Изучение стабилизации двойной спирали ДНК для хранения на твёрдых носителях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.04, кандидат наук Бачурин Станислав Сергеевич

• Бачурин Станислав Сергеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Бачурин Станислав Сергеевич

Введение

Глава 1. Структура и свойства молекулы ДНК (Обзор литературы)

1.1 Физико-химические свойства молекулы ДНК

1.2 Роль неканонических структур ДНК

1.3 Устойчивость отдельных структурных элементов ДНК к химическим воздействиям

1.3.1 Химическая устойчивость фосфодиэфирных групп

1.3.2 Химическая устойчивость дезоксирибозы

1.3.3 Химическая устойчивость азотистых оснований

1.4 Влияние ионов металлов на структуру ДНК

1.5 Фотохимические модификации нуклеиновых кислот

1.6 Влияние ионизирующей радиации на нуклеиновые кислоты

1.7 Биологическая устойчивость ДНК

1.8 Анализ требований, предъявляемых к свойствам ДНК-карты

Глава 2. Методология и методы исследования

Глава 3. Квантово-химическое исследование сравнительной

стабильности неканонических структур (НС) ДНК

3.1 Определение нуклеотидных последовательностей ДНК человека, наиболее склонных к образованию НС ДНК

3.2 Термодинамическая значимость протонирования гуанина в образовании пары гуанин-цитозин

3.3 Комбинации НС ДНК изомерные гуанин-цитозиновым парам оснований

3.4 Роль положения протона на термодинамическую стабильность и образование протонированных триплексов

Глава 4. Изучение селективности различных комплементарных пар

ДНК к ионам Cu2+

4.1 Электрофоретическое исследование взаимодействия ионов Cu2+ с высокомолекулярной ДНК

4.2 Взаимодействие ионов Cu2+ с основными дНТФ

4.3 Влияние ионов Cu2+ на одно- и двухцепочечные синтетические олигонуклеотиды

4.4 Квантово-химические DFT расчёты стабильности аквакомплекса иона Cu2+ с нуклеотидной парой гуанин-цитозин

Глава 5. Изучение целостности высокомолекулярной ДНК в

стабилизирующем буфере

5.1 Сравнение ДНК-стабилизирующих свойств разработанного BIO буфера и коммерческого FTA буфера

5.2 Сравнение эффективности стабилизации ДНК на бумажном носителе, пропитанном FTA или BIO буфером

5.3 Выбор антибактериальных и фунгицидных веществ для предотвращения микробной контаминации

5.4 Изучение стабильности молекул ДНК в растворе BIO буфера с добавлением противомикробных препаратов

5.5 Влияние компонентов BIO-буфера на антимикробную активность антибактериальных и фунгицидных препаратов

Глава 6. Изучение роли антикоагулянтов в хранении

ДНК-содержащего биологического материала на примере пятен крови

6.1 Антикоагулянты, как вещества, улучшающие распределение

крови на ДНК-карте

6.2 Ультрамикроскопия ДНК-карты с нансённым образцом крови

Глава 7. Основные результаты работы

Заключение

Список литературы

Список рисунков

Список таблиц

Приложение А. Таблицы значений абсолютных и относительных

энергий НС ДНК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение стабилизации двойной спирали ДНК для хранения на твёрдых носителях»

Введение

Физико-химические свойства молекулы ДНК, как основной макромолекулы несущей информацию о живом организме, активно исследуют с момента определения её структуры Уотсоном и Криком [1]. В настоящее время структура, функции и биологические процессы, которые могут происходить с молекулой ДНК достаточно изучены, чтобы иметь представление об организации механизма наследования генетической информации в живых системах. С другой стороны из-за чрезвычайно сложной организации живой материи многие вопросы, касающиеся структуры ДНК и её устойчивости к воздействиям различного рода остаются невыясненными. Благодаря развитию как экспериментальных методов, так и теоретических (в частности улучшению методов квантово-химических расчётов, применительно к биомолекулам), становится возможно всестороннее изучение свойств ДНК для решения практических задач. Одной из таких задач является хранение молекулы ДНК длительное время (более 10 лет) при минимальных затратах.

Существует несколько основных подходов к проблеме хранения ДНК-содержащих биологических образцов. Первый представляет собой ультразаморозку биологических образцов при — 70оС [2]. Данный способ позволяет сохранять биологический материал практически в неизменном виде. Также применяются методы заморозки при —20оС и при — 196оС (в жидком азоте).Однако для создания таких условий требуется дорогостоящее оборудование, емкость которого сильно ограничена, и специальное обучение персонала по работе с такими системами. В то же время эксплуатация оборудования достаточно затратна в финансовом плане.

Второй метод заключается в нанесении биологического образца на специальный материал, обладающий ДНК-стабилизирующим эффектом. Наиболее выгодным считается использование специальных бумажных карт, пропитанных стабилизирующим раствором, компоненты которого предотвращают разрушение ДНК под действием факторов окружающей среды [3—8]. Во всём мире широко используются ДНК-карты фирм FTA и Copan. Исходя из патентных данных [9; 10] основными компонентами стабилизирующего буфера, которым пропитывается бумажная подложка, являются:

1. Слабое основание (трис-гидроксиметил метан в виде свободного основания или карбоната) - необходимо для поддержания рН между 8.0 и 9.5, так как ДНК стабильна в щелочной среде, а рН крови может находиться в диапазоне 7.36-7.42. Также щелочная среда необходима для того, чтобы хелатирующие агенты могли связывать двухвалентные металлы. Помимо трис-гидроксиметил метана и его солей могут использоваться неорганические основания, такие как основные карбонаты или бикарбонаты натрия, лития, калия и т.д.

2. Хелатирующий агент (ЭДТА) - необходим для связывания двхвалентных ионов металлов, таких как Mg2+ и Са2+, а также ионов переходных металлов, в особенности ионов железа Fe2+ (которые в норме присутствуют в составе гемоглобина) и меди Си2+, входящей в состав многих цитохро-мов . Кальций и магний усиливают деградацию ДНК благодаря тому, что являются кофакторами ферментов, разрушающих ДНК. Ионы переходных металлов, таких как железо, могут подвергаться окислительно-восстановительным процессам, также участвуя в повреждении ДНК, благодаря генерации свободных радикалов.

3. Анионный детергент (додецил сульфат натрия) - необходим для разрушения мембран клеток крови, ядер и митохондрий и последующему осаждению ДНК из клеток на поверхность бумажного носителя.

4. Мочевая кислота (или соль мочевой кислоты) - необходима для защиты ДНК от окисления кислородом воздуха. Выступает в роли так называемой "электронной ловушки".

Примечательно, что анионному детергенту в буферной смеси отводится роль антисептика. По мнению авторов патента предполагается, что детергент будет разрушать мембраны не только клеток крови, но и патогенных микроорганизмов, ферментные системы которых могут разрушить хранящуюся ДНК и привести к потере ценной генетической информации. Практика использования данных FTA карт опровергла такое предположение. Например, некоторые авторы [11] отмечают, что около 1% FTA карт было подвержено загрязнению плесневыми грибками. Это могло быть вызвано как несовершенством самих FTA карт, так и нарушениями условий хранения и эксплуатации данных карт. Соответственно усиление противомикробной защиты ДНК карт является одним из важных аспектов их совершенствования. Более того, FTA карты имеют относительно высокую

стоимость и требуют условия хранения в температурном диапазоне +10 — 15^

[9; 10].

Помимо разрушительного действия микроорганизмов, нарушать целостность сохраняемой генетической информации в ДНК могут ионы переходных металлов. Как отмечено выше в состав ДНК-стабилизирующего буфера входят хелаторы, которые конкурируют с ДНК за связывание с ионами гемового железа Fe2+. Предполагается, что повреждение ДНК может быть обусловлено инициацией ионами Fe2+ окислительно-восстановительных реакций, которые приводят к разрушению молекулы ДНК. Однако в состав клеток крови, помимо ионов Fe2+ входят ионы ^2+. В большом количестве они находятся в активных центрах ци-тохромов митохондрий и входят в состав церулоплазмина. Соответственно влияние ионов двухвалентной меди на стабильность ДНК требует рассмотрения.

Ионы переходных металлов могут иметь огромное влияние на структуру ДНК, благодаря образованию комплексных соединений с азотистыми основаниями. Оказалось, что ионы d-элементов стабилизируют ДНК в иной, отличной от B-формы, спирали [12]. Более того, даже при сохранении B-формы спирали в целом может происходить отдельная структурная деформация на участке нуклеиновой кислоты. Топологии связывания азотистых оснований, которые характеризуют такие локальные структурные деформации получили название неканонических структур (НС). Несмотря на то, что они давно изучаются, до сих пор в рамках единой расчётной схемы не была проанализирована их термодинамическая стабильность относительно нативной B-формы ДНК.

Изучение поставленных вопросов позволит усовершенствовать ДНК-карты и методы их эксплуатации. Сферы применения ДНК-карт в настоящее время являются практически безграничными. По мере снижения потребности (но не значимости) можно ранжировать сферы применения в следующем порядке: идентификация личности, исследование наследственных заболеваний, сохранение информации о видовом разнообразии живых организмов.

Проблема идентификации личности по биологическим образцам становится всё актуальнее. По данным Культина А.Ю. и соавт. [13] только в России ежегодно пропадает без вести около 60 тыс. человек и обнаруживается до 30 тыс. неопознанных трупов. Их появление связано с участившимися техногенными катастрофами, авариями, природными катаклизмами и т.д. В то же время локальные

военные конфликты также являются источником неопознанных тел и биологических останков. Более того, на месте преступления зачастую остается ДНК содержащий биоматериал (потожировые следы, кровь, слюна, эпителий кожи и т.д.), который может помочь органам следствия в идентификации преступника [14].

Идентификация по биологическим останкам стала возможна благодаря открытию метода ДНК-анализа в 1984 году [15]. ДНК-анализ (генная "дактилоскопия", генотипоскопия), был признан во всём мире как наиболее универсальный, эффективный и достоверный. Найденное небольшое количество ДНК может быть многократно увеличено до необходимого объема для анализа, благодаря способности ДНК воспроизводиться при проведении амплификации. В отличие от белков или жиров, ДНК всех клеток организмов и тканей одного организма имеют одинаковое строение и не изменяется на протяжении всей жизни человека. Это позволяет точно идентифицировать человека и исследовать ДНК из биологических следов большой давности образования. Также следует отметить, что анализ ДНК позволяет устанавливать либо подтверждать отцовство, материнство или иную близкородственную связь.

ДНК-анализ производится методом попарного сравнения неизвестного образца ДНК с заранее установленным. В случае идентичности обоих образцов говорят об успешной идентификации. 10 апреля 1995 г. Министерство внутренних дел Великобритании объявило о создании первой в мире национальной базы данных ДНК, сокращенно называемой UK NDNAD, объем которой к середине 1998 года составлял уже 320 тысяч генотипов, а на конец 2016 года - около 6 миллионов генетических профилей С 1995 по 1999 годы информация в UK NDNAD была представлена в виде генотипов по 6 локусам (участкам ДНК) системы SGM (Second Generation Multiplex) (локусы: vWA, D8S1179, D21S11, D18S51, TH01, FGA). Для увеличения надежности ДНК-анализа идею оцифровки генетического профиля биообъектов пришлось дополнить длительным хранением биологического образца для дальнейшей молекулярно-генетической идентификации. Таким образом, основной проблемой для успешного проведения ДНК-анализа является накопление и хранение идентифицированных образцов ДНК с которыми будет производится сравнение найденных неопознанных биологических объектов.

В целях организации хранения таких образцов ДНК была принята инициатива создания ДНК банков. К настоящему времени созданы банки ДНК в Ве-

1https://www.gov.uk/government/statistics/national-dna-database-statistics

ликобритании, США, Австралии, Канаде, Израиле, Кувейте. С подачи Дональда Атвуда (Donald J. Atwood), заместителя министра обороны администрации Джорджа Буша, в 1991 г. в армии США для идентификационных целей стали активно использовать молекулярно-генетические методы. Одновременно с этим, в том же 1991 году был создан депозитарий биологических образцов (сухой крови) всех военнослужащих и гражданского персонала армии США. Основная цель создания депозитария образцов крови военнослужащих и гражданского персонала армии США - быстрая и эффективная ДНК-идентификация человеческих останков. Эффективность такой структуры была надежно доказана во время войн в Персидском заливе и в Афганистане. В настоящее время депозитарий биологических образцов военнослужащих и гражданского персонала армии США насчитывает свыше 6 миллионов образцов сухой крови. При этом срок хранения биологических образцов определяется не менее, чем 50-ю годами (при условии поддержания постоянной температуры хранения -20°С). По требованию донора, после его увольнения из рядов вооруженных сил США, его биоматериал немедленно уничтожается.

В настоящее время создано четыре основных типа ДНК-банков: судебно-медицинские, военные, генетической генеалогии и медицинские. Первые необходимы для нужд правоохранительных органов. В целях повышения раскрываемости преступлений было предложено собирать образцы крови, слюны и пото-жировые выделения у людей, совершивших уголовное преступление. Благодаря этим мерам, в развитых странах раскрываемость преступлений увеличилась на 90% [16]. Банк ДНК военнослужащих, как упоминалось выше, позволяет оптимизировать и облегчить идентификацию личности погибшего военнослужащего, даже при достаточно скудном биологическом материале (напр. обгоревшие кости) [17; 18]. Банки генетической генеалогии содержат образцы ДНК всех возможных видов живых организмов и используются в научных целях. Медицинские банки аналогичны генеалогическим, но служат для определения взаимосвязи наследственной предрасположенности к определенным заболеваниям людей и проведения исследований в этой области.

Очевидно, что с помощью только одного методологического подхода не удастся получить всю необходимую информацию, которую можно будет использовать для решения практической задачи по усовершенствованию ДНК-карт. Целью данной работы является исследование факторов (структурных, термодина-

мических и биологических) нарушающих структурную целостность двойной спирали ДНК, и разработка способов защиты от них.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить термодинамическую стабильность неканонических структур ДНК;

Г% I

2. Исследовать связывание иона Си2 с различными комплементарными парами азотистых оснований;

3. Рассмотреть влияние антибактериальных и фунгицидных препаратов на целостность ДНК в стабилизирующем буфере;

4. Изучить влияние антикоагулянтов в составе стабилизирующего буфера на сохранность ДНК в крови на твёрдом носителе (ДНК-картах).

Научная новизна:

1. Найдены нуклеотидные последовательности минимальной длины, способные к равновероятному образованию основных неканонических структур ДНК;

2. Впервые в рамках единой расчётной схемы проведены квантово-химические расчёты термодинамической стабильности различных неканонических структур азотистых оснований. В результате чего обнаружены комбинации неканонических структур, способные конкурировать с В-формой ДНК;

3. Предложен механизм образования протонированных триплексов ДНК;

4. Изучено влияние различных антибактериальных препаратов а также их комбинаций на стабильность ДНК. Выбраны препараты, которые могут быть введены в состав ДНК-стабилизирующих систем длительного хранения;

5. Спектральными и теоретическими методами обоснована селективность пар гуанин-цитозин в составе олигонуклеотидов к ионам Си2+;

6. Показано влияние антикоагулянта (ЭДТА) на эффективность ДНК-карт сохранять образцы крови.

Практическая значимость: Разработан алгоритм и его программная реализация для поиска нуклеотидных последовательностей, способных образовывать заданное количество неканонических структур ДНК. Рзработан состав ДНК-

стабилизирующего буфера, обладающий противомикробной активностью. Создан и защищён патентом опытный образец ДНК-карты, устойчивой к микробной контаминации превосходящий по аналогичным показателям прототип - FTA-карту фирмы Whatman. Предложена модель фармакологической мишени в ДНК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Большая стабильность некоторых неканонических структур ДНК (G-квадруплекс, i-мотив, некоторые виды триплексов) по сравнению с классической уотсон-криковской формой;

2. Существование участков ДНК, способных к равновероятному образованию неканонических структур ДНК;

3. Селективность ионов Cu2+ в отношении участков гуанин-цитозин в молекуле ДНК;

4. Сохранение стабильности ДНК в буферах, содержащих антимикробные препараты пефлоксацин, офлоксацин, кларитромицин и дифеноконазол;

5. Разработка новых BIO-карт на поверхности которых жидкий биологический материал (кровь) распределяется более эффективно, чем на поверхности коммерческих FTA-карт.

Достоверность результатов обеспечивается точностью выбранных методов исследования. Результаты находятся в соответствии с результатами, полученными другими авторами.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на:

XIV Российская научно-практическая конференция с международным участием "Обмен веществ при адаптации и повреждении" (15-16 мая 2015 г.).

V съезд биофизиков России (4-10 октября 2015 г.).

Конференции "Языки программирования и компиляторы 2017" (3-5 апреля 2017 г.).

XVI Российская научно-практическая конференция с международным участием "Обмен веществ при адаптации и повреждении - дни молекулярной медицины на Дону" (12-13 мая 2017 г.).

Личный вклад. Автору принадлежит ведущая роль в анализе литературных данных, анализе и обобщении полученных результатов. Автор принимал активное участие в выборе противомикробных препаратов ДНК-стабилизирующего

буфера. Лично автором проведены УФ-спектроскопические исследования влия-

Г% I

ния ионов Cu2 на дНТФ и олигонуклеотиды. Автор принимал участие в планировании и проведении всех квантово-химических исследований, указанных в настоящей работе. Автор принимал участие в разработке алгоритма поиска нуклео-тидных последовательностей, способных образовывать более одной неканонической структуры ДНК.

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 8 работах, 2 из которых — статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 статья в зарубежном издании, индексируемом в базе данных Scopus, 5 — являются тезисами докладов. Оформлен 1 патент.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения и двух приложений. Полный объём диссертации составляет 118 страниц, включая 39 рисунков и 9 таблиц. Список литературы содержит 122 наименования.

Глава 1. Структура и свойства молекулы ДНК (Обзор литературы)

1.1 Физико-химические свойства молекулы ДНК

Молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) представляют собой длинные двойные цепи полимеров, составленных из азотистых оснований, связанных с углеводно-фосфатным остовом. В состав ДНК всех живых организмов входят всего четыре типа азотистых оснований - аденин (А), гуанин цитозин (С) или тимин (Т).

а) б) в) г)

Рисунок 1.1 —Азотистые основания, составляющие ДНК: а) - аденин, б) -

тимин, в) - гуанин, г) - цитозин.

Аденин и гуанин являются пуриновыми основаниями, тогда как тимин и цитозин - пиримидиновыми. Замещенные и незамещенные основания сходны по структуре, различия наблюдаются только в окружении атома азота, соединенного с углеводным остатком [19]. Структура гетероциклических оснований в растворах обычно планарна. Было определено, что в пуринах (гуанин, аденин) и ци-тозине аминогруппы участвуют в образовании резонансной структуры, так как

о

длина экзоциклической С— КН2 связи равна 1,34(1) А, что значительно меньше

о

одинарной связи С— N равной 1,472(5) А [20]. Связь С—NH2 занимает промежуточное положение между одинарной и двойной, исходя из данных рентгено-структурного анализа и квантово-химических расчётов [19]. Такая особенность геометрии затрудняет вращение вокруг связи С—NH2 и приводит к тому, что эк-зоциклические аминогруппы и связанные с ними гетероциклы компланарны.

В свою очередь экзоциклические длина связи С—О в гуанине и пиримиди-

о

нах составляет 1,21-1,24А, что ближе по значениям к двойной связи [21]. Это указывает на существование пиримидинов и гуанина преимущественно в лактамной форме.

Углеводным остатком в ДНК является 2-дезокси^-рибоза . Углеводофос-фат соединен с азотистым основанием посредством ^гликозидной связи. Азотистое основание прикрепляется к С атому углерода дезоксирибозы. Кислотные свойства молекулы ДНК обусловлены возможностью фосфатных групп нуклеиновых кислот высвобождать ион водорода.

В отличие от азотистых оснований, пятичленное фуранозное кольцо в составе дезоксирибозы никогда не бывает плоским. Как показал анализ конформа-ций рибозы в составе большого числа нуклеозидов, величина изгиба кольца дезоксирибозы принимает значения 38,6±3° [19].

Углеводно-фосфатные группы связывают между собой остатки 2-дезокси-D-рибозы (с которыми соединены азотистые основания). Из-за вклада п-связи (который составляет примерно 35%) валентный угол между диэфирными связями атома кислорода увеличивается до 118-120°. Остальные межатомные расстояния и валентные углы сильно зависят от формы и окружения молекулы ДНК и имеют значения только при рассмотрении кристаллического состояния. В растворе различие между атомами кислорода, не принимающими участия в образовании эфирной связи нивелируются из-за миграции ионов металлов и водорода [22].

В отличие от связи С-0 в фуранозе, вращение вокруг связи Р-0 менее заторможено, в результате чего именно возможность вращения вокруг данной связи определяет структурное разнообразие полинуклеотидов. Однако особенности ориентации относительно связей Р-0 и стэкинг взаимодействие между основаниями приводит к стабилизации полинуклеотидов в форме правой спирали [23]. В итоге удлинение спирали влияет на конформационную гибкость нуклеотидов, что приводит к стабилизации углеводных остатков в С3-эндо-конформации [24; 25].

Таким образом из-за физико-химических особенностей отдельных частей ДНК, связанных в единую полимерную цепь, нуклеиновая кислота образует пространственную компактную форму, которая представляет собой правозакручен-ную спираль.

Представления о вторичной структуре ДНК были сформулированы Д. Уот-соном и Ф. Криком еще в 1953 г. [1] На основе данных рентгеноструктурного анализа молекул ДНК, строения азотистых оснований и правил А. Чаргаффа эти представления сводятся к следующему:

1. Молекула ДНК построена из двух правозакрученных спиралевидных по-линуклеотидных цепей, причем каждый виток спирали соответствует 10 азотистым основаниям или расстоянию в 3,4 нм. Молекулы ДНК, цепи которых правозакручены, первоначально назвали В-формой.

2. Обе цепи объединены в результате закручивания одной вокруг другой по общей оси. Из-за противоположной последовательности атомов в каждой цепи, обе цепи инвертированы относительно одна другой, т. е. направление вдоль дуплекса для одной цепи идёт от 3' —> 5' концу, и от 5' —> 3' для другой.

3. Углеводно-фосфатные группы располагаются на внешней стороне двойной спирали, тогда как основания находятся внутри спирали под прямым углом и вдоль ее оси. Диаметр молекулы составляет 2 нм, расстояния между отдельными азотистыми основаниями в молекуле равны 0,34 нм.

4. Цепи в молекуле не идентичны, но комплементарны и удерживаются слабыми водородными связями между азотистыми основаниями, причем спаривание азотистых оснований для связывания цепей имеет специфический характер. Водородные связи устанавливаются не просто между азотистыми основаниями цепей, а специфически между пуриновым азотистым основанием одной цепи и пиримидиновым азотистым основанием другой. В результате этого аденин одной из цепей связывается с ти-мином другой цепи двумя водородными связями, тогда как гуанин одной из цепей связывается с цитозином, находящимся в другой цепи, посредством трех водородных связей.

Дезоксирибозные остатки пар А=Т и G=C разделены одинаковыми расстояниями. Для углеводофосфатных скелетных связей характерна полярность, поскольку фосфат связывает группу 3'- одной дезоксирибозы с группой 5'- другой, тогда как комплементарные цепи имеют противоположную полярность. Двойная спираль имеет упорядоченный характер, поскольку каждая связь основание-углевод имеет одинаковое расстояние от оси спирали и перевернута на 36° . Описанная вторичная структура отражает собой нативную геометрическую форму нуклеиновой кислоты (В-форма).

Помимо уотсон-криковских водородных связей между азотистыми основаниями могут образовываться хугстеновские водородные связи [26], что приводит к уменьшению упорядоченности спирали ДНК в растворах. Однако благо-

даря стэкинг-взаимодействию (образованию слабых вертикальных водородных связей, диполь-дипольных взаимодействий, гидрофобных сил между основаниями) азотистые основания образуют стопки, как в кристаллической ДНК, так и в водных растворах [27; 28], что позволяет удерживать структуру ДНК в упорядоченной В-форме.

При исследовании растворов ДНК было выявлено, что количество нуклео-тидов в витках правозакрученной спирали может составлять не только 10 оснований, как у В-формы, но также меньше и больше 10 [29]. Эти формы спиралей получили названия А, А', В, а-В', в -В', С, С', С", D, Е и В данной клиссифика-ции латинскими буквами обозначены структурные полиморфные модификации, приставки а и в относятся к чисто упаковочным отличиям из-за симметрии кристаллической решетки. Штрихи указывают на незначительные вариации в пределах полиморфизма. А-форма нуклеиновых кислот может образовываться вне зависимости от нуклеотидной последовательности, в отличие от остальных форм ДНК [12].

Установлено также, что в молекулах ДНК встречаются районы, цепи в которых левозакручены. Эти районы получили название 7-форм. 7-форму преимущественно образуют участки богатые чередующимися пурин-пиримидиновыми основаниями (С = С) [30]. Данная форма стабилизируется в концентрирован-

• О I

ных растворах солей и миллимолярных концентрациях ионов №2 [31].

Третичная структура ДНК связана с трехмерной пространственной конфигурацией молекул и зависит от большого количества условий (взаимодействие с белками-гистонами, первичной и вторичной структуры ДНК, ионного состава раствора и т.д.). Однако эта структура достаточно еще не изучена. Следует отметить, что в образовании третичной структуры и нуклеосом важную роль играют "экзотические" формы ДНК (неканонические структуры), характеристика которых будет дана ниже [32].

1.2 Роль неканонических структур ДНК

В ядре клетки ДНК находится в виде суперскрученной уотсон-криковской В-формы, стабилизированной вспомогательными белками. Однако во время ре-

пликации и транскрипции, или при изменении условий среды и лигандного окружения, ДНК расплетается и может образовывать совершенно иные структуры, в которых межмолекулярные водородные связи образуются между "не уотсон-криковскими" (хугстиновскими) гетероатомами (рис. 1.2). Все это в целом и обеспечивает высокое многообразие (полиморфизм) системы [1]. Структуры, образованные комбинированием азотистых оснований с помощью уотсон-криковских и хугстиновских водородных связей или только хугстиновских, называют неканоническими структурами (НС) ДНК. К ним относятся G-квадруплекс, i-мотив, триплекс и шпилька (рис. 1.2) [33]. Все они могут образовываться как в пределах одной цепи ДНК, так и состоять из разных молекул.

Известно, что нативная ДНК (содержащаяся в клетке) содержит определенное количество связанной воды. Методом дифракции рентгеновских лучей показано, что пространственная структура ДНК зависит также от количества связанной воды. B-форма ДНК стабильна при относительной влажности выше 70% [34]. Таким образом нельзя исключать, что участки ДНК во внеклеточных условиях (а также в условиях иных, отличных от воды, растворителей) будут приобретать отличные от B-формы структуры.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бачурин Станислав Сергеевич, 2019 год

Список литературы

1. Watson J. D., Crick F. H. Molecular Structure of Nucleic Acids: A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid // Nature. — 1953. — Т. 171. — С. 737—738.

2. Корниенко И. В., Харламов С. Г. Методы исследования ДНК человека. — Ростов-на-Дону : Издательство Южного федерального ун-та, 2012.

3. Effects of field conditions on fecal microbiota / V. L. Hale [и др.] // Journal of Microbiological Methods. — 2016. — Т. 130. — С. 180—188. — URL: http: //www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167701216302676.

4. DNA Cards: Determinants of DNA Yield and Quality in Collecting Genetic Samples for Pharmacogenetic Studies / S. Mas [и др.] // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. — 2007. — Т. 101, № 2. — С. 132—137. — URL: http://dx.doi.org/10.1111/j.1742-7843.2007.00089.x.

5. The feasibility of storing ovarian tumor cells on databasing paper: establishing a library of ovarian cancer DNA / K. Galaal [и др.] // International Journal of Gynecological Cancer. — 2007. — Т. 17, № 1. — С. 94—100. — URL: http: //dx.doi.org/10.1111/j.1525-1438.2006.00755.x.

6. DNA quality and quantity from up to 16 years old post-mortem blood stored on FTA cards / A.-L. Rahikainen [и др.] // Forensic Science International. — 2016. — Т. 261. — С. 148—153. — URL: http://www.sciencedirect.com/ science/article/pii/S0379073816300366.

7. A comparison of DNA extraction protocols from blood spotted on FTA cards for the detection of tick-borne pathogens by Reverse Line Blot hybridization / Z. Hailemariam [и др.] // Ticks and Tick-borne Diseases. — 2017. — Т. 8, № 1. — С. 185—189. —URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S1877959X16301807.

8. Long-term storage and safe retrieval of human papillomavirus DNA using FTA elute cards / H. Barth [и др.] // Journal of Virological Methods. — 2016. — Т. 229. — С. 60—65. —URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S0166093415003936.

9. Fta-coated media for use as a molecular diagnostic tool / G. Fomovskaia [и др.]. — 2000. — URL: https://www.google.com/patents/WO2000062023A1? cl=en ; WO Patent App. PCT/US2000/010,230.

10. Burgoyne L. A. Solid medium and method for DNA storage. — 1998. — URL: https://www.google.com/patents/US5807527 ; US Patent 5,807,527.

11. Опыт использования FTA-носителей для хранения образцов крови при проведении молекулярно-генетических идентификационных исследований неопознанных погибших - жертв военных действий на территории Чеченской Республики / П. Л. Иванов [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. — 2002. — № 6. — С. 20—27.

12. A bouquet of DNA structures: Emerging diversity / M. Kaushik [и др.] // Biochemistry and Biophysics Reports. — 2016. — Т. 5. — С. 388—395. — URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405580816300024.

13. Криминалистическое исследование STR-локусов ДНК костных останков человека в целях идентификации личности: Методические рекомендации / А. Ю. Культин [и др.]. — Москва : Щербинская типография, 2004. — 2 с.

14. Проблемы молекулярно-генетической идентификации потожировых следов отпечатков пальцев человека / Т. Г. Фалеева [и др.] // Судебно-медицинская экспертиза. — 2016. — Т. 59, № 2. — С. 14—18.

15. Jeffreys A., Wilson V., Them S. Individual specific fingerprints of human DNA // Nature. — 1985. — Т. 361. — С. 75—79.

16. Doleac J. L. The Effects of DNA Databases on Crime // American Economic Journal: Applied Economics. — 2017. — Т. 9, № 1. — С. 165—201. — URL: http://www.aeaweb.org/articles?id=10.1257/app.20150043.

17. Корниенко И. В., Кононов Н. В. О необходимости создания ДНК-депозитария военнослужащих Российской Федерации // Судебно-медицинская экспертиза. — 2015. — № 6. — С. 17—21.

18. Корниенко И. В., Внукова Н. В., Березовский Д. П. Опыт выделения ядерной ДНК из костных останков, подвергшихся термическому воздействию с целью идентификации личности // Судебно-медицинская экспертиза. — 2011. —Т. 9, № 3. — С. 139—140.

19. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. Пер. с англ. — Москва : "Мир", 1987. — 584 с.

20. Allen P. W., Sutton L. E. Tables of interatomic distances and molecular configurations obtained by electron diffraction in the gas phase // Acta Crystallographica. — 1950. — T. 3, № 1. — C. 46—72. — URL: https : //doi.org/10.1107%2Fs0365110x50000100.

21. Donohue ./.Crystal symmetry of deoxyribonucleic acid // Journal of Molecular Biology. — 1969. — T. 41, № 2. — C. 291—294. — URL: https://doi.org/10. 1016%2F0022-2836%2869%2990393-3.

22. The Cambridge Crystallographic Data Centre: computer-based search, retrieval, analysis and display of information / F. H. Allen [h gp.] // Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. — 1979. — T. 35, № 10. — C. 2331—2339. — URL: https : / / doi . org / 10 . 1107 % 2Fs0567740879009249.

23. Seven basic conformations of nucleic acid structural units / S.-H. Kim [h gp.] // Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. — 1973. — T. 29, № 4. — C. 703—710. — URL: https://doi.org/ 10.1107%2Fs0567740873003201.

24. Davies D. B. Conformations of nucleosides and nucleotides // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. — 1978. — T. 12, № 3. — C. 135— 225. — URL: https://doi.org/10.1016%2F0079-6565%2878%2980006-5.

25. Evans F. E., Sarma R. H. Nucleotide rigidity // Nature. — 1976. — T. 263, № 5578. — C. 567—572. — URL: https://doi.org/10.1038%2F263567a0.

26. Hoogsteen K. The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1-methylthymine and 9-methyladenine // Acta Crystallographica. — 1963. — T. 16, № 9. — C. 907—916. — URL: https://doi.org/10.1107% 2Fs0365110x63002437.

27. Hanlon S. The importance of London dispersion forces in the maintenance of the deoxyribonucleic acid helix // Biochemical and Biophysical Research Communications. — 1966. — T. 23, № 6. — C. 861—867. — URL: https: //doi.org/10.1016%2F0006-291x%2866%2990567-5.

28. DeVoe H., Tinoco I. The stability of helical polynucleotides: Base contributions // Journal of Molecular Biology. — 1962. — T. 4, № 6. — C. 500—517. — URL: https://doi.org/10.1016%2Fs0022-2836%2862%2980105-3.

29. Polymorphism of DNA double helices / A. Leslie [и др.] // Journal of Molecular Biology. — 1980. — Т. 143, № 1. — С. 49—72. — URL: https://doi.org/10. 1016%2F0022-2836%2880%2990124-2.

30. Wang G., Vasquez K. M. Non-B DNA structure-induced genetic instability // Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. — 2006. — Т. 598, № 1/2. — С. 103—119. — URL: http://www.sciencedirect. com / science / article / pii / S0027510706000625 ; Induced Tandem Repeat Instability.

31. Renciuk D., Kypr J., Vorlickova M. CGG repeats associated with fragile X chromosome form left-handed Z-DNA structure // Biopolymers. — 2011. — Т. 95, № 3. — С. 174—181.—URL: http://dx.doi.org/10.1002/bip.21555.

32. Sinden R R DNA Structure and Function. — 1-е изд. — Academic Press, 1994. — С. 398.

33. Wang G., Vasquez K. M. Impact of alternative DNA structures on DNA damage, DNA repair, and genetic instability // DNA Repair. — 2014. — Т. 19. — С. 143—151. — URL: http: //www. sciencedirect. com/science/article/pii/ S1568786414000883 ; Cutting-edge Perspectives in Genomic Maintenance.

34. Ладик Я. Квантовая биохимия для химиков и биологов. — Перевод на русский язык, "Мир", 1975.

35. GehringK.,Leroy J.-L., Gu'eronM. A tetramericDNA structure withprotonated cytosine-cytosine base pairs // Nature. — 1993. — Т. 363, № 6429. — С. 561— 565. — URL: http://dx.doi.org/10.1038/363561a0.

36. DayH. A., PavlouP., Waller A. E. i-MotifDNA: Structure, stability and targeting with ligands // Bioorganic & Medicinal Chemistry. — 2014. — Т. 22, № 16. — С. 4407—4418. —URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S0968089614004064 ; Unlocking Nature through Chemistry.

37. Saxena S., Bansal A., Kukreti S. Structural polymorphism exhibited by a homopurineB-homopyrimidine sequence found at the right end of human c-jun protooncogene // Archives of Biochemistry and Biophysics. — 2008. — Т. 471, № 2. — С. 95—108. —URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/ S0003986108000386.

38. Day H. A., Huguin C., Waller Z. A. E. Silver cations fold i-motif at neutral pH // Chem. Commun. — 2013. — T. 49, № 70. — C. 7696—7698. — URL: http: //dx.doi.org/10.1039/C3CC43495H.

39. Geliert M., Lipsett M. N., Davies D. R. Helix formation by guanylic acid // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 1962. — T. 48, № 12. — C. 2013—2018. — URL: http://dx.doi.org/10.1073/pnas.48.12.2013.

40. Pochon F., Michelson A. M. Polynucleotides. VI. Interaction between polyguanylic acid and polycytidylic acid. // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 1965. — T. 53, № 6. — C. 1425—1430. — URL: http://dx.doi.org/10.1073/pnas.53.6.1425.

41. Zemanek M., Kypr J., Vorlickova M. Conformational properties of DNA containing (CCA)n and (TGG)n trinucleotide repeats // International Journal of Biological Macromolecules. — 2005. — T. 36, № 1/2. — C. 23—32. — URL: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0141813005000541.

42. Simonsson T. G-Quadruplex DNA Structures Variations on a Theme // Biological Chemistry. — 2001. — T. 382, № 4. — URL: http: //dx. doi. org/10.1515/bc.2001.073.

43. Horwitz M. S., Loeb L. A. An E. coli promoter that regulates transcription by DNA superhelix-induced cruciform extrusion // Science. — 1988. — T. 241, № 4866. — C. 703—705. — eprint: http://science.sciencemag.org/content/241/ 4866/703.full.pdf. — URL: http://science.sciencemag.org/content/241/4866/ 703.

44. Folded DNA in Action: Hairpin Formation and Biological Functions in Prokaryotes / D. Bikard [h gp.] // Microbiology and Molecular Biology Reviews. — 2010. — T. 74, № 4. — C. 570—588. — eprint: http://mmbr. asm.org/content/74/4/570.full.pdf+html. — URL: http://mmbr.asm.org/content/ 74/4/570.abstract.

45. Behe M. J. An overabundance of long oligopurine tracts occurs in the genome of simple and complex eukaryotes // Nucleic Acids Research. — 1995. — T. 23, № 4. — C. 689—695. — URL: https://doi.org/10.1093%2Fnar%2F23A689.

46. DNA Triplexes: A Study of Their Hydrogen Bonds / M. Peters [h gp.] // The Journal of Physical Chemistry B. — 2003. — T. 107, № 1. — C. 323—330. — eprint: http://dx.doi.org/10.1021/jp026684+. — URL: http://dx.doi.org/10. 1021/jp026684+.

47. Zain R., Sun J.-S. Do natural DNA triple-helical structures occur and function in vivo? // Cellular and Molecular Life Sciences. — 2003. — T. 60, № 5. — C. 862—870. — URL: https://doi.org/10.1007%2Fs00018-003-3046-3.

48. Besch R., Giovannangeli C., Degitz K. Triplex-Forming Oligonucleotides - Sequence-Specific DNA Ligands as Tools for Gene Inhibition and for Modulation of DNA-Associated Functions // Current Drug Targets. — 2004. — T. 5, № 8. — C. 691—703. — URL: http://www.eurekaselect.com/node/62641/ article.

49. Triple Helix-Specific Ligands / J. L. Mergny [h gp.] // Science. — 1992. — T. 256, № 5064. — C. 1681—1684. — URL: https://doi.org/10.1126%2Fscience. 256.5064.1681.

50. Szybalski W. Thermobiology //. — New York Academic Press, 1967. — Tn. Effects of elevated temperatures on DNA and on some polynucleotides. Denaturation, renaturation, and cleavage of glycosidic and phosphate ester bonds. C. 73—122.

51. Trauger J. W., Dvan P. B. Footprinting methods for analysis of pyrrole-imidazole polyamide DNA complexes // Methods in Enzymology. — Elsevier BV, 2001. —C. 450—466.

52. Ermolinsky B. S., Mikhailov S. ^.Periodate oxidation in chemistry of nucleic acids: Dialdehyde derivatives of nucleosides, nucleotides, and oligonucleotides (Review) // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. — 2000. — T. 26. — C. 429—449.

53. Green M., Cohen S. S. Biosynthesis of bacterial and viral pyrimidines. II. Dihydrouracil and dihydrothymine nucleosides // Biol. Chem. — 1957. — T. 225. — C. 397—407.

54. Synthesis and Antiviral Evaluation of Adenosine-N1-Oxide and 1-(Benzyloxy) Adenosines / C. Krauth [h gp.] // Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids. — 1989. — T. 8, № 5. — C. 915—917. — URL: http://dx.doi.org/10.1080/ 07328318908054244.

55. Synthesis and Characterization of Stereoisomers of 5,6-Dihydro-5,6-Dihydroxythymidine / Y. Vaishnav [h gp.] // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. — 1991. — T. 8, № 5. — C. 935—951. — URL: http://dx.doi. org/10.1080/07391102.1991.10507858.

56. Nampalli S., Kumar S. Efficient synthesis of 8-Oxo-dGTP: A mutagenic nucleotide // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. — 2000. — T. 10. — C. 1677—1679.

57. Pichersky E. DNA Sequencing by the Chemical Method // DNA Sequencing Protocols. — Springer Science mathplus Business Media, 1993. — C. 255— 260. — URL: http://dx.doi.org/10.1385/0-89603-248-5:255.

58. Phillips J., Brown D. The Mutagenic Action of Hydroxylamine // Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. — 1967. — C. 349—368.

59. Shapiro R., Difate V., Welcher M. Deamination of cytosine derivatives by bisulfite, mechanism of the reaction // Chemischer Informationsdienst. — 1974. — T. 96, № 3. — C. 906—912.

60. Carreras C. W., Santi D. V.The Catalytic Mechanism and Structure of Thymidylate Synthase // Annu. Rev. Biochem. — 1995. — T. 64, № 1. — C. 721—762. — URL: http://dx.doi.org/10.1146/annurev.bi.64.070195.003445.

61. Cheng X. AdoMet-dependent methylation, DNA methyltransferases and base flipping // Nucleic Acids Research. — 2001. — T. 29, № 18. — C. 3784— 3795. — URL: https://doi.org/10.1093%2Fnar%2F29.18.3784.

62. Houghton J. A., Houghton P. J. 5-Halogenated Pyrimidines and Their Nucleosides // Antitumor Drug Resistance. — Springer Science mathplus Business Media, 1984. — C. 515—549. —URL: http://dx.doi.org/10.1007/978-3-642-69490-5_19.

63. Shapiro R., Yamaguchi H. Nucleic acid reactivity and conformation I. Deamination of cytosine by nitrous acid // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. — 1972. — T. 281, № 4. — C. 501—506. — URL: http://dx.doi.org/10.1016/0005-2787(72)90150-5.

64. Mutagenicity of carcinogenic methylating agents is associated with a specific DNA modification / R. Newbold [h gp.] // Nature. — 1980. — T. 283, № 5747. — C. 596—599. — URL: http://dx.doi.org/10.1038/283596a0.

65. Blans P., Fishbein J. C. Determinants of Selectivity in Alkylation of Nucleosides and DNA by Secondary Diazonium Ions: Evidence for, and Consequences of, a Preassociation Mechanism // Chem. Res. Toxicol. — 2004. — T. 17, № 11. — C. 1531—1539.—URL: http://dx.doi.org/10.1021/tx0498004.

66. Wurdeman R. L., Douskey M. C., Gold B. DNA methylation by N-methyl-N-nitrosourea: methylation pattern changes in single- and double-stranded DNA, and in DNA with mismatched or bulged guanines // Nucl Acids Res. — 1993. — T. 21, № 21. — C. 4975—4980. — URL: http://dx.doi.org/10.1093/nar/21.21. 4975.

67. Synthesis, Characterization, and Quantitation of the Major Adducts Formed between Sulfur Mustard and DNA of Calf Thymus and Human Blood / A. Fidder [h gp.] // Chem. Res. Toxicol. — 1994. — T. 7, № 2. — C. 199—204. — URL: http://dx.doi.org/10.1021/tx00038a013.

68. Bergstrom D. E., Lin X. Recent Advances in Palladium-Mediated Reactions of Nucleosides // Nucleosides and Nucleotides. — 1991. — T. 10, № 1—3. — C. 689—691. — URL: http://dx.doi.org/10.1080/07328319108046574.

69. Langer P. R., Waldrop A. A., Ward D. C. Enzymatic synthesis of biotinlabeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 1981. — T. 78, № 11. — C. 6633—6637. — URL: https://doi.org/10.1073%2Fpnas.78.11.6633.

70. A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides / J. Prober [h gp.] // Science. — 1987. — T. 238, № 4825. — C. 336—341. —URL: http://dx.doi.org/10.1126/science.2443975.

71. Rosenberg B. Platinum complex-DNA interactions and anticancer activity // Biochimie. — 1978. — T. 60, № 9. — C. 859—867. — URL: https ://doi. org/10.1016%2Fs0300-9084%2878%2980570-7.

72. Jamieson E. R., Lippard S. J. Structure, Recognition, and Processing of Cisplatin-DNA Adducts // Chemical Reviews. — 1999. — T. 99, № 9. — C. 2467—2498. — URL: http://dx.doi.org/10.1021/cr980421n.

73. Spingler B., Whittington D. A., Lippard S. J. Crystal Structure of an Oxaliplatin 1,2-dGpG Intrastrand Cross-Link in a DNA Dodecamer Duplex // Inorganic Chemistry. — 2001. — T. 40, № 22. — C. 5596—5602. — URL: http://dx. doi.org/10.1021/ic010790t.

74. Mildvan A. S., Loeb L. A., WuC.-W. The Role of Metal Ions in the Mechanisms of DNA and RNA Polymerase // CRC Critical Reviews in Biochemistry. — 1979. — T. 6, № 3. — C. 219—244. — URL: https://doi.org/10. 3109% 2F10409237909102564.

75. Eichhorn G. L., Shin Y. A. Interaction of metal ions with polynucleotides and related compounds. XII. The relative effect of various metal ions on DNA helicity // Journal of the American Chemical Society. —1968. — T. 90, № 26. —

C. 7323—7328. — URL: https://doi.org/10.1021%2Fja01028a024.

76. Ahrland S., Chatt J., Davies N. R. The relative affinities of ligand atoms for acceptor molecules and ions // Quarterly Reviews, Chemical Society. —1958. — T. 12, № 3. — C. 265. — URL: https://doi.org/10.1039%2Fqr9581200265.

77. Sissoeff I., Grisvard J., Guillé E. Studies on metal ions-DNA interactions: Specific behaviour of reiterative DNA sequences // Progress in Biophysics and Molecular Biology. — 1978. — T. 31. — C. 165—199. — URL: https://doi.org/ 10.1016%2F0079-6107%2878%2990008-1.

78. Multiplicity of cadmium binding sites in nucleotides: X-ray evidence for the involvement of O21' and O3' as well as phosphate and N7 in inosine 5'-monophosphate / D. Goodgame [h gp.] // Nucleic Acids Research. — 1975. — T. 2, № 8. — C. 1375—1380. — URL: https://doi.org/10.1093%2Fnar%2F2.8. 1375.

79. Brown E. A., Bugg C. E. Calcium-binding to nucleotides: structure of a hydrated calcium salt of inosine 5'-monophosphate // Acta Crystallographica Section B. — 1980. — T. 36, № 11. — C. 2597—2604. — URL: https://doi.org/10. 1107/S0567740880009508.

80. Sletten E. Crystal structure of a copper-nucleoside analogue // J. Chem. Soc.

D. — 1971. — № 11. — C. 558—558. — URL: https://doi.org/10.1039% 2Fc29710000558.

81. Kuntz G. P. P., Kotowycz G. Nuclear magnetic resonance relaxation time study of the manganese(II)-inosine 5-triphosphate complex in solution // Biochemistry. — 1975. — № 14. — C. 4144—4150. — URL: https://doi. org/10.1021/bi00689a036.

82. DNA-copper(II) complex and the DNA conformation / C. Zimmer [h gp.] // Biopolymers. — 1971. — T. 10, № 3. — C. 441—463. — URL: https://doi. org/10.1002%2Fbip.360100303.

83. Manning G. S. Counterion binding in polyelectrolyte theory // Accounts of Chemical Research. — 1979. — T. 12, № 12. — C. 443—449. — URL: https: //doi.org/10.1021%2Far50144a004.

84. Record M. T., Anderson C. F., Lohman T. M. Thermodynamic analysis of ion effects on the binding and conformational equilibria of proteins and nucleic acids: the roles of ion association or release, screening, and ion effects on water activity // Quarterly Reviews of Biophysics. — 1978. — T. 11, № 02. — C. 103.—URL: https://doi.org/10.1017%2Fs003358350000202x.

85. Alden C. J., Kim S.-H. Solvent-accessible surfaces of nucleic acids // Journal of Molecular Biology. — 1979. — T. 132, № 3. — C. 411—434. — URL: https: //doi.org/10.1016%2F0022-2836%2879%2990268-7.

86. Chaires J. B. Energetics of drug-DNA interactions // Biopolymers. — 1997. — T. 44, № 3. — C. 201—215. — URL: http://dx.doi.org/10.1002/(SICI) 1097-0282(1997)44:3%3C201::AID-BIP2%3E3.0.C0;2-Z.

87. UVB and UVA radiation-mediated damage to isolated and cellular DNA / J. Cadet [h gp.] // Pure and Applied Chemistry. — 2005. — T. 77, № 6. — URL: http://dx.doi.org/10.1351/pac200577060947.

88. Fisher G., Johns H. Pyrimidine Photohydrates // Photochemistry and Photobiology of Nucleic Acids. — Elsevier BV, 1976. — C. 169—224. — URL: http://dx.doi.org/10.1016/b978-0-12-734601-4.50010-0.

89. Nucleic Acids in Chemistry and Biology / nog peg. G. M. Blackburn [h gp.]. — The Royal Society of Chemistry, 2006. — C. 470. — URL: http://dx.doi.org/ 10.1039/9781847555380.

90. Kim J.-K., Choi B.-S. The Solution Structure of DNA Duplex-Decamer Containing the (6-4) Photoproduct of Thymidylyl(3' leftarrow 5')Thymidine by NMR and Relaxation Matrix Refinement // European Journal of Biochemistry. — 1995. — T. 228, № 3. — C. 849—854. — URL: http : //dx.doi.org/10.1111/j.1432-1033.1995.0849m.x.

91. RNA Is More UV Resistant than DNA: The Formation of UV-Induced DNA Lesions is Strongly Sequence and Conformation Dependent / L. M. Kundu [и др.] // Chemistry - A European Journal. — 2004. — Т. 10, № 22. — С. 5697— 5705. — URL: http://dx.doi.org/10.1002/chem.200305731.

92. Taylor J. S. Unraveling the Molecular Pathway from Sunlight to Skin Cancer // Accounts of Chemical Research. — 1994. — Т. 27, № 3. — С. 76—82. — URL: http://dx.doi.org/10.1021/ar00039a003.

93. You Y.-H. Cyclobutane pyrimidine dimers form preferentially at the major p53 mutational hotspot in UVB-induced mouse skin tumors // Carcinogenesis. — 2000. — Т. 21, № 11. — С. 2113—2117. — URL: http://dx.doi.org/10.1093/ carcin/21.11.2113.

94. Douki T., Cadet J. Individual Determination of the Yield of the Main UV-Induced Dimeric Pyrimidine Photoproducts in DNA Suggests a High Mutagenicity of CC Photolesions // Biochemistry. — 2001. — Т. 40, № 8. — С. 2495—2501. —URL: http://dx.doi.org/10.1021/bi0022543.

95. Schuchmann H.-P. The chemical basis of radiation biology // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. — 1989. — Т. 3, № 3. — С. 465. — URL: http://dx.doi.org/10.1016/1011-1344(89)80053-3.

96. Boorstein R., Cadet J.., Hilbert T. FORMATION, STABILITY AND REMOVAL OF PYRIMIDINE DAMAGE IN DNA // Journal de chimie physique and de physico-chimie biologique. — 1993. — Т. 90, № 4. — С. 837—852.

97. Корниенко И. В., Харламов С. Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: Учебно-методическое пособие. —Ростов-на-Дону: ЮФУ, 2012.

98. Корниенко И. В., Фалеева Т. Г. Композиция для хранения ДНК-содержащих препаратов или ДНК (варианты) и её применение. — 2015. — Патент РФ №2567145.

99. Methods for the determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents // Clinical Microbiology and Infection. — 1998. — Т. 4, № 5. — С. 291— 296. —URL: https://doi.org/10.1111%2Fj.1469-0691.1998.tb00061.x.

100. Cyclo[n]pyrroles: Size and Site-Specific Binding to G-Quadruplexes / E. S. Baker [и др.] // Journal of the American Chemical Society. — 2006. — Т. 128, №8. —С. 2641—2648.

101. Day H. A., Huguin C., Waller Z. A. E. Silver cations fold i-motif at neutral pH // Chemical Communications. — 2013. — Т. 49, № 70. — С. 7696.

102. Юрушкин М. В., Гервич Л. Р., Бачурин С. С. Проблемно-ориентированый язык быстрого поиска нуклеотидных последовательностей минимальной длины, удовлетворяющих различным топологиям связывания азотистых оснований // Языки программирования и компиляторы. — 2017. — С. 272— 275.

103. Dardel F., Bensoussan P. DNAid: a Macintosh full screen editor featuring a built-in regular expression interpreter for the search of specific patterns in biological sequences using finite state automata // Bioinformatics. — 1988. — Т. 4, № 4. — С. 483—486.

104. Toan N. M., Thirumalai D. On the origin of the unusual behavior in the stretching of single-stranded DNA // The Journal of Chemical Physics. — 2012. — Т. 136, №23. — С. 235103.

r

105. Vorlickova M., Kypr J. Conformational Variability of Poly(dA-dT) Poly(dA-dT) and Some Other Deoxyribonucleic Acids Includes a Novel Type of Double Helix // Journal of Biomolecular Structure and Dynamics. — 1985. — Т. 3, № 1. — С. 67—83. — URL: https://doi.org/10.1080%2F07391102.1985. 10508399.

106. Yanson I. K., Teplitsky A. B., Sukhodub L. F. Experimental studies of molecular interactions between nitrogen bases of nucleic acids // Biopolymers. — 1979. — Т. 18, № 5. — С. 1149—1170.

107. Properties of the nucleic-acid bases in free and Watson-Crick hydrogen-bonded states: computational insights into the sequence-dependent features of double-helical DNA / A. R. Srinivasan [и др.] // Biophysical Reviews. — 2009. — Т. 1, № 1. —С. 13—20.

108. Jurecka P., Hobza P. True Stabilization Energies for the Optimal Planar Hydrogen-Bonded and Stacked Structures of Guanine—Cytosine, Adenine—Thymine, and Their 9- and 1-Methyl Derivatives: Complete Basis Set Calculations at the MP2 and CCSD(T) Levels and Comparison with

Experiment // Journal of the American Chemical Society. — 2003. — Т. 125, №50. — С. 15608—15613.

109. Structure-Based Approaches Targeting Oncogene Promoter G-Quadruplexes / D.-L. Ma [и др.] // Oncogene and Cancer - From Bench to Clinic. — InTech, 2013. — URL: https://doi.org/10.5772%2F54809.

110. Beal P., Dervan P. Second structural motif for recognition of DNA by oligonucleotide-directed triple-helix formation // Science. — 1991. — Т. 251, №4999. — С. 1360—1363.

111. Gehring K., Leroy J.-L., Gueron M. A tetrameric DNA structure with protonated cytosine-cytosine base pairs // Nature. — 1993. — Т. 363, № 6429. — С. 561— 565.

112. pK values of the ionizable groups of proteins / R. L. Thurlkill [и др.] // Protein Science. — 2006. — Т. 15, № 5. — С. 1214—1218.—URL: http://dx.doi.org/ 10.1110/ps.051840806.

113. Fei J., Ha T. Watching DNA breath one molecule at a time // Proceedings of the National Academy of Sciences. — 2013. — Т. 110, № 43. — С. 17173— 17174. — URL: https://doi.org/10.1073%2Fpnas.1316493110.

114. DeVoe H., Tinoco I. The hypochromism of helical polynucleotides // Journal of Molecular Biology. — 1962. — Т. 4, № 6. — С. 518—527. — URL: https: //doi.org/10.1016%2Fs0022-2836%2862%2980106-5.

115. Michelson A. M. Hyperchromicity and Nucleic Acids // Nature. — 1958. — Т. 182, № 4648. — С. 1502—1503. — URL: https ://doi. org/10 . 1038 % 2F1821502a0.

116. Lawley P. Interaction studies with DNA // Biochimica et Biophysica Acta. — 1956. — Т. 21, №3. —С. 481—488.— URL: https://doi.org/10.1016%2F0006-3002%2856%2990185-8.

117. Ребриков Д. В., Саматв Г. А., Трофимов Д. Ю. ПЦР в реальном времени. — Москва : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. — 223 с.

118. Касьяненко Н. А., Бартошевич С. Ф., Фрисман Э. В. Исследование влияния pH среды на конформацию молекул ДНК // Молекулярная биология. — 1985. — Т. 19, № 5. — С. 1386—1393.

119. Courtois Y., Fromageot P., Guschlbauer W.Protonated Polynucleotide Structures. 3. An Optical Rotatory Dispersion Study of the Protonation of DNA // European Journal of Biochemistry. — 1968. — T. 6, № 4. — C. 493— 501. —URL: https://doi.org/10.1111%2Fj.1432-1033.1968.tb00472.x.

120. Guschlbauer W. Nucleic Acid Structure. —New York: Springer, 1976. —URL: https://doi.org/10.1007%2F978-1-4613-9397-9.

121. Copper interactions with DNA of chromatin and its role in neurodegenerative disorders / M. Govindaraju [h gp.] // Journal of Pharmaceutical Analysis. — 2013. — T. 3, №5. — C. 354—359. — URL: https://doi.org/10.1016%2Fj. jpha.2013.03.003.

122. Stellwagen N. C. DNA Gel Electrophoresis // Nucleic Acid Electrophoresis. — Springer Berlin Heidelberg, 1998. — C. 1—53. — URL: https://doi.org/10. 1007%2F978-3-642-58924-9 1.

Список рисунков

1.1 Азотистые основания, составляющие ДНК: а) - аденин, б) - тимин, в)

- гуанин, г) - цитозин..........................................................13

1.2 Расплетение двойной цепи ДНК. Свободные участки цепей способны заново образовать комплементарную пару или же одну из НС ДНК. Для G-квадруплекса и ьмотива указаны только азотистые основания, между которыми образуются хугстиновские водородные связи. Точечными стрелками обозначен углеводно-фосфатный остов............18

1.3 Гидролиз фосфодиэфирных связей.....................21

1.4 Мягкий гидролиз нуклеозидов.......................22

1.5 Восстановление тимина...........................22

1.6 Окисление аденозина............................23

1.7 Окисление тимина под действием осмия тетроксида...........23

1.8 Нуклеофильное присоединение гидразина к цитозину ....................23

1.9 Замещение по N4 в молекуле цитозина..................24

1.10 Дезаминирование под действием бисульфит иона............24

1.11 Дезаминирование дезоксиаденозина в дезоксиинозин под действием азотистой кислоты ............................................................25

1.12 Метилирование гуанина диметилсульфатом ..............................26

1.13 Действие иприта на молекулы гуанина ....................................27

1.14 Реакция взаимодействия цисплатина с гуанином ..........................27

1.15 Образование циклобутанового димера из двух молекул тимина . . . . 31

1.16 Структура пиримидин-(6,4)-пиримидонового фотопродукта, образованного из двух молекул тимина ....................................32

1.17 Анаэробное облучение гуанина, приводящее к образованию 8-оксигуанина ................................................................35

2.1 Структура бромистого этидия (а) и механизм его интеркалирования

между азотистыми основаниями ДНК (б) [97] ..............44

3.1 Различные топологии неканонических структур, которые может образовывать одна из найденных нуклеотидных последовательностей ^-квадруплекс силы 1, ьмотив силы 1,

шпильку силы 5, триплекс силы 2.....................53

3.2 Различные топологии связывания непротонированной пары гуанин-цитозин (а,б) и протонированной пары (в-д). Продольным штрихом обозначены уотсон-криковские водородные связи, поперечным - хугстеновские водородные связи .............54

3.3 Реакции протонирования гуанина, цитозина и комплементарной

пары ионом гидроксония .......................... 55

3.4 Наиболее стабильные комбинации НС ДНК изомерные непротонированным гуанин-цитозиновым парам азотистых

оснований. См. пояснения в тексте. Наиболее важные межатомные

о

растояния (в А) представлены из собственных расчётов (верхние

числа) и работ [109; 110] (даны в скобках).................57

3.5 Наиболее стабильные комбинации НС ДНК изомерные

гуанин-цитозиновым парам азотистых оснований, в которых половина молекул гуанина протонирована по N7 атому. Наиболее

о

важные межатомные растояния (в А) представлены из собственных

расчётов (верхние числа) и работ [46; 109] (даны в скобках).......58

3.6 Изомерные структуры протонированных триплексов с различным расположением протона ........................... 60

3.7 Реакции образования различных изомеров протонированного триплекса CGя С...............................61

3.8 Реакции образования различных изомеров протонированного триплекса GGя С...............................62

4.1 Результаты электрофореза растворов ДНК, инкубировавшихся при температуре +70°С с добавлением CuSO4 • 5Н20: 1 - контрольный раствор ДНК не подвергавшийся инкубированию; 2 - раствор ДНК инкубировавшийся в течении 15 минут; 3 - раствор ДНК инкубировавшийся в течении 30 минут; 4 - раствор ДНК инкубировавшийся 60 минут; 5 - контрольный раствор ДНК с добавлением CuSO4 • 5 Н20 не подвергавшийся инкубированию; 6 -раствор ДНК с добавлением CuSO4 • 5Н20 инкубировавшийся 15 минут; 7 - раствор ДНК с добавлением CuSO4 • 5 Н20 инкубировавшийся 30 минут; 8 - раствор ДНК с добавлением CuSO4 • 5 Н20 инкубировавшийся 60 минут, М - маркер

молекулярных масс Lambda DNA/Hind III Markers............64

4.2 Спектры поглощения дГТФ и дЦТФ....................67

4.3 Спектры поглощения дГТФ и дЦТФ....................68

4.4 Спектры поглощения олигонуклеотидов в воде: а) Одноцепочечные АТ-олигонуклеотиды, б) Двухцепочечные АТ-олигонуклеотиды; в) Одноцепочечные ГЦ-олигонуклеотиды; г) Двухцепочечные ГЦ-олигонуклеотиды............................69

4.5 Спектры поглощения олигонуклеотидов в физ.растворе: а) Одноцепочечные АТ-олигонуклеотиды, б) Двухцепочечные АТ-олигонуклеотиды; в) Одноцепочечные ГЦ-олигонуклеотиды; г) Двухцепочечные ГЦ-олигонуклеотиды..................70

4.6 Схема образования медь-гуанин-цитозинового аквакомплекса в соответствии с которой была расчитана энергия стабилизации комплекса нуклеотидной пары с медью..................72

4.7 Геометрические характеристики аквакомплекса

о

медь-гуанин-цитозин. Длины связей в А: 1 - 1.996, 2- 1.815, 3 - 1.820, 4- 1.997,5 - 1.990,6-2.014,7-2.052 ................... 73

5.1 Сравнение стабилизирующей способности FTA буфера в сравнении с BIO буфером (обозначен Буфер 10). k - контроль; 1w - раствор, инкубировавшийся 1 неделю; 2w- раствор, инкубировавшийся 2 недели; 1m - раствор, инкубировавшийся 1 месяц; 2m- раствор, инкубировавшийся 2 месяца; М - маркер. Инкубирование проводилось при температуре 45°С....................75

5.2 Результаты инкубирования ДНК при 70оС в BIO буфере с противомикробными препаратами: 1. Офлоксацин; 2. Офлоксацин+дифеноконазол; 3. Пефлоксацин; 4. Пефлоксацин+дифеноконазол; 5. Клацид (кларитромицин); 6. Клацид + дифеноконазол; 7. Дифеноконазол; 10. Контрольный раствор BIO-буфера.............................81

6.1 Ультрамикроскопия поверхности ДНК-карт до нанесения образца

крови ..................................... 86

6.2 Ультрамикроскопия поверхности ДНК-карт с пятном крови, через 2

часа после нанесения ............................ 87

6.3 Ультрамикроскопия поверхности ДНК-карт с пятном крови, через

суток после нанесения ............................ 88

7.1 Сравнение результатов расчётов геометрии G-квадруплекса методами ММ в силовых полях Амбер (верхние номера) и DFT/6 — 31 + +G(d) (значения даны в скобках) ............91

Список таблиц

1 Активность антибиотиков в отношении патогенных бактерий.....80

2 Активность фунгицидов в отношении грибов...............80

3 Антимикробная активность буферной смеси, содержащей антибактериальные и фунгицидные препараты ............................83

4 Площадь пятна крови на поверхности в зависимости от взятого

объёма и активности системы свёртывания................85

5 Наиболее важные межатомные расстояния в НС ДНК..........92

6 Полные и относительные энергии основных молекулярных структур, из которых составлялись комбинации, изомерные олигонуклеотиду (ГЦ)4/4 ....................................116

7 Полные и относительные энергии стабилизации комбинаций НС

ДНК изомерных непротонированному олигонуклеотиду (ГЦ)4/4 . . . .117

8 Полные и относительные энергии стабилизации комбинаций НС

ДНК изомерных протонированному олигонуклеотиду (ГЦ)4/4 ..... 118

9 Полные и относительные энергии стабилизации комбинаций НС

ДНК изомерных "полупротонированному"олигонуклеотиду (ГЦ)4/4 . .118

Приложение А

Таблицы значений абсолютных и относительных энергий НС ДНК

Таблица 6 — Полные и относительные энергии основных молекулярных структур, из которых составлялись комбинации, изомерные олигонуклеотиду (ГЦ)4/4

Структура Полная энер- ДЕ (ккал/-

гия Е (а. и.) моль)

Гуанин -542,57667 0

Цитозин (С) -394,94996 0

Пара гуанин-цитозин ^С) (рис. 2.1а) -937,56817 0

Пара гуанин-цитозин связанная хуг- -937,54573 -12

стиновскими связями ^С*) (рис.

2.1б)

Протонированный гуанин ^Н) -542,95029 0

Протонированный цитозин (СН) -395,32265 0

Пара цитозин-протонированный гуа- -937,95848 0

нин (ШН) (рис. 2.1в)

Протонированный триплекс -1332,95958 -32,1

(C(GH)C) (рис. 2.6а)

Протонированный триплекс -1332,95988 -43,3

(Ш(НС)) (рис. 2.9г)

Протонированный триплекс -1480,55629 -13,3

^(Ш)С) (рис. 2.6б)

Протонированный триплекс -1480,56104 -26,7

((GH)GC) (рис. 2.9а)

Треугольный триплекс (trGGC) (рис. -1480,18058 -48,5

2.5г)

Триплекс (CGG) (рис. 2.5б) -1480,17246 -43,4

Триплекс (СGC) (рис. 2.5а) -1332,53627 -37,4

Триплекс (GGC) (рис. 2.5в) -1480,1599 -35,5

G-квадруплекс (Gquad) (рис. 2.4б) -2170,41636 -68,8

i-Мотив (CHC) (рис. 2.4а) -790,34269 -44

i-Мотив с непротонированными ци- -789,92964 -18,6

тозинами (CC) (рис. 2.4в)

Таблица 7 — Полные и относительные энергии стабилизации комбинаций НС ДНК изомерных непротонированному олигонуклеотиду (ГЦ)4/4

Структура Полная энергия E (a. u.) AE (ккал/моль)

4GC (эталон) (fig6 - center) -3750,27268 0

Gquad+CC (fig 6a) -3750,27564 -1,9

Gquad + 4C -3750,2162 35,4

2GGC+CC -3750,24944 14,6

2CGG+CC (fig 6b) -3750,27456 -1,2

GGC+ CGG+ CC -3750,262 6,7

2trGGC + CC (fig 6c) -3750,2908 -11,4

GGC + trGGC + CC -3750,27012 1,6

CGG + trGGC + CC (fig 6d) -3750,28268 -6,3

2CGC+2G -3750,22588 29,4

trGGC +CGC + GC (fig 6e) -3750,28502 -7,7

trGGC +CGC + GC* -3750,26258 6,3

GGC + CGC + GC -3750,26434 5,2

GGC + CGC + GC* -3750,2419 19,3

CGG + CGC + GC (fig 6f) -3750,2769 -2,6

CGG + CGC + GC* -3750,25446 11,4

2GC+2G+2C (шпилька) -3750,1896 52,1

Таблица 8 — Полные и относительные энергии стабилизации комбинаций НС ДНК изомерных протонированному олигонуклеотиду (ГЦ)4/4

Структура Полная энергия Е (а. и.) AE (ккал/моль)

4GCH (эталон) -3751,8339 0

2СНС + 2G+2GH -3751,7393 59,3

2CG(HC)+2GH -3751,8197 8,9

2GG(HC)+2CH -3751,7579 47,7

Gquad + 4CH -3751,707 79,6

Таблица 9 — Полные и относительные энергии стабилизации комбинаций НС ДНК изомерных "полупротонированному"олигонуклеотиду (ГЦ)4/4

Структура Полная энергия E (a. u.) AE (ккал/моль)

2GCH+2GC (эталон, fig 7 - center) -3751,0533 0

2CHC + Gquad (fig 7a) -3751,10174 -30,4

2CG(HC)+2G (fig 7b) -3751,0725 -12

2(GH)GC+CC -3751,05172 1