Изучение процессов глюкуроноконъюгации на основе фармакокинетических и биохимических исследований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.25, кандидат биологических наук Баранов, Павел Андреевич

• Баранов, Павел Андреевич
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Баранов, Павел Андреевич

1 Введение.

2 Обзор литературы.

2.1 Основы биотрансформации ксенобиотиков.

2.2 Основы биотрансформации мексидола.

2.2.1 Экспериментальные и клинические основы биотрансформации мексидола.

2.2.2 Взаимосвязь экспериментальных и клинических данных биотрансформации мексидола с биохимическими особенностями процессов деалкилирования.

2.3 Биохимические основы II фазы биотрансформации мексидола.

2.3.1 Механизм конъюгации ксенобиотиков с глюкуроновой кислотой.

2.3.2 Классификация УДФ-глюкуронозилтрансфераз.

2.3.3 Кинетические и биохимические особенности субстратной специфичности УДФ-глюкуронозилтрансфераз.

2.4 Методологические основы фенотипирования реакций биотрансформации в условиях in vitro.

2.4.1 Источники ферментов, используемые при проведении фенотипирования в условиях in vitro.

2.4.2 Преимущества и недостатки проведения фенотипирования в условиях in vitro.

3 Материалы и методы исследования.

3.1 Объект исследования.

3.2 Химические реактивы и вспомогательные материалы.

3.2.1 Исходные вещества.

3.2.2 Химические реактивы.

3.3 Аналитическая аппаратура и средства измерений.

3.3.1 Основные аналитические измерительные приборы.

3.3.2 Вспомогательные устройства.

3.4 Приготовление растворов и буферов.

3.4.1 Приготовление концентрированных и рабочих растворов образцов свидетелей.

3.4.2 Приготовление буферных растворов, растворов кислот и щелочей.

3.4.3 Приготовление 50 мМ буферного раствора Трис-НС1 (рН 7,3 - 7,4).

3.4.4 Приготовление 50 мМ раствора магния хлорида (II).

3.4.5 Приготовление 50 мМ раствора уридин-5'-дифосфат-а-В-глюкуроновой кислоты.

3.4.6 Приготовление подвижной фазы для хроматографического анализа биологических образцов животных.

3.4.7 Приготовление буферного раствора для хромато-масс-спектрометрического анализа.

3.4.8 Приготовление буферного раствора бикарбоната натрия (рН 10,5).

3.5 Изучение влияния янтарной кислоты на процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина.

3.5.1 Экспериментальные животные.

3.5.2 Введение препарата и отбор биологических проб.

3.5.3 Обработка биологических проб, экстракция 2-этил-6-метил-3-оксипиридина и его глюкуроноконъюгированного продукта из биологических образцов.

3.5.4 Условия хроматографического определения 2-этил-6-метил-3-оксипиридина и его глюкуроноконъюгированного продукта в биологических образцах животных.

3.5.5 Построение калибровочных кривых, расчет процента извлечения 2-этил-6-метил-З-оксипиридина из мочи животных.

3.5.6 Метрологическая характеристика метода определения 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче животных.

3.6 Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации в опытах in vitro.

3.6.1 Методология проведения реакции глюкуроноконъюгации в опытах in vitro.

3.6.1.1 Приготовление субстратов.

3.6.1.2 Приготовление УДФ-глюкуронозилтрансферазы.

3.6.1.3 Приготовление раствора коферментов.

3.6.1.4 Приготовление инкубационной смеси.

3.6.1.5 Внутренний контроль проведения реакции глюкуроноконъюгации.:.

3.6.1.6 Подготовка инкубационной смеси для хромато-масс-спектрометрического анализа.

3.6.2 Условия хромато-масс-спектрометрического анализа инкубационной смеси.

3.6.3 Построение калибровочных кривых.

3.6.4 Метрологическая характеристика хромато-масс-спектромегрического метода определения субстратов в инкубационной смеси.

3.7 Изучение продуктов экскреции И фазы биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче добровольцев.

3.7.1 Выбор здоровых добровольцев и их рандомизация.

3.7.2 Прием препарата и сбор биологических образцов.

3.7.3 Подготовка биологических образцов суточной мочи к анализу.

3.7.3.1 Подготовка биологических образцов суточной мочи к анализу свободной фракции.

3.7.3.2 Энзиматический гидролиз с ß-глюкуронидазой Е. Coli К12.

3.7.3.3 Энзиматический гидролиз с Р-глкжуронидазой НеНх.Ротайа Туре НР-2.

3.7.3.4 Кислотный гидролиз.

3.7.3.5 Дериватизация предварительно подготовленных биологических образцов мочи.

3.7.4 Условия хромато-масс-спектрометрического анализа.

3.8 Изучение влияния мексидола на соотношение бР-гидроксикортизол / свободный кортизол. Косвенная оценка влияния мексидола на СУРЗА4.

3.8.1 Выбор здоровых добровольцев и их рандомизация.

3.8.2 Прием препарата и сбор биологических образцов.

3.8.3 Подготовка биологических образцов суточной мочи к анализу.

3.8.4 Условия хромато-масс-спектрометрического анализа определения 6(3-гидроксикортизола и свободного кортизола в биологических образцах суточной мочи человека.

3.9 Метрологическая характеристика хромато-масс-спектрометрических методов анализа.

3.9.1 Определение градуировочных зависимостей.

3.9.2 Расчет процента извлечения исследуемого соединения из биологической пробы и оценка влияния эффекта матрицы.

3.9.3 Определение предела детектирования (ПД).

3.9.4 Определение мешающих веществ (селективность).

3.9.5 Точность, воспроизводимость и правильность измерений.

3.9.6 Устойчивость метода.

3.10 Статистическая обработка полученных результатов.

4 Результаты и их обсуждение.

4.1 Изучение влияния янтарной кислоты на процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина.

4.2 Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации в опытах in vitro на примере сукцината и основания 2-этил-6-метил-3-оксипиридина.

4.3 Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации в опытах in vitro на примере таксифолина (дигидроквертицина).

4.4 Изучение продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче добровольцев.

4.4.1 Разработка хромато-масс-спектрометрического метода количественного определения 2-этил-6-метил-3-оксипиридина и его конъюгированных продуктов в моче добровольцев.

4.4.2 Анализ продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этшт-б-метил-3-оксипиридина в моче человека.

4.5 Изучение влияния мексидола на соотношение бр-гидроксикортизол / свободный кортизол. Косвенная оценка влияния мексидола на CYP3A

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение процессов глюкуроноконъюгации на основе фармакокинетических и биохимических исследований»

Актуальность проблемы

Одной из основных проблем современной экспериментальной и клинической фармакологии является изучение процессов биотрансформации лекарственных веществ и ксенобиотиков-[41, 141, 142, 153, 165]. В-последнее время вопросам метаболизма лекарственных веществ в живых организмах, образованию метаболитов, их распределению и выведению уделяется все большее и большее внимание. Это обусловлено не только возрастающим количеством оригинальных лекарственных препаратов на фармацевтическом рынке, но и с бурным развитием современных технологий, позволяющих проводить биохимические и фармакокинетические исследования, фенотипи-рование и генотипирование пациентов; а также необходимостью разработки принципов рациональной фармакотерапии [43, 53, 57, 68, 182].

Открытия фундаментальных наук последних десятилетий коренным образом изменили представления о патогенезе заболеваний и подходы к их лечению. Индивидуализация фармакотерапии является неотъемлемой частью и качественной основой современных высокоэффективных принципов экспериментальной и клинической фармакологии [30, 68]. Рациональный выбор адекватной дозы лекарственного препарата, а также режима дозирования, на основе оценки индивидуальных фенотипических и генотипических особенностей биотрансформации, может значительно снизить число нежелательных побочных эффектов и повысить эффективность лечения [165].

Одним из подходов к изучению процессов биотрансформации является использование «маркерных субстратов», которое позволяет проводить комплексное и направленное изучение особенностей биотрансформации ксенобиотиков, оценивать индивидуальные фенотипические особенности метаболизма у различных биологических видов [53, 68].

Клинической основой применения «маркерных субстратов» является оценка активности определенных ферментативных систем у пациентов, а

10 также выявление генетических вариантов процессов биотрансформации ксенобиотиков, в том числе лекарственных веществ [53,133].

Методологической основой изучения «маркерных субстратов» является комплексная оценка процессов биотрансформации потенциального субстрата с учетом влияния ферментативных систем I и II фаз, а также биохимические и клинические исследования энзиматической активности исследуемого субстрата на основании результатов прямого и косвенного фенотипирования как в условиях in vitro, так и in vivo [81, 85,167,178,189].

Объектом исследования в представленной работе является мексидол (2-этил-6-метил-З-оксипиридина сукцинат). В ранних работах по изучению биотрансформации и экскреции мексидола показано, что основной метаболизм данного лекарственного препарата у человека проходит с участием ферментативных систем II фазы [14, 29]. Кроме того, были выявлены генотипиче-ские различия в скорости экскреции неизмененного соединения и глюкуро-ноконъюгированного метаболита у представителей различных этнических групп* [15]. На основании полученных результатов экспериментальных и клинических исследований было предложено проведение биохимических исследований с целью обоснования применения мексидола в качестве типи-рующего агента реакции глюкуроноконъюгации у человека [15].

Цель исследования

Изучение процессов глюкуроноконъюгации методами фармакокинети-ческого и биохимического анализа в условиях in vitro и in vivo на примере препарата мексидол.

Задачи исследования

1 Разработать высокочувствительный, селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче человека.

2 Изучить влияние янтарной кислоты на процессы глюкуроно-конъюгаци и 2-этил-б-метшг-З-оксипиридина у животных в условиях in vivo.

3 Провести in vitro фенотипирование реакции глюкуроноконъюга-ции на примере 2-этил-б-метил-З-оксипиридина и 2-этил-б-метил-З-оксипиридина сукцината. Определить изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуро-ноконъюгированных продуктов биотрансформации 1Г фазы метаболизма.

4 Исследовать процессы конъюгации мексидола у людей с использованием различных типов гидролиза (селективные ферменты (3-глюкуронидазы, кислотный гидролиз).

5 Изучить влияние основных ферментативных систем I фазы, биотрансформации человека на процессы! метаболизма 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в: условиях in vivo. На основе хромато-масс-спектрометрического анализа биологических образцов провести поиск возможных метаболитов I фазы биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека.

Научная новизна работы

Впервые установлено влияние янтарной кислоты на процессы глюку-роноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у животных, в условиях in vivo. Показано, что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) способствует увеличению количества-экскретируемого неизмененного и глюкуро-ноконъюгированного продукта биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в среднем в три и девять раз, соответственно, после перораль-ного и внутрибрюшинного введения:

На основании разработанного хромато-масс-спектрометрического метода установлено, что процесс биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина у человека происходит при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Впервые показано, что процесс конъюгации 2-этил-бметил-З-оксипиридина является комплексным, включающим в себя образо

12 вание не только глюкуроноконъюгированных производных, но и сульфо-, фосфоконъюгированных метаболитов и иных видов продуктов конъюгации.

Показано, что фенотипирование процесса глюкуроноконъюгации с использованием 2-этил-6-метил-3-оксипиридина не возможно, поскольку в опытах in vitro не обнаружены какие-либо взаимодействия с микросомаль-ным пулом человека, а также ни с одной из девяти изоформ УДФ-глюкуронозилтрансферазы (UGTs: 1А1; 1АЗ; 1А5; 1А7; 1А8; 1А10; 2В4; 2В7; SF9WT).

В ходе фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации впервые установлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGT1A1; UGT1A3; UGT1A10).

На основе неинвазивного метода количественного определения изменения уровня эндогенного 6р-гидроксикортизола к свободному кортизолу выявлена тенденция к индукции системы CYP3A4 человека под действием мексидола.

Практическая значимость работы

Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче человека. Метод соответствует международным требованиям IUPAC (ИЮПАК)1, предъявляемым к инструментальным методам анализа биологических образцов, и может быть использован в экспериментальных и клинических исследованиях продуктов биотрансформации мексидола.

Показана перспективность проведения дополнительных исследований с целью детального изучения субстратной специфичности дигидроквертицина и определения кинетических профилей субстрата по отношению к отдельным изоформам УДФ-глюкуронозилтрансферазы.

1 Международный союз практической и прикладной химии.

13

В ходе комплексного исследования биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина расширено представление о путях его биотрансформации у человека при участии ферментативных систем II фазы метаболизма. Показано потенциальное активирующее влияние мексидола на изоформу CYP3A4.

Положения, вынесенные на защиту

1 Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина на основе анализа различных фракций мочи человека.

2 Установлено, что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) способствует увеличению количества экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного продукта биотрансформаций 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в среднем в три и девять раз, соответственно, после перорального и внутрибрюшинного введения.

3 Выявлено, что в условиях in vivo процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина является одним из основных путей биотрансформации препарата, в то время как в in vitro исследованиях процесс образования конъюгированных продуктов с глюкуроновой кислотой не наблюдался. Рациональность выбранного методического подхода фенотипиро-вания реакции глюкуроноконъюгации показана на примере дигидрокверти-цина. Установлено, что процесс глюкуроноконъюгации наблюдается как в

•г условиях in vivo, так и в исследованиях in vitro. В ходе фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации выявлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGT1A1; UGT1A3; UGT1A10).

4 Впервые установлено, что в течение 24-х часов после приема мексидола, с мочой человека экскретируется 0,39 % ± 0,02 % неизмененного препарата; 20,71 % ± 4,18 % глюкуроноконъюгированного производного;

14

30,15 % ± 4,27 % сульфоконъюгированного продукта и 15,56 % ± 1,54 % иных форм конъюгированных продуктов от введенной дозы мексидола.

5 Однократный пероральный прием мексидола в дозе 750 мг приводит к изменению соотношения 6(3-гидроксикортизол / свободный кортизол, что может свидетельствовать об индукции системы CYP3A4 под действием препарата в течение 24-х часов после его приема.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на XIV Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2007 г.); Российском национальном съезде фармакологов (Санкт-Петербург, 2007 г.); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хромато-масс-спектрометрия» (Москва-Клязьма, 2008 г.); на VII Международном симпозиуме «7th Joint of the Association Francophone pour l'Enseignement et la Recherche en Pharmacognosie» (Греция, 2008 г.); научно-практической конференции «Медико-биологические науки для теоретической и практической медицины» (Москва, 2008 г.); на XXV Международном симпозиуме «LC/MS», (Швейцария, 2008 г.); II Ежегодной конференции «Фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2009); Первом Съезде нейрохирургов Республики Казахстан с международным участием (Астана, 2009 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 2 статьи и 8 тезисов.

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, 4 главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, библиографический указатель, вклю

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Баранов, Павел Андреевич

Выводы

1 Разработан высокочувствительный селективный хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина на основе анализа различных фракций мочи человека.

2 Наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) увеличивает количество экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгированного продукта биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в среднем в три и девять раз, соответственно, после перорального и внутрибрюшинного введения.

3 В-условиях in vivo процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-3-оксипиридина является* одним из основных путей биотрансформации препарата, в то время* как в in vitro исследованиях процесс образования конъюгированных продуктов с глюкуроновой кислотой не наблюдался: Рациональность выбранного «методологического подхода. фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации показана на примере дигидроквертицина. Доказано, что процесс глюкуроноконъюгации наблюдается как в условиях in vivo, так и в исследованиях in vitro. В ходе фенотипировании реакции глюкуроноконъюгации выявлены предположительные изоформы УДФ-глюкуронозилтрансферазы, ответственные за процесс образования глюкуроноконъюгированных форм дигидроквертицина (UGT1A1; UGT1A3; UGT1A10).

4 Установлено, что в течение 24-х часов (после приема мексидола с мочой человека экскретируется 0,39 % ± 0,02 % неизмененного препарата; 20,71 % ± 4,18 % глюкуроноконъюгированного производного; 30,15 % ± 4,27 % сульфоконъюгированных форм препарата и 15,56 % ± 1,54 % иных форм конъюгированных продуктов от введенной дозы мексидола.

5 Однократный пероральный прием мексидола в дозе 750 мг приводит к изменению соотношения бр-гидроксикортизол / свободный кортизол, что может свидетельствовать об индукции системы CYP3A4 под действием препарата течение 24-х часов после его приема. к

Заключение

В ранних исследованиях было показано, что основным путем биотрансформации мексидола является конъюгация его с глюкуроновой кислотой [14, 29]. Рассматривая мексидол в качестве потенциального маркерного агента реакции глюкуроноконъюгации, необходимо обратить внимание на его химическое строение. По химической структуре мексидол — простейший гетероциклический аналог ароматических фенолов (структурный аналог пиридоксина - витамина Вб) и в этой связи проявляет антиоксидантные и антирадикальные свойства. С другой стороны, в его состав входит остаток янтарной кислоты, который в организме человека является субстратом для повышения энергетического обмена в клетке и, следовательно; частично обуславливает фармакодинамиче-ские свойства препарата [4, 13].

Таким образом, до-проведения! непосредственного процесса фенотипиро-вания глюкуроноконъюгации вусловиях in vitro ¡необходимо был о оценитьсте-пень влияния, янтарной кислоты на процесс конъюгации 2-этил-6-метил-3-оксипридина (ОП). . .'.•(>,

Оценку влияния^ янтарной кислоты проводили в эксперименте после пе-рорального и внутрибрюшинного введения 2'-этилг1б-метил-3-оксипиридина в виде сукцината.и ввиде основания беспородным мышам-самцам. Основание 2-этил-6-метил-З-оксипиридина не растворимо в воде, поэтому параллельно проводили оценку влияния твин-80 на процесс глюкуроноконъюгации ОП, так как в случае введения основания 5,0 % раствор твин-80 являлся основой для растворения соединения, что явилось сопутствующей задачей. Влияние янтарной кислоты и твин-80 на процесс глюкуроноконъюгации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина уценивали на основании данных экскреции по,-собранной суточной моче у животных.

В ходе проведенного исследования было изучено влияние янтарной кислоты и,твин-80 на процесс глюкуроноконъюгации ОП при различных способах введения. Как и в предыдущих экспериментах.по изучению экскреции 2j I t этил-6-метил-З-оксипиридина было подтверждено, что основным путем экскреции ОП является конъюгации с глюкуроновой кислотой.

Установлено что наличие янтарной кислоты достоверно (р < 0,05) увеличивает количество экскретируемого неизмененного и глюкуроноконъюгиро-ванного ОП в среднем в три и девять раз, соответственно, после перорального и внутрибрюшинного введения.

Влияние твин-80 менее выражено, при этом установлено, что наличие твин-80 достоверно увеличивает содержание нативного соединения в моче животных лишь при внутрибрюшинном введении, а количество экскретируемого глюкуроноконъюгированного метаболита при пероральном введении. В остальных случаях получены статистически незначимые данные. j На основании полученных экспериментальных данных, а также литературных источников [69, 75, 82], было выдвинуто предположение, что янтарная кислота способствует увеличению степени ионизации ОП по сравнению с основанием, тем самым снижая процесс реабсорбции соединения (обратного всасывания) в почечных канальцах, что соответственно приводит к увеличению экскреции, ОП. В свою очередь, твин-80, обладая ярко выраженными гидрофильными свойствами, а также способностью к мицеллообразованию, способствует увеличению скорости всасывания 2-этил-6-метил-3-оксипиридина из желудочно-кишечного тракта в системный кровоток.(

Вновь полученные данные учитывали в исследованиях по фенотипирова-нию реакции глюкуроноконъюгации на примере 2-этил-6-метил-3-оксипиридина. Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации проводили на основании скринингового метода определения i активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы, разработанного М. Court и соавт. [73]. В эксперименте .использовали девять различных субмитохондриальных (S9) изоформ УДФ-глюкуронозилтрансферазы, а также микросомальный пул, выделенный из печени человека. При постановке реакции фенотипирования в условиях in vitro в качестве субстратов использовали как основание; так и сукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина.

В ходе эксперимента.впервые были получены MC и MG/MC спектры, 2-этил-6-метил-З-оксипиридина с использованием масс-спектрометра типассион-ная< ловушка» в условиях электрораспылительной, ионизации.«при'атмосферном давлении-и регистрации положительных ионов.

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов инкубационной смеси, отобранных в дискретные интервалы времени' (0 -360 минут) не выявил присутствия глюкуроноконъюгированного продукта реакции. При этом количественный. анализ полученных данных свидетельствует о>флуктуационном (случайном) и, неконтролируемом изменении* концентрации^ субстрата в, исследуемой инкубационной^ смеси.

Анализ, данных по фенотипированию реакции глюкуроноконъюгации с девятью • отдельными,* изоформами- УДФ-глюкуронозилтрансферазы. также не выявил образование конъюгированного продукта Пфазы биотрансформации.

С целью адекватной оценки воспроизведения .скринингового метода определения' активности УДФ-глюкуронозилтрансферазы было принято решение о воспроизведении .реакции глюкуроноконъюгации^ на примере таксифолина (дигидроквертицина).

Фенотипирование реакции глюкуроноконъюгации в условиях in vitro на примере таксифолина проводили в условиях, аналогичных, при изучении сукци-ната и основания 2-этил-6гметил-31оксипиридина. .

Хромато-масс-спектрометрический анализ образцов инкубационной смеси, отобранных в дискретные интервалы.времени (0 - 360 минут) выявил присутствие как нативного соединения, так и глюкуроноконъюгированного производного таксифолина, при этом, полученный МС-МС спектр полностью совпадал с., ранее .полученным МС-МС спектром конъюгированного производного таксифолина в моче животных. . .

Анализ данных по фенотипированию реакции глюкуроноконъюгации таксифолина с девятью различными рекомбинантными субмитохондриальными (S9) фракциями УДФ-глюкуронозилтрансферазы показал образование конъю-гированного продукта лишь в трех случаях (изоформы 1А1; 1АЗ и 1А10).

В результате проведенного исследования был воспроизведен метод скри-нинговой оценки субстратной специфичности таксифолина по отношению к УДФ-глюкуронозилтрансферазе. На примере фенотипированияфеакции глюкуроноконъюгации с таксифолином показана адекватность и методологическая рациональность используемого метода.

В экспериментальных и клинических исследованиях биотрансформации мексидола установлено, что основной путь метаболизма препарата в организме человека и животных - конъюгация с глюкуроновой кислотой [15, 25, 29]. Методологической основой данных исследований являлся» анализ биологических образцов на основании предварительного их гидролиза с р-глюкуронидазой, выделенной из, печени крупного рогатого^ скота., При экспериментальных и клинических исследованиях фармакокинетики препарата не проводилась комплексная оценка экскреции иных конъюгированных продуктов II фазы биотрансформации. Таким образом, данные экскреции препарата не отражают потенциальную, способность препарата к взаимодействию со всеми возможными ферментативными системами II фазы метаболизма.

На основании вышеизложенного, а также опираясь на данные результатов фенотипирования реакции глюкуроноконъюгации сукцината и основания 2-этил-6-метил-З-оксипиридина в условиях in vitro, было проведено детальное изучение, продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина в моче добровольцев после перорального приема мексидола.

Для .решения поставленной задачи был разработан хромато-масс-спектрометрический метод количественного определения конъюгированных продуктов биотрансформации 2-этил-б-метил-З-оксипиридина на основе анали

4 I за различных фракций мочи добровольцев. В ходе разработки метода проведена оптимизация процесса пробоподготовки и экстракции 2-этил-6-метил-3-оксипиридина из мочи человека. На основании проведенных исследований был предложен метод твердофазной экстракции в сочетании с последующим процессом дериватизации дансилхлоридом в качестве основного способа пробоподготовки биологических образцов мочи добровольцев.

Анализ продуктов экскреции II фазы биотрансформации 2-этил-6-метил-3-оксипиридина в моче добровольцев проводили на- основе данных свободной фракции, а также фракции суточной мочи добровольцев после проведения различных типов гидролиза: ферментативный гидролиз с ß-глюкуронидазой Е. Coli и Н. Pomatia; кислотный гидролиза с 6 М кислотой хлористоводородной.

В результате исследования^ продуктов экскреции II фазы метаболизма 2-этил-6-метил-З-оксипиридина впервые показано, что в течение-первых 24-х часов с мочой добровольцев выводится более 65,5 % препарата в виде различного рода конъюгированных продуктов II фазы биотрансформации.

Анализ усредненных данных показал, что в течение первых 24-х часов после 0 приема, мексидола с мочой добровольцев- экскретируется 1,99 мг± 0,32 мг неизмененного препарата (0,39 % ± 0,02 % от введенной дозы); 109,68 мг± 17,79 мг глюкуроноконъюгированного производного 2-этил-6-метил-3-оксипиридина (20,71 % ± 4,18 % от введенной дозы мексидола); 150,77 мг ± 21,35 мг в виде сульфоконъюгированных ,форм 2-этил-6-метил-3-оксипиридина, (30,15 %± 4,27 % от изначально введенной дозы мексидола) и 67,8 мкг ± 7,69 мкг в виде иных форм конъюгированных продуктов (15,56 % ± 1,54.% от введенной дозы мексидола). , ,

Стоит отметить, что в отличие от человека, в,организме животных про

• ч цесс биотрансформации мексидола проходит. при, участии ферментативных систем как II, так и I фазы метаболизма, о чем свидетельствуют данные экспериментальной фармакокинетики фармакологически, активного деметилирован-ного метаболита - 2,6-диметил-З-оксипиридина. Согласно данным биохимических и фармакокинетических исследований в процессах деметилирования активное участие принимает СУРЗА4 [54, 56, 75]. По нашему предположению, отсутствие продуктов I- фазы биотрансформации мексидола не является- свидетельством отсутствия влияния препарата на данные метаболические пути.

Таким образом, было проведено изучение потенциального влияния мексидола на Г фазу биотрансформации, а именно на изоформу СУРЗА4. Оценку активности СУРЗА4 проводили на основании неинвазивного метода количественного определения изменения« уровня эндогенного 6(3-гидроксикортизола к свободному кортизолу до и после приема препарата [17, 121].

Для каждого из добровольцев естественный уровень активности СУРЗА4 оценивали на основании данных среднего-значения соотношения- 6(3-ГК/К в суточной моче, полученного в течение трех дней до приема препарата. Изучение влияние мексидола на активность СУРЗА4 оценивали в течение последующих трех дней после приема препарата по изменению уровня 6(3-ГК/К в сравнении с естественным уровнем также у каждого из добровольцев.

Анализ данных выявил достоверное (р = 0,03) увеличение соотношения' 6(3-ГК/К по сравнению, с его естественным уровнем в первые 24 часа после пе-рорального приема мексидола (в среднем в 2,96 раз ± 0,76 раза).

Полученные данные коррелируют с вновь полученными данными по комплексному изучению продуктов экскреции 2-этил-6-метил-3-оксипиридина у человека, которые свидетельствуют о том, что более, 65,5 % препарата выводится с мочой'за первые 24 часа.

Хромато-масс-спектрометрический анализ мочи, полученной у добровольцев в ходе изучения экскреции, не выявил присутствия хотя бы следовых количеств самого неизмененного 2-этил-б-метил-ЗтОКсипиридина и его метаболитов на вторые и третьи сутки после приема препарата. Продуктов биотрансформации I фазы метаболизма в образцах мочи добровольцев найдено не было. Таким образом, предположительно индукция системы СУРЗА4 под действием мексидола наблюдается лишь в момент активной его. биотрансформации и экс креции и не сохраняется после полной элиминации соединения из организма человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Баранов, Павел Андреевич, 2009 год

1. Аляутдин, Р. Н. Фармакология / Р. Н. Аляутдин. — Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2004. 592 с.

2. Белобородое, В. Л. Органическая химия: учебник для Вузов / В; Л. Белобородов и др. -Москва : Дрофа, 2003. 630 с.

3. Вальдман, А. В. Влияние производных 3-оксипиридина: на центральную нервную систем / А. В. Вальдман и др. // Бюллютень экспериментальное биологии и медицины. 1985. №1 (99). С. 60-62.

4. Воронина, Т. А. Антиоксидант мексидол.Основные нейропсихотропные эффекты; и механизм: действия // Психофармакология и биологическая наркология. 2001. №1 (1). С. 2-12.

5. Воронина, Т. А. Героприхотропные свойства антиоксиданта из класса 3-оксипиридина в эксперименте / Т. А. Воронина и др. // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 1986. №9 (102): С. 307-10.

6. Воронина^ Т. А; Гипоксия и память. Особенности ¡эффектов и применения ноотропных препаратов // Вестник РАМН. 2000. №9. С. 27-34.

7. Воронина, Т. . А. Новые направления? поиска ноотропных препаратов // Вестник РАМН: 1998; №1. С. 16—21. ; , .

8. Воронина, Т. А. Влияние мембраномодулятора из класса 3-оксипиридина на фармакологическую активность психотропных . препаратов / Т. А. Воронина, Л. Д. Смирнов, К. М. Дюмаев // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 1985. №5 (99). С. 519-22.

9. Гоженко, А. И. Методика определения . неметаболизированного антицирина в моче человека / А. И. Гоженко и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2004. N3 (67). С. 59-60.,

10. Головенко, Н. Я. Сравнительная биохимия чужеродных соединений / Н. Я. Голвенко, Т. Л. Карасаева. — Киев : Наукова;Думка, 1983. — 200 с.

11. Головенко, Н. Я. Уридинфосфатглюкуронилтрансфераза. Структура? и каталитические свойства- // Успехи, современной? биологии. 1980. №3- (89). С. 360-376.

12. Давыдова;, II. А. Клинико-фармакологические закономерносги терапевтического действия препаратов^ с: ноотропными свойствами: Автореферат, диссертации кандидата медицинских наук / Давыдова И. А. -Москва;, 2001*. — с: 24: .

13. Дюмасв, К. М. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий Ц11С / К. М. Дюмаев, Т. А. Воронина, Л. Д1 Смирнов. — Москва: Издательство Института^ биомедицинскошхимитРАМН; 1995;.- с:, 272.

14. Жердев, В. 1Т. Метаболизм. антиоксиданта из класса- 3-оксипиридина / В?. П: Жердев, А. К. Сариев, Т. А. Воронина. . // Фармакология и токсикология. 1988. №1 (51). С. 55-59. , , .

15. Кукес, В. Г. Метаболизм лекарственных • . средств: клинико-фармакологические аспекты. / В: /,Е.Кукес.^.Москва?: ЮОТАР-МЕД^ 2004. 944 с.

16. Лакин,.К.М; Биотрансформация лекарственных средств / К. М. Лакин, Ф. Ю* Крылов? -Москва: Медицина, ! 981.-344. с;

17. Лукьянова, Л. Д. Особенности антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен / Л; Д. Лукьянова^ и др. // Химико-фармацевтический журнал. 1990. №8 (24). С. 9-11. . .

18. Мирошниченко^ И. И. Изучение фармакокинетики и биораспределения мексидола в5эксперименте / Ш И: Мирошниченко, О.Ю; Кузьмина; А. Е. Воронин //Бюллютень В1ЩБАВ. 1994. №2. С. 49-54.

19. Сариев, А. К. Кинетика выведения мексидола и его глюкуроноконъюгата с мочой больных / А. К. Сариев и др. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1999. №5 (62). С. 42^46.

20. Сариев, А. К. Фармакокинетические, поведенческие и нейрофизиологические аспекты действия 2-этил-6-метил-3-оксипирилина у крыс / А. К. Сариев и др. // Бюллютень экспериментальной биологии и медицины. 1988. №8. С. 165-167.

21. Сариев, А. К. Фармакокинетика производных 3-оксипиридина в эксперименте : Диссертация кандидата медицинских наук / А. К. Сариев. -Москва, 1987.-178 с.

22. Сергиенко, В. И. Прикладная фармакокинетика: основные положения и клиническое применение / В. И. Сергиенко, Р. Джеллифф, И. Б.

23. Бондарева. Москва : Издательство РАМН, 2003. - 248 с.

24. Середенин, С. Б. Влияние мамбраномодулятора 3-оксипиридина на эмоционально-стрессовую реакцию и связывание НЗ-диазепама в мозге инбредных мышей / С. Б. Середенин и др. // Химико-фармацевтический журнал. 1987. №2. С. 134-137. ,,

25. Середенин, С. Б. Исследования ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН по-поиску новых нейротропных средств,/ С. Б. Середенин, Т. А. Воронина // Клинические исследования лекарственных средств в России. 2004. №2. С. 22-27.

26. Середенин, С. Б. Лекции по фармакогенетике J С. Б. Середенин. -Москва : Медицинское Информационное Агентство, 2004. 303 с.

27. Слюсарев, А. А. Биология с общей генетикой / А. А. Слюсарев. -Москва : Медицина, 1978. 630 с.

28. Смирнов, Л. Д. Гетероароматические антиоксиданты мексидол и эмоксипин - универсальные средства антиоксидантной фармакотерапии / Л. ,Д. (Смирнов, Т. А. Воронина, К. М. Дюмаев // Тезисы доклада VIII

29. Российского Национального конгресса "Человек и лекарство": Москва : 2001. С. 622.

30. Смирнов, JI. Д. Бета-оксипроизводные шестичленных гетероциклов. Синтез; ингибирующая активость и биологические свойства / Л.Д. Смирнов, К. М. Дюмаев // Химико-фармацевтический журнал. 1982. №4 (16): С. 28-44.

31. Токсонбаева, Г. К. Зависимость фармакокинетики' от химической* струтуры ß-пиридинкарбоновых кислот : Диссертация кандидата медицинских'наук / Г. К. Токсонбаева. Москва, 1987. - 119 с.

32. Токсонбаева, Г. К. Количественные- соотношения» структура-фармакокинетика в ряду бета-поридинкарбоновых кислот / Г. К. Токсонбаева» и др. // Тезисы доклада» ИТ Всесоюзной- конференции по фармакокинетике. Москва, 1991. С. 96.

33. Шашков, B. C. Вопросы экспериментальной^, клинической фармакологии венотропных лекарственных средств1 / В. С. Шашков, A.A. Модин, А. В. Шашков// Экспериментальная и< клиническая- фармакология. 1998. №3 (61). С. 3-9.

34. Aitio, A. UDP glucuronosyltransferase and mixed function oxidase activity in microsomes prepared by differential centiifugation, and calcium aggregation / A. Aitio; H. Vainio // Acta pharmacologica et toxicologica.- 1976. N. 5 (39). P.555.561.

35. Atkinson; A. Ji Jr. Effect of active drug metabolites on plasma level-response correlations / A. J. Jr. Atkinson, J. M. Strong// Journal of pharmacokinetics and biopharmaceutics. 1977. N. 2'(5): P;.95-109h

36. Axelrod, J. The enzymatic deamination of amphetamine (benzedrine) // The Jburnalfofbiological chemistry. 1955: N: 2;(214)> P: 753-763=

37. Axelrod^ Ji The: enzymatic: demethylatiom of ephedrine // The Journal! of . pharmacology and experimentalitherapeutics: 195511N. 4t(llT); P^ 430M^8l

38. Balaz, S. Modelling kinetics of biological activity in xenobiotics / S. Batez. -Bratislava.: Veda, 1990. 130 p. ^

39. Bloom, J: G. Biomarkers in clinical drug development / J. C. Bloom, R. A. Dean. New York : Marcel Dekker, 2003. - 295 p.

40. Bonn, B. The molecular basis of CYP2D6-mediated N-dealkylation: balance between metabolic clearance routes and enzyme inhibition,/ B; Bonn et. al. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 2008'. N. 11 (36). P: 2199-2210.

41. Breck, G. D. Oxidative N-dealkylation: a mannich intermediate in the formation of a new metabolite of lidocaine in man / , G. , D: Breck, W, F, Trager.// Science. 19yi. N.>966 (172). P: 544^-546i

42. Brockmoller, J. Assessment of liver metabolic function. Clinical implications / J. Brockmoller, I. Roots. // Clinical pharmacokinetics. 1994. N. 3 (27). P: 216248. ,,

43. Brodie, B. B. Udenfriend S. Detoxication of drugs and other foreign compounds. :; by .liver microsomes / B. B. Brodie, et. al. // Science. 1955. N. 3147 (121). P.603.604.

44. Burchell j B. Specificity of human UDP-glucuronosyltransferases and xenobiotic glucuronidation / B. Burchell, C. Hi Brierley, D. Ranee. // Life sciences. 1995. N. 20 (57). P. 1819-1831.

45. Burchell, B: Genetic and environmental' factors associated with variation of human xenobiotic glucuronidation and sulfation / B. Burchell, M. W. Coughtrie. // Environmental health perspectives. 1977. N. 105. P. 739-747.

46. Burchell, B. Coughtrie M. W., UDP-glucuronosyltransferases / B. Burchell, M. W.Coughtrie. //Pharmacology & therapeutics. 1989. N. 2*(43). P. 261-289.

47. Burchell, B. Cellular and molecular aspects of glucuronidation / B. Burchell, J. Magdalou, G. Siest. Paris : INSERM, 1980. - 327 p,

48. Coffmair, BI L.> Humanî¥GT2B7 catalyzes morphine:glucuronidationi/ Bl E. Coffman et. al.// Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 1997. N.l (25). P. 1-4. • : V.

49. Cohen, N. Pharmacogenomics and personalized medicine / N. Cohen.

50. Court, M. Hi Isoform-selective probe substrates for in vitro studies of human UDP-glucuronosyltransferases / Ml H. Court. // Methods in enzymology. 2005. N. 400. P. 104-116.

51. Coutts, R. T. Involvement of CYP2D6, CYP3A4, and other cytochrome P-450 isozymes in N-dealkylation reactions / R. T. Coutts, PI Su, G. B: Baker. // Journal of pharmacological and toxicological methods. 1994*. N. 4 (31). P. 177186.

52. Denton, R. M. Metabolic regulation / R. M. Denton, C. I. Pogson. London, New York : Chapman and Hall, Willey, 1976. - 63 p.

53. Dutton, G. J. Glucuronidation of drugs and other compounds / G. J. Dutton.

54. Boca Raton, Fla.: GRC Press, 1980: 268 p.' j • ,j

55. Dutton, \G. J; Variations in glucuronide: formation by perinatal liver / G. J. Duttom // Biochemical pharmacology. 1966. N. 7 (15). P. 947-951.

56. Ernstgard, L. Phenotyping of cytochrome P450 2E1 in vitro and in vivo / L. Emstgard et. al. // Currentdrug metabolism. 2007. N. 5-(8). P. 493-498.

57. Evans, G. A. handbook of bioanalysis and drug metabolism / G. A. Evans. -Boca Raton, Fla.: CRC Press, 2004. 390 p.

58. Fevery, J. Perinatal' development of bilirubin UDP-glycosyltransferase activities-in rat liver / J: Fevery et. al. // Biology of the neonate. 1977. N. 5-6 (32). P. 336-342.

59. Fevery, J:. Glucuronidation of bilirubin and the occurrence of pigment gallstones in patients with chronic haemolytic diseases / J. Fevery et. al. // European-journal'of clinical investigation. 1980; N. 3 (10): P: 219-226.

60. Fuhr, U. Evaluation of caffeine as a test drug for CYP1A2, NAT2 and CYP2E1phenotypingiin man» by in vivo versus in vitro correlations 7 U. Fuhr. et. al. // Pharmacogenetics. 1996': N. 2 (6): P: 159-176.

61. Gaudette, L. E. Relationship between the lipid solubility, of drugs-and'their oxidation by liver microsomes / L. E. Gaudette, Bt B: Brodie. // Biochemical pharmacology. 1959:N. 2: Pi 89-96. , . ,

62. Ghosal, A. Identification of human UDP-glucuronosyltransferase. enzyme(s) responsible for the glucuronidation of 3-hydroxydesloratadine / A. Ghosal et. al. // Biopharmaceutics & drug disposition: 2004. N. 6 (25). P. 243-252.

63. Gibson, D. M. Metabolic regulation*in mammals / Di M. Gibson; R. A. Harris. London, New York : Taylor & Francis, 2002: - 224 p.

64. Gibson, G. G. Introduction to drug metabolism / G. G: Gibson, P. Skett. -Cheltenham; UK : Nelson. Thornes Publishers, 2001. 256 p.

65. Granvil; C. PI 4-Hydroxylation1 of debrisoquine by human CYP1A1 and its inhibition by quinidine- and quinine / C. P: Granvil et.al.// The Journal of pharmacology and experimental therapeutics: 2002::N.;3 (301).P. 1025-1032.

66. Green, M. D. Glucuronidation of amines and other xenobiotics catalyzed by expressed human UDP-glucuronosyltransferase 1 A3 / Mi. D. Green et. al. //

67. Drug metabolism and disposition: the biological fate: of chemicals. 1998! N. 6 (26). P. 507-512:

68. Habdous, M. Glutathione S-transferases genetic polymorphisms and human diseases::overview« ofiepidemiological?studies-/ M: Habdous et. alQ// Annales: de biologie clinique. 2004. N." 1 (62): Pi 15-24'.

69. Hall, L. R. N-dealkylation of tertiary amides by cytochrome P-450 / L. R. Hall, R. P. Hanzlik. //Xenobiotica. 1991.N. 9 (21). .P. 1127-1138:.

70. Handschin, C. Induction of drug metabolism: the role of nuclear receptors/ C. HandsellingU. A. Meyer. // Pharmacological^ reviey/S;, 20031N; 4f (55):.P1 649673. . , :

71. Hansch, C. The use of substituent constants in the ¡correlation of demethylation rates; / €. Hansch;, A;. RL Steward; J\ Iwasa://; .Journal: of<" medicinal? chemistry. 1965. N. 6 (8). P. 868 -870.

72. Hartiala,. K., Metabolism of hormones, dings and other substances by the ;gut // Physiological^reviews. 19731N: 2 (53). PI 496-5341/

73. Iwata^J. Direct determination of four sulfates and seven glucuronides of 17-oxosteroids in urine by; fluorescence "high-performance" liquid chromatography /JMwata, T.Suga. // Clinical chemistry. 1989. N. 5 (35). P. 794-799.

74. Jucker, E. Progress in drug research / E. Jucker. Basel; Boston : Birkhäuser, 1998.-512 p.

75. Jurima-Romet, M. Induction of GYP3A andt associated; terfenadine N-dealkylätiomimrathepatocytes;cocultoedtwith;3T3* cells/ M. Jurima-Romet et. a^ Z/GelBbiolog^and;toxicology.l995^N 11 (6)^P; 313-327.

76. Kurganov, B. I. Modern enzymology : problems and trends / B. I. Kurganov, S. N. Kochetkov, V. I. Tishkov. Commack, N.Y.: Nova Science Publishers, 1995.-829 p.

77. Landi, S. Mammalian class theta GST and differential susceptibility to carcinogens: a review // Mutation research. 2000. N. 3 (463). P. 247-283.

78. Lash, L. H. Drug metabolism and transport : molecular methods and mechanisms / L. H. Lash. Totowa, N.J. : Humana Press, 2005. - 387 p.

79. Lee, H. S Identification of cytochrome P450 enzymes responsible for N -dealkylation of a new oral erectogenic, mirodenafil / H. S. Lee et. al.// Xenobiotica. 2008. N. 1 (38). P. 21-33.

80. Lee, J. S. Drug metabolizing enzymes : cytochrome P450 and other enzymes in drug discovery and development / J. S. Lee, R. S. Obach, M. B. Fisher. -Lausanne, Switzerland : FontisMedia SA; Marcel Dekker, 2003. 588 p.

81. Levy, R. H. Metabolic drug interactions / R. H. Levy. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2000. - 739 p.

82. Linder, M. W. Pharmacogenetics: a laboratory tool for optimizing therapeutic efficiency / M. W. Linder, R. A. Prough, R. Valdes. // Clinical chemistry. 1997. N. 2 (43). P. 254—266.

83. Lipman, M. An alternate pathway for Cortisol metabolism. 6 beta-hydroxycortisol production by human tissue slices / M. Lipman, F. H. Katz, J. W. Jailer. // The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 1962. N. 22. P. 268-272. , ,

84. Lodish, H. F. Molecular cell biology / H. H. Lodish. New York: W. H. Freeman, 2008. - 730 p.

85. Liillmann, H. Color atlas of pharmacology / H. Liillmann. Stuttgart; New York : Thieme, 2005. - 402 p.

86. Mackenzie, P. I. Expression of chimeric cDNAs in cell culture defines a region of UDP glucuronosyltransferase involved in substrate selection // The Journal of biological chemistry. 1990. N. 6 (265). P. 3432-3435.

87. Mackenzie, P. I. The UDP glycosyltransferase gene superfamily: recommended nomenclature update based on evolutionary divergence / P. I. Mackenzie et. al. //Pharmacogenetics. 1997. N. 4 (7). P. 255-269.

88. Mahgoub, A. Polymorphic hydroxylation of Debrisoquine in man / A. Mahgoub et. al. // Lancet. 1977. N. 2. (8038). P. 584-586.

89. Martin, B. R. Metabolic regulation: a molecular approach / B. R. Martin. -Oxford, Boston : Blackwell Scientific Publications, 1987. 299 p.

90. Maruo, Y. UDP-glucuronosyltransferase / Y. Maruo, H. Sato. // Japanese journal of hygiene. 2002. N. 4 (56). P. 629-633.

91. Matsubara, T. Liver microsomal cytochrome P-450-dependent O-dealkylation reaction in various animals / T. Matsubara, S. Otsubo, E. Yoshihara. // Japanese journal of pharmacology. 1983. N. 5 (33). P. 1065-1075.

92. Mazzachi, B. C. Reference range and method comparison studies for enzymatic and Jaffe creatinine assays in plasma and serum and early morning urine / B. C. Mazzachi, M. J. Peake, V. Ehrhardt. // Clinical laboratory. 2000. N. 1-2 (46). P. 53-55.

93. McMahon, R. E. Demethylation Studies. Iv. The in Vitro and in Vivo Cleavage of Alkyl- and Arylalkyl-P-Nitrophenyl Ethers / R. E. McMahon et. al. // Journal of medicinal chemistry. 1963. N. 6. P. 343-346.

94. McMahon, R. E. Microsomal dealkylation of drugs// Journal of Pharmaceutical Sciences. 1966. N. 5 (55). P. 457-466.

95. Mendelsohn, M. L. Biomarkers: medical and workplace applications / M. L. Mendelsohn, L. C. Mohr, J. P. Peeters. Washington, D.C.: Joseph Henry Press, 1998.-456 p.

96. Meyers, M: Steroid D-ring glucuronides: characterization' of a new class of cholestatic agents in the rat / M. Meyers, W. Slikker, M>. Vore. // The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 1981. N. 1 (218). P. 63-67.

97. Miners, J. O. In vitro-in vivo correlation- for drugs and' other compounds eliminated by glucuronidation in humans: pitfalls and promises / J. O. Miners et. al.//Biochemicalpharmacology. 2006. N. 11 (71). P. 1531-1539.

98. Mirishnichenko, I. I. Pharmacokinetics and neurochemistry of mexidol / I. I. Mirishnichenko, L. D. Smirnov. // European Journal of Pharmaceutical Sciences. 1995. N. 2. P. 193-197.

99. Mojarrabi, B. cDNA cloning and characterization of the human UDP glucuronosyltransferase, UGT1A3 / B. Mojarrabi, R4. Butler, P: I. Mackenzie. // Biochemical and biophysical research communications. 1996. N. 3 (225). P. 785-790.

100. Oellerieh, M.Eidocainemetabolite formation »as a? measure: of liver function in patients; witht. cirrhosis; / Mi Oelleiich? et;. al.f// Therapeutic drug: monitpring;: 1990.<N: 3 (12); P: 219-226í

101. Pacifîci, G. M; Tissue*distribution- of drug-metabolizing enzymes: in humans / G. M. Pacifici et. al. //Xcnobiotica. 1988. N. 7 (18). P.849-856.

102. Pan,. L. P. . In-vitro characterization; of the cytochrome P450 ; isoenzymes; inyolvedíinithe:backoxidation: and:N-dèalkylàtionipfreducedïhaloperidol?/ L. P.

103. Pàn,. G. De Vriendt, F. Mi Belpaire. // Pharmacogenetics. 1998: № 5 (8);. Pi • 383-389. • ; . :

104. Parquet; M: Glucuronidation of bile: acids imhuman liver, intestine: andkidney. An- in vitro study on? hyodëoxycholic acid. / ¡ M. Parquet et., al.'// FEB S

105. Letters. .1985. N. 2 (189). P. 183-187. . . :| r:;

106. Purich, D. L. Enzyme kinetics and mechanism»/ D: E. Punch, V. L. Schramm. -New York : Academic Press, 1979. 746 p.

107. Radominska, A. Biosynthesis of hydroxyl-linked glucuronides of short-chain bile acids by rat liver 3-hydroxysteroid UDP-glucuronosyltransferase / A. Radominska et. al.// Journal of lipid research. 1988. N. 4 (29). P. 501-508.

108. Ramage, A. Problems of drug selectivity and dose-pharmacology // The Journal' of physiology. 2005. N. 2(569). P. 711-712.

109. Rodrigues,.A. D. Drug-drug interactions / A. D. Rodrigues. New York: Informa Healthcare, 2008. - 744 p.

110. Roosemalen, M; C. High-performance liquid,chromatographic determination of the polar metabolites« of nifedipine* in plasma, blood* and urine / M. C.- • Roosemalen et. al.// Journal of chromatography., 1991'. N. 1-2 (565). P. 516 -522.

111. Rowe, B. J. Diisopropylfluorophosphate increases clofibric acid clearance: supporting» evidence for a futile cycle / B. J. Rowe, P. J. Meffin. // The Journal of pharmacology and experimental8 therapeutics. 1984. N. 1 (320). P. 237-241.

112. Salman, K. Serum androstanediol glucuronide in women with facial hirsutism / K. Salman et. al. // Journal* of the American Academy of Dermatology. 19921 N. 3 (26). P. 411-414.

113. Sariev, A. K. Kinetics of Mexidol and its glucuronconjugate release in patients-. urine,/ A.rK. Sariev et. al. // Neurotrauma symposium. -, Cruise Moscow

114. Volga river, 1997. P. 203.

115. Shuster, L. Metabolism of Drugs and Toxic Substances // Annual review of biochemistry. 1964. N. 33. P. 571-596.

116. Sinclair,.K. A. The formation of beta-glucuronidase resistant glucuronides by the intramolecular rearrangement of glucuronic acid conjugates at mild alkaline pH / K. A. Sinclair, J. Caldwell. // Biochemical pharmacology. 1982. N. 6 (31). P: 953-957.

117. Sipes, Ii G. Comprehensive toxicology / II G. Sipes,. C. A. McQueen, A. J: Gandolfi.-New York : Pergamon; 1997. 520^.-:

118. Staines,, A.« G. N-glucuronidatiom of carbamazepine in human? tissues* is , mediated!by UGT2B7 / A. G:. Staines, Mi W. Coughtrie;, Bi Burchell:// The;

119. Journal of pharmacology and' experimental therapeutics. 2004. N. 3: (311). P. 1131-1137. . ' ■ . : .

120. Tephly, TV ft, UDP-glucuronosyltransferases: a family of detoxifying enzymes / T. R. Tephly, B. Burchell. // Trends in pharmacological sciences. 1990. N. 7 (11). P. 276-279. ; v

121. Testa, B. The biochemistry of drug metabolism : principles, redox reactions, hydrolyses / B. Testa, S. D. Krämer. Weinheim; Chichester: Wiley-VCH, 2008.

122. Thompson, D. L. Androsterone glucuronide is a marker of adrenal hyperandrogenism in hirsute women / D! L. Thompson, N. Horton, R. S. Rittmaster. // Clinical endocrinology. 1990. N. 3 (32). P. 283-292.

123. Tietz, A. A New Pteridine-Requiring Enzyme System for the Oxidation of Glyceryl Ethers / A. Tietz, M. Lindberg, E. P. // The Journal of biological chemistry. 1964. N. 239. P. 4081^090.

124. Timbrell, J. A. Introduction to toxicology / J. A. Tinmrell. London; New York : Taylor & Francis, 2002.

125. Tukey, R. H. Human UDP-glucuronosyltransferases: metabolism, expression, and disease / R. H. Tukey, C. P. // Annual review of pharmacology and toxicology. N. 40. P. 581-616.

126. Van der Reis, L. Enzymology of the live / L. Van der Reis. Basel; New York : S. Karger, 1976. - 295 p.

127. Vanstapel, F. Topology and regulation of bilirubin UDP-glucuronyltransferase in! sealed native microsomes from rat liver / F. Vanstapel, N. Blanckaert. // Archives of biochemistry and biophysics. 1988. N. ,1 (263). P. 216-225.

128. Vincent, G. Metabolic phenotyping of the diseased rat heart using 13C-substrates and ex vivo perfusion in the working mode / G. Vincent et.al. // Molecular and cellular biochemistry. 2003. N. 1-2 (242). P. 89-99.

129. Vore, M. Cholestatic properties and hepatic transport of steroid glucuronides / M. Vore, Y. Liu, L. Huang. // Drug metabolism reviews. 1997. N. 1-2 (29). P. 183-203.

130. Wahllander, A. Fasting plasma caffeine concentration. A guide to the severity of chronic liver disease / A. Wahllander, E. Renner, R. Preisig. // Scandinavian journal of gastroenterology. 1985. N. 9 (20). P. 1133-1141.

131. Wang. F. Biomarker methods in drug discovery and development / F. Wang. -Totowa, NJ : Humana Press, 2008. 396 p.

132. Watkins, P. B. Noninvasive tests of CYP3A enzymes// Pharmacogenetics. 1994: N.4(4). P. 171—184®.

133. Williams, A. M. Studies on the reactivity of acyl glucuronides-III. Glucuronide-derived adducts of valproic acid and plasma protein and anti-adduct antibodies in humans / A. M. Williams et. al.// Biochemical,pharmacology. 1992. N. 4 (43). P. 745-755.

134. Wolf; C. R. Science, medicine, and the future: Pharmacogenetics / C. R. Wolf, G. Smith, R. L. Smith. // BMJ (Clinical research ed.). 2000. N. 320 (7240). P. 987-990.

135. Woolf, T. F. Handbook of drug metabolism / T. F. Woolf. New York: Dekker, 1999.-596 p.

136. Yamanaka, H. Trans-3'-hydroxycotinine O- and N-glucuronidations in human liver microsomes / H. Yamanaka et. al. // Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 2005. N. 1 (33). P. 23-30.

137. Yan,,Z. Optimization in drug discovery : in vitro methods / Z. Yan, G. Caldwell. Totowa, N.J. : Humana Press, 2004. - 41'8 p.

138. Zhanataev, A. K. In* vive study of dihydroquercetin genotoxicity / A. K. Zhanataev et. al. // Bulletin of experimental biology and medicine. 2008. N. 3 (145). P. 338-340: ,

139. Zien, A. Phenotyping of chondrocytes in vivo and'in vitro using cDNA array technology / A. Zien et. al. // Clinical orthopaedics and related research. 2007. N. 460. P. 226-233.

140. Zimniak, P. Formation of three types of glucuronides of 6-hydroxy bile acids by rat liver microsomes / P. Zimniak et. al. // Journal of lipid research. 1988. N. 2 (29). P. 183-190.