Изучение теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Щербакова, Дарья Михайловна

• Щербакова, Дарья Михайловна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Щербакова, Дарья Михайловна

Содержание.

1. Введение.

2. Обзор литературы. Теломеразный комплекс: структура и функции.

2.1. Введение. Теломераза - сложный РНГГ комплекс.

2.2. Теломераза как фермент.

2.3. Основные компоненты теломеразного комплекса - TER и TERT.

2.3.1. Теломеразная обратная транскриптаза (TERT).-.

2.3.2. Теломеразная РНК (TER).

2.4. Функционирование теломеразы in vivo. Вспомогательные белки теломеразного комплекса.

2.4.1. Защитная функция теломеразы.

2.4.2. Координация удлинения теломер тсломеразой и других процессов in vivo.

2.4.3. Субстрат теломеразы - теломера.

2.4.4. Локализация теломеразы в зависимости от стадии клеточного цикла.

2.4.5. Вспомогательные белки теломеразного комплекса дрожжей Estlp и Est3p. Регуляция теломеразы в клеточном цикле.

2.4.6. Удлинение теломер теломеразой in vivo.

2.4.7. Регуляция количества теломеразы. Деградация компонентов теломеразы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae»

На концах хромосом находятся ДНК-белковые структуры - теломеры. Они защищают линейные концы хромосом эукариот от деградации и слияния, поддерживая стабильность генома. Аппарат репликации клетки не в состоянии обеспечить полную репликацию концов. У большинства организмов основным механизмом поддержания длины теломер является достраивание теломерных повторов ДНК ферментом теломсразой [1]. Этот фермент удлиняет З'-конец хромосомы, а комплементарную цепь достаивается ДНК-полимеразами. Теломераза представляет собой рибонуклеопротеидный комплекс [2]. Коровый фермент включает в себя теломеразную обратную транскриптазу и теломеразную РНК, содержащую матричный участок для удлинения ДНК. В теломеразный комплекс входит еще целый ряд вспомогательных компонентов, необходимых для функционирования теломеразы in vivo. Часть из них необходима для посадки теломеразы на теломеру в определенное время при прохождении клетки по клеточному циклу [3], часть для регулирования ее активности [4], также некоторые белки необходимы для созревания теломеразного комплекса и для деградации его компонентов [5]. Тонко регулируется количество теломеразы в клетках различного типа [6, 7]. Это необходимо, ведь в человеческих клетках укорочение теломер и, в конечном итоге, сспессенс ведут к ограничению потенциала деления клетки и предотвращению развития рака [8]. С другой стороны, слишком короткие теломеры также могут привести к возникновению опухоли [8]. Теломераза активна в клетках, обладающих потенциалом к неограниченному делению. Она активна в 85% типов раковых опухолей (в остальных 15% действуют другие механизмы поддержания длины теломер, основанные на рекомбинации) [9]. Теломераза функционирует в клетках одноклеточных эукариот, таких как простейшие [1] и дрожжи [10]. Изучение принципов работы теломеразы в различных организмах, сравнение, выявление общих закономерностей и различий поможет в изучении работы теломеразы. Это представляет интерес, так как имеется достаточное количество фактов, свидетельствующих о том, что нарушение функционирования теломеразы и теломер (генетические дефекты, ответственные за это) приводят к целому ряду возрастных патологий, таких как повреждение костного мозга, остеопороз, фиброз легких, цирроз печени и др. (ссылки в работе [11]). Активация теломеразы связана с развитием рака [12]. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae, как хорошо изученный и удобный для культивирования и генетических манипуляций эукариотический микроорганизм, являются хорошей модельной системой для изучения теломеразы.

Несмотря на интенсивное изучение теломеразы, до сих пор не известен точный состав теломеразного комплекса. Опубликованные данные о четвертичной структуре теломеразы дрожжей противоречивы. Данная работа посвящена изучению структуры и состава теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae, а также новых взаимодействий белков с компонентами теломеразного комплекса.

2. Обзор литературы. Теломеразный комплекс: структура и функции.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Щербакова, Дарья Михайловна

5. Выводы.

1. Созданы штаммы дрожжей S. cerevisiae, экспрессирующие TLC1 РНК с РНК-аптамерной вставкой к стрептавидину.

2. Разработан метод выделения теломеразы с помощью аффинной хроматографии с использованием РНК-аптамерной вставки в TLC1 РНК.

3. Теломераза дрожжей S. cerevisiae активна in vitro в мономерной форме.

4. В состав легкой фракции активных теломеразных комплексов входит биотинилированный белок массой около 50 кДа.

3.3. Заключение.

Данная работа посвящена изучению теломеразного комплекса дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Показано, что теломераза дрожжей активна in vitro в мономерной форме. На основе литературных данных о теломеразах других организмов и полученных в работе результатов можно сделать вывод о том, что функциональность in vitro в виде мономера — это общее свойство теломераз различных организмов. Также в работе получены интересные данные о составе теломеразного комплекса. Впервые обнаружена возможность того, что в состав теломеразного комплекса входит биотинилированный белок. Этот белок массой около 50 кДа входит в состав легкой фракции теломеразных комплексов. Этот факт указывает на то, что обнаруженный биотинилированный белок не является постоянным компонентом теломеразного комплекса, а входит в его состав временно, на определенном этапе сборки, регуляции или деградации теломеразы, и, возможно, принимает участие в этих процессах. Таким образом, в представленной работе получены интересные результаты о строении и составе активного теломеразного комплекса дрожжей S. cerevisiae.

4. Материалы и методы. 4.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы, олигодезоксирибонуклеотиды, штаммы.

В работе были использованы следующие реактивы и препараты: NaCl, NaOAc, Na2HP04, KH2P04, КС1, КОАс, MgCl2, Mg(OAc)2, CaCl2, MnCl2, Tris, NaOH, КОН, ЭДТА, H3BO3, HEPES, персульфат аммония, бромфеноловый синий, ксиленцианол, бромистый этидий, глицерин фирм Merk, Германия и Helicon, Россия;

SDS, акриламид, ]Ч,Н'-метилснбисакриамид, 1,4-дитиотреитол (DTT), Кумасси R-250 фирмы Serva, Германия;

Д-глюкоза, 2-меркаптоэтанол, Ы,1Ч,]ЧГ,]ЧГ-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), РНазин, насыщенный ТЕ фенол, рибонуклеаза А фирмы Helicon, Россия уксусная кислота, соляная кислота, хлороформ, изоамиловый спирт, ацетон фирмы Химмед, Россия; водонасыщенпый фенол, Triton Х-100 фирмы Roth, Германия; этанол фирмы Ферейн, Россия; азотистые основания: аденин, урацил; аминокислоты: лейцин, триптофан, гистидпи, треонин, аргинин, изолейцин, лизин, метионин, фенилаланин, тирозин, валин; сахара: глюкоза, галактоза, арабиноза, сахароза, стеклянные шарики диаметром 425-600 микрон, LiOAc, БСА, ДТТ, ПМСФ, ДНК спермы лосося, спермидин, формальдегид, формамид, 2-меркаптоэтанол, ампициллин, генетицин, протеиназа К, РНКаза А фирмы Sigma, Германия; полиэтиленгликоль 6000, Tween 20 фирмы Fluka, Германия; бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар, YNB (Yeast Nitrogen Base w/o aminoacids), мочевина фирмы Difco, США; легкоплавкая агароза для электрофореза фирмы Life Technologies, Шотландия; [a-32P]dGTP, [у-32Р]АТР фирмы Amersham Biosciences Part of GE Healthcare, США; олигодезоксирибонуклеотиды были синтезированы фирмой Синтол, Россия; циркониевые шарики фирмы BioSpec Products, США; Zymolyase фирмы Seikagatu, Япония; стрептавидин-сефароза (Streptavidin Sepharose High Performance) фирмы GE Healthcare, США; стрептавидин, конъюгировапный с пероксидазой хрепа, авидин куриного яйца фирмы Имтек, Россия; диэтиламиноэтил целлюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза) (DE-52) фирмы Whatman BioSystems Ltd, США;

Ni-NTA агароза, набор реагентов для выделения плазмидной ДНК и набор реагентов для выделения ДНК из агарозного геля фирмы Qiagen, Германия; суммарная тРНК Е. coli, мембрана PVDF, ECL Western Blotting Detection Kit, фирмы Amersham-Pharmacia Biotech, США; набор ингибиторов протеаз в таблетках фирмы Roche, Германия; фильтровальная бумага Whatman ЗММ фирмы Whatman Biomerta, Германия; 20 мл центриконы фирмы Sartorius, США;

ДНКаза I (DNase I, RNase-frce), Т4 ДНК-лигаза, Taq-полимераза, полинуклеотид киназа Т4, эндонуклеазы рестрикции Bell, Hpal, Ncol, Nsil, NotI, Xhol, BamHI, PstI, Xmalll, Kpnl и фирменные буферные растворы к ним фирм MBI Fermentas, Литва и Roche, Франция; штамм DBY-746 а был любезно предоставлен М.Д. Тер-Аванесяном (Москва); плазмида pSD107 была любезно предоставлена Д. Готтшлингом, США.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Щербакова, Дарья Михайловна, 2009 год

1. Greider С. W., Blackburn Е.Н. (1987) Cell, 51,887-98.

2. Shcherbakova D.M., Zvereva M.E., Shpanchenko O.V., Dontsova O.A. (2006) Mol Biol (Mosk), 40, 580-94.

3. Osterhage J.L., Talley J.M., Friedman K.L. (2006) Nat Struct Mol Biol, 13, 720-8.

4. Hsu M., Yu E.Y., Singh S.M., Lue N.F. (2007) Eukaryot Cell, 6, 1330-8.

5. Gallardo F., Chartrand P. (2009) Med Sci (Paris), 25, 232-3.

6. Mozdy A.D., Podell E.R., Cech T.R. (2008) Mol Cell Biol, 28, 4152-61.

7. Cristofari G., Lingner J. (2006) Embo J, 25, 565-74.

8. Denchi E.L. (2009) DNA Repair (Amst), 8, 1118-26.

9. Bollmann F.M. (2007) Cancer Treat Rev, 33, 704-9.

10. Cohn M., Blackburn E.H. (1995) Science, 269, 396-400.

11. Chavez A., Tsou A.M., Johnson F.B. (2009) Biochim Biophys Acta, 1792, 329-40.

12. Janknecht R. (2004) FEBS Lett, 564, 9-13.

13. Lingner J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V., Cech T.R. (1997) Science, 276, 561-7.

14. Chen J.L., Greider C.W. (2004) Trends Biochem Sci, 29, 183-92.

15. Osterhage J.L., Friedman K.L. (2009) J Biol Chem, 284, 16061-5.

16. Hayflick L. (1997) Biochemistry (Mosc), 62, 1180-90.

17. Olovnikov A.M. (1973) J Theor Biol, 41, 181-90.

18. Reddel R.R., Bryan T.M. (2003) Lancet, 361, 1840-1.

19. Theimer C.A., Feigon J. (2006) Curr Opin Struct Biol, 16, 307-18.

20. Autexier C., Lue N.F. (2006) Annu Rev Biochem, 75, 493-517.

21. Prescott D.M. (1994) Microbiol Rev, 58, 233-67.

22. Zappulla D.C., Cech T.R. (2004) Proc Natl Acad Sci USA, 101, 10024-9.

23. Forstemann K., Hoss M., Lingner J. (2000) Nucleic Acids Res, 28, 2690-4.

24. Jacobs S.A., Podell E.R., Cech T.R. (2006) Nat Struct Mol Biol, 13, 218-25.

25. Bachand F., Kukolj G., Autexier C. (2000) Rna, 6, 778-84.

26. Licht J.D., Collins K. (1999) Genes Dev, 13, 1116-25.

27. Collins K. (2006) Nat Rev Mol Cell Biol, 7, 484-94.

28. Zappulla D.C., Goodrich K., Cech T.R. (2005) Nat Struct Mol Biol, 12, 1072-7.

29. Lendvay T.S., Morris D.K., Sah J., Balasubramanian В., Lundblad V. (1996) Genetics, 144, 1399-412.30.