Изучение нуклеотидных последовательностей и серологических свойств V 3 петли ВИЧ-I на материале из Санкт-Петербурга и Украины тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Набатов, Алексей Анатольевич

• Набатов, Алексей Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Набатов, Алексей Анатольевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.И

2.1. Развитие эпидемии ВИЧ/СПИД в мире.

2.2. ГеномВИЧ-1, свойстваи функции вирус-специфичных белков.

2.3. Вариабельность ВИЧ-1.г.

2.4. Структурам функции поверхностного гликопротеина.

ОР120 ВИЧ-1.

2.5. Гуморальный ответ на ВИЧ.

2.6. Субтипы ВИЧ-1 и методы определения субтипов ВИЧ-1.

2.6.1. ПЦР-секвенирование.

2.6.2. Серотшшрование.

2.6.3. Гетеродуплексный анализ.

2.7. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции.

2.7.1. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в мире.

2.7.2. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-инфекции в странах бывшего СССР.

3.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Пациенты.

3.2.Метод пептидного ИФА.

3.2.1. Синтетические пептиды.

3.2.2.Твердофазный иммуноферменшый анализ.^

3.3. Получение материала из периферической крови ВИЧ-инфщщроаддных пациентов.

3.3.1 Получение сывороток.

3.3.2 Получение плазм иМКПК.

3.4. Методы очистки ДНК.

3.4.1. Выделение ДНК из МКПК ВИЧ-инфицированных пациентов.

3.4.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.4.3. Выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы.

3.4.4. Очистка ДНК между ферментативными реакциями.

3.5. Амплификация ВИЧ-специфичных фрагментов.

3.6. Анализ нуклеиновых кислот.

3.6.1. Электрофорез препаратов ДНК.

3.6.2. Препаративный электрофорез препаратов ДНК в легкоплавкой агарозе.

3.6.3. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в неденатурируюхцих условиях.

3.6.4. Электрофорез препаратов ДНК в ПААГ в денатурирующих условиях.

3.6.5. Перенос и иммобилизация препаратов ДНК на фильтрах.

3.6.6. Методы молекулярной гибридизации.

3.6.6.1. Мечете ДНК радиоактивными изотопами.

3. б. 6.2. Гибридизация нуклеиновых кислот на фильтрах.

3.7. Клонирование амплифицированных ВИЧ-специфичных фрагментов.

3.7.1. Подготовка плазмидного вектора для клонирования.

3.7.2. Подготовка амплифицированного фрагмента для клонирования.

3.7.2.1. Выделение и очистка фрагментов амплифицированной ДНК из легкоплавкой агарозы.

3.7.2.2. Модификация концов амплифицированных фрагментов.

3.7.2.3. Фосфорилирование концов амплифицированных фрагментов.

3.7.3. Лигирование.

3.7.4. Подготовка компетентных клеток Е.соН для трансформацииТ.

3.7.5. Трансформация клеток Е.соН рекомбинантными плазмидами.

3.7.6. Огбор рекомбинантных клонов.

3.7.7. Анализ клонированных фрагментов.

3.7.7.1. Рестрищионный анализ рекомбинантных плазмид.

3.7.7.2. Анализ рекомбинантных плазмид методом ПЦР.

3.8. Секвенирование фрагментов ДНК.

3.8.1 Секвенирование клонированных фрагментов ДНК.

3.8.2. Прямое секвенирование ампшфицированных фрагментов ДНК.

3.9. Математические методы анализа данных.

3.9.1. Методы анализа многомерных данных при серотшшровании.

3.9.2. Методы анализа нуклеотидных последовательностей.

3.9.2.1 Поиск межсубтипных рекомбинаций в последовательностях ВИЧ-1.

3.9.2.2 Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей.

3.9.3. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1. Нуклеотидные последовательности УЗ петли ВИЧ-1 на материале Санкт-Петербурга и Украины.

4.1.1. Амплификация -специфичных фрагментов вариантов ВИЧ-1 из г. Санкт-Петербург и Украины.

4.1.2. Результаты клошфования еиу-специфичных фрагментов.

4.1.3. Определение нуклеотидных последовательностей еиу-специфичных фрагментов ВИЧ-1.

4.1.3.1. Определение нуклеотидных последовательностей участков гена ет> вариантов ВИЧ-1 методом секвенирования клонированных фрагментов.

4.1.3.2. Определение нуклеотидных последовательностей ВИЧ-специфичных участков гена ет> методом прямого секвенирования.

4.1.4. Результаты поиска максимально гомологичных последовательностей в Банке генов.

4.1.5. Результаты филогенетического анализа нуклеотвдных последовательностей.

4.2. Изучение антигенного разнообразия ВИЧ-1.

4.2.1. Изучение гомологии реконструированных аминокислотных последовательностей ВИЧ и синтетических пептидов, взятых для анализа.

4.2.2. Изучение спектров иммунореакгивности сывороток, взятых на различных сроках ВИЧ-инфекции.:.

4.2.3. Изучение спектров иммунореакгивности сывороток в популяции украинских ВИЧ-инфицированных

5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение нуклеотидных последовательностей и серологических свойств V 3 петли ВИЧ-I на материале из Санкт-Петербурга и Украины»

Актуальность проблемы.

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является возбудителем опасного инфекционного заболевания - ВИЧ-инфекции, конечной стадией которой является СПИД. Первые случаи СПИДа в США были зарегистрированы в 1981 году (Gottlib et al., 1981; Masur et al., 1981). В настоящее время распространение этого заболевания приобрело характер пандемии. По мнению экспертов ВОЗ, интенсивное распространение ВИЧ началось в конце 70-х - начале 80-х годов. К началу 80-х годов уровень инфицирования ВИЧ-1 оценивался в 100 тысяч человек, а к началу 90-х годов это число увеличилось в 100 раз и составило 10 миллионов человек (Mann, 1992). По данным Всемирной организации по борьбе со СПИДом (UNAIDS), представленным в докладе о глобальной СПИД/ВИЧ эпидемии общее число инфицированных в мире составляет 30,6 миллиона человек, из которых 5,8 миллиона было инфицировано в 1997 году, а количество смертных случаев от СПИД на конец 1997 года составляет 11,7 миллиона человек. Наиболее пострадавшим регионом является Африка, где количество случаев заболевания СПИДом оценивается более чем в 21 миллион человек. В настоящее время эпидемия наиболее быстро распространяется в Южной и Юго-Восточной Азии. На данный момент развития эпидемии число инфицированных в Азии составляет свыше 6 млн. человек (Report on the global HIV/AIDS epidemic, 1998).

По современной классификации для эпидемии ВИЧ/СПИД выделяются три стадии ее развития: ранняя (nascent), на которой уровень инфицированности в определенных группах риска составляет менее 5%; концентрированная (concentrated), на которой уровень инфицированности в определенных групп риска составляет более 5%, а уровень. инфицированности среди беременных женщин составляет менее 5% и генерализованная (generalized), на которой распространение ВИЧ-инфекции выходит за пределы групп риска, а уровень инфицированности среди беременных женщин составляет 5% и более (A World Bank policy report, 1997)

Первые случаи ВИЧ-инфекции на Украине были зарегистрированы в 1987 году, при этом доминировал половой путь передачи инфекции. За период 1987-1994 гг. было зарегистрировано только 183 ВИЧ-инфицированных. Но в конце 1994 года были обнаружены первые единичные случаи ВИЧ-инфекции среди наркоманов, использующих внутривенное введение наркотиков. За 1995 год было зафиксировано 1490 новых случаев ВИЧ-инфекции, из них 1021 (68%) - наркоманы (Kobyshcha et al., 1996). На конец 1997 года оценочное число ВИЧ-инфицированных на Украине составляло 110 ООО (Report on the global HIV/AIDS epidemic, 1998), из которых 76% составляли наркоманы, 15% заразились гетеросексуальным путем, причем источником полового пути передачи ВИЧ-1 в большинстве случаев являлись ВИЧ-инфицированные наркоманы.

Взрывообразное распространение эпидемии ВИЧ/СПИД на Украине в 1995 году явилось подобным примером данной эпидемии в странах бывшего СССР.

В соседних с Украиной странах - бывших республиках Советского Союза (Россия, Беларусь, Литва) - наблюдается такая же тенденция в развитии эпидемии. В 1996 году зафиксировано взрывообразное распространение ВИЧ-инфекции среди наркоманов в Светлогорске (Беларусь) (Рытик и др., 1997). В ряде регионов России, в частности в Калининградской области, в 1996 году также зарегистрировано быстрое распространение ВИЧ-инфекции среди наркоманов (Момот и др., 1997). Так, в Поволжском регионе с апреля 1996 по январь 1997 года выявлено 346 ВИЧ-инфицированных, из которых более 90% - внутривенные наркоманы. В Калининградской области, начиная с июля 1996 года по апрель 1997, выявлено более 1200 ВИЧ-инфицированных, среди которых 75% внутривенные наркоманы. В целом по России на конец 1997 года выявлено 5123 ВИЧ-инфицированных (в т.ч. 323 ребенка), из них 2516 - за 7 месяцев 1997 года.

Одной из особенностей ВИЧ является исключительно высокий уровень генетической изменчивости, обусловленной значительной скоростью репродукции вируса и селективным отбором мутантных вирусов в процессе развития заболевания. Развитие методов ферментативной амплификации нуклеиновых кислот с последующим их структурным анализом позволило проводить прямой мониторинг генетической изменчивости ВИЧ в организме инфицированного, в популяции ВИЧ-инфицированных и в географическом регионе. С увеличением объема данных о первичных последовательностях ВИЧ-1, полученных из основных центров пандемии СПИДа, оказалось, что можно идентифицировать 2 отличающихся друг от друга группы ВИЧ-1 (Myers et al., 1996; Kostrikis, 1995), которые обозначают - М (major) и О (outliner). В свою очередь группа М включает . в себя 10 подгрупп. Эти подгруппы в настоящее время принято называть субтипами ВИЧ-1 и обозначать латинскими буквами от А до J.

В последнее время, в связи с работами по созданию вакцины против ВИЧ/СПИД, все большее внимание исследователей занимает изучение субтип-зависимой иммунологической реакции организма на ВИЧ-1. В связи с этим быстро развиваются методы серотипирования ВИЧ. Серотипирование на основе УЗ-субтипимитирующих пептидов как метод анализа субтипического разнообразия ВИЧ-1 находится на начальном уровне, о чем свидетельствует продолжающаяся дискуссия о взаимоотношении между серотипом и генотипом ВИЧ-1 (Cheingsong-Popov et al., 1998, Zolla-Pazner et al., 1998). Одним из выходов из создавшегося положения все больше исследователей видят в выделении серотипа в отдельную таксономическую единицу ВИЧ-1 (Cheingsong-Popov et al., 1998) или во введении новых понятий вроде "иммунотип" (Zolla-Pazner et al., 1998).

Для Украины, несмотря на то, что эпидемия ВИЧ там приобрела взрывообразный характер раньше, чем в других странах бывшего СССР, многие молекулярно-биологические характеристики данной эпидемии, такие как частота представленности субтипов ВИЧ-1, их географическое и популяциоиное распределение все еще остаются неясными. На Украине существует возможность изучить эти параметры параллельно с прогрессией начальной стадии эпидемии ВИЧ/СПИД при переходе ее в стадию концентрированной эпидемии.

Учитывая уникальность эпидемической ситуации на Украине как возможного источника распространения ВИЧ в другие страны бывшего СССР и в первую очередь в Россию, изучение молекулярно-биологических характеристик изолятов ВИЧ-1, которые выявляются в различных группах риска на Украине, могут помочь в дальнейшем в работе по разработке вакцин и лекарств против ВИЧ/СПИД.

Цели и задачи исследования.

Целью исследования было изучение различными биохимическими методами факторов определяющих результаты серотипирования ВИЧ-1, а также изучение субтипического разнообразия изолятов ВИЧ-1, которые выявляются в популяции наркоманов на Украине.

Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможные изменения в реактивности антител к основному нейтрализуемому домену ВИЧ-1 с течением инфекции.

2. Осуществить широкомасштабный серотипический анализ сывороток ВИЧ-инфицированных.

3. Определить нуклеотидные последовательности гена еп\ ВИЧ-1 и провести их филогенетический анализ с целью определения их субтипов ВИЧ-1.

4. Сопоставить данные серо- и генотипирования ВИЧ-1.

Научная новизна работы.

Впервые для серотипического анализа ВИЧ-1 были использованы множественные антигенные пептиды (МАП). Впервые показано, что у ВИЧ инфицированных с течением инфекции не меняется спектр иммунореактивности сывороток к УЗ области ВИЧ-1. Впервые установлено, что среди ВИЧ-инфицированных внутривенных наркоманов Украины в разных географических регионах циркулируют ВИЧ-1 принадлежащие различным субтипам. Впервые показано филогенетическое родство ВИЧ-1, выявляемых в Николаеве и Калининграде.

Научно-практическая значимость работы.

Исследование относится к разряду научно-практических работ. Показана неизменность данных серотипирования ВИЧ-1 в ходе ВИЧ-инфекции, что вносит определенный вклад в обоснование метода серотипирования ВИЧ-1 как инструмента изучения субтипического разнообразия ВИЧ-1. Даны практические рекомендации по проведению мероприятий, связанных с изучения субтипического разнообразия ВИЧ-1. Полученные данные о серотипах и субтипах ВИЧ-1, присутствующих на Украине, важны для разработки вакцины против ВИЧ в странах бывшего СССР.

Форма выполнения диссертационной работы.

Работа была выполнена в рамках финансирования по договорам С-8188, С-7389, ФПС-5189, ФПС-7089, ФПС-0590, ФПС-0690, ФПС-5390, ФПС-5791, ФПС-8091, ФПС-8291, ФПС-7491, ФПС-0492, ФПС-4893, ФПЗ-0991, ФПЗ-45926 в рамках межведомственной программы «Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего». Апробация работы.

Материалы, представленные в диссертации, докладывались на следующих конференциях:

- 5-ая Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, Россия, Май 25-30,1997.

- 3rd European Conference on Experimental AIDS Research, Munich, Germany, February 28 — March 3,1998.

- 5-ая Международная конференция "СПИД, рак и родственные проблемы", Санкт-Петербург, Россия, Май 18-22, 1998.

- 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28 —July 3,1998.

- CIS Congress of Immunological and Allergological Societies, IV International Congress on Immunorehabilitation, I Conference "Vaccines of New Generation and Medical Diagnostic Systems of the Future", Sochi, Russia, July 5-9,1998.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Набатов, Алексей Анатольевич

6.выводы

1. Спектр иммунореактивности антител к УЗ петле ВИЧ-1 у ВИЧ инфицированных с течением ВИЧ-инфекции не меняется.

2. В результате широкомасштабного серотипического анализа ВИЧ-1 из Украины обнаружено три группы сывороток, отличающихся спектрами иммунореактивности, обладающие:

1) максимальной реактивностью с пептидами, имитирующими УЗ петлю субтипа В ВИЧ-1;

2) высокой кросс-реактивностью к пептидам различных субтипов;

3) максимальной реактивностью с пептидом, имитирующим УЗ петлю субтипа С ВИЧ-1

3. Из 11 изученных нуклеотидных последовательностей гена ет ВИЧ-1 7 принадлежат субтипу В ВИЧ-1,4 принадлежат субтипу А ВИЧ-1.

4. Изученные епу-специфические нуклеотидные последовательности ВИЧ-1 субтипа А из Украины кодируют аминокислотную структуру апекса УЗ петли схожую с таковой субтипа С, что подтверждается данными серотипирования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Набатов, Алексей Анатольевич, 1999 год

1. Козлов А.П., Емельянов A.B?, Веревочкин C.B., Карамов Э.В. Закономерности ранней фазы эпидемии ВИЧ/СПИД // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.-1997.-Т.1, №1.-С.5-28

2. Момот О.Ф., Смольская Т.Т., Ташкинова И.П., Шилова Э.А., Терентьева Ж.В., Лубкина М.О., Райская В.А.: Развитие эпидемии ВИЧ-инфекции среди наркоманов // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.-1997.-Т., №1-С.125.

3. Перевозчиков А.П., Курышев В.Ю., Арредоуани М. И др. Напрвленный перенос гена аполипогпротеина A-I человекаи бактериальных генов-маркеров в печень крысы // Доклады Академии Наук 1997-T.352,N4-C. 571-574.

4. Рытик П.Г., Кучеров И.И., Подольская И.А., Коржев М.О.: Эпидемиологические особенности ВИЧ-инфекции в Беларуси на современном этапе // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы-1997.-Т.1, №1-С.126.

5. Смольская Т.Т., Коровина Г.И., Новикова В.А., Власов H.H., Сизова Н.В., Бурова Н.В. Изучение генотипов ВИЧ-1, циркулирующих в России (1987-1996 гг.)// Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.-1997.-Т1,№1- С.132.

6. Ярославцева Н.Г., Щелканов М.Ю., Еремин В.Ф., Рытик П.Г., Титов Л.П., Карамов Э.В.: Серологическая однородность ВИЧ-1 из светлогорского очага эпидемии (1996) в Белоруссии// Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы.-1997. Т.1,№1-С.135.

7. A World Bank Policy Report. Confronting AIDS. Public priorities in a global epidemic.-Oxford University Press, Inc., 1997, P. 86-87

8. Albert J. and Fenyo E.M. Simple, sensitive, and specific detection of human immunodeficiency virus type 1 in clinical specimens by polymerase chain reaction with nested primers.// J.Clin. Microbiol.-1990.-V.28.-P. 1560-1564.

9. Allen J.S., Coligan J.E., Barin F., McLane M.F., Sodorski J.G., Rosen C.A., Haseltine W.A., Lee T.H., Essex N. Major glycoprotein antigens that induses antibodies in AIDS patients are encoded by HTLV-III.//Science.-1985.-V.228.-P.1091-1093.

10. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool.//J. Mol. Biol.-1990.-V.215.-P.403-410.

11. Ayenuine S., Johanson B., Salminen M., Leinikki P., Sonnerborg A., Zewdie D-W., Britton S., Strannegard O. HIV-I in Ephiopia: Phylogenetic divergence from other HIV-1 strains.// Virus Genes.-V5.-N.4.-p.359-366.

12. Bebenek K., Abbotts J., Roberts J. D., Wilson S. H., Kunkel T. A. Specificity and mechanism of error-prone replication by human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase // J.Biol.Chem.-1989.- V.264-P. 16948-16956.

13. Bobkov A., Cheingsong-Popov R., Selimova L., Ladnaya N., Kazennova E., Kravchenko A., Pokrovsky V., Weber J. HIV type 1 subtype E in Russia // AIDS Res.Hum.Retroviruses.-1997b-V. 13 .-P.725-727.

14. Briles, D. E. and Davie, J.M. Clonal nature of the immune response. II. The effect of immunization on clonal commitment // J.Exp.Med.-1980-V.152-P.151-160.

15. Bruce C., Clegg C., Featherstone A., Smith J., Oram J. Sequence analysis of the gpl20 of the env gene of Ugandan human immunodeficiency proviruses from a single individual.// AIDS Res.Hum. Retroviruses.-1993.-V.9.-N.4.-p.357-361.

16. Cantarero L.A., Butler J.E., Osborne J.W. The adsorptive characteristics of proteins for polystyrene and their significance in solid phase immunoassays // Anal. Biochem.-1980.-V.105-P.375-382.

17. Caponi L., Pegoraro S., Di Bartolo V., Rovero P., Revoltella R., Bombardieri S. Autoantibodies directed against ribosomal P proteins: use of a multiple antigen peptide as the coating agent in ELISA // J.Immunol.Methods.-1995.-V.179.-P.193-202.

18. Chan D.C., Fass D., Berger J.M., Kim P.S. Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein // Cell.-1997.-V.89.-P. 263-273.

19. Chassy B. M., Mercenier A., and Flickinger J. Transformation of bacteria by electroporation // Trends in Biotechnology.-1988.-V.6.-P.303-309.

20. Cheingson-Popov R., Lister S., Callow D., Kaleebu P., Beddows S., Weber J. Serotyping HIV-I by antibody binding to V3 loop: Relationship to viral genotype.// AIDS Res.Hum.Retroviruses.-1994.-V. 10.-N. 11 .-P. 1379-13 86.

21. Clavel F., Hoggan M.D., Willey R.L., Strebel K., Martin M. A., Repaske R. Genetic recombination of human immunodeficiency virus // J. Virol.4989.-V.63.-P. 1455-1459.

22. Clerici M. and Berzofsky J.A. Cellular immunity and cytokines in HIV infection // AIDS.-1994.-V.8 P.S175-S182.

23. Cochrane A.W., Perkins A., Rosen C. Identification of sequence important in the nucleolar localisation of human immunodeficiency virus rev: Relevance of nucleolar localisation to function // J.Virol.-1990.-V.64, N.2.-P.881-885.

24. Coffin J.M. Genetic variation in AIDS viruses // Cell.-1986.-V.46.-Nl.-P.l-4.

25. Cohen E.A., Denni G., Sodorski J.G., Haseltine W.A. Human immunodeficiency virus vpr product is a virion-associated regulatory protein // J.Virol.-1990.-V.64, N.6-P.3097-3099.

26. Dalgleish A.G., Beverly P.C.L., Clapham P.R., Crawford D.H., Greaves M.F., Weiss R.A. The CD4 (T4) Antigene is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus // Nature.- 1984.-V.312.-P.763-767.

27. D'Amelio R., Biselli R., Nisini R., Matricardi P.M., Aiuti A., Mezzaroma I., Pinter E., Pontesilli 0., Aiuti F. Spectrotype of anti-gpl20 remains stable during the course of HIV disease // J.AIDS. -1992-V.5,N.9-P.930-935.

28. Delwart E.L., Shpaer E.G., McCutchan F.E., Louwagie J., Grez M., Rubsamen-Waigmann H., Mullins J.I. Genetic relationships determined by a DNA heteroduplex mobility assay: Analysis of HIV-1 env genes // Science.-1993.-V.262.-P.1257-1261.

29. Delwart E.L., Sheppard H.W., Walker B.D., Goudsmit J., Mullins J.I. HIV-1 evolution in vivo tracked by DNA heteroduplex mobility assays.// J.Virol.-1994.-V.68.-N.10.-P.6672-6683.

30. Dyson H.J., Wright P.E. Antigenic peptides // FASEB J.-1995.-V.9.-P.37-42.

31. Emerman M., Malim M.H. HIV-1 regulatory/accessory genes: keys to unraveling viral and host cell biology // Science.-1998.-V.280.-P. 1880-1884.

32. Emerman M. HIV-1, Vpr and the cell cycle // Curr. Biol.-1996.-V.6.-P. 1096-1103.

33. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenesis: An approach using the bootstrap // Evolution.-1985.-V.39.-P.783-791.

34. Felsenstein J. PHYLIP Phylogeny Inference Package (Version 3.2) // Cladistics. -1989.-V.5: 164-166.

35. Feng, Y., Broder, C.C., Kennedy P.E. and Berger, E.A. HIV-1 entry cofactor: Functional cDNA cloning of a seven-transmembrane G protein coupled receptor // Science.-1996.-V.272.-P. 872-877.

36. Fisher A.G., Ensoli B., Looney D., et al. Biologically diverse molecular variants within a single HIV-1 isolate //Nature.-1988.-V.334.-P.444-447.

37. Freed E.O., Delwart E.L., Buschacher G.L., Panganiban A.T. A mutation in the human immunodeficiency virus type 1 transmembrane glycoprotein gp41 dominantly interferes with fusion and infectivity// Proc.Nat.Acad.Sci.USA.-1992.-V.89.-P.70-74.

38. Galaher W.R. Detection of a fusion peptide sequence in the transmembrane protein of human immunodeficiency virus // Cell.-1987.-V.50.-P.327-328.

39. Garcia J.V., Miller A.D. Serine phosphorylation-independent downregulation of cell-surface CD4 by nef // Nature.-1991.- V.350.-P.508-511.

40. Geyer H., Holschbach C., Hunsmann G., Schneider J. Carbohydrates of human immunodeficiency virus. Struture of oligosacharides linked to the envelope glycoprotein 120 // J.Biol.Chem.-1988.-V.263.-P.l 1760-11767.

41. Geysen H.M., Barteling S.J., Meloen R.H. Small peptides inlDUce antibodies with a sequence and structural requirement for binding antigen comparable to antibodies against the native protein // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.-1985.-V.82.-P. 178-182.

42. Goh W.C., Rogel M.E., Kinsey C.M., Michael S.F., Fultz P.N., Nowak M.A., Hahn B.H., Emerman M. HIV-1 Vpr increases viral expression by manipulation of the cell cycle: a mechanism for selection of Vpr in vivo //Nature Med.- 1998.-V.4.-P.65-71.

43. Gonda M.A., Wong-Staal F., Gallo R.C., Clements J.E., Narayan O., Gilden R.V. Sequence homology and morphologic similarity of HTLV-III and Visna virus, a pathogenic lentivirus // Science.-1985.-V.227.-P. 173-177.

44. Goudsmith J., Boucher C.A.B., Meloen R.H., Epstein L.G., Smit, L., van der Hoek L., Bakker M. Human antibody responce to a stain specific HIV-1 gpl20 epitope associated with cell fusion inhibition // AIDS- 1988a.-V.2.-P. 157-164.

45. Goudsmit J., Kuiken C.L., Nara P.L. Linear versus conformational domains of HIV-1 during experimental and natural infection // AIDS.-1989.-V.3.-P.5119-5123.

46. Goudsmit J., Back N.K.T., Nara P.L. Genomic diversity and anigenic variation of HIV-I: links between pathogenesis, epidemiology, and vaccine development.// FASEB J.-1991.-V.5.-P.2427-2436.

47. Groux H., Torpier G., Monte D., Mouton Y., Capron A., Ameisen J.C. Activation-induced death by apoptosis in CD4+ T cells from human immunodeficiency virus-infected asymptomatic individuals // J. Exp. Med.-1992.-V.175.-P.331-340.

48. Gurtler L., Eberle J., von Brunn A., Knapp S., Hauser H-P., Zekeng L., Tsague J.M., Selegny E., Kaptue L. A new subtype of human immunodeficiency virus type I (MVP5180) from Cameroon // J.Virol.-1994.-V.68.-p.l581-1585.

49. Guy B., Riviere Y., Dott K., Regnault A., Kieny M.P. Mutational analysis of the HIV nef protein // Virology.-1990.-V.176.-P.413-425.

50. Hahn B.H., Shaw G.M., Arya S.U., Popovic M., Gallo R.C., and Wong-Staal F. Molecular cloning and Characterization of the HTLV-III virus associated with AIDS // Nature.-1984.-V.312.-P.166-169.

51. Hahn B.H., Gonda M.A., Shaw G.M., Popovic M., Hoxie J., Gallo R.C., Wong-Staal F. Genomic diversity of the AIDS virus HTLV-III different viruses exhibit greatest divergence in their envelope genes // Proc.Nat.Acad.Sci.USA.-1985.-V.82.-P.4813-4817.

52. Haseltine W.A. Molecular biology of the AIDS virus: Ten years of discovery hope for the future // Science Challenging AIDS / Ed. G.Giraldo.-Bazel, Switzerland, 1991.-P.71-106.

53. Hizi A., McGill C., Hughes S.H. Expressiobn of soluble, enzymatically active, human immunodeficiency virus reverse transcriptase in Escherichia coli and analysis of mutants // Proc.Nat.Acad.Sci.USA.-1988.-V.85.-P. 1218-1222.

54. Ho D.D., NeumannA.U., Perelson A.S., Chen W., Leonard J.M., Markowitz M. Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV-1 infection // Nature.-1995.-V.373.-P.123-126.

55. Hu, W. S., and Temin, H. M. Retroviral recombination and reverse transcription // Science.-1990.-V.250.-P. 1227-1233.

56. Javaherian K., Langlois A.J., McDanal C., et al. Principal neutrolizing domain of the human immunodeficiency virus type 1 envelope protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1989,-V.86.-P.6768-6772.

57. Kaleebu P., Bobkov A., Cheingson-Popov R., Bieniasz P., Garaev M., Weber J. Identification of subtype G from Uganda.// AIDS Res.Hum. Retroviruses.- 1995.-V11.-N.5.-P.657-659.

58. Kalish M.L., Luo C-C., Weniger B.G., Limpakarnjanarat K., Young N., Ou C-Y., Schochetman G. Early HIV type I strains in Thailand were not responsible for the current epidemic.// AIDS Res.Hum.Retr.-1994.-V.10.-N.ll.-P.1573-1575.

59. Kimura M. A simple model for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences.// Journal of Molecular Evolution.-1980.-V.16.-P.111-120.

60. Klimkait T., Strebel K., Hoggan M.D., Martin M.A., Orenstein J.M. The Human immunodeficiency virus type 1-specific protein vpu is required for efficient virus maturation and release // J.Virol.-1990.-V.64, N.2.-P.621-629.

61. Kostrikis L.G., Bagdades E., Cao Y., Zhang L., Dimitrou D., Ho D.D. Genetic analysis of human immunodeficiency virus type I strains from patients in Cyprus: Identification of a new subtype designated subtype I // J.Virol.- 1995.-V.69.-P.6122-6130.

62. Kowalski M.L., Potz J., Basiripour L., Dorfman T., Gih W.C., Terwilliger E., Dayton A., Rosen C., Haseltine W., Sodorski J. Functional regions of the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type I.// Science.- 1987.- V.237.-P.1351-1355.

63. Kuiken C.L., Lukashov V.V., ßaan E., Dekker J., Leunissen'J.A., Goudsmit J. Evidence for limited within-person evolution of the V3 domain of the HIV-1 envelope in amsterdam population // AIDS.-1996.-V.10.-P.31-37.

64. Laure F., Courgnaud V., Rouzioux C., Blanche S., Veber F., Burgard M., Jacomet C., Griscelli C., Brechot C. Detection of HIV-1 DNA in infants and children by means of polymerase chain reaction // Lancet.-1988.-V.2.-P.538-541.

65. Leder L., Berger C., Bornhauser S., Wendt H., Ackermann F., Jelesarov I., Bosshard H.R. Spectroscopic, calorimetric, and kinetic demonstration of conformational adaptation in peptide-antibody recognition // Biochemistry.-1995.-V.34.-P.16509-16518.

66. Leitner T. Genetic Subtypes of HIV-1 // Human Retroviruses and AIDS.-Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1996-P.28-40.

67. Letvin N.L. Vaccines against human immunodeficiency virus progress and prospects.// N.Enl.J.Med.-1993.-V.329.-p. 1400-1405.

68. Levy J A., Hoffman A.D., Kramer S.M., Lanois J.A., Shimabukruro J.M., Obkiro B.S. Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San-Francisco patients with AIDS.// Science. -1984. V.225 .-P. 840-842.

69. Li W.-H., Tanimura M., Sharp P.M. Rates and dates of divergence between AIDS virus nucleotide sequences//Mol.Biol.Evol.-1988.-V.5.-P.313-330.

70. Louwagie J., Delwart E.L., Mullins J.I., McCutchan F.E., Eddy G., Burke D.S. Genetic analysis of HIV-I isolates from Brasil reveals presence of two distinct genetic subtypes // AIDS Res.Hum.Retr.-1994.-V. 10.-P.561-567.

71. Lukashov V., Karamov E., Eremin V., Titov L., Goudsmit J. Extreme founder effect in an HIV type 1 a epidemic among drug users in Svetlogorsk, Belarus.// AIDS Reseach and Human Retroviruses. 1998 (in press).

72. Luria S., Chambers I., Berg P. Expression of the type 1 human immunodeficiency virus Nef protein in T cells prevents antigen receptor-mediated induction of interleikin 2 mRNA.//Proc.Nat. Acad. Sci.USA.-1991.-V.88.-P.5326-5330.

73. Maddon P.J., Dalgleish A.G., McDougal J.S., Clapham PR., Neiss R A., Axel R. The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and the brain.// Cell.-1986.-V.47.-P.333-348.

74. Mann J.M. AIDS The second deade: a global perspective.// J.Inf.Dis.-1992.-V.165.-P.245-250.

75. Marx P.A., Munn R.J., Joy K.I. Computer imulation of thin section electron microscopy predicts an envelope-associated icosadeltahedral capsid for human immunodeficiency virus.// Läb.Invest.-1988.-V.58.-P. 112-118.

76. Masur H., Michelis M.A., Green J.B. An outbreak of community-acquired Pneumacistis carini pneumonia//New England J. Med.-1981.-V.305.-P.1431-1438.

77. McCune J.M., Rabin L.B., Feinberg MB., Lieberman M., Kosek J.C., Reyes G.R., Weissman I.L. Endoproteolytic cleavage of gp 160 is required for the activation of human immunodeficiency virus // Cell.-1988.-V.53.-P.55-67.

78. McDougal J.S., Kennedy M.S., Sligh J.M., Cort S.P., Mawle A., Nicholson J.K.A. Binding of HTLV-III/LAV to T4+ T-cells by a complex of the 1 lOkD viral protein and the T4 molecule // Science.-1986.-V.231.-P.382-385.

79. Moog C., Fleury H.J., Pellegrin I., Kirn A., Aubertin A.M. Autologous and heterologous neutralizing antibody responses following initial seroconversion in human immunodeficiency virus type 1-infected individuals.// J. Virol.-1997.-V.71.-P.3734-3741.

80. Provisional Public Health Service inter-agency recommendations for screening donated blood and plasma for antibody to the virus causing acquired immunodeficiency syndrome.// Morb. Mortal. Wkly. Rep.-1985.-V.34.-P. 1-5.

81. Update: trends in AIDS incidence, deaths, and prevalence. United States, 1996 // Morb.Mortal.Wkly Rep.-1997.-V.46.-P. 165-73.

82. Murphy G., Belda F.J., Clewly J.P., Parry J.V. Discordances between peptide serotyping and HMA genotyping in distinguishing HIV subtype from non-B // Abstracts of 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28- July 3, 1998, Abstract № 11193

83. Myers G., Korber B., Foley B., Jeang K.-T., Mellors J.W., and Wain-Hobson S.: Human Retroviruses and AIDS: A Compilation and Analysis of Nucleic Acid and Amino Acid Sequences // Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1996.

84. Nahmias A.J., Weiss J., Yao X., Lee F., Kodsi R., Schanfield M., Matthews T., Bolognesi D., Durak D., Motulsky A., Kanki P., Essex M. Evidence for human infection with HTLV-III/LAV-like virus in Central Africa.// Lancet.-1986.-V.8492.-P. 1279-1280.

85. Nara P.L., Garrity R.R., Goudsmit J. Neutralization of HIV-I: a paradox of humoral proportions // FASEB J.-1991.-V.5.-P.2437-2455.

86. Nara P.I. and Garrity P. Deceptive imprinting: a cosmopolitan strategy for complicated vaccination // Vaccine.-1998. -V. 16.-P. 1780-1787.

87. Narayan 0., Clements J.E. Biology and pathogenesis of lentiviruses.// J.Gen.Virology.-1989.-V.70.-P. 1617-1639.

88. Nardelli B., Lu Y.A., Shiu DR., Delpierre-Defoort C., Profy A.T., Tam J.P. A chemically defined synthetic vaccine model for HIV-1 // J. Immunol.-1992.-V. 148.-P.914-920.

89. Nelson G.W. and Perelson A.S. A mechanism of immune escape by slow- replicating HIV strains //J. of AIDS.-1992.-V.5.-P.82-93.

90. Ngeow Y-F. STD and HIV epidemiology in Asia // Abstracts X-th International Conference on AIDS-1994, 7-12 August, Yokohama, Japan.

91. Niederman T.M.J., Garcia J.V., Hastings W.R., Luria S., Ratner L. Human immunodeficiency virus type 1 Nef protein inhibits NF-kB induction in human T cells // J.Virol.-1992.-V.66.-P.6213-6219.

92. Novitsky V. A., Montano M.A., Essex M. Molecular epidemiology of an HIV-1 subtype A subclaster among injection drug users in the Southern Ukraine // AIDS Res.Hum. Retroviruses.- 1998.-V.14.-P. 1079-1085.

93. Nowak M. HIV mutation rate letter. //Nature.-1990.-V.347.-P.522.

94. Nunn A.J., Kamali A., Kengeya-Kayondo J.F. Migration and HIV-1 seroprevalence in rural Ugandan population // Abstracts X-th International Conference on AIDS-1994, 7-12 August, Yokohama, Japan.

95. Ohno M., Fornerod M., Mattaj I.W. Nucleocytoplasmic transport: the last 200 nanometers // Cell.-1998.-V.92.-P.327-336.

96. Osmanov S., Heyward W.L., Esparza J. The World Health Organization Network for HIV isolation and characterization: Summary of pilot study.// AIDS Res.Hum.Retroviruses-1994.-V.10.-N.il.-P. 1325-1326.

97. Ou C.-Y., Kwok S., Mitchell S.W., Mack D.H., Shinsky J.J., Krebs J.W., Feorino P., Warfield D., and Shochetman G. DNA amplification for direct detection of HIV-I in DNA of peripheral blood mononuclear cells // Science.-1988.-V.238.-P295-297.

98. Papsidero L.D., Shen M., Ruscetti F.W. Human immunodeficiency virus type 1 -neutralizing monoclonal antibodies which react with pi7 core protein: chracterization and epitope mapping // J.Virol.-1989.-V.63.-P.267-272.

99. Pau C.P., Lee-Tomas S„ Auwanit W., George J.R., Ou C.Y., Parekh B.S., Granade T.C., Holoman D.L., Philips S., Schochetman G., Young N.L., Takebe Y., Gayle H.D., Weniger

100. B.G. Highly specific V3 peptide immunoassay for serotyping HIV type I specimens from Thailand // AIDS-1993.-V.7.-P.337-340.

101. Perelson S.A., Neumann A.U., Markowitz M., Leonard J.M., Ho D.D. HIV-1 dynamics in vivo: virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time // Science -1996 -V.271-P.: 1582-1586.

102. Pestano G., Prince A., Guyden J., Ntambi J.M., Atkin A., Boto W.M.O. Independent divergences in the CD4 binding site and V3 loop encoded in two seroprevalent Ugandan HIV-I clinical isolates // AIDS.- 1993.-V.6.-P.872-880.

103. Popovic M., Sarandgandharan M.G., Read E., Gallo R.C. Detection, isolation, and continious production of cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patient with AIDS and pre-AIDS // Science.-1984.-V.224.-P.497-500.

104. Posnett D.N., McGrath H., Tam J.P. A novel method for producing anti-peptide antibodies. Production of site-specific antibodies to the T cell antigen receptor beta-chain // J.Biol.Chem.-1988.-V.263.-P. 1719-1725.

105. Profy A.T., Salinas P.A., Eckler L.I., IDUnlop N.M., Nara P.L., Putney S. Epitopes recognized by the neutralizing antibodies of an HIV-I infected indivIDUal.// J.Immun.-1990.-V.144.-P.4641-4648.

106. Ramlingaswami V. Perspectives on AIDS in Asia // Ann.Natl. Acad.Med.Sci.(India).-1989.-V.25, Nl.-P.3-8.

107. Reitz M.S., Wilson C., Gallo R.C. Generation of neutralization resistant variants of HIV-I is due to selection for a point mutation in the envelope gene // Cell. -1988.-V. 54,-P.57-63.

108. Ricchetti M. and Buc H. Reverse transcriptases and genomic variability: the accuracy of DNA replication is enzyme specific and sequence depedent // EMBO J.-1990.-V.9.-P. 15831593.

109. Rizzuto C.D. and Sodroski J.G. Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.// J.Virol.-1997.-V.71.-P. 4847-4851.

110. Robert-Guroff M., Brown M., Gallo R.C. HTLV-III neutralizing antibodies in patients with AIDS and AIDS- related complex // Nature.-1985.-V.316.-p.72-74.

111. Roberts, J. D., Bebenek, K., and Kunkel, T. A. The accuracy of reverse transcriptase from HIV-1// Science.-1988.-V.242.-P. 1171-1173.

112. Saag M.S., Hahn B.H., Gibbons J., Li Y., Parks E.S., Parks W.P., Shaw G.M. Extensive variation of human immunodeficiency virus type 1 in vivo// Nature.-1988,- V.334.-P.313-330.

113. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzimatic amplification of b-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of side cell anemia.// Science-1985.-V.230.-P. 1350-1354.

114. Sharp P.M., Robertson D.L., Feng G., and Hahn B.H. Origins and diversity of human immunodeficiency viruses //AIDS.-1994.-V.8 (suppl. 1).-P. S27-S42.

115. Shaw G.M., Hahn B.H., Arya S.K., Groopman J.E., Gallo R.C., Wong-Stall F. Molecular characterization of Human T-cell leUKRemia (lymphotropic) virus type III in the acquired immune deficiency syndrome.// Science.-1984.-V.226.-P. 1165-1171.

116. Sherefa K., Sallberg M., Sonnerborg A. Evidence of no change in V3 loop antybody recognition pattern in HIV type I- infected ethiopians between 1988 and 1993// AIDS Res.Hum. Retroviruses.-V.10.-N.ll.-P.1551-1556.

117. Simon H.M. and Malim M.H. The human immunodeficiency virus type 1 Vif protein modulates the postpenetration stability of viral nucleoprotein complexes.// J.Virol.-1996,-V. 70.-P. 5297-5305.

118. Siwka W., Schwinn A., Baczko K., Pardowitz I., Mhalu F., Shao J., Rethwilm A, ter Meulen V. vpu and env sequence variability of HIV-I from Tanzania // AIDS Res.Hum. Retroviruses.- 1994.- V.10.-N.12.-P. 1753-1754.

119. Smith T.F., Srinivasan A., Schochetmann G., Marcus M., Myers G. The phylogenetic history of immunodeficiency viruses // Nature.-1988.-V. 333.-P. 573-575.

120. Strebel K., Daugherty D., Clouse K., Cohen D., Folks T., Martin M. The HIV "AH(sor) gene product is essential for virus infectivity//Nature.-1987.-V.328.-P.728-730.

121. Takebe Y., Sato H., Oka S., Miyakuni T., Imai M., Pau C.-P., Ou C.-Y., Weinger B.G., Kimura S., Shimada K. Molecular epidemiology of HIV-1 infections in Asia.// Abstracts X-th International Conference on AIDS-1994, 7-12 August, Yokohama, Japan.

122. Tam J.P. and Zavala F. Multiple antigen peptide. A novel approach to increase detection sensitivity of synthetic peptides in solid-phase immunoassays // J.Immunol.Methods.-1989.-V.124.-P.53-61.

123. Tang X.L., Tregear G.W., White D.O., Jackson D.C. Minimum requirements for immunogenic and antigenic activities of homologues of a synthetic peptide of influenza virus hemagglutinine // J.Virol.-1988.-V.62.-P.4745-4551.

124. Tarlinton D.M., Smith K.G. Apoptosis and the B cell response to antigen.// Int. Rev. Immunol.-1997.-V. 15.-P.53-71.

125. Tsujimoto H., Hasegava A., Maki N. Sequence of the novel Simian Immunodeficiency Vims from wild- caught African mandrill //Nature.-1989.-V.341.-P.539-541.

126. Report on the global HIV/AIDS epidemic UNAIDS and WHO. June 1998. Geneva: 1998

127. Vartanian J.P., Meyerhans A., Asjo B., Wain-Hobson S. Selection, recombination and G—>A hypermutation of HIV-1 genomes.// J.Virol.-1991.-V.65.-P.1779-1788.

128. Verdoliva A, Cassani G, Fassina G. Affinity purification of polyclonal antibodies using immobilized multimeric peptides // J.Chromatogr.B. Biomed. Appl.-1995.-V.664.-P.175-183.

129. Vogel T, Kurth R, Norley S. The majority of neutralizing Abs in HIV-1-infected patients recognize linear V3 loop sequences. Studies using HIV-1MN multiple antigenic peptides // J.Immunol.-1994.-V.153.-P. 1895-1904.

130. Wain-Hobson S., Sonigo P., Danos O., Cole S., Alizon M. Nucleotide sequence of the AIDS vims, LAV// Cell.-1985.-V.40.-P.9-17.

131. Wain-Hobson S. Retroviral G-A hypermutation.// Human Retrovimses and AIDS. Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico, 1996.

132. Weiss R.A., Clapham P.R., Cheiningsong- Popov R., Dalgleish A.G., Carne C.A., Weller I.V.D., Tedder R.S. Neutralization of Human T- lymphotropic vims type III by sera of AIDS and AIDS- risk patients //Nature.-1985.-V.316.-P.69-72.

133. Wong-Staal F., Shaw G.M., Hahn B.H., Salahuddin S.Z , Popovic M., Markham P.D., Redfield R., Gallo R.C. Genomic diversity of human T-lymphotropic virus type III // Science.-1985.-V.229-P.759-762.

134. Wood R., Dong H., Katzenstein D.A., Merigan T. Quantification and comparison of HIV-1 proviral load in periferal blood mononuclear cells and isolated CD4+T cells // AIDS.-1993.-V.6.-N2.-P.237-240.

135. Wu, L., Gerard, N.P., Wiatt, R., et al. CD4-inIDUced interaction of primary HIV-1 gpl20 glycoprotein with chemokine receptor CCR5 // Nature.-1996.-V.384.-P. 179-183.

136. Zazzi M., Romano L., Brassini A., Valensin P.E. Nested polymerase chain reaction for detection of human immunodeficiency virus type I in clinical specipens // J.Med.Virol-1992.-V.38.-P. 172-174.