Изучение структурно-функциональных особенностей δ-эндотоксина Cry9A Bacillus thuringiensis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Кириллова, Нина Евгеньевна

• Кириллова, Нина Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кириллова, Нина Евгеньевна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Ведение

2.2. Молекулярная организация Сгу-белков

2.2. 1. Первичная структура, филогенетическое родство, номенклатура

2.2.2. Пространственная организация молекулы Сгу-белков

2.2.3. Междоменные контакты. Поведение истинных токсинов Cry-белков в ходе денатурации

2.2.4 Ограниченный протеолиз Cry- белков

2.3. Механизм действия Сгу-белков

2.3.1 .Специфичность инсектицидной активности

2.3.2. Общая схема патогенеза

2.3.3. Механизм порообразования

2.4. Взаимоотношение структуры и функции в молекулах Сгу-белков

2.4.1 .Роль домена I в образовании пор

2.4.2.Мутагенез спирального домена

2.5. Организация генома В. thuringiensis

2.5.1 .Положение cry-генов в геноме В. thuringiensis

2.5.2. Регуляция синтеза 5- эндотоксинов

2.5.3. Промоторы

2.5.4. Копийность плазмид, включающих cry гены

2.5.5. мРНК

2.6. Токсическое действие Cry- белков на другие объекты

2.6.1. Антимикробная активность белков параспоральных кристаллов В. thuringiensis.

2.6.2. Влияние биогенных аминов на микроорганизмы

2.6.3. Фунгицидное действие Сгу-белков

2.6.4. Действие на клетки теплокровных организмов

3. Материалы и методы

3.1. Используемые штаммы и среды

3.1.1. Выращивание штаммов Bt

3.1.2. Выращивание штаммов Escherichia coli

3.1.3. Выращивание анаэробных микроорганизмов

3.1.4. Выращивание Saccharomyces cerevisiae

3.2. Микроскопическое исследование культуры клеток бацилл

3.3. Получение активированного 8-эндотоксина Сгу9А

3.4. Электрофорез в денатурирующих условиях

3.5. Иммунодиффузия по Оухтерлони

3.6. Ограниченный протеолиз

3.7.Хроматографическое разделение продуктов протеолиза

3.7.1. Гельпроникающая хроматография

3.7.2. Ионнообменная хроматография

3.8. Трансформация клеток Bt методом электропарации

3.9. Очистка антисывороток на афинных сорбентах

3.9.1 Синтез аффинного сорбента.

3.9.2. Хроматография антисыворотки на аффинном сорбенте

3.10. Вестерн-блоттинг

3.11. Определение концентрации белка

3.12. Определение токсичности

3.13. Просвечивающая электронная микроскопия

3.14. Сканирующая электронная микроскопия

3.15. Конструирование плазмид для клонирования и экспрессии фрагментов гена Сгу9А в Е. coli

3.16. Введение аминокислотных замен в ген Сгу9А методом сайт-направленногомутагенеза.

3.17. Конструирование плазмид, для экспрессии в Bt полученных мутантных вариантов гена сгу9А.

3.18. Проведение экспериментов по изучению влияния БА на бактериоцидный эффект

3.18.1. Техника анаэробного культивирования

3.18.2. Определение биомассы

3.19. Мутагенез I домена Сгу9А методом «еггог-ргопе» ПЦР и анализ токсичности на уровне экспрессии в Е. coli.

3.20. Изучение фунгицидного эффекта мутантных вариантов

Сгу9А на протопластах дрожжей Saccharomyces cerevisiae

3.20.1. Приготовление протопластов дрожжей с помощью ферментативного разрушения клеточной стенки литиказой

3.20.2. Проведение экспериментов по изучению фунгицидного эффекта 80 4. Результаты и обсуждение

4.1. Введение. Постановка задачи исследования

4.2. Использование хроматографических методов для разделения продуктов ограниченного протеолиза 5-эндотоксина Сгу9А

4.3. Разработка системы для экспрессия эндотоксина Сгу9А в клетках акристаллического штамма Bt подвида kurstaki.

4.4. Доказательства экспрессии и правильного фолдинга рекомбинантного Сгу9А в бациллярных клетках

4.4.1. Электрофорез и иммунологические тесты

4.4.2. Ограниченный протеолиз

4.5. Биологическая активность рекомбинантного Сгу9А

4.6. Формирование кристаллов рекомбинантным 5-эндотоксином Сгу9А

4.7. Получение точечных мутаций в области спиралей а5 и аб гена сгуЯА

4.7.1. Создание модифицированной версии гена сгу9А, содержащей уникальные сайты рестрикции, ограничивающие область, кодирующую спирали а5 и аб.

4.7.2. Сайт-направленный мутагенез в области спиралей а5 и аб

4.8. Выделение и изучение полученных мутантных белков

4.9. Электрофорез и ограниченный протеолиз полученных мутантов

4.10. Биологическая активность полученных мутантных белков на гусеницах G. Mellonella

4.11. Антибактериальный эффект Cry9А

4.11.1. Изучение действия эндотоксина Сгу9А на анаэробные Микроорганизмы

4.11.2. Эффект биологических аминов: серотонина и дофамина, добавленных к питательной среде, на чувствительность

М. thermoacetica к антимикробной активности Сгу9А

4.12. Система скрининга нетоксичных вариантов Сгу9А, основанная на его антибактериальной активности

4.12.1. Конструкция для экспрессии в клетках Е. coli.

4.12.2. Изучение роли отдельных доменов в антибактериальной токсичности Сгу9А

4.12.3. Скрининг слаботоксичных вариантов Сгу9А, полученных методом «еггог-ргопе» ПЦР

4.12.4. Токсичность, отобранных мутантов на протопластах дрожжей Saccharomyces cerevisiae

4.13. Сопоставление антибактериального эффекта с энтомоцидным

5. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение структурно-функциональных особенностей δ-эндотоксина Cry9A Bacillus thuringiensis»

Актуальность темы

Bacillus thuringiensis (Bf) представляет собой широко распространенную в природе спорообразующую бактерию. Известны ее энтомопатогенные свойства, и промышленные препараты на основе (Bf) являются наиболее важными средствами биологического контроля численности насекомых во многих странах.

Основным действующим началом Bt, ответственным за комплекс патологических проявлений в организме чувствительного насекомого, является продуцируемые ею 5-эндотоксины (Cry и Cyt-белки). Они оказывают эффективное высокоспецифическое действие на различных насекомых, нематод, клещей - паразитов растений и животных и практически неактивны в отношении теплокровных организмов. Кроме инсектицидного действия 8-эндотоксины, вырабатываемые некоторыми подвидами Bt, проявляют антибиотическую активность по отношению к ряду аэробных микроорганизмов и фитопатогенным грибам.

Все это дает основание предположить, что Bt и её кристаллические 5-эндотоксины являются важным универсальным высокоизбирательным природным регулятором численности ряда организмов, влияющих на экономическую деятельность человека. Создание и применение биоинсектицидов на основе 8-эндотоксинов позволяет обеспечить максимальную эффективность и экологическую безвредность мероприятий по защите растений от вредных насекомых и фитопатогенных микроорганизмов, а также решить целый ряд медицинских и ветеринарных проблем. Встраивание генов этих белков в геном растений дает возможность получить трансгенные растения, не повреждаемые насекомыми. В настоящее время так называемые ßi-растения занимают основную долю в общем, объеме генетически модифицированных культур хлопка и кукурузы, которые выращивают на полях США.

В свою очередь, необходимость повышения эффективности действия указанных биоинсектицидов и уменьшения вероятности образования резистентных к ним форм насекомых делает необычайно актуальным детальное изучение механизма действия 5-эндотоксинов, в том числе взаимоотношения структуры и функции в их молекуле. Данное исследование посвящено решению этой проблемы на примере эндотоксина Cry 9 а, токсичного для гусениц пчелиной огнёвки {Gallería mellonellá), являющейся паразитом пчелиных ульев.

Цели и задачи работы

Данная работа посвящена изучению функциональной роли спиралей.N-концевого домена эндотоксина Cry9A Bt. В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Получение эффективной системы для экспрессии рекомбинантного Сгу9А в. клетках бацилл, изучение и характеристика свойств полученного белка, сопоставление его свойств со свойствами природного Сгу9А.

2. Конструирование генетической системы для эффективного мутагенеза-и получение серии точечных аминокислотных замен в белке Cry9А в районе 5-и 6- a-спиралей, выделение полученных мутантных белков и изучение их биологической активности на гусеницах G. mellonellá.

3. Создание новой модели для тестирования антибактериального эффекта Сгу9А.

4. Изучение роли отдельных доменов молекулы Сгу9А и отдельных элементов их структуры в антибактериальном и фунгицидном эффектах этого белка, сравнение механизма действия Сгу9А на клетки насекомых и микроорганизмов.

Научная новизна

В работе впервые на примере рекомбинантного S-эндотоксина Сгу9А показано, что Cry-белки, которые в природных штаммах формируют кристаллические включения совместно с другими S-эндотоксинами, способны образовывать кристаллы самостоятельно. Получена серия мутантов в области 5-й и 6-й а-спиралей, анализ которых показал, что не только 5-я, но и 6-я а-спираль первого домена важна для токсичности на гусеницах G. mellonella. Установлено, что 5-эндотоксин Сгу9А, а так же его N-концевой домен обладают антибактериальной активностью. Создана генетическая система отбора форм токсина с измененной эффективностью антибактериального эффекта. На основе полученных с её помощью мутантов Сгу9А установлена корреляция между бактерицидной и инсектицидной активностями.

Практическая значимость

Полученные данные о структурно-функциональных особенностях 5! эндотоксина Cry 9 А создают базу для дальнейших исследований механизма-энтомоцидного и антибактериального эффекта этого и других Cry-белков, а также путей адаптации патогенного микроорганизма к физиологическим и биохимическим особенностям организма-хозяина. В свою очередь, результаты проведенных исследований могут быть использованы при создании биоинсектицидов с существенно повышенной эффективностью против гусениц пчелиной огнёвки и с уменьшенной вероятностью возникновения устойчивых форм этого насекомого.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Введение.

Bacillus thuringiensis (Bt) - спорулирующая грамположительная аэробная бактерия, обладающая патогенностью для насекомых. Впервые данную бактерию из личинок тутового шелкопряда выделил японский бактериолог Ишивата и назвал ее Bacillus sotto [Schnepf 1998, Вершинина и Алимова, 2000]. Позднее было описано большое количество штаммов этой бактерии, каждый из которых характеризовался своим спектром восприимчивых насекомых [Berliner, 1915; Steinhaus, 1951]. Было установлено, что токсичностью для насекомых обладают включения, обнаруженные в бациллярной клетке, которые возникают одновременно со спорой, растут в ходе споруляции и по окончанию этого процесса лежат в противоположном от споры конце спорангия, вследствие чего они были названы "параспоральными включениями" (рисунок 1) [Наппау 1953]. Было предложено группировать все образующие подобные включения штаммы под названием Bacillus thuringiensis [Delapore and Beguin, 1955; Heimpel and Angus, 1960].

Рисунок 1. Электронная фотография заспорулировавшей клетки Bacillus thuringiensis. SP -спора; PB - кристалл эндотоксина [de Maagd, 2001]

Обнаруженные включения растворялись лишь при pH 12 и выше. [Наппау 1953], Под электронным микроскопом включения были очень похожи на кристаллы, что привело к появлению нового термина для этих частиц -"кристаллоподобные включения". После лизиса спорангиев кристаллы и высвобождаются во внешнюю среду и вместе со спорами могут заглатываться личинками насекомых.

После того как была доказана белковая природа веществ, образующих параспоральные включения [Hannay and Fitz-James, 1955],. [Fitz-James et al, 1958; Yong and Fitz-James, 1959], составляющие их белки стали называться "белками кристаллов", или б-эндотоксинами. В последующем было установлено, что 5-эндотоксины включают два семейства белков:Сгу- и Cyt-белки. В'данном обзоре речь пойдет о Cry-белках. В составе кристалла белки компактно уложены и неактивны, это предшественники активных белков (протоксины). При попадании в кишечник насекомого происходит растворение кристаллов и процессинг протоксинов протеолитическими: ферментами кишечного сока, в результате чего формируется« устойчивый к протеолизу «истинный токсин» - активная1 форма дельта-эндотоксина с молекулярной массойют 55-до 65кДа [CHestuckina1982; Zalunin 2004]). t

В1:, настоящее время-: известно; более 100 Cry-белков, продуцируемых, различными^ штаммами Bt и обладающих энтомоциднойг активностью. Flo величине мол. массы- они делятся на несколько групп. Самая многочисленная; состоит из Cry-белков с мол. массой 130-145 кДа, но описаны белки, имеющие мол массы- околов 70 кДа. , а также промежуточные значения- (80-901 кДа) [Crickmore, Full list of delta-rendotoxins] .

Данный обзор посвящен описанию молекулярно-биологических свойств и механизма действия Cry- белков, образующих кристаллы в спорулирующих клетках Bt.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Кириллова, Нина Евгеньевна

5. Выводы.

1. При анализе серии мутантов Сгу9А впервые показано, что не только пятая, но и шестая a-спираль первого домена важна для токсичности на гусеницах Gallería mellonella.

2. Установлено, что не только 5-эндотоксин Сгу9А, но и его N-концевой домен обладают антибактериальной активностью и способностью лизировать протопласты дрожжей. Этот эффект связан с мембранотропной активностью указанных белков.

3. Создана система, позволяющая отбирать мутантные варианты 5-эндотоксина Сгу9А с уменьшенной бактерицидной активностью. Установлена корреляция между величинами бактерицидной и инсектицидной активности.

4. На примере рекомбинантного 5-эндотоксина Сгу9А впервые показано, что Cry-белки, которые в природных штаммах формируют кристаллические включения совместно с другими 5-эндотоксинами, способны образовывать кристаллы самостоятельно.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Кириллова, Нина Евгеньевна, 2011 год

1. Галушка Ф.П., Азизбекян P.P. (1977) Изучение плазмид линий различных разновидностей Bacillus thuringiensis Berliner // Докл. Акад. наук СССР, Т. 236, С. 1233-1235.

2. Гришечкина С.Д., Смирнов О.В., Кандыбин Н.В.(2002) Фунгистатическая активность различных подвидов Bacillus thuringiensis. И Микология и фитопатология, Т. 36. Вып. 1. С. 58-62.

3. Дебабов В.Г., Азизбекян P.P., Хлебалина О.И. и др. (1977) Выделение и предварительная характеристика экстрахромосомных элементов ДНК Bacillus thuringiensis. //Генетика, Т. 13, №3, С. 496-501.

4. Дьяков Ю.Т, (1998) Популяционная биология фитопатогенных грибов. М., Муравей, 384 с.

5. Дьяков Ю.Т., Озерецковская О.Л., Джавахия В.Г., Башрова СФ. (2001) Общая и молекулярная фитопатология: Учебное пособие, М.: Общество фитопатологов, 302 с.

6. Егоров Н.С., Юдина Т.Г., Баранов А.Ю. (1990). О корреляции между инсектицидной и антибиотической активностями параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis.//Микробиология, Т.59. вып.З. С. 448 — 452.

7. Левина. Т.А. (2005) Особенности антибактериального действия 5 -эндотоксинов Bacillus thuringiensis как перспективного агента защиты растений Дисс канд. биол. наук - Казань, 172 с.

8. Маликина К.Д., Шишов В.И., Чувелёв Д.И., Кудрин B.C., Олескин A.B. (2010) Регуляторная роль нейромедиаторных аминов в клетках Saccharomyces cerevisiae //Прикл. биохим. микробиол.,№ 6. С. 1 —6.

9. Олескин A.B., Ботвинко И.В., Кировская Т.А.(1998б) Микробная эндокринология и биополитика // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. Биология, № 4. С. 3-10.

10. Хеймпел A.M. (1976) Безопасность энтомопатогенных микроорганизмов длячеловека и позвоночных животных. // Микроорганизмы в борьбе свредными насекомыми и клещами, М.: Колос, С. 373-390.

11. Цавкелова Е.А., Ботвинко И.Б., Кудрин B.C., Олескин A.B. (2000) Детекциянейромедиаторных аминов у микроорганизмов методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии // Докл. Росс. Акад. Наук, Т.372, С. 840—842.

12. Честухина Г.Г., Костина Л.И., Залунин И.А., Котова Т.С., Катруха СП.,

13. Кузнецов Ю.С., Степанов В.М. (1977) Белки кристаллов дельта-эндотоксина

14. В. thuringiensis //Биохимия, Т. 42, Вып. 9, С. 1660-1667.

15. Шкаликов В.А., Белошапкина О.О., Букреев Д.Д. и др. (2001) Защитарастений от болезней/Под ред. В.А. Шкаликова. М.: Колос, 248 с.

16. Юдина Т.Г., Егоров Н.С., Лория Ж.К., Выборных С.Н. (1988) Биологическаяактивность параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis Л Известия АН

17. СССР. Серия биологич., №3. С. 427 436.

18. Юдина Т.Г., Милько Е.С., Егоров Н.С. (1996а) Чувствительность диссоциантов Micrococcus luteus к действию эндотоксинов В. thuringiensis.// Микробиология, Т.65. №3. С. 365 369.

19. Юдина Т.Г., Егоров Н.С. (19966) Антимикробная активность белковых включений различных бактерий. // Доклады РАН, Т.349. №2. С. 283 287.

20. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. (1997) Предварительный отбор подвидов Bacillus thuringiensis, способных к синтезу уникальных эндотоксинов. // Сб. научн. трудов "Регуляция численности беспозвоночных и фитопатогенов". Новосибирск. 1997. С. 59 64.

21. Юдина Т.Г., Брюханов A.JL, Нетрусов А.И. (2004) Чувствительность архей к антибиотическому действию белков параспоральных включений различных подвидов Bacillus thuringiensis.//Микробиология,. Том 73. №1. С. 25 30.

22. Юдина Т.Г.( 2006) Антимикробная активность и экологическая роль белковых включений бактерий представителей родов Bacillus, Xenorhabdus, Photorhabdus. Дисс.докт. биол. Наук.- М, 81 с.

23. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. (1991) Cytotoxicity of a cloned Bacillus thuringiensis subsp. israelensis CrylVB toxin to an Aedes aegypti cell line. // FEMS Microb. Lett., 83, P. 273-276.

24. Angsuthanasombat C., Crickmore N., Ellar, D.J. (1992) Comparison of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis Cry IVA and CrylVB cloned toxins reveals synergism in vivo. // FEMS Microb. Lett., 94, P. 63-68.

25. Arnold S, Curtiss A, Dean DH, Alzate 0.(2001) The role of a proline-induced broken-helix motif in alpha-helix 2 of Bacillus thuringiensis delta-endotoxins. I I FEBS Letters, Feb 9;490(l-2), P. 70-4

26. Aronson, A.I., Wu, D., and Zhang, C. (1995). Mutagenesis of specificity and toxicity regions of a Bacillus thuringiensis protoxin gene. // J. Bacteriol. 177, P 4059-4065.

27. Aronson, A.I., Geng, C., and Wu, L. (1999). Aggregation of Bacillus thuringiensis Cryl A toxins upon binding to target insect larval midgut vesicles. // Appl. Invironment. Microb., 65, P. 2503-2507.

28. Aronson, A.I. and Shai, Y. (2001) Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: unique features of their mode of action.// FEMS Microbiol. Lett., 195, 1-8.

29. Auffray Y, Boutibonnes P.(1985) Prophage induction and filamentation in Bacillus thuringiensis caused by the genotoxic mycotoxin aflatoxin B1. // Mycopathologia, Sep;91(3), P. 159-63.

30. Barbehenn, R.V. (2003) Antioxidants in grasshoppers: higher levels defend the midgut tissues of a polyphagous species than a graminivorous species. // J. Chem. Ecol. 29, P. 683-702.

31. Baum JA, Coyle DM, Gilbert MP, Jany CS, Gawron-Burke C. (1990) Novel cloning vectors for Bacillus thuringiensis. II Appl Environ Microbiol., Nov;56(l 1), P. 3420-8.

32. Baum J.A., Malvar T. (1995) Regulation of insecticidal crystal protein production in Bacillus thuringiensis. II Mol Microbiol., 18(1), P.1-12.

33. Berliner E.(1915) Uber die Schlaffsucht der Mehlmottenrouppe (Ephestia kuhniella Zell.) und ihen Erreger Bacillus thuringiensis, n. sp. // Z. Angew. Entomol.,V. 2 . P. 29-56.

34. Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D.J., and Li, J. (2005) Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications. // J. Mol. Biol., 348, P. 363-382.

35. CaroII, J., and Ellar, D J. (1993). An analysis of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin action on insect-midgut-membrane permeability using a light-scattering assay. // Eur. J. Biochem. 214, P. 771-778.

36. Chen X.J., A. Curtiss, E. Alcantara, Dean D.H., (1995) Mutations in domain I of Bacillus thuringiensis 5-endotoxin Cryl Ab reduce the irreversible binding of toxin to Manduca sexta brush border membrane vesicles. // J. Biol. Chem., 270, P. 64126419.

37. Chestukhina, G.G., Kostina, L.I., Mikhailova A.L., Tyurin, S.A., Klepikova F.S.,' and Stepanov, V.M. (1982) The main features of Bacillus thuringiensis 8-endotoxin molecular structure. // Arch.Microbiol., 132, P. 159-162.

38. Chestukhina, G.G., Tyurin, S.A., Kostina, L.I., Osterman, A.L., Zalunin, I.A., Khodova, O.M., and Stepanov, V.M. (1990) Subdomain organization of Bacillus thuringiensis entomocidal protein's N-terminal domains. // J.Protein Chem., 9, P. 501-507

39. Choi, G.J. et al (2007) Antifungal activities of Bacillus thuringiensis isolates on barley and cucumber powdery mildews. //J. Microbiol. Biotechnol., 17(12), P. 20712075

40. Choma C.T., Surewicz W.K., Carey P.R., Pozsgay M., Raynor T., Kaplan H. (1990) Unusual proteolysis of the protoxin and toxin from Bacillus thuringiensis structural implications. //Eur. J. Biochem., 189, P. 523-527.

41. Chungjatupornchai, W.P., Hoefte, H., Seurinck, J., Angsuthanasombat, C., and Vaeck, M. (1988) Common features of Bacillus thuringiensis toxins specific for Diptera and Lepidoptera. // Eur. J. Biochem., 173, P. 9-16.

42. Clarke M. B., Hughes D. T., Zhu C., Boedeker E. C., Sperandio V. (2006) The QseC sensor kinase: A bacterial adrenergic receptor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V.103, P.10420-10425.

43. Crickmore, N (2005) Using worms to better understand how Bacillus thuringiensiskills insects. Revew. I I Trends Microbiol., Aug; 13(8), P. 347-50.

44. Dai, S-M., and Gill, S.S. (1993) In vitro and in vivo proteolysis of the Bacillusthuringiensis subsp. israelensis Cry IVD protein by Culex quinquefasciatus larvalmidgut proteases. // Insect Biochem. Molec. Biol., 23(2), P. 273-283.

45. Debro L, Fitz-James PC, Aronson A. (1986) Two different parasporal inclusionsare produced by Bacillus thuringiensis subsp. finitimus. IIJ Bacteriol., Jan; 165(1), P.258.68.

46. Delapore B., Beguin S., (1955) Study of a strain of Bacillus, pathogenic for certain insects, identifiable with Bacillus thuringiensis Berliner. I I Ann Inst Pasteur (Paris), Dec;89(6), P. 632-43.

47. Derbyshire, D.J., Ellar, D.J., and Li, J. (2001) Crystalization of the Bacillus thuringiensis toxin Cry 1 Ac and its complex with the receptor ligand N-acetyl-D-galactosamine. //Acta Crystallog. sect. D, 57, P. 1938-1944.

48. English, L.H., Readdy, T.R., and Bastian, A.E. (1991). Delta-endotoxin phospholipid vesicles is catalysed by reconstituted midgut membrane. // Insect Biochem., 21, P. 177-184.

49. Felsenstein J. (1989) Mathematics vs. Evolution: Mathematical Evolutionary Theory. // Science, Nov 17;246(4932), P. 941-2.

50. Fitz-James, P.C., Toumanoff, C., and Yong, I.E. (1958) Localization of a toxicity for silkworm larvae in the parasporal inclusion of Bacillus cereus var. alesti. II Can. J. Microbiol., 4, P. 385-392

51. Flores H., X. Soberon, J. Sanchez, A. Bravo, (1997) Isolated domain II and III from the Bacillus thuringiensis CrylAb delta-endotoxin binds to lepidopteran midgut membranes. // FEBS letters, 414, P. 313-318

52. Fonstein M, Haselkorn R. (1995) Physical mapping of bacterial genomes. Review // J Bacteriol., Jun;177(12), P/ 3361-9.

53. Freestone P. P, Haigh R. D., Williams P. H., Lyte M. (1999) Stimulation of bacterial growth by heat-stable, norepinephrine-induced autoinducers // FEMS Microbiol. Lett., V.172,. P. 53-60.

54. Freestone P.P., Haigh R.D., Lyte M. (2007) Blockade of catecholamine-induced growth by adrenergic and dopaminergic receptor antagonists in Escherichia coli 0157:H7, Salmonella enterica and Yersinia enterocolitica // BMC Microbiol., V.7, P.8.

55. Freestone P. P., Lyte M. (2008) Microbial endocrinology: Experimental design issues in the study of interkingdom signaling in infectious disease // Adv. Appl. Microbiol., V.64, P. 75-108.

56. Gonzales J.M., Dulmage H.T., Carlton B.C. (1981) Correlation between specific plasmids and delta-endotoxin production in Bacillus thuringiensis. //Plasmid, 5, P. 351-365.

57. Gonzales J.M., Dulmage H.T., Carlton B.C. (1982) Transfer of Bacillus thuringiensis plasmids coding delta toxin among strain of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereu. //Proc. Nat. Acad. Sci., 79, P. 6591-6595.

58. Grochulski P., L. Masson, S. Borisova, M. Pusztai-Carey, J.-L. Schwartz, R. Brousseau, M. Cygler, (1995) Bacillus thuringiensis CrylAa insecticidal toxin: crystal structure and channel formation. // J. Mol. Biol., 254, P. 447-464.

59. Hannay C.L. (1953) Crystalline inclusions in aerobic sporeforming bacteria // Nature, V. 172,P. 1004

60. Hannay C.L., Fitz-James P. (1955) The protein crystals of Bacillus thuringiensis Berliner II Can. J. Microbiol., V. 1, P. 694-710.

61. Heimpel A.M., Angus T.A. (1960) Bacterial insecticides II Bacteriol. Rev., V. 2, P. 266-288

62. Hodgman, T.C. & Ellar, D.J. (1990) Models for the structure and function of the Bacillus thuringiensis S-endotoxins determined by compilation analysis. // DNA Seq., 1,P. 97-106.

63. Hofmann, C., Liithy, P. (1986). Binding and activity of Bacillus thuringiensis deltaendotoxin to vertebrate cells. // Arch. Microbiol., 146, P. 7-11.

64. Hofmann C., P. Luthy, R. Hutter, V. Pliska, (1988) Binding of the delta-endotoxinfrom Bacillus thuringiensis to brush-border membrane membrane vesicles of thecabbage butterfly (Pieris brassicae. II Eur. J. Biochem., 173, P. 85-91.

65. Hoefte, H. & Whiteley, H.R. (1989) Insecticidal crystal proteins of Bacillusthuringiensis. //Microbiol. Rev., 53, 242-255.

66. Jung, Y.C., Mizuki, E., Akao, T., Cote, J.C. (2007) Isolation and characterization of a novel Bacillus thuringiensis strain expressing a novel crystal protein with cytocidal activity against human cancer cells. // J. Appl. Microbiol. 103(1), P. 65-79

67. Jurat-Fuentes, J.L., Gould, F.L., and Adang, M.J. (2004). Altered glycosylation of63. and 68-kilodalton microvillar proteins in Heliothis virescens correlates withreduced Cryl toxin binding, decreased pore formation, and increased resistance to

68. Bacillus thuringiensis Cryl toxins. // Appl. Environ. Microbiol., 68, P. 5711-5717.

69. Kalman S, Kiehne KL, Libs JL, Yamamoto T. (1996) Cloning of a novel crylC-type gene. // Curr Microbiol., 32(4), P. 195-200 Kanintronkul, Y., Sramala, I., Katzenmeier, G., Panyim, S., and

70. Angsuthanasombat, C. (2003). Specific mutations within a4-a5 loop of the Bacillusthuringiensis Cry4B toxin reveal a crucial role for Asn-166 and Tyr-170. // Mol.

71. Biotechnol., 24, P. 11-20.

72. Kinney K.S., Austin C.E., Morton D.S., (1999) Sonnenfeld G. Catecholamine enhancement of Aeromonas hydrophila growth // Microbial Pathogenesis, V.25, P. 85-91.

73. Knowles, B.H., and Ellar, DJ. (1987). Colloid-osmotic lysis is a general feature of the mechanism of action of Bacillus thuringiensis 5-endotoxins with different insect specificity. Biochim. Biophys. Acta 924: 509-518.

74. Kolst0 AB. (1997) Dynamic bacterial genome organization. Review. // Mol Microbiol., Apr;24(2), P. 241-8.

75. Kruk Z. L., Pycock C. J. (1990) Neurotransmitters and Drugs. L., N.Y., Tokyo: Chapman & Hall.

76. De Maagd, R.A., Bravo, A., Crickmore, N. (2001) How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to colonize the insect world. Review // Trends Genet., 17(4), P. 193-9.

77. Manasherob R, Zaritsky A, Metzler Y, Ben-Dov E, Itsko M, Fishov I. (2003) Compaction of the Escherichia coli nucleoid caused by CytlAa/ // Microbiology. Dec;149(Pt 12), P. 3553-64.

78. Macy JM, Snellen JE, Hungate RE. (1972) Use of syringe methods for anaerobiosis // Am J Clin Nutr., Dec;25(12), P. 1318-23

79. McNall, R.J., and Adang, M.J. (2003). Identification of novel Bacillus thuringiensis Cry 1 Ac binding proteins in Manduca sexta midgut through proteomic analysis. // Insect Biochem. Mol. Biol., 33, P. 999-1010.

80. Nagamatsu, Y., Itai, Y., Hatanaka, G., Funatsu,G., Hayashi K. (1984) A toxic fragment from the entomocidal crystal protein of Bacillus thuringiensis. II Agric. Biol. Chem., 48, P. 611-619.

81. Nicholls, C.N., Ahmad, W., and Ellar, D.J. (1989) Evidence for two different types of insecticidal P2 toxins with dual specificity in Bacillus thuringiensis subspecies. // J. Bacterriol., 171, P. 5141-5147.

82. Pang, A.S., Gringorten, J.L., Bai, C. (1999) Activation and fragmentation of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin by high concentrations of proteolytic enzymes. // Can. J. Microbiol., 45(10), P. 816-25.

83. Poncet S, Delecluse A, Klier A, Rapoport G. Evaluation of synergistic interactions between the CrylVA, CrylVB and CrylVD toxic components oiB.thuringiensis subsp.israelemis crystals // J. Invert. Pathol. 1995. - V.66. -P.131-135

84. Promdonkoy B, Ellar DJ (2005) Structure-function relationships of a membrane pore forming toxin revealed by reversion mutagenesis. // Mol Membr Biol.,22(4), P. 327-37

85. Salamitou S, Agaisse H, Bravo A, Lereclus D (1996) Genetic analysis of crylllA gene expression in Bacillus thuringiensis. II Microbiology, Aug; 142 ( Pt 8), P. 204955.

86. Sambrook, J., Fritsch, R.F., Maniatis, T.(1989) // Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Second Edition).

87. Sharpe, E.S., and Baker, F.L. (1979). Ultrastructure of the unusual crystal of the HD-1 isolate of Bacillus thuringiensis var. kurstaki. II J. Invertebr. Pathol. 34: 320322.

88. Schnepf, E., Crickmore, N., Van Rie, J., Lereclus, D., Baum, J., Feitelson, J., Zeigler, D.R. & Dean, D.H. (1998) Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. // Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, P. 775-806.

89. Smedley DP, Armstrong G, Ellar DJ., (1997) Channel activity caused by a Bacillus thuringiensis delta-endotoxin preparation depends on the method of activation. // Molecular Membrane Biology, Jan-Mar; 14(1), P. 13-8

90. Spurr H., Bailey J. (1983) Biological control of peanut leafspot // ZProc. Amer. Peanut. Res. and Educ.Soc., V. 15, P. 93.

91. Stahly D.P., Dingman D.W., Irgens R.L., Field C.C., Feiss M.G., Smith G.L. (1978a) Multiple extrachromosomal deoxyribonucleic acid molecules in Bacillus thuringiensis//FEMS Microbiol. Lett., V. 3, P. 139.

92. Stahly D.P., Dingman D.W., Bulla L.A., Aronson A.T.(19786) Possible origin and function of the parasporal crystals in Bacillus thuringiensis //Biochem. Biophys. Res. Communs., V. 84, P. 581-588.

93. Steinhaus E.A. (1951) Futher observations on Bacillus thuringiensis Berliner and other sporeforming bacteria // Hilgardia, V. 23, P. 1-21.

94. Tomimoto, K., Hayakawa, T., Hori, H. (2006) Pronase digestion of brush border membrane-bound CrylAa shows that almost the whole activated CrylAa molecule penetrates into the membrane. // Comp. Biochem. Physiol. Biochem. Mol. Biol., 144(4), P. 413-22.

95. Walters F.S., Slatin S.L., C.A. Kulesza, L.H. English, (1993) Ion channel activity of N-terminal fragments from CrylA(c) delta-endotoxin. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 196, P. 921-926.

96. Wolfsberger M.G., (1995) Permeability of Bacillus thuringiensis Cryl toxin channels. In J.M. Clark (ed.), Molecular action of insecticides on ion channels. American Chemical Society, Washington, D.C.

97. Wong HC, SchnepfHE, Whiteley HR (1983) Transcriptional and translational start sites for the Bacillus thuringiensis crystal protein gene.// Biol Chem, Feb 10;258(3), P. 1960-7.

98. Xia, L.Q., Zhao, X.M, Ding, X.Z, Wang, F.S, and Sun, Y.J. (2008): The theoretical 3D structure of Bacillus thuringiensis Ciy5Ba. // J.Mol. Model, 14(9), P. 843-848.

99. Xin-Min Z, Li-Qiu X, Xue-Zhi D, Fa-Xiang W (2009) The theoretical three-dimensional structure of Bacillus thuringiensis Cry5Aa and its biological implications. // Protein J, Feb;28(2), P. 104-10.

100. Yudina T.G, Konukhova A.V, Revina L.P, Kostina L.I, Zalunin LA, Chestukhina G.G. (2003) Antibacterial activity of Cry- and Cyt-proteins from Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. // Can. J. Microbiol, V.49, №1, P. 37 -44.

101. Zalunin, I.A., Revina, L.P., Kostina, L.I., and Chestukhina, G.G. (2004) Peculiarities of Cry proteins to be taken into account during their in vivo and in vitro study. // IOBC Wrps Bulletin, 27, P. 177-185.