Изучение сенсорных свойств органических и полимерных пленок на твердой подложке тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.06, кандидат физико-математических наук Киселев, Глеб Александрович

• Киселев, Глеб Александрович
• кандидат физико-математических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Киселев, Глеб Александрович

1. Обзор литературы.

1.1. Меюды зондовой микроскопии.

1.1.1. Атомно-силовая микроскопия.

1.1.2. Силовая спектроскопия.

1.1.3. Методы, использующие датчики на основе кантилеверов АСМ.

1.1.4 Архитектура кантилеверных датчиков и системы контроля за положением кантилеверов.

1.1.5. Производство и методы отчистки кантилеверов.

1.2. Преобразователи биохимических реакций в аналишческий сш на.i.

1.2.1. Амперометрический анализатор.

1.2.2.11отенциометрический анализатор.

1.2.3 Lmkoctiioh иммуносенсор.

1.2.4. Кондуктометрические датчики.

1.2.5. Оптические иммуносенсоры.

1.2.6. Пьезокварцевые иммуносенсоры.

1.3. Исследования химических и био.нн ических процессов на поверхносш каптилевера.

1.3.1. Хемосорбция низкомолекулярных веществ и поверхностные химические реакции

1.3.2. Кантилеверпые сепоры на основе высокомолекулярных и биополимерных систем

Экспериментальная часть.

2. Разработка универсальной измерительной системы для микрокантилеверных сенсоров.

2.1 Введение.

2.2 Материалы и методы.

2.3 Полученные роультаты и обсуждение.

2.3.1 Измерение массы микрообъектов.

2.3.3 Артефакты метода микровзвешивания с помощью каптилевера.

2.3.4. Измерение сил натяжения в полимерной пленке.

2.4 Выводы.

3. Исследование свойств монослоев низкомолекулярных веществ.

3.1. Введение.

3.2. Материалы и методы.

3.3. Результаты и обсуждение.

3.4. Выводы.

Глава 4.

4. Исследование иммунохимических реакций, протекающих на поверхности кантилевера.

4.1. Иммунохимический сенсор на морфин.

4.1.1. Введение.

4.1.2. Материалы и методы.

4.1.3. Результаты и обсуждение.

4.1.4. Выводы.

4.2. Иммунохимический сенсор на пероксидазу хрена.

4.2.1. Введение.

4.2.2. Материалы и методы.

Блокировка кремниевой поверхности кантилевера.

Физическая иммобилизация IgG с испольюванием белка Л.

Химическая иммобилизация IgG с испо шзованием белка Л.

4.2.3. Результаты и обсуждение.

Физическая иммобичиыция IgG с использованием белка Л.

Химическая иммобипизация IgG на поверхности кантилевера.

4.2.4. Выводы.

Глава 5.

5. Исследование агрегации лизоцима на поверхности кантилевера.

5.1 Введение.

5.2. Ма1ериалы и методы.

5.3. Результаты и обсуждение.

5.4. Выводы.

Теоретическая часть.

6. Задача колебаний нагруженной балки.

7. Модель расчета сил парных взаимодействий между молекулами, находящимися на поверхности кантилевера.

8. Качественное описание процесса образования фибрилл в химически иммобилизованном монослое молекул белка.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение сенсорных свойств органических и полимерных пленок на твердой подложке»

Микрокантилеверпые системы являются современными типами высокочувствительных твердофазных преобразователей биохимических реакций, протекающих на их поверхности, в аналитический сигнал. Существенной особенностью кантилевера, не имеющей альтернативных аналогов, является способность прямою измерения натяжения в пленках, помещенных на одну из его сторон. Благодаря этому информация о состоянии исследуемых объектов, получаемая с помощью микромеханических систем, оказывается уникальной и, вообще товоря, отличается от той, которую дают распространенные методы анализа массы, а также оптических, и элеюрических свойств иченок. Уникальность информации состоит в том, что она непосредственно характеризует энершо межмолекулярных взаимодействий внутри пленки, преобразующуюся в статический изгиб каптилевера (энерт ию аиалитическо-[о сигнала).

Появлением кангилеверы обязаны атомно-сичовой микроскопии (АСМ), которая сама по себе является мощным и всеми признаным инструментом исследования свойст поверхностей. В 80-х и 90-х юдах прошлого века развитие методов силовой микроскопии имело тенденцию к более мубокому и мульти-информативному анализу поверхностей, что в конечном итоге привело к качественно новым методам исследования свойств ппенок с использованием кантилеверов, когда обьект исследования определяет параметры микроэлектромеханическою зонда.

Сейчас системы с капгичеверными преобразователями зарекомендовали себя в качестве полноценного экспериментального метода, применяемого в исследованиях межмо окулярных взаимодействий в монослойных п 1енках пизкомолекулярпых веществ, биопо жмер-пых объектов, а также в обчасти химии поверхностных реакций [30,80,89,93-100,102] и молекулярной биологии [86,103,104]. Использование микрокантилеверов может быть также полезным для практических задач анализ био Ю1ических маркеров различных иболсвапий человека [90,91], контроля концентраций тербицидов [89], обнаружения ядовитых [107,108] и взрывчатых веществ [67,70] в окружающей среде.

До появчепия кантилеверов и подобных им систем не существова ю возможности напрямую эксперимента!ьно охарактеризовать силы кооперативных взаимодействий биопо ш-меров вблизи поверхности при всей актуальности такой задачи стоящей в областях сенсорных приложений, биосовмсстимых материалов и медицинских приборов, контактирующих с физиологическими жидкостями, таких как зонды, протезы, контактные линзы и т.д Подобная задача явпяется актуальной также в исследованиях механизмов aipeiauHH белков в клеточных мембранах, приводящих к нарушениям ионного обмена и нейродегенеративным заболеваниям человека. На данный момент момент фундаментапьные причины выработки аналитическою сишала в микромеханических системах в ответ на реакции в бионолимерных рецепторах, ввиду сложности и разнообразия белковых систем, яв 1яются мало изученными. Однако фундаментальные закономерности невозможно установить без совершенствования технологий эксперимент&1ыюго изучения конкретных объектов.

В настоящей диссертации с использованием микрокантилсверной системы и атомно-силовой микроскопии представлены результаты исследовании нескольких видов наибопее важных взаимодействий в биополимерных системах и поверхностных реакций в слоях ионо-селективных сурфактантов. На примере иммунохимической реакции морфина со специфическими антителами (ангиморфин-IgG) изучены основные причины генерации поверхностных сил в рецептороном слое при диссоциации иммунных комппексов закрепленных на поверхности кантилевера под действием гаптена (морфин). Поверхностные реакции афимного типа в биополимерных системах необходимые для создаиия высокоселективпых анализаторов биологических aieiiTOB были исследованы па примере иммунной пары IgG с пероксидазой хрена. Реакция на поверхности кантилевера проводилась по прямой схеме анализа {label-free), при которой производился количественный анализ свойств рецепторопого слоя в зависимости от метода ею иммобилизации на поверхности кантилевера. Задача кооперативно!о взаимодействия биомо 1екул па поверхности оказалась актуальной так же и в исследованиях механизмов агре!ации белков в клеточных мембранах, приводящих к нарушениям ионною обмена и нейроде!енеративным забопеваниям человека.

Изменение массы одиночных живых клеток или грибковых спор в процессе их жизненных циклов явчяется важной задачей в разработке эффективных ингибиторов pocia патогенных бактерий. Без прямых методов исследования фазовых переходов образования и де-фадации микрокристаллов 1азошдратов невозможно определит!, энергии их метастабильно-го состояния. Резонансные кантилеверы применяются также в качестве масс-чувствительпых преобразователей для селективных датчиков массы разпичных частиц ипи веществ. Все вышеперечисленное является далеко не полным перечнем возможных применений микрорезо-напепых систем. В данной работе микровзвешивающие возможности кантипеверов впервые используются ,1ля исследований сорбционпых свойств микрочастиц силика!еля.

Цель и задачи исследовании

Целыо диссертационной работы яв тялось но 1учсние новых экспериментальных данных с использованием зондовой микроскопии и микрокаптипеверных систем о свойствах самоорганизующихся монослойных пленок сераортанических соединений, иммунных ком-п 1ексов и белков, иммобилизованных на твердой подложке, и разработка методики иммобилизации биополимеров на поверхности кантичевера. Методическая часть работы включала в себя также разработку научного прибора на основе атомно-силовото микроскопа, позволяющею прецизионно измерять массу микрообъектов и латеральные напряжения в тонких п 1ен-ках, помещенных на поверхности каптилеверов.

В соответствии с поставленной целью реша гись следующие задачи исследования:

1. Выявить и охарактеризовать основные механизмы, инициирующие аналитический сит на i деформаций микрокантилеверпого преобразователя при комплсксации ионов двухвалентных металлов в рецепторном слое молекул бис-4-(2-пиридилметичснамипофспил)дисульфида на примере самоорганизующихся монослоев сурфаетантов: тиофенола, 4-аминотиофенола и тсксантиола.

2. Разработать методику ковалентной и физической иммобилизации биополимеров па кремниевой и золотой поверхностях кантилевера. Исследовать морфологию рецепторпых слоев прямых биополимерных кантилеверных анализаторов морфина и высокомолекулярного антигена - пероксидазы хрена (ПХ). Изучить механизмы, отвечающие за возникновение поверхностного натяжения в рецепторной пченке при различных методах иммобилизации мо тскул иммуноглобулина G (IgG) в рецепторе.

3. С помощью АСМ исследовать процессы образования фибрилл лизоцима при низких рН из монослойных пленок на модифицированных гидрофильной и гидрофобной поверхностях. Изучить кинетику и измерить абсолютные значения сил изгиба кантилевера на примере мочекул лизоцима, привитых па сто золотой и кремниевой сторонах. Построить схему расчета сил парных взаимодействий соседних белковых звеньев, находящихся на поверхности кантилевера, исходя из данных о величине изтиба кантилевера и о структуре монослойиой пленки.

4. Разработать методику закрепления микрочастиц и реализовать метод измерения их массы с использованием канти тевера атомно-сиповою микроскопа в резонансном режиме. Провести сопоставтепие модельных и экспериментальных результатов определения массы с помощью канти гевера для оценки относительной погрешности измерения массы и разрешающей способности разработанной системы микровзвешивания. Исследовать сорб-ционные свойства одиночных микрочастиц хромаюфафическою сорбента (си жкагеля с модифицированной поверхностью).

Научная новизна диссертации

1. Установлен факт увеличения поверхностного давления в самоорганизующейся пленке мо 1скул бис-4-(2-пиридилметипенаминофенил)дисульфида (лжанда), иммобилизованной на поверхности кантилевера, вследствие возрастания электростатической плотности н пленке в результате комплексации иопов Со2\ Ni2+, Cu2+ с молекулами лиганда. Показана обратимость реакции образования хелатпых комплексов в рецепюре. Обнаружено разпи-чие в значениях поверхностных сил при комплексации ионов Со2', Ni2+, Cu2+ в слое ли-1анда, связываемое с тем, что энергии образования соответствующих хелатпых комптек-сов отличаются друт от друга.

2. Разработаны методики ковалентпой и физической иммоби жзации белков па кремниевых и золотых поверхностях кантилевера. Впервые реализованы высокоселективные микро-кантилеверные анализаторы на основе биополимерной пары - пероксидазы хрена и IgG -с чувствительностью к нескольким напомолям анализируемою вещества в I л буферного раствора. Показано, что коиформациопные изменения молекул IgG при связывании с пе-роксидаюй 1енерируют аналитический сигнал деформаций кантилевера, характери зую-щий уменьшение энтропии макромолекулярных коми гексов.

3. Впервые реализован ко1гтроль селективной реакции определения морфина на поверхности кантилевера. Установлено, что причиной деформаций кантилевера при диссоциации комплексов морфип-IgG на его поверхности является спонтанное снятие напряжения в рецепюрной п юнке, которое сообщалось сииеме при иммобилизации молекул IgG в рецепюре.

4. Обнаружен катализ роста фибрилл лизоцима из химически иммоби жзованпою мопослоя на поверхностях золота и слюды при рН = 3,0. Впервые получены данные по морфологии и размеру фибрилл лизоцима, выросших из мопослоя химически иммобитизованых молекул белка. С помощью микрокапги юверпой системы проведены измерения сил в птен-ках лизоцима на ыдрофобпых и гидрофильных поверхностях кантитевера при «кислом» значении рН = 3,0. Обнаружена корреляция между скоростями процессов роста фибри 11 из монослоев на гидрофильных и гидрофобных полюжках и развитием си i в н 1енке белка на данных поверхностях.

5. Предложена качественная модель, объясняющая возможность образования фибрин из молекул белка, находящихся на поверхности в связанном состоянии.

6. Предложена схема расчета парных взаимодействии соседних белковых звеньев, находящихся на поверхности кантипевера, на основе данных о величине изгиба кантипевера и структуре монослойной пленки. Экспериментально определены силы парных взаимодействий мопекул лизоцима в мопослое па поверхности кантилевера.

7. Разработана методика закрепления микрочастиц на поверхности кантилевера и реализован метод измерения их массы с помощью кантилевера атомно-силового микроскопа в резонансном режиме. Впервые охарактеризованы сорбционные свойства одиночных микрочастиц хроматографическото сорбенга диасорб-60-С16 к парам полярных и неполярных растворителей.

Практическая значимость работы

Результаты диссертации позволяют продвинуться в решении следующих задач:

- исследования кооперативных взаимодеиствий в биопо жмерных пленках;

- разработки новых методов исследования массовых свойств микрообъектов;

- создания новых прямых методов иммунохимическою анализа па базе микроэпек-тромехапических систем;

- создания высокочувствительных сенсоров на ионы металлов в жидкостях, разработка ионоселективных электродов;

- создания методов диагностики и профилактики нейроде1еперативпых заболеваний животных и человека, вызванных прионными патогенными белками.

Стоит отметить, что результаты диссертации могут быть полезны в физике биопо жмеров, биофизике, молекулярной биолотии и медицине.

Апробации работы. Основные результаты диссертационной работы были представ тены на следующих научных конференциях:

- Международный симпозиум «Мо текулярный дизайн и синтез с>прамолекулярных архитектур», Казань, 2004.

- Международная конференция «Scanning Tunneling Microscopy/Spectroscopy and Related Techniques in conjunction with 13th International Colloquium on Scanning Probe Microscopy», Sapporo, Japan, 2005.

- Международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005.

- Международная конференция «Малый полимерный конгресс», Москва, 2005.

- Международная конференция «Биогехнолот ия и медицина», Москва, 2006.

- Международная конференция «International Conference on Nanoscience and Technology 2006», Swisserland, Basel, 2006.

- Всероссийская конференция (с международным участием) «Химия поверхности и нано1ехнология», Санкт-Петербург, 2006.

- «Четвсргая всероссийская каргинская конференция», Москва, Россия, 2007.

Личный вклад автора

Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии выполнены автором. Все образцы приготовлены автором лично (за исключением синтеза химических вещесгв). Разработка многофункциональною измерительного комплекса на основе микроскопа «Фемто-скан» и проведенные на нем измерения выношены автором лично. Ана шз и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 рабог.

Заключение диссертации по теме «Высокомолекулярные соединения», Киселев, Глеб Александрович

5.4. Выводы

Обнаружен эффект катализа роста амилоидных фибрилл из химически иммобилизо-ваных молекул лизоцима на золотой и кремниевой подложках при повышеной кислотности (рН = 3,0) и комнатной температуре. Как известно, агрегация в объеме происходит в тех же условиях при более высокой температуре « 57 °С.

Применен сенсорный метод атомно-силовой микроскопии для анализа сил, возникающих в монослойных пленках белка при его агрегации. Установлена корреляция между процессом развития латеральных напряжений и скоростью роста белковых фибрилл в монослое. Показано, что при ковалентной иммобилизации на поверхности кремния (слюды) скорость агрегации белка в монослое в 4,6 раз (по анализу кинетических данных изгиба кантилевера) и в 5 раз (по подсчету фибрилл на АСМ-изображениях) медленнее, чем на поверхности золота.

Предложена модель расчета сил парных взаимодействий, возникающих между молекулами белка в монослое при их агрегации (см. главу 7). С применением модели рассчитаны силы парных взаимодействий молекул лизоцима на поверхностях золота и кремния на основе экспериментальных данных. Рассчитанные силы по порядку величины совпадают с данными силовой спектроскопии искуственною растягивания мочекул агрегата лизоцима Т4 [189]. Построена качественная модель, описывающая принцип образования белковых фибри ы из монослоя химически иммобилизованных молекул (см. главу 8).

Экспериментально показано, что химическая иммоби шзация лизоцима на поверхности сиоды приводит к деформации (расплющиванию) молекул белка по отношению к их на-тивной конформации.

С целью точного определения взвешиваемой массы по изменению собственной резонансной частоты кантилеверных микровесов рассмотрим математическую модель колебании балки, закрепленной с одного конца, в свободном колебательном состоянии. Введем систему координат, показанную на рис. 6.1.

• А

Колебание стержня описывается краевой задачей д гя дифференциального уравнения в частных производных четвертого порядка Пренебрегая вращательными движениями балки при поперечном изгибе, можно записать уравнение поперечных колебаний стержня в виде

Теоретическая часть Глава 6

6. Задача колебаний нагруженной балки

Рис. 6.1. Система координат для задачи колебаний нагруженной балки

14,198-199]:

El д*г(х,1) .d2z(x,t) te{x,t)

-;--г Л-:--г Сдх дг at F{x,t),

1) здесь Е- модуль Юнга, А-масса на единицу длины, / -момент инерции стержня, в случае прямоугольной балки / - ut3/I2, тде и и / -соответственно ширина и толщина ба ikh, с - коэффициент диссипационных потерь.

В качестве граничных условий для закрепленного конца (х = 0) приняты условия неподвижности и юризонтальности касательной: z\ = 0, дх 0. (2) i о

На незакрепленном конце накладываются следующие условия для изгибающею момента тантенциальных си i внутри стержня [197,200]:

Eldlz дх1

1 5x2dt ' дх'

3) х-1 х-1 тде /t- момент инерции наконечника, М-масса наконечника.

Пашей целью является нахождение собственных частот колебания нагруженною стержня. Поскольку начальные условия не влияют на собственные значения задачи, то их задание здесь не рассматривается. Задачу (1-3) можно решить методом разделения переменных, тшда значения собственных частот запишутся в следующем виде:

4)

V 1т тде А„ - положительные корни трансцендентного уравнения, полученного при нулевых ipa-ничных условиях (3): 1 + cosЛпсИАп =0, определяемые численно.

Собственную частоту основного колебания свободной балки можно записать приближенной формулой о -3,52Ж. (5)

1т

При вычислении собственных значений нагруженной балки объем выкладок и численных расчетов значительно возрастает и коэффициент А„ в формуле (4) будет изменяться в соответствии с изменением граничных условий (3). Величина /, при численном расчете собственных частот, приведенных на рис. 2.4, принималась ввиду ее малости равной пулю.

Представленное описание колебания стержней можно упростить, используя приближение 1армоничсскою осциллятора, получаемое из элементарных соображений закона сохранения энергии </(£КНн + El0l)/dt = 0, где an k

F<mm= \Fdz = -{z{L,t)f, (7) о ^ который при подстановке в нею выражений (6), (7) записывается в виде уравнения 0,24mz(L,t) + kz(L,t) = 0 для нахождения собственной частоты \\} колебаний стержня

KI \Е

1— «1,03—J— 0,24/и /2Vp J^T-*3>5Утг~: * Ц'Ы-' (8)

I дс р- плотность материала стержня,к - жесткость прямоугольной балки,

AV3w "4/

Тогда изменение массы па конце балки представляется с тедующим образом [9,201]: = iT7f- (9)

М.=п'

10')2 (Уа)2

10)

Следует отметить, что для расчета присоединенной массы намиою удобнее пользоваться формулой (10), чем численно решать задачу (1 - 3). Погрешность численного расчета при использовании формулы (10) составчяет 1,4 %, что в несколько раз меньше погрешности, возникающей в случае закрепления частиц на конце кантилевера с некоторой дисперсией. Ее ш погрешность метода меньше, чем 1,4%, то испочьзованис формулы (10) можег быть оправданным.

Глава 7

7. Модель расчета сил парных взаимодействий между молекулами, находящимися на поверхности кантилевера

Для оценки сил межмолекулярных взаимодействий в белках или иммунных комплексах, находящихся в связанном состоянии на поверхности была принята модель упаковки взаимодействующих субъединиц в монослойной пленке на поверхности. Для определения средней силы парных взаимодействий мы предполагаем, что молекулы, находясь на поверхности в глобулярном состоянии в виде шаров, образуют плотнейшую гексагональную упаковку (рис. 7.1.) (более плотная упаковка классических объектов невозможна).

Рис. 7.1. Модель плотней-шей гексагональной упаковки монослоя белка на поверхности кантилевера. Стрелками указаны направления действия сил межмолекулярных взаимодействий и результирующей силы, дающей вклад в поверхностное натяжение белковой пленки.

Направление сил межмолекулярных взаимодействий Направление результирующей силы

Результирующая сила Fpe3 взаимодействия, приходящаяся на одну молекулу белки, представляющая собой суммарный вклад со стороны двух соседних молекул в эффективное поверхностное натяжение (рис 7.1), рассчитывается по формуле

Fpc3 = ad, (1) где d - характерный линейный размер (диаметр) молекулы, а - поверхностное натяжение монослойной пленки. При расчете силы взаимодействия двух молекул F2 учитывалось, что при образовании плотнейшего монослоя, состоящего из белковых глобул, каждая молекула взаимодействует с шестью соседними. Из принятой модели плотнейшей гексагональной упаковки следует, что результирующая сила Fpci может быть разложена по базису сил парных взаимодействий молекул (рис. 7.1), тогда F

F =£2(2)

2 2 cos(?r / б)

Применимость данной модели необходимо оценивать (если есть возможность) по результатам атомно-силовой микроскопии поверхности монослойной пленки белка. Модель гексагональной упаковки может дать завышенные значения силы парных взаимодействий, поэтому если имеются достоверные данные о структуре монослоя целесообразно произвести соответствующие изменения в расчетах силы. Например, для модели кубической упаковки (рис. 7.2.) сила парных взаимодействий Fi оказывается на 28 % меньше, чем в случае гексагональной.

Рис. 7.2. Модель кубической упаковки монослоя белка на поверхности кантилевера. Стрелками указаны направления действия сил межмолекулярных взаимодействий и результирующей силы, дающей вклад в поверхностное натяжение белковой пленки.

Направление сил межмолекулярных взаимодействий оовф Направление результирующей силы

Глава 8

8. Качественное описание процесса образования фибрилл в химически иммобилизованном монослое молекул белка

Распространенной точкой зрения яв 1яется то, что центры роста фибрилл формируются из нестабильных белковых агреталов. Компьютерные эксперименты, в которых моделировалось поведение молекул амилоид-Р-нептида в растворе, показали, чю рост фибрилл начинается из неупорядоченных и нестабильных аггрегатов молекул пептида [170], имеющих повышенную плотность молекул белка по отношению к раствору. Вероятно, плотное окружение молекул пептида в агрегате электростатически влияет на нативное состояние конкретной гробулы, блокируя естественные механизмы, сохраняющие ее нашвную копформацию [175], и переводя июбулу в энергетически более выгодную прионную упаковку. В пользу этого предпо юления свидетельствует факт, что димеры молекул пептида являются нестабильными во времени и не могут служить центрами фибриллообраювания [170].

На основе данных атомно-силовой микроскопии (рис. 8.1) [203] можно также заключить, что увеличение скорости роста фибрилл из раствора вблизи поверхности происходит за счет увеличения поверхностной плотности белка в результате ею физической сорбции. Кроме тою, известны факты поверхностной денатурации белка, обусловленные электростатическими (шдрофобпыми) силами [80], в результате действия которых белок может перейти в стабильное состояние с неправи 1ыюй укладкой.

В настоящей работе достишут рекорд скорости поверхностною катализа роста фиб-рил I из химически иммоби шзованного монослоя па примере молекул лизоцима (см. главу 5). А

Механизм 2 i i„ о

Aggregation

ГИнк-яЦях! PrukifibriU mhuait ойртак aggregate №«

D -* М В

Механизм 1 б

VUMg/Лыт and гстт&яюаа of рпэ<иГй*й* I» forni fibrils

Cro»>wvef Пфсй twimcd frtwib

Amorphous Rcsnmgcmoil of Protofibril* radiating aggregate жхрЬом from caeraJ care

Fibrih formed from ажшрЬпш aggregates and twmcd protofibril*

Рис. 8.1 Механизмы роста фибрилл: а) линейная сборка олигомеров в двух направлениях, б) линейный рост фибрилл из предварительно образовавшегося аморфного центра [203].

Для описания принципа фибриллизации белковых молекул, находящихся в связанном состоянии на поверхности, предлагается качественная модель (рис. 8.2а), основанная на существующей модели типа «застежки» [193], которая, судя по экспериментальным данным [192], хорошо описывает фибриллы лизоцима. В предложенной модели принимается, что составляющими частями фибрилл являются отдельные части молекулы - преимущественно (3-листы, в то время как остальные части молекул находятся на перифериии жесткого стержня фибриллы.

Присутствие на поверхности фибрилл, образующихся из белкового монослоя, свидетельствует о подвижности иммобилизованных молекул лизоцима, так как плотность упаковки молекул белка в фибриллярном состоянии больше, чем в неагрегированном. Очевидно, что материалом фибриллы являются соседние к ней молекулы белка, находящиеся в связанном состоянии в монослое. фибрилла поверхность центр роста фибриллы лизоцим б) поверхность

Рис. 8.2. Качественная модель образования фибрилл в монослое гексогонально упакованных белковых молекул: а) трехмерная модель, б) двумерная модель сечения фибриллы.

Если считать молекулы сферами, прикрепленными к поверхности одним линкером (рис. 8.26), то, опираясь на данные атомно-силовой микроскопии поверхности монослоя лизоцима на золоте, содержащего фибриллы (рис. 5.36), можно предположить, что в процессе агрегации происходит изменение конформации молекулы белка таким образом, что определенная ее часть переходит непосредственно в фибриллу, а другая - в частично денатурированном состоянии - остается вне ее жесткого стержня [192].

Заключение Выводы

1. Впервые произведен прямой контроль сич, действующих в монослойных пленках [руппы серосодержащих соединений, во время их самоорганизации на золотой поверхности микрокантичевера. В низкомочекулярпых пленках выявюиы механизмы 1снсрации латеральных сил, обусловленных тидрофобным и э шктростатическим взаимодействием между мономерами пленки. Показана связь сил, действующих в п 1енке, со структурой ее мономерного звена.

2. Впервые создан микрокантичеверный анализатор с рецептором из молекул бис-4-(2-пиридилметичспаминофенил)дисульфида, селективный к ионам тяжелых двухвалентных металлов: Со2+, Си2\ Ni2+, образующих с этими молекулами хелатпый комплекс. Показано, что механический изгиб кантилевера главным образом зависит от двух конкурирующих факторов: конформационных трансформаций молекул в слое и изменения их зарядовой плотности. Определен nopoi чувствительности сенсора-107 М.

3. Разработаны методики ковалс1ггиой и физической иммобилизации белков на кремниевой и золотой поверхностях кантилевера. Впервые реализованы высокоселекшв-ные микрокаптилеверные анализаторы на основе пары комплиментарных биопожме-ров - псроксидазы хрена и иммуноглобулина G (IgG) - с чувствительностью к нескольким иапомолям пероксидазы в литре буферного раствора. Показано, что кон-формациоппые изменения молекул IgG при связывании с пероксидазой уменьшают энтропию системы и вызывают регистрируемый сигнал деформаций кантилевера.

4. Впервые проведена реакция диссоциации макромолекулярпого комшекса анштело-конъкмат (морфин-овальбумии) под действием морфина па поверхности каитичевера, показавшая, что скорость анализа морфина, по конкурентной схеме, может быть выше, чем скорость прямого анализа, проводимого с помощью кантилеверных сенсоров, за счет резкого снятия напряжений в рецепторе (при десорбции мочекул антигел), возникающих при дштсльпом процессе реорганизаций мочекул рецепторпого слоя.

5. Впервые произведен контроль агрегации молекул лизоцима, физически и ковлеигпо иммобилизироваппых на поверхности канти 1евсра и образующих плотноупаковап-иый моносюй, с помощью регистрации средних сичовых напряжений в пленке. 06наружено что афсмация молекул в связанном состоянии на поверхностях зоюта, кремния и слюды происходит в условиях, при коюрых в растворе они не агрегируют.

6. Построена универсальная модель изгиба кантигевсра при взаимодействии субъединиц пленки, имеющих плотнейшую упаковку, коюрая позволяет производить расчет средней силы их парных взаимодействий. Предложена качественная модель, объясняющая возможность образования фибрилл из молекул белка, находящихся в связанном состоянии на поверхности.

Благодарности

В заключение хочу выразить мубокую благодарность научному руководителю Ямин-скому И. В. Выражаю блаюдарность также Д.В. Ковалевскому и A.II. Прохоров) за ряд ценных разъяснений по части электроники и механики микроскопа ФемтоСкан, А.С. Филонов) за помощь в освоении нротраммного обеспечения к микроскопу, а также Г.К. Жавнерко (Институт физики им. Б. И. Степанова АН Белорусии, Минск), группу Г.В.Лисичкина (кафедра химии нефти и органического катализа химическою ф-та МГУ им. М. В. Ломоносова), группу Е.К. Белоглазкиной (кафедра органической химии, лаборатория Биолотически активных органических соединений Химического ф-та МГУ им М. В. Ломоносова), группу М.А.Мягковой, (Института физиологически активных веществ Москва), ipynny «Биосенсоров» А.А. Карякина (кафедры химической энзимокнии Химическою ф-та МГУ) за предоставление образцов для исследований и необходимые консультации в области физхимии молекулярных слоев, и биосепсорпых устройств. Хочу также выразить признательность сотрудникам кафедры и объединенной группе зондовой микроскопии за предоставление базовых знаний в области физики полимеров и аналитической наноскопии.

Отдельно хочу поблагодарить: Г.Б. Мешкова, А А. Кудринского, П.В. Горе 1кина, а также всех студентов и аспирантов за дружеское участие и поддержку.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Киселев, Глеб Александрович, 2007 год

1. G. Binnig, H. Rohrcr, С. Gcrber. Scanning tunneling microscopy II Phys Rev Lett,- 1982, - Vol.49,-pp.57-61.

2. G. Binnig, С F Quale, C. Gerber, E. Weibel. Atomic force microscope // Phvs Rev lett, -1986,-Vol 56, pp.930-933.

3. H.K. Wickramasinghe. Progress in scanning probe microscopy // Acta Mater, — 2000, — Vol.48,-No. l,-pp.347-358.

4. J. K. Gimzewski, C. Gerber, E. Meyer, R. R. Schlittler. Observation of a chemical reaction using a micromechanical sensor // Chem Phys Lett, 1994, - Vol.217, - No.5-6, -pp.589-594.

5. G. G. Stoncy. The tension of metallic films deposited by electrolysis // Proc R Sue, -1909, Vol.82, - No.553, - pp.172-175.

6. N.V. Lavrik, M.J. Sepaniak, P.G. Datskos. Cantilever transducers as a platform for chemical and biological sensors // Rev ofSci Ins, 2004, - Vol.75, - No.7, - pp.2229-2253

7. P.B. Каттралл. Химические сенсоры //Научный мир, Мошш, 2000, - 144 стр.

8. I.V. Yaminsky, G.A. Kiselev. Scanning Probe Microscopy of Biomacromolecules: Instrumentation and Experiments, in "Frontiers of Multifunctional Integrated Nanosystems" // Ed by E Buzaneva, P. Schraff Kluwer Academic Publishers, 2003, - pp 221-228.

9. Т. Ono. X. Li, H. Miyashita, M. Esashi. Mass sensing of adsorbed molecules in sub-picogram sample with ultrathin silicon resonator // Rev Sci lnstrum, 2003, - Vol.74, -No.3, 1240-1243.

10. S. Timoshenko. Analysis of bi-metal thermostats II J Opt Soc Am, 1925, - Vol.11, -pp.233-255.

11. T. Naik, E.K. Longmire, S.C. Mantell. Dynamic response of a cantilever in liquid a solid wall // Sensors and Actuators A Physics, 2003, - Vol.102, - No 3, - pp.240-254.

12. G.A. Kiselev, I.V. Yaminsky, G.F. Tereshenko. Chemical sensor on the basis of atomic force microscope // Third International Symposium "Molecular Design and Synthesis ofSu-pramolecular Architectures", Казань, Россия, 2004, - стр. 102.

13. Г.А. Киселев, Д.В. Багров, II.В. Горелкин, И.В. Яминский. Сенсор на основе аюмно-силово! о микроскопа // Сенсор, 2005, - No.4, - сс.22-26

14. N.V. Lavrik, P.G. Datskos. Femtogram mass detection using photothermally actuated nanomcchdnical resonators // Appl Phys I ett, 2003, - Vol. 16, - No.82, - pp.2697-2699.

15. S. Cherian, Т. Thundat. Determination of adsorption-induced variation in the spring constant of a microcantilever // Appl Phys L«f//. 2002, - Vol.80, - No.12, - pp.2219-2221.

16. A.L. Dring, B.E. Jones. Integrated on-line multisensing of fluid flow using a mechanical resonator I I Sensors and Actuators, 2000, - Vol 85, - No.l, - pp.275-279.

17. B.H. Kim, F.E. Prins, D.P. Kern, S.Raible, U. Weimar. Multicomponent analysis and prediction with a cantilever array based gas sensor // Sensors and Actuators В Chemical, -2000 Vol.78, - No.l, - pp.12-18.

18. M.L Roukes. Nanoelcctromechanical System // Technical Digest of the 2000 Solid-State Sensor and Actuator Workshop, Hilton Head Isl, SC, 2000, - Vol.6, - pp.1-10.

19. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзаптиев Б.В., Гаври.юва F.M. Теория и практика имму-ноферментиого анализа // Высшая шкоча, Москва, 1991, - 288 с.

20. S. Sundararajan, В. Bhushan. Topography-induced contributions to friction forces measured using an atomic force friction force microscope IIJ Appl Phys, 2000, - Vol.88, - No.8, -pp.4825-4831.

21. L.B. Sharos, A. Ramana, S. Crittenden, R. Reifcnberger. Enhanced mass sensing using torsional and lateral resonances in microcantilevers //./ Appl Phys Lett, 2004, - Vol 84, -No.23, - pp.4638-4640.

22. D. Dragoman, M. Dragoman. Terahertz field characterization using Fabry-Perot-like canti-levers//J Appl. Phys lett,-2001, Vol.79, - No.5, - pp.581-583.

23. D. R. Baselt, G.U. Lee, K.M. Hansen, LA. Chrisey, R.J. Colton. A High-Sensitivity Mi-cromachined Biosensor// Proceedings of the leee, 1997, - Vol.85, - No.4, - pp.672-680.

24. M.S. Kulomaa, H.A. Elo, P.J. Tuohimaa. A Radioimmunoassay for Chicken Avidin comparison with a biotin-binding method // Biochem J, 1978, - Vol.175, - No.2, -pp 685690.

25. T. A. Betts, C.A. Tipple, M.J. Scpaniak, P.G. Datskos. Selectivity of chemical sensors based on micro-cantilevers coated with thin polymer films // Anal Chim Act, 2000, - Vol.422, -No.l,-pp 89-99.

26. M. Toda, A.N. Itakura, K. Beuscher, K. Graf, R. Bcrger. Surface stress of polyelectrolyte adsorption measured by micromechanical cantilever sensors // e-J. Surf Sci Nanotech, -2006, Vol.4, - pp.96-99.

27. J.Z. Hilt, A.K. Gupta, R. Bashir, N.A. Peppas. Ultrasensitive biomems sensors based on patterned with environmentally responsive hydrogcls // Biomedical Microdevices, 2003, -Vol.5,-No.3,-pp.177-184.

28. R. Berger, E. Delamarche 1, H. P. Lang, C. Gerber, J.K. Gim/ewski, E. Meyer, H.-J. Guntherodt. Surface stress in the self-assembly of alkanethiols on gold probed by a force microscopy technique //./ Appl Phys A, 1998, - Vol.66, - No.55.

29. M. Godin, 0. Laroche, V. Tabard-Cossa, L.Y. Bcaulieu, P. Grutter. Combined in situ mi-cromechanical cantilever-based sensing and ellipsometry // Rew of Sci Inst., -2003, -Vol.74, No 11, - pp 4902-4907.

30. J. H. Fendler. Chemical Self-assembly for Electronic Applications // Chem Mater, 2001, - Vol.13, - No. 10, - pp.3196-3210

31. D.W. Carr, S. Evoy, L. Sekaric, H.G. Craighead, J.M. Parpia. Measurement of mechanical resonance and losses in nanometer scale silicon wires // J Appl Phys lett, 1999, -Vol.75, - No.7, - pp.920-922.

32. R. L. Johnson. Characterization of piezoelectric ZnO thin films and the fabrication of piezoelectric micro-cantilevcrs // PhD Iowa State University Ames, 2005.

33. D.L. Devoe, A.P. Pisano. Modeling and Optimal Design of Piezoelectric Cantilever Micro-actuators IIJ of Microelectrochemical System, 1997, - Vol.6, - No 3, - pp.266-270.

34. B. Piekarski, D.L. Devoe, M. Dubcy, R. Kaul, J. Conrad. Surface micromachined piezoelectric resonant beamfiltcrs // Sensors and Actuators A Physics, -2001, Vol.91, - No.3, -pp 313-320.

35. F. J Giessibl. High-speed force sensor for force microscopy and profilometry utilizing a quartz tuning fork II Appl. Phys lett,- 1998, Vol.73, - No.26, - pp 3956-3958.

36. T.L. Porter, M.P. Eastman, D.L. Pace, M. Bradley. Sensor based on piezorcsistive microcan-tilcvcr technology // Sensors and Actuators A Physical, 2001, - Vol.88, - No.l, - pp.4751.

37. J. 1 haysen, A. Boisen, O. Hansen, S. Bouwstra. Atomic force microscopy probe with pic-/oresistive read-out and a highly symmetrical Wheatstone bridge arrangement // Sensors and Actuators A Physical, 2000, - Vol.83, - No.l, - pp 47-53.

38. R. Berger, J.-H. Fabian. Thermal Analysis of Nanogram Quantities Using a Micromechani-cal Cantilever Sensor // Manuscript for 30th Conference on 1 hernial Analysis and Applications, Pittsburgh, USA, 2002, - pp.68-73.

39. J.G. Simmons. Generalized formula for the electronic tunnel effect between similar electrodes separated by a thin insulating film // J Appl Phys, 1963, - Vol.34, - No.6, -pp. 1793-1803.

40. P.G. Datskos, T. Thundat. Nanocantilever Signal Transduction by Electron Transfer //./ of Nanoscience and A'anolechnology, 2002, - Vol.2, - pp.369-372.

41. C.A. Savran, T.P. Burg, J. Fritz, S.R. Manalis. Microfabricated nicchanical biosensor with inherently differential readout // Appl Phys Lett, 2003 - Vol.83, - No.8, - pp.1659-1661.

42. A. Majumdar, J. Lai, M. Chandrachood, O. Nakabeppu, Y. Wu, Z. Shi. Thermal imaging by atomic force microscopy using thermocouple cantilever probes // Rev Set lnstrum , 1995, - Vol.66, - No.6, - pp.3584-3592.

43. R. Bergcr, C. Gerber, H.-P. Lang, J.K. Gimzewski. Microniechanics: A Toolbox for Femto-scalc Science: «Towards a Laboratory on a Tip» // Microelectronic Engineering, 1997, -Vol.35,-No.l,-pp.373-379.

44. V. Tabard-Cossa, M. Godin, L.Y. Beaulieul, P. Gruttcr. A differential microcantilever-based system for measuring surface stress changes induccd by electrochemical reactions // Sensors and Actuators B, 2005, - Vol.107, - No.l, - pp.233-241.

45. M. Su, V.P. Dravid. Surface Combustion Microengines Based on Photocatalytic Oxidations of Hydrocarbons at Room Temperature // Nano letters, -2005, Vol.5, -No.10, -pp.2023-2028.

46. P. Dutta, L.R. Sencsac, N.V. Lavrik, P.G. Datskos, M.J. Scpaniak. Signatures for Nanostruc-turcd, Optically-Probed, Functionalizcd Microcantilever Sensing Arrays // Sensor lett, -2004, Vol.2, - No.3-4, - pp.238-245.

47. I. Yaminsky, P. Gorclkin, G. Kiselev. Concurrence of Intcrmolecular Foces in Monolayers // Japanese Journal of Applied Physics, 2006, - Vol.45, - No.3B, - pp.2316-2318.

48. M. Yuc, J.C. Stachowiak, A. Majumdar. Cantilever Arrays for Multiplexed Mechanical Analysis of Biomolecular Reactions // Mechanics and Chemistry of Biosystems, 2004, -Vol.1,-No.3,-pp.211-220.

49. M. Godin, P.J. Williams, V. Tabard-Cossa, O. Laroche, L.Y. Bcaulieu, R.B. Lennox, P. Grutter. Surface Stress, Kinetics, and Structure of Alkanethiol Self-Assembled Monolayers // / angmuir, 2004, - Vol. 20, - No. 17, - pp.7090-7096.

50. A.G. Hansen. In Situ Scanning Tunneling Microscopy and Microcantilcver Investigations of yeast cytochrome с on gold. // Ph D Department of Chemistry Technical University, Denmark, 2002.

51. N.V. Lavrik, C.A. Tipple, M.J. Scpaniak, P.G. Datskos. Gold nano-structured for transduction of biomolecular interactions into micrometer scale movements // Biomedical Mocrode-vices, 2001, - Vol.3, - No.l, - pp.35-44.

52. В. C. Fagan, C.A. Tipple, Z. Xue, M.J. Sepaniak, P.G. Datskos. Modification of micro-cantilever sensors with sol-gels to enhance performance and immobilize chemically selective phases HPalanta, 2000, - Vol.3, - No.3, - pp.599-608.

53. H.P. Lang, M. Hcgner, C. Gerber. Cantilever array sensors // Material today, 2005, -Vol.8, - pp.30-36.

54. F. Quist, V. Tabard-Cossa, A. Badia. Nanomechanical Cantilever Motion Generated by a Surface-Confined Redox Reaction // J Phys Chem B, -2003 Vol.107, -No.39, -pp. 10691-10695.

55. H.M. Schcsslcr, D.S. Karpovich, G.J. Blanchard. Quantitating the Balance between Enthal-pic and Entropic Forces in Alkanethiol/Gold Monolayer Self Assembly // Am Chem Soc, -1996, Vol.118, - No.40, - pp.9645-9651.

56. A. Bietsch, J. Zhang, M. Hegner, H.-P. Lang, C. Gerber. Rapid functionalization of cantilever array sensors by inkjet printing Nanotechnology // Nanotechnology, -2004, Vol.15, -No 8, - pp.873-880.

57. P.G. Datskos, N.V. Lavrik, M.J. Sepaniak. Detection of Explosive Compounds with the Use of Microcantilcvers with Nanoporous Coatings // Sensor Lett, -2003, Vol.1, - No.l, -pp.25-32.

58. С Hagleitner, A. Hicrlcmann, I). Lange, A. Kummer, N. Kerncss, O. Brand, H. Baltes. Smart singlc-chip gas sensor microsystem // Nature, -2001, Vol.414, -No.6861, -pp.293-296.

59. L A. Pinnaduwage, V. Boiadjiev, J. E. Hawk, T. Thundat. Sensitive detection of plastic explosives with self-assembled monolaycr-coated microcantilcvers // Appl Phys lett, 2003, - Vol.83, - No.7, - pp.1471-1473.

60. K.A. Pctcrlinz, R. Georgiadis. In Situ Kinetics of Self-Assembly by Surface Plasmon Resonance Spectroscopy Langmuir// Langmuir, 1996, - Vol.12, - No.20, - pp.4731-4740.

61. M. Helm, J. J. Servant, F. Saurcnbach, R. Bergcr. Read-out of micromechanical cantilever sensors by phase shifting interferometry // Appl Phys Lett, 2005, - Vol.87, - No.6, -pp.64101-64103.

62. G. Yang, G. Liu. New Insights for Self-Assembled Monolayers of Organothiols on Au(lll) Revealed by Scanning Tunneling Microscopy //./ Phys Chem B, -2003, Vol.107, -No.34, - pp 8746-8759.

63. J. Brugger, M. Despont, C. Rossel, H. Rothuizen, P. Vettiger, M. Willemin. Microfabricated ultrasensitive piezoresistive cantilevers for torque magnetometry // Sensors and Actuators,1999, Vol.73, - No.3, - pp.235-242.

64. P.G. Datskos, I. Saucrs. Detection of 2-mercaptoethanol using gold-coated micromachined cantilevers // Sensors and Actuators B, 1999, - Vol.61, - No.l, - pp.75-82.

65. R. Raiteri, H.-J. Butt, M. Changes in surface stress at the liquid-solid interface measured with a microcantilever // Grattarola Electrochimica Acta, 2000, - Vol.46, - No.3-4, - pp. 157-163.

66. H.-F. Ji, K.M. Hansen, Z. Ни, T. Thundat. Detection of pH variation using modified micro-cantilcvcr sensors // Sensors and Actuators B, 2001, - Vol.72, - No.3, - pp.233-238.

67. H.-F. Ji, E. Finot, R. Dabestani, T. Thundat, G. M. Brown, P. F. Britt. Л novel self-assembled monolayer (SAM) coated microcantilever for low level caesium detection // Chem Commun., 2000, - pp.457-458.

68. H.-F. Ji, T. Thundat, R. Dabestani, G.M. Brown, P.F. Britt, P.V. Bonnesen. Ultrasensitive Detection of СЮ42- Using Microcantilever Sensor // Anal Chem, -2001, Vol.73, -No.7, - pp.1572-1576.

69. A.M. Moulin, S.J. O'Shea, R.A. Badley, P. Doyle, M.E. Welland. Measuring Surface-Induced Conformational Changes in Proteins // Iangmuir, 1999, - Vol.15, -pp.87768779.

70. A.A. Карякин, E.A. Уласова, М.Ю. Baimi, E.E. Карякина. Биосенсоры: устройство, классификация и функциональные характеристики // Сенсор, -2002, -No.l, -сс.16-24.

71. H.-F. Ji, X Yan, M.J. McShane. Experimental and theoretical aspects of glucose measurement using a microcantilever modified by enzyme-containing polyacrylamide // Diabetes Technol I her., 2005, - Vol.7, - No.6, - pp.986-995.

72. X. Yan, X.K. Xu, H.-F. Ji. Glucose oxidase multilayer modified microcantilevers for glucose measurement I I Anal. Chem, 2005, - Vol.77, - No.19, - pp 6197-6204.

73. J. I'ei, F. Tian, T. Thundat. Glucose biosensor based on the microcantilever // Anal Chem, -2004, Vol.76, - No.2, - pp.292-297.

74. A. Subramanian, P.I. Oden, S.J. Kennel, K.B. Jacobson, R.J. Warmack, T. Thundat, M.J. Doktyc/. Glucose biosensing using an enzyme-coated microcantilever // Appl Phys Lett, -2002, Vol.81, - No.2,, - pp.385-387.

75. N. Nugaeva, K.Y. Gfeller, N. Backmann, H.P. Lang, M. Duggelin, M. Hegner. Microme-chanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection // Biosensors and Bioelectronics, 2005, - Vol.21, - pp. 849-856.

76. J. Tamayo, A.D.L. Humphris, A.M. Malloy, M.J. Miles. Chemical sensors and biosensors in liquid environment based on microcantilevers with amplifed quality factor // Ultramicro-scopy, 2001, - Vol.86, - No. 1-2, - pp.167-173.

77. W. Guanghua, H. R. Datar, K.M. Hansen, T. Thundat, R.J. Cote, A. Majumdar. Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers // Nature Biotechnology, -2001, -Vol 19,-pp 856-860.

78. R. Raiteri, M. Grattarola, H.-J. Butt, P. Skladal. Micromcchanical cantilever-based biosensors // Sensors and Actuators B, 2001, - Vol.79, - No.2, - pp.115-126.

79. C. Grogan, R. Raiteri, G.M. O'Connor, Г J. Glynn, V. Cunningham, M. Kane, M. Charlton, D. Leech. Characterisation of an antibody coated microcantilever as a potential immuno-based biosensor // Biosensors & Bioelectronics, 2002, - Vol.17, - pp.201-207.

80. Y. Arntz, J.D. Seelig, H.P. Lang, J. Zhang, P. Hunzikcr, J P. Ramseyer, E. Meyer, M. Hegner, Ch. Gerber. Label-free protein assay based on a nanomcchanical cantilever array // Nanotechnology, 2003, - Vol.14, - pp.86-90.

81. P. Dutta, С.Л. Tipple, N.V. Uvrik, P.G. Datskos, H. Hofstetter, 0. Hofstetter, M.J. Sepaniak. Enantioselective Sensors Based on Antibody-Mediated Nanomechanics // Analytical Chemistry, 2003, - Vol.75, - No. 10, - pp.2342-2348.

82. M. Su, S Li, V.P. Dravid. Microcantilever resonance-based DNA detection with nanoparti-cle probes HAppl Phy s lett, 2003, - Vol.82, - No.20, - pp.3562-3564.

83. J. Fritz, M.K. Bailer, H.P. Lang, H. Rothuizen, P. Vettiger, Meyer, H.-J. Guntherodt, Ch. Gerber, J.K. Gimzewski. Translating Biomolecular Recognition into Nanomechanics // Science, 2000, - Vol. 288, - pp. 316-318.

84. R. Marie, H. Jcnscnius, J. Thaysen, C. B.Christcnscn, A. Boisen. «Adsorption kinetics and mechanical properties of thiol-modi .ed DNA-oligos on gold investigated by microcantilever sensors //Ultramicroscopy, 2002, - Vol.91, - pp.29-36.

85. M. Yang, H.C.M. Yau, H.L Chan. Adsorption kinetics and ligand-binding poperties of thiol-modifed double stranded DNA on a gold surface // Langmuir, -1998, Vol.14, -pp.6121-6129.

86. G. Wu, H. Ji, K. Hansen, T. Thundat, R. Datar, R. Cote. M.F. Hagan, A.K. Chakraborty, A. Majumdar. Origin of nanomechanical cantilever motion generated from biomolecular interactions // PNAS, 2001, - Vol.98, - No.4, - pp.1560-1564.

87. M. F. Hagan, A. Majumdar, A.K. Chakraborty. Nanomechanical Forces Generated by Surface Grafted DNA IIJ Phys Chem B, 2002, - Vol.106, - pp. 10163-10173.

88. F. Liu, Y. Zhang, Z.-C. Ou-Yang. Flexoelcctric origin of nanomcchanic deflection in DNA-microcantilever system, Biosensors and Bioelectronics, 2003, - Vol.18, - pp.655-660.

89. K.M. Hansen, H.-F. Ji, G. Wu, R. Datar, R. Cote, A. Majumdar, T. Thundat., Cantilever-based optical deflection assay for discrimination of DNA single-nuclcotide mismatches // Anal. Chem 2001, - Vol. 73, - No. 7, - pp.1567-1571.

90. V. T. Moy, E.L. Florin, H.G. Gaub. Intermolecular forces and energies between ligands and receptors // Science, 1994, - Vol. 266, - pp.257-259.

91. K.Y. Gfeller, N. Nugacva, M. Hegner. Rapid Biosensor for Detection of Antibiotic-Selective Growth of Escherichia toll // Applied and Environmental microbiology, 2005, -Vol .71,- No.5, - pp.2626-2631.

92. K.Y. Gfeller, N. Nugaeva, M. Hegner. Micromcchanical oscillators as rapid biosensor for the detection of active growth of Escherichia coll // Biosensors and Bioelectronics, 2005, - Vol.21,-pp.528-533.

93. C.A. Savran, S.M. Knudsen, A.D. Ellington, S.R Manalis. Micromcchanical detection of proteins using aptamer-based receptor molecules // Anal Chem, 2004, - Vol.76, - No.l 1, -pp.3194-3198.

94. H.-F. Ji, T. Thundat. In situ detection of calcium ions with chemically modified microcanti-levers // Biosensors & Bioelectronics, 2002, - Vol.17, - pp.337-343.

95. X. Xu, Т. Thundal, G.M. Brown, H.-F. Ji. Detection of Hg2+ using microcantilcver sensors // Anal Chem , 2002, - Vol.74, - No.15, - pp.3611-3615.

96. H.-F. Ji, Y. Zhang, V.V. Purushotham, S. Kondu, B. Ramachandran, T. Thundat, D.T. Haynie. 1,6-Hcxanedithiol monolayer as a receptor for specific recognition of alkylmercury I I Analyst, 2005, - Vol. 130, - pp. 1577-1579.

97. K. Liu, H.-F. Ji. Detection of Pb2+ using a hydrogcl swelling microcantilcver sensor II Anal Sci., 2004, - Vol. 20,- No.l, - pp.9-11.

98. Y. Zhang, H.-F. Ji, G.M. Brown, T. Thundat. Detection of Cr()4(2} using a hydrogcl swelling microcantilever sensor II Anal Chem, 2003, - Vol.75, - No. 18, - pp.4773-4777.

99. B. Ilic, Y. Yang, H.G. Craighead. Virus detection using nanoelectromechanical devices // Appl. Phys lett,- 2004, Vol.85, - No.13, - pp.2604-2606.

100. A Gupta, D. Akin, R. Bashir. Single virus particle mass detection using microresonators with nanoscale thickness /I Appl Phys. lett, 2004, - Vol.84, - No.l 1, - pp.1976-1978

101. J. Zlatanova, S.M. Lindsay, S.H. Leuba. Single Molecule Force Spectroscopy in Biology Using the Atomic Force Microscope // Prog. Biophys Mol Biol, 2000, - Vol.74, - pp.3761.

102. X. Jiang, C. Z. Yang, K. Tanaka, A. Takahara, T. Kajiyama. Effect of chain end group on surface glass transition temperature of thin polymer film UPhysics letters A, -2001, -Vol.281,-pp.363-367.

103. Y. Sugawara, T. Ishizaka, S. Morita, S. Imai, N. Mikoshiba. Simultaneous observation of atomically resolved AFM/STM images of a graphite surface // Jpn J Appl. Phys., 1990, -Vol.29, - No.l,-pp.Ll57-LI59.

104. T. Hochwitz, A.K. Henning, C. Lcvery. Imaging integrated circuit dopant profiles with force-based scanning Kelvin probe microscope // J Vac Sci Technol B, 1996, - Vol.14, -No.l, - pp.440-446.

105. J.J. Saens, N. Garcia, P. Grutter, E. Meyer, H. Heinzelmann, R. Wiezendanger, L. Rosen-thaler, H.R. Hidber, and H.J. Guntherodt. Observation of magnetic forces by the atomic force microscope IIJ Appl Phys, 1987, - Vol.63, - pp 4293-4295.

106. LB. Дубровин. Зондовая микроскопия биомакромолекул: нуклеиновых кислот, белков и их комплексов II Диссертация па соискание ученой степепи кат) физ-мат наук, МГУ, 2005,- 112с.

107. Y. Martin, U.K. Wickramasinghe. Magnetic imaging by "force microscopy" with 1000-A resolution II Appl Phys Lett, 1987, - Vol.50, - No.20, - pp.1455120. T.V. Ratio, K.C. Langry, R.E. Rudd, R.L. Balhorn, M.J. Allen, M.W. McElfresh. Force

108. Spectroscopy of the Double-Tethered Concanavalin-A Mannose Bond // Biophysical Journal, 2004, - Vol.86, - pp.2430-2437.

109. O.H. Willemsen, M.E. Snel, A. Cambi, J. Greve, B.G. De Grooth, C.G. Figdor. Bimolecular Interactions Measured by Atomic Force Microscopy // Biophysical Journal, -2000, -Vol.79,-pp.3267-3281.

110. R. Tycko. Insights into the Amyloid Folding Problem from Solid-State NMR // Biochemistry, 2003, - Vol.42, - No.l 1, - pp.3151-3159.

111. Т. Strunz, К. Oros/lan, R. Schafer, H.-J. Gunthcrodt. Dynamic force spectroscopy of single DNA molecules // I'roc Natl Acad Sci USA, 1999, - Vol.96, - pp.11277-11282

112. K.L. Ekinci, Y.T. Yang, M.L. Roukes. Ultimate limits to incrtial mass sensing based upon nanoelectromechanical systems //J Appl Phys, -2004, Vol. 95, - No. 5, - pp. 26822689.

113. C.P. Green, J.E. Sader. Torsional frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope // J Appl Phys, 2002, -Vol.92, - No.10, - pp 6262-6274.

114. M.C. Cocn, R. Lehmann, P. Groning, M. Bielmann, C. Galli, L. Schlapbach. Adsorption and Bioactivity of Protein A on Silicon Surfaces Studied by AFM and XPSII Journal of Colloid and Interface Science, 2001, - Vol.233, - pp.180-189.

115. Э.П. Медямцева, Б В. Халдеева, Г К.Будников. Иммуносенсоры в биопогии и медицине: аналитические возможности, проблемы и перспективы // Жури auai химии, -2001, том 56, - № 10, - сс. 1015-1031.

116. M.S. Wilson, R.D. Rauh. Novel amperometric immunosensors based on iridium oxide matrices // Biosensors and Bioelectronics, 2004, - Vol.19, - pp 693-699.

117. A.A. Suleiman, Y. Xu. An Amperometric immunosensor for cocaine // Electroanalysis,1998, Vol.10, - No.4, - pp.240-243.

118. J. Parelladaa, A. Narvae/, M.A. Lopez, E. Domingueza, J.J. Fernandez, V. Pavlov, I. Ka-takis. Amperometric immunosensors and enzyme electrodes for environmental applications I I Analytic a ChimicaActa, 1998, - Vol.362, - pp.47-57.

119. P. Skladal, M. I'iala, J. Krejci, Detection of pesticides in the environment using biosensors based on cholinesterases// Int. J Environ Anal. Chem, 1996, - Vol.65, - pp.139-148.

120. M.F. Ylaev, R.A. Sitdikov, N.M. Dmitricva, E.V. Yazynina, A.V. ZHerdev, B.B. D/antiev. Development of a potentiometric immunosensor for herbicide simazinc and its application for food testing// Sensors and Actuators B, 2001, - Vol.75, - pp.129-135.

121. D.V. Brown, M.E. Meyerhoff. Potentiometric enzyme channeling immunosensor for proteins//Biosens Bioelectron, 1991.- Vol.6, - No.7, - pp.615-622.

122. M. Kanungo, D.N. Srivastava, A. Kumar, A.Q. Contractor. Conductimetric immunosensor based on poly(3,4-ethylenedioxythiophene)//C7/e/?j Commun, -2002,- pp.680-681.

123. R.G. Sandberg, L J. Van-Houten, J.L. Schwartz. A conductive poly mer-based immunosen-sor for the analysis of pesticide residues. ln:Biosensor Design and Application // ACS Symposium Series 511, Washington DC,-1992, pp 81 -88.

124. A L Ghindilis, P. Atanasov, M. Wilkins, E. Wilkins. Immunosensors: electrochcmical sensing and other engineering approaches // Biosens Bioelectron 1998, - Vol.13, - No.l, -pp.113-131.

125. N. Nath, M. Eldefrawi, J. Wright, D. Darwin, M. Huestis. A rapid reusable fiber optic biosensor for detecting cocaine metabolites in urine // J Anal Foxitol, 1999, - Vol.23, -No 6, - pp.460-467.

126. P.J. Devine, N.A. Anis, J. Wright, S. Kim, A.T. Eldefrawi, M.E. Eldefrawi. A fiber-optic cocaine biosensor I I Anal Biochem , 1995, - Vol.227, - pp.216-224.

127. G. Sakai, K. Ogata, T. Uda, N. Miura, N. Yamazoe. A surface plasmon resonance-based immunosensor for highly sensitive detection of morphine // Sens actuators B, 1998, -Vol.45,-No.l,-pp.5-12.

128. G. Sakai, S. Nakata, T. Uda, N. Miura, N. Yamazoe. Highly selective and sensitive spr immunosensor for detection of methamphetamine // Electrochim Acta , 1999, - No.21-22, -pp.3849-3854.

129. В. В. Малов // Пьезорезонаиспые датчики, Москва, Энергоатоми иат, 1989, - 272с.

130. N. Barie, M. Rapp. Covalent bound sensing layers on surface acoustic wave (SAW) biosensors, Biosensors & Bioelectronics, 2001, - Vol 16, - pp.979-987.

131. K. Kalantar-Zadeh, W. Wlodarski, Y.Y. Chen, B.N. Fry, K. Galatsis. Novel Love mode surface acoustic wave based immunosensors // Sensors and Actuators В, ~ 2003, Vol.91, -pp. 143-147.

132. Г.В. Лисичкин, A.IO. Фадеев, А.А. Сердан, П.Н Нестеренко, II.Г. Минтев, Д.В. Фурман II Химия привитых поверхностных соединении., Москва, Фи шат.шт, 2003, -592с.

133. Стрелков С. Г1. // Введение в теорию кочеваний, 2 изд., Москва, 1964, -440с.

134. J.E. Sadcr. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers // Rev. Sci In-strum, 1999, - Vol.70, - No. 10, - pp 3967-.

135. J. Zak, H. Yuan, M. Ho, L. K. Woo, M.D. Porter. Thiol-Derivatized Metalloporphyrins: Monomolecular Films for the Electrocatalytic Reduction of Dioxygen at Gold Electrodes // langmuir, 1993, - Vol.9, - pp.2772-.

136. K.V. Gobi, T. Ohsaka, Enhanced Electrostatic Interactions for Selective and Controllable Permeation of Ionic Species at a Monolayer of Self-Assembled Dicationic Nickel Complex //./ Electroanal Chem , 1999, - Vol.465, - pp.177-.

137. M. Haga, H.-G. Hong, Y. Shiozawa, Y. Kawata, H. onjushiro, T. Fukuo, R. Arakawa. Synthesis and Proton-Coupled Electron Transfer Reaction of Self-Assembled Monolayers of

138. Ruthcnium(II) Complex Containing Tridentate 2,6-Bis(benzimidazol-2-yl)-pyridine on Gold Surface // Inorg Chem, 2000, - Vol.39, - pp.4566-.

139. C.G.F. Cooper, J.C. MacDonald, E. Soto, W.G. McGimpsey. Non-Covalent Assembly of a Photoswitchable Surface //./ Am Chem Soc, 2004, - Vol.126, - pp.1032-.

140. E Coronado, A. Forment-Aliaga, F.M. Romero. Copper(l) pseudorotaxanc monolayers assembled on gold electrodes // Inorg Chem. 2003, - Vol.42, - pp.6959-.

141. A. Ulman. Self-Assembled Monolayers of 4-Mercaptobiphenyls // Acc Chem Res, 2001,- Vol.34, pp.855-.

142. А.Ю. Фадеев, A.A. Ельцов, 10.К. Алешин, С.И. Малышенко, Г.В. Лисичкин. Жидкостной химически модифицированный кварцевый резонатор как иммуносенсор // Ж физ хим., — 1994, — том 68,-№2, сс.2071-2075.

143. L.S. Shlyakhtenko, V.N. Potaman, R.R. Sindcn, A.A. Gall and Y.L. Lyubchenko Structure and dynamics of three-way DNA junctions: atomic force microscopy studies // Nucleic Acids Research, 2000, - Vol.28, - No. 18, - pp.3472-3477.

144. J. Homola, S.S. Yee, G. Gauglitz. Surface plasmon resonance sensors: review // Sens Actuators В Chem , 1999, - Vol.54, - pp.3-15.

145. K. Bizet, C. Gabriclli, H. Perrot, J. Thcrasse. Validation of antibody-based recognition by piezoelectric transducers through electroacoustic admittance analysis // Bio sens Bioelec-tron , 1998, - Vol.13, - pp.259-269.

146. T. Braun, M. Ghatkcsar Krishna, N. Backmann, H.P. Lang, C. Gerber, M. Hegner. Nanome-chanical Biosensors for Membrane Proteins // International Conference on Nanoscience and Technology 2006, Swisserland, Basel, 2006

147. N. Backmann, C. Zahnd, F. Huber, A. Bictsch, A. Pluckthun, H.-P. Lang, H.-J. Guntherodt, M. Hegner, C. Gerber. A label-free immunosensor array using single-chain antibody fragments // I'NAS, 2005, - Vol.102, - No 41, - pp.14587-14592.

148. Y. Arntz, J.D. Seelig, H.P. Lang, J. Zhang, P. Hunzikcr, J.P. Ramscyer, E. Meyer, M. Hegner, Ch. Gerber. Label-free protein assay based on a nanomechanical cantilever array // Nanotechnology, 2003, - Vol.14, - pp.86-90.

149. S. Ohnishi, K.Takano. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding // Cell Mol Life Sci, 2004, - Vol.61, - pp.511-524.

150. J.L. Pellequcr, S. Chen, V.A. Roberts, J.A. Tainer, E.D. Gctzoff. Unraveling the effect of changes in conformation and compactness at the antibody V(L)-V(H) interface upon antigen binding//./ Mol Recogmt, 1999, - Vol.12, - No. 4, - pp 267-275.

151. Д.Ю. Гавричко, Программное обеспечение для обработки трехмерных изображений "ФемюСкан Онлайн", Москва, Центр перспективных техноло! ий, 2005, - 89с.

152. А.С. Филонов, И.В. Яминский. Руководство пользователя пакета про1раммною обеспечения для управления сканирующим зондовым микроскопом и обработки изображений "ФемтоСкан Онлайн", Москва, Центр перспективных технологий, -2006,103 с.

153. H.D. Nguyen, С.К. Hall. Molecular dynamics simulations of spontaneous fibril formation by random-coil peptides // PNAS, 2004, - Vol.101, - No.46, - pp.16180-16185.

154. С.Г. Инте-Вечтомов, А.С. Борхсениус, С.П. Задорский. Белковая наследственность: конформациопиые матрицы и эпигенетика// Вестник ВОГиС, 2004, - том 8, -№2, -сс.60-66.

155. A.K. Chamberlain, C.E. MacPhcc, J. Zurdo, L.A. Morozova-Roche, H. Allen O. Hill, CM. Dobson, J.J. Davis Ultrastructural Organization of Amyloid Fibrils by Atomic force Microscopy // Biophysical Journal, 2000, - Vol. 79, - pp.3282-3293.

156. S. Ohnishia, K.Takanob. Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding// Cell Mol Life Sci, ~ 2004, Vol.61, - pp.511-524.

157. I). Hamada, C.M. Dobson. A kinetic study of 0-lactoglobulin amyloid fibril formation promoted by urea // Protein Science, 2002, - Vol.11, - pp.2417-2426.

158. K. Kuwajima, H. Yamaya, S. Sugai. The burst-phase intermediate in the refolding of B-Iactoglobulin studied by stopped-flow circular dichroism and absorption spectroscopy // J Mol Biol 1996, - Vol.264, - pp.806-822.

159. F. Tani, M. Murata, T. Higasa, M. Goto, N. Kitabatake, E. Doi. Molten Globule State of Protein Molecules in Heat-Induced Transparent Food Gels II .J Agric Food Chem , 1995, - Vol.43, -pp.2325-2331.

160. C. McAllister, M. Karymov, Y. Kawano, A.Y. Lushnikov, A. Mikheikin, V.N. Uversky, Y.L Lyubchenko. Protein Interactions and Misfolding Analyzed by AFM Force Spectroscopy // J Mol Biol, -2005, -Vol.354, -No 5, pp.1028-1042.

161. A. Kato, T. Takagi. Formation of intermolecular beta-sheet structure during heat denatura-tion of ovalbumin Ц J Agric Food Chem , 1988, - Vol.36, - pp.1156-1159.

162. S.B. Prusincr. Prions // Proc. Natl Acad Sci USA, 1998, - Vol.95, - pp.13363-13383.

163. C.E. Giacomelli, W. Norde. Conformational Changes of the Amyloid B-Peptide (1-40) Adsorbed on Solid Surfaces // Macromolecular Bioscience, 2005, - Vol.5, - No.5, - pp.401-407.

164. R.E. Marsh, R.B. Corey, L. Pauling An investigation of the structure of silk fibroin // Bio-chim. Bioph) s Acta., 1955, - Vol.16, - pp.1-34.

165. E I). Eanes, G.G. Glenner. X-ray diffraction studies on amyloid filaments // J Histochem Cytochem, 1968, - Vol.16, - pp 673-677.

166. L Bonar, A S. Cohen, M.M. Skinner. Characterization of the amyloid fibril as a cross-beta protein, Proc Soc.Exp Biol Med, 1969, - Vol.131, - pp.1373-1375.

167. L.N. Arnaudov, Renko de Vrics. Thermally Induced Fibrillar Aggregation of Hen Egg White Lysozyme // Biophys J, 2005, - Vol.88, - pp.515-526.

168. V. Yaminsky, N. V. Gvozdev, M. I. Sil'nikova, L. N. Rashkovich. Atomic Force Microscopy Study of Lysozyme Crystallization // Crystallography Reports- 2002, Vol.47, -No.l, - pp.S149-S158.

169. G. Yang, С. Cecconi, W.A. Baase, I.R. Vetter, W.A Breyer, J.A. Haack, B.W. Matthews, F.W. Dahlquist, C.Bustamante. Solid-state synthesis and mechanical unfolding of polymers of T4 lysozyme // PNAS, 2000, - Vol.97, - No.l, - pp. 139-144.

170. Y.L. Lyubchenko, L.S. Shlyakhtenko. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ//Proc Natl Acad Sci, 1997, - Vol.94, - pp.496-501.

171. M. Refaee, T. Tezuka, K. Akasaka, M. Williamson. Pressure-Dependent Changes in the Solution Structure of Hen Egg-White Lysozyme // J Mol Biol, 2003, - Vol.327, - No.4, -pp.857-865.

172. L.C. Serpell, M. Sundea, C.C.F. Blakea. The molecular basis of amyloidosis // Cell Mol. life Sci , 1997, - Vol.53, - pp.871-887.

173. Y. Liu, D. Eisenberg. 3D domain swapping: as domains continue to swap // Protein Sci, -2002,-Vol.11,-pp. 1285-1299.

174. W. Wang, M.H. Hecht. Rationally designed mutations convert de novo amyloid-like fibrils into monomeric beta-sheet proteins // Proc Natl Acad Sci USA, -2002, Vol.99, -pp.2760-2765.

175. L.B. Украинцев, Г.А. Киселев, Д.В. Бафов, II.В. Горелкин, А.А. Кудринский, Г.В. Лисичкин, И.В. Яминский. Атомные весы: новые возможности исследования взаимо-деиствия мопекул // Датчики и системы, -2007, -No.l (подписан в печать 22.10.2006),-pp. 18-21.

176. D. Sun, J. К. Mills. Control of rotating cantilever beam using a torque actuator and a distributed piezoelectric polymer actuator // Applied Acoustics, -2002, Vol.63, -No.44, -pp.885-899.

177. T.T. Braun, V. Barwich, M.K. Ghatkcsar, A.H. Bredekamp, C. Gerber, M. Hegner, HP. Lang. Micromechanical mass sensors for biomolecular detection in a physiological environment // Phys Rev E, 2005, - Vol.72, - pp 031907-031916.

178. J.E. Sadcr. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope IIJ Appl Phys, 1998, - Vol 84, - No.l, - pp 64-76.

179. A.II. Тихонов, A.A. Самарский. Уравнения математической фишки // Наука, Москва, 1977, -735с.

180. R. Bergcr, Ch. Gcrbcr, J.К. Gimzewski, E. Meyer, H.J. Guentherodt. Thermal analysis using a micromechanical calorimeter II Appl Phys Lett., 1996, - Vol.69, - No.l, - pp.40-42

181. М. Zhu, P.O. Souillac, С. Ionescu-Zanctti, S.A. Carter, A.L. Fink. Surface-catalyzed Amyloid Fibril Formation IIJ Biol. Chem , 2002, - Vol.277, - No.52, - pp.50914- 50922.