.4. Перекись водорода.

1.1.2.5. Гидроксильный радикал.

1.1.2.6. Синглетный кислород.

1.1.2.7. Гипохлорид.

1.1.2.8. Оксид азота.

1.1.2.9. Пероксинитрит.

1.1.3. Источники активных форм кислорода.

1.1.3.1 Метаболические пути образования АФК.

1.1.3.2. Образования АФК митохондриями во время гипоксии и гипероксии.

1.1.3.3. Образования АФК при действии ионизирующего облучения

1.1.4. Роль АФК.

1.1.4.1. Клеточная сигнализация.

1.1.4.2. Экспрессия генов.

1.1.4.3. Регуляция клеточной гибели.

1.1.4.4. Регуляция клеточного роста.

1.2.Методы определения окислительного стресса в клетках.

1.2.1. Определение супероксидного аниона-радикала.

1.2.2. Детекция перекиси водорода.

1.2.3. Детекция пероксинитрита.

1.2.4. Использование флуоресцентного красителя 2',7'-дихлорофлуоресцеина.

1.3. Множественная лекарственная устойчивость.

1.3.1. Неклеточные механизмы устойчивости.

1.3.2. Клеточные формы устойчивости.

1.3.3. Природная устойчивость.

1.3.4. Приобретенная устойчивость.

1.3.4.1. Роль ключевых генов, контролирующих апоптоз, в развитии лекарственной устойчивости.

1.3.4.2. Транспортные белки, ответственные за множественную лекарственную устойчивость.

1.3.4.2.1. Структура Р-гликопротеина.

1.3.4.2.2. Конформационные изменения структуры Р

§р.

1.3.4.2.3. Субстратная специфичность Р

§р.

1.3.4.2.4. Ген ггкМ, кодирующий Р-гликопротеин, генетические механизмы Р-^р-МЛУ.

1.3.4.2.5. Экспрессия шс!г1 в нормальных тканях и клетках.

1.3.4.2.6. Роль МЛУ, опосредованной Р-^р, в злокачественных новообразованиях.

1.3.4.2.7. МЯР, белок, ассоциированный с множественной лекарственной устойчивости.

1.3.4.2.8. Ингибиторы транспортных белков МЛУ.

1.3.5. Регуляция МЛУ.

1.3.5.1. Влияние цитокинов на МЛУ.

1.3.5.2. Роль фосфолипазы С и протеинкиназы С в регуляции МЛУ.

1.3.5.3. Роль МАРК каскада в МЛУ.

1.3.5.4. Факторы транскрипции, регулирующие МЛУ.

1.3.5.5. Влияние окислительного стресса на экспрессию генов и синтез белков, ответственных за МЛУ

2. Материалы и методы.

2.1. Реактивы и среды.

2.2 Определение количества клеток в опухоли.

2.3. Облучение клеток.

2.4. Культуры клеток. Определение выживаемости клеток.

2.4.1. Клетки Р388 и P388VR. Определение влияния винкристина и перекиси водорода на выживаемость клеток.

2.4.2. Клетки НЕр-2. Определение влияния винкристина и облучения на выживаемость клеток.

2.5. Определение АФК.

2.5.1. Определение АФК в клетках Р388 и P388VR.

2.5.2. Определение АФК в клетках НЕр-2.

2.6. Определение активности транспортных белков.

2.6.1. В клетках НЕр-2.

2.6.2. В клетках P388VR.

2.7. Статистический анализ.

3. Результаты.

3.1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках DCF.

3.2. Определение АФК в клетках в различных условиях.

3.2.1. Влияние на АФК в клетках in vitro состава среды, концентрации клеток, перекиси водорода.

3.2.2 Влияние ионизирующей радиации на АФК в клетках.

3.3. Влияние окислительного стресса на МЛУ клеток лимфолейкоза P388VR.

3.3.1. Изменение МЛУ при росте клеток in vivo.

3.3.2. Влияние перекиси водорода на МЛУ.

3.4. Влияние ионизирующей радиации на МЛУ клеток НЕр-2.

3.4.1. Влияние радиации на МЛУ. Зависимость от дозы, концентрации клеток и времени после облучения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение влияния окислительного стресса на множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток»

По данным Всемирной Организации Здравоохранения онкологические заболевания являются одной из самых распространенных причин смерти на Земле. Несмотря на многолетние изучения проблемы рака, терапия онкологических заболеваний сталкивается с рядом трудностей, одной из которых является множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток к различным противоопухолевым препаратам.

Устойчивость к лекарственным препаратам может развиваться вследствие блока в опухолевых клетках апоптоза, вследствие особенности роста опухоли, при которых уменьшается кровоснабжение опухоли, и следовательно, доставка препаратов с кровью. МЛУ также может быть результатом инактивации препарата в клетке, снижения его поступления в клетку и повышения вывода препарата из нее. В последнее время показано, что множественная лекарственная устойчивость опухолевых клеток, обусловленная откачкой из клеток противоопухолевых препаратов транспортными белками, является одним из главных факторов снижающих эффективность химиотерапии опухолей. Поэтому изучение регуляции экспрессии и активности транспортных белков в опухолевых клетках важно для химиотерапии опухолей.

В последние десятилетия возросло внимание ученых к изучению эффектов активных форм кислорода. В качестве месенжеров они влияют на такие клеточные процессы как клеточная гибель, старение, пролиферация, экспрессия генов, множественная лекарственная устойчивость. Относительно последнего имеется большой ряд работ, посвященных эффекту активных форм кислорода на синтез транспортных белков, ответственных за множественную лекарственную устойчивость. Причем этот эффект носит довольно противоречивый характер: в одних случаях окислительный стресс стимулирует МЛУ за счет синтеза новых белков, в других - подавляет, а в третьих - не оказывает влияния вовсе. Скорее всего, противоречивость эффектов связана с различиями в типах клеток, генах, которые экспрессируют разные белки, в концентрациях АФК. Все это в совокупности дает разные результаты в экспериментах о влиянии АФК на МЛУ. Одной из наших задач было посмотреть влияние ионизирующего облучения как модулятора АФК на множественную лекарственную устойчивость на уровне синтеза транспортных белков, отвечающих за МЛУ.

При большом количестве работ о влиянии АФК на синтез транспортных белков, ответственных за МЛУ, нами не было обнаружено статей о влиянии окислительного стресса на активность самих транспортных белков. Поэтому одной из задач данного исследования было оценить влияние окислительного стресса на активность белка P-gp, обеспечивающего множественную лекарственную устойчивость клеток мышиного лимфолейкоза P388VR мышей.

Параллельно с увеличением внимания к изучению эффектов АФК появилось большое количество методов количественного определения АФК как в клетке, так и в растворе. Довольно часто используется флуоресцентный краситель, который начинает светиться после взаимодействия с окислителем (АФК). Одним из таких красителей является 2',7'-дихлорфлуоресцин. В методах определения АФК пользуются его предшественником 2',7'-дихлорофлуоресцин диацетатом, который, после попадания в клетку, посредством внутриклеточных эстераз теряет две ацетатные группы, приобретает заряд и таким образом "запирается" в клетке. Появившийся в клетке 2',7'-дихлорфлуоресцин в реакции с АФК становиться 2',7'-дихлорфлуоресцеином, который флуоресцирует и определяется спектрофлуориметрически или микроскопически. Главная проблема использования этого детектора - его неустойчивость, что сказывается на точности результатов. 2',7'-дихлорофлуоресцин диацетат при нейтральном рН способен спонтанно гидролизоваться, а 2',7'-дихлорфлуоресцин спонтанно окисляться. По этому еще одной задачей настоящей работы явилась адаптация использования DCF для измерения окислительного стресса в клетках.

Задачи исследования:

1. Разработать метод определения АФК в клетках с использованием 2',7'-дихлорофлуоресцин диацетата и определить АФК в клетках в норме и при действии окислительного стресса различной природы (радиация, перекись водорода).

2. Изучить влияние ионизирующего облучения на МЛУ клеток рака гортани человека НЕр-2.

3. Изучить влияние окислительного стресса на активность белка Р-§р и МЛУ клеток Р388УЯ мышиного лимфолейкоза.

1. Обзор литературы.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Емельянов, Максим Олегович

4. Заключение.

4.1. Разработка нового метода определения АФК по количеству образовавшегося в клетках БСГ.

Одним из результатов данной работы является адаптация использования 2',7'-дихлорофлуоресцина для определения количества активных форм кислорода при окислительном стрессе (избыточная концентрация эндогенно-добавленной перекиси водорода, ионизирующее облучение). Был рассмотрен ряд параметров, влияющих па спонтанный гидролиз БСРНл-ОА и окисление ВСРН2. Из полученных результатов стоит выделить несколько моментов. Во-первых, при обработке клеток дигитонином и до определения флуоресценции рН экстракта, должен быть кислым; для этого мы экстрагировали БСР цитратным буфером (рН=4) с дигитонином. Такое значение рН находится на границе буферной емкости для раствора Хэнкса, в то время как цитратный буфер способен удерживать это значение рН. Перед самим измерением рН необходимо повысить, так как максимум флуоресценции БСР наблюдается при нейтральном значении рН (рН=7). Во-вторых, экстрагирующий раствор не должен содержать сыворотку крови, которая вызывает спонтанное окисление ВСРН2.

4.2. Влияние на АФК ионизирующей радиации.

При измерении окислительного стресса в клетках при действии ионизирующей радиации были выявлены артефакты (рис. З.8.). При дозах свыше 3 Гр клеточная мембрана по-видимому становится более проницаемой (скорее всего происходит окисление липидов, составляющих саму мембрану, в результате чего появляются бреши) и ВСБ выходит из клеток . Вследствие выхода БСР, определяемый уровень БСБ в клетках занижается; этот эффект возрастает с увеличением дозы облучения и дозовая зависимость искажается. При обработке клеток дигитонином, мы получили экстракт БОБ, который был образован АФК, возникшими как в клетках, так и в среде и проникшими в клетки при инкубации клеток с ВСРН2-ОА. В этом случае зависимость количества АФК от дозы имела линейный характер.

Было выяснено, что основной вклад в образование АФК в клетках при ионизирующем облучении вносит радиолиз внеклеточной воды. Образовавшаяся при радиолизе воды перекись водорода проникает в клетки и окисляет внутриклеточный DCFH2. В подтверждение этому были проведены эксперименты по влиянию на радиационное образование АФК в клетках сыворотки и смены среды сразу после облучения (рисунки 3.9., 3.10.). Внутри самих клеток радиационное образование АФК мало по сравнению с метаболическим, но в зонах (ядро клетки), где метаболические АФК практически отсутствуют, именно радиационные АФК вызывают генотоксические и геномодулирующие эффекты.

4.3. Роль АФК в изменении МЛУ опухолевых клеток.

Для рассмотрения этого вопроса мы взяли 2 типа опухолевых клеток: это мышиный лимфолейкоз - P388VR и клетки рака гортани человека - НЕр-2. В нашу задачу не входило сравнение этих клеточных культур. Но так как результаты о влиянии окислительного стресса на эти клетки противоположны, то имеет смысл уделить внимание различиям в самих этих клеточных культурах, так и в постановках экспериментов относительно каждого типа.

Клеточные культуры P388VR (мышиная) и НЕр-2 (человеческая) принадлежат разным организмам и происходят из разных тканей: P388VR из крови, НЕр-2 из эпителия. По этой причине, транспортные белки, отвечающие за множественную лекарственную устойчивость клеток различны: у мышиного лимфолейкоза - это P-gp (Nagayama J. Et al., 2001) и скорее всего MRP у клеток рака гортани человека. Кроме того, эксперименты были поставлены специально так, чтобы исследовать разные эффекты окислительного стресса на МЛУ: на клетках НЕр-2 через длительное время после облучения, когда проявляется изменение количества белков, обусловленное влиянием на экспрессию генов, а на клетках P388VR сразу после воздействия окислительного стресса, когда может проявиться только изменение активности существующих белков.

Как уже было упомянуто (см. 3.2.2.) при ионизирующем облучении уровень АФК существенно повышается в ядре, а не в цитоплазме и эти АФК воздействуют на ДНК клетки. Нами было показано, что определённые дозы ионизирующего излучения (максимум при 1 Гр) увеличивают активность транспортных белков и МЛУ через длительное время после облучения. Максимальный эффект наблюдался при 16 часах после облучения (табл. 3.1.). К 24 часам уровень МЛУ и активность транспортных белков возвращались к контрольному значению. Такое изменение экспрессии транспортных белков, ответственных за МЛУ сходно с изменением экспрессии стрессорных белков и может быть одним из компонентов ответа клетки на стрессорное воздействия, каковым является и ионизирующее излучение.

P388VR явился удобным объектом, чтобы исследовать эффект окислительного стресса не на синтез, а на активность уже функционирующих транспортных белков, ответственных за МЛУ. Окислительный стресс был вызван добавлением перекиси водорода и её эффект на МЛУ и транспортную активность исследовали сразу после воздействия. В отличие от ионизирующей радиации перекись водорода вызывает окислительный стресс в цитоплазматической мембране и цитоплазме и, следовательно, её действие было направлено непосредственно на транспортные белки, ответственные за МЛУ. Увеличение чувствительности клеток P388VR к винкристину (рис. 3.13.) и уменьшение скорости транспорта кальцеина (рис. 3.12.) говорит о понижении уровня лекарственной устойчивости при обработке клеток перекисью водорода. Таким образом, мы вправе утверждать, что окислительный стресс подавляет МЛУ на уровне активности транспортных белков клеток P388VR. Скорее это связно с окислением SH-групп в Cys431 белка P-gp, как это было показано при воздействии N-метиламида в работе Sharom (Sharom F.J., 1997).

4.4. Значение полученных результатов для терапии опухолей.

В работе было показано, что окислительный стресс сразу после воздействия может снижать МЛУ опухолевых клеток. Этот факт указывает на возможность увеличения эффективности химиотерапии опухолей с множественной лекарственной устойчивостью при сочетании противоопухолевых препаратов с окислительным стрессом, причём препараты должны применяться одновременно или сразу после окислительного стресса. При сочетании химиотерапии с радиотерапией следует иметь в виду, что после облучения может увеличиваться экспрессия генов транспортных белков, что приводит к увеличению МЛУ. Этот эффект развивается за время сопоставимое с длительностью клеточного цикла и применение противоопухолевых препаратов в это время после облучения менее эффективно, чем без облучения.