Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Гладких, Ирина Николаевна

• Гладких, Ирина Николаевна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гладких, Ирина Николаевна

1. Введение.

2. Литературный обзор. Протеолитические ферменты и способы регуляции их активности.

2.1. Классификация протеолитических ферментов.

2.1.1. Сериновые протеиназы.

2.1.2. Химотрипсинподобные протеиназы: характеристика и физиологическая активность.

2.2. Способы регуляции активности протеолитических ферментов.

2.2.1. Зимогены - неактивные предшественники протеиназ.

2.2.2. Регуляция активности протеиназ с помощью ингибиторов.

2.2.2.1. Классификация ингибиторов протеиназ по механизму действия.

2.2.2.2. Общая характеристика ингибиторов сериновых протеиназ.

2.2.2.3. Пространственные структуры ингибиторов сериновых протеиназ.

2.2.2.4. Доменные структуры ингибиторов сериновых протеиназ.

2.2.2.5. Каноническая конформация связывающей петли.

2.2.2.6. Семейство Кунитца.

2.3. Ингибиторы протеиназ актиний.

2.3.1. Низкомолекулярные ингибиторы протеиназ актиний.

2.3.2. Эквистатин - высокомолекулярный ингибитор протеиназ актинии Actinia equina.

2.3.3. Биологическая роль и применение ингибиторов протеиназ актиний.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Выделение и некоторые физико-химические характеристики ингибиторов протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus.

3.2 Установление аминокислотной последовательности ингибиторов протеиназ

3.2.1. Определение N-концевой аминокислотной последовательности ингибиторов Rmln I и Rmln II.

3.2.2. Установление полной аминокислотной последовательности ингибитора InhVJ.

3.3. Изучение пространственной организации ингибитора InhVJ.

3.4. Определение констант ингибирования.

3.5. Определение антигистаминной активности ингибиторов сериновых протеиназ Rmln I и Rmln II.

3.6. Изучение взаимодействия ингибиторов с протеолитическими ферментами

3.6.1. Масс-спектрометрический анализ комплексов ингибиторов протеиназ Rmln I и Rmln II с трипсином и а-химотрипсином.

3.6.2. Исследование специфичности ингибитора InhVJ методом биосенсорного анализа.

3.7. Компьютерное моделирование пространственной структуры ингибитора InhVJ и его комплексов с сериновыми протеиназами и потенциал-зависимым К+-каналом.

3.7.1. Построение модели пространственной структуры ингибитора InhVJ.

3.7.2. Теоретическое предсказание структуры комплексов ингибитора InhVJ с трипсином, а-химотрипсином и потенциал-зависимым К+-каналом.

4. Экспериментальная часть.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

5. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение структуры и механизма действия ингибиторов сериновых протеиназ из актинии Radianthus macrodactylus»

Поиск биологически активных природных соединений, специфически взаимодействующих с протеолитическими ферментами и регулирующих их активность, изучение взаимосвязи между их структурой и функцией является одной из интереснейших и важнейших задач биоорганической химии, так как протеолитические ферменты и процессы протеолиза играют ключевую роль в белковом обмене живых организмов. Известно, что одним из основных способов регуляции действия ферментов является ингибирование их активности. В связи с этим, исследование структурно-функциональных особенностей, специфичности и механизма действия ингибиторов протеиназ является фундаментальной задачей, выясняющей молекулярные основы белок-белковых взаимодействий. Решение этой задачи может служить основой для создания лекарственных препаратов направленного действия при лечении заболеваний, вызванных нарушением естественной регуляции активности протеолитических ферментов.

К настоящему времени накоплен огромный массив информации о структуре и функциональной активности ингибиторов сериновых протеиназ растительного и животного происхождения. В то же время ингибиторам протеиназ морских организмов, в частности, ядовитых кишечнополостных, актиний, посвящено несравнимо меньшее количество публикаций. Уже более двадцати лет известно, что в организме-продуценте ингибиторы протеиназ присутствуют совместно с нейро- и цитотоксинами, выполняющими алломональную роль, но до сих пор отсутствует убедительное объяснение этого феномена. Это требует расширения знаний как о структуре и механизме действия ингибиторов, так и об их экологической роли в морском биоценозе.

Актуальность поиска и установления структуры новых представителей ингибиторов протеиназ актиний связана с обнаружением у ряда представителей этой группы полипептидов новых биологических функций. Так установлено, что некоторые ингибиторы протеиназ актиний способны блокировать потенциал-зависимые калиевые каналы, взаимодействовать с ваниллоидным рецептором TRPV1, проявлять антигистаминную активность, что свидетельствует об их полифункциональности.

Выделение новых ингибиторов из актиний, изучение их структурной организации и механизма действия с помощью современных биохимических, биофизических, молекулярно-биологических, а также методов компьютерного моделирования, позволит понять причины их структурно-функционального многообразия.

Настоящая работа является частью исследований, проводимых в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по изучению структуры и функции биологически активных полипептидов актиний. Данная диссертационная работа посвящена изучению физико-химических свойств ингибиторов, выделенных из тропической актинии Radianthus macrodactylus, установлению их аминокислотных последовательностей, исследованию пространственной организации, специфичности, а также изучению механизма действия и биологической активности этих полипептидов.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Гладких, Ирина Николаевна

5. Выводы

1. Из актинии R. macrodactylus выделены и охарактеризованы три новых ингибитора сериновых протеиназ (InhVJ, Rmln I и Rmln II). Установлено, что полипептиды относятся к семейству Кунитца.

2. Установлены аминокислотные последовательности N-концевых фрагментов ингибиторов Rmln I, Rmln II и полная аминокислотная последовательность ингибитора InhVJ. Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотных последовательностей ингибиторов, выделенных из таких эволюционно далеких типов организмов, как кишечнополостные, пресмыкающиеся и млекопитающие.

3. Выявлены различия в строении реактивных центров ингибиторов. Показано, что замена одного аминокислотного остатка в реактивном центре ингибиторов приводит к уменьшению их ингибирующей активности.

4. Исследована пространственная организация ингибитора InhVJ на уровне вторичной и третичной структуры. Показано, что InhVJ имеет упорядоченную вторичную, жесткую третичную структуру и относится к белкам со смешанной а+Р структурой.

5. Изучены специфичность ингибиторов и особенности их взаимодействия с протеиназами. Показано, что ингибиторы InhVJ, Rmln I и Rmln II являются высокоспецифичными полипептидами: ингибируют активность только двух сериновых протеиназ, трипсина и а-химотрипсина. Установлено, что ингибиторы образуют комплексы с протеиназами в стехиометрическом соотношении 1:1. Рассчитаны константы ингибирования, определены кинетические и термодинамические характеристики комплексов ингибитор-протеиназа.

6. Установлено, что ингибитор InhVJ взаимодействует с сериновыми протеиназами в области их активных центров. Количество и тип связей, стабилизирующих комплексы, вероятно, определяет ингибирующую способность полипептида.

7. Обнаружено, что ингибиторы Rmln I и Rmln II проявляют антигистаминную активность. Показано, что характер влияния ингибиторов на эффект торможения развития аллергической реакции является дозозависимым. Предсказана возможность взаимодействия InhVJ с потенциал-зависимым калиевым каналом. Таким образом, выделенные полипептиды могут быть отнесены к полифункциональным ингибиторам протеиназ.