Изучение новых фотосенсибилизаторов, предназначенных для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии опухолей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Фомина, Галина Ивановна

• Фомина, Галина Ивановна
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фомина, Галина Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Введение

2. Молекулярные механизмы действия фотосенсибилизаторов.

3. Основные классы фотосенсибилизаторов.

4. Модели и этапы изучения фотосенсибилизаторов.

5. Локализация фотосенсибилизаторов в опухоли.

6. Механизмы опухолевой деструкции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Характеристика биологических объектов исследования.

2. Характеристика препаратов.

3. Методика измерений флюоресценции фотосенсибилизаторов в биотканях.

4. Изучение эффективности ФДТ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Разработка методических подходов для оценки эффективности новых фотосенсибилизаторов in vivo.

1.1. Модели опухолевого роста.

1.2. Изучение распределения фотосенса в тканях и органах животных с использованием флюоресцентного метода.

1.3. Изучение эффективности ФДТ с использованием фотосенса.

1.3.1. Оценка эффективности фотосенсибилизаторов на модели опухоли Эрлиха.

1.3.2. Оценка эффективности фотосенсибилизаторов на модели опухоли Р-388.

Глава 2. Скрининг новых соединений, предназначенных для ФД и ФДТ.

2Л. Производные фталоцианинов.

2Л.1. Дисульфофталоцианин цинка (Z11PCS2).

2Л. 1.1. Изучение накопления дисульфофталоцианина цинка (ZnPcS2).

2Л. 1.2. Изучение эффективности ФДТ с дисульфофталоцианином цинка (ZnPcS2).

2.1.1.1. Дисульфофталоцианин магния (MgPcS2).

2.1.1.2. Изучение накопления дисульфофталоцианина магния (MgPcS2).

2.1.1.3. Изучение эффективности дисульфофталоцианина магния (М^РсБг).

2.1.2. Безметальный дисульфофталоцианин (Н2Рс82).

2.1.2.1. Изучение накопления безметального дисульфофталоцианина (Н2Рс82).

2.1.3.2. Изучение эффективности ФДТ с безметальным дисульфофтало-цианином (Н2Рс82).

2.2. Производные хлоринов (Хл, а-Хл, ф-Хл).

2.2.1. Изучение распределения хлоринов (Хл, а-Хл, ф-Хл).

2.2.2. Изучение эффективности хлоринов (ф-Хл).

Глава 3. Оценка эффективности нового отечественного препарата

Аласенс» для ФД и ФДТ на основе 5-АЛК.

3.1. Изучение флюоресцентных свойств препарата «Аласенс».

3.2. Изучение фототоксичности препарата «Аласенс».

3.2.1. Изучение фототоксичности препарата «Аласенс» при применении внутрь.

3.2.2. Изучение фототоксичности препарата «Аласенс» при местном применении в составе мази.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение новых фотосенсибилизаторов, предназначенных для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии опухолей»

Актуальность темы.

В настоящее время интенсивно развиваются новые методы диагностики и терапии злокачественных новообразований - флюоресцентная диагностика (ФД) и фотодинамическая терапия рака (ФДТ), основанные на применении фотосенсибилизаторов.

ФДТ основана на взаимодействии молекулы опухолетропного фотосенсибилизатора с оптическим излучением определенной длины волны. В результате образуются цитотоксические агенты (синглетный кислород и свободные радикалы), поражающие клеточные элементы опухолевой ткани.

Внедрение в клиническую практику метода фотодинамической терапии злокачественных опухолей позволило расширить диапазон оказания радикальной и паллиативной помощи онкологическим больным, некурабельным по соматическому статусу, с функциональной нерезектабельностью опухолей или в случае их отказа от лечения традиционными методами [12,26]. Показанием для применения ФДТ являются тяжелая очаговая дисплазия; ранние неоплазии; злокачественные опухоли различных локализаций, резистентные к лучевой и химиотерапии; рецидивы и метастазы рака, возможность лечения которых традиционными методами исчерпаны; множественные опухоли; сопутствующие заболевания и старческие возрастные изменения, не позволяющие проводить противоопухолевое лечение традиционными методами.

Избирательное накопление некоторых фотосенсибилизаторов в тканях злокачественных новообразований и возможность их обнаружения по характерной флюоресценции составляет основу метода ФД.

Многолетние и обширные исследования в области ФД и ФДТ позволили сформулировать требования, предъявляемые к оптимальному фотосенсибилизатору, который должен обладать следующими свойствами:

- сочетание высоких значений квантового выхода триплетного состояния и времени триплетного состояния для эффективного образования синглетного кислорода;

- поглощение в длинноволновой области спектра с высоким коэффициентом экстинкции для увеличения глубины проникновения света в ткань и поглощения большого количества фотонов;

- высокая селективность накопления в опухолях по сравнению с окружающими нормальными тканями;

- сравнительно быстрое выведение из организма;

- низкая токсичность;

- стабильный и постоянный химический состав;

- технологичность производства;

- устойчивость при хранении.

Наиболее распространенным в клинической практике сенсибилизатором для ФДТ остается производное гематопорфирина, которое производится в ряде стран и имеет различные фирменные названия: Фотофрин I (haematoporphyrin derivative, HPD), Фотофрин II (dihaematoporphyrin ether, DHE, USA), Фотосан III, фотогем (Россия) [26]. В России в клинической практике используется также препарат на основе фталоцианинов - фотосенс. Однако эти фотосенсибилизаторы имеют ряд недостатков:

- относительно невысокую селективность накопления в опухолевой ткани;

- длительное удержание в организме, что является причиной выраженной кожной фототоксичности;

- сложный химический состав;

- поглощение при длине волны 630-670 нм (с низким коэффициентом экстинкции), что позволяет достигнуть при проведении ФДТ биологической эффективности в ткани лишь на глубине ~ 5-10 мм.

Поэтому актуальной задачей современной клинической онкологии является создание новых фотосенсибилизаторов с поглощением в более длинноволновой части спектра, или сходных по фотофизическим свойствам с имеющимися, но обладающих более высокой активностью и более быстрым выведением из организма.

В настоящее время активно исследуются на экспериментальных моделях экзогенные фотосенсибилизаторы различных классов: фталоцианины и нафталоцианины, производные бензопорфирина, феофорбиды и их производные, хлорины, пурпурины и др [9,26]. Проходят различные фазы клинических испытаний такие соединения как: FOSCAN (производное хлорина, Шотдандия), PURLYTIN (производное пурпурина, США), PHOTOCHLOR (производное феофорбида а, Канада), VERTEPORFIN (производное бензопорфирина, Канада) и др [26].

Кроме экзогенных сенсибилизаторов в последние годы широко используется 5-аминолевулиновая кислота (5-АЛК). 5-AJIK является индуктором эндогенного флюорохрома - протопорфирина IX (111 ИХ), который селективно накапливается в опухолевых клетках в результате нарушений в биосинтезе гема. В настоящее время существует один препарат на основе 5-АЖ - LEVULAN (DUSA, США), который проходит II/III фазы клинических испытаний в качестве агента как для ФД, так и для ФДТ. Применение этих методов с 5-АЛК в лечебных учреждениях России затруднено вследствие отсутствия оффицинального препарата. Поэтому разработка отечественного менее дорогостоящего препарата на основе 5-АЛК являлась актуальной задачей.

Одной из важных проблем изучения новых фотосенсибилизаторов является разработка методики проведения оценки их эффективности в опытах на животных. Как у нас в стране, так и за рубежом отсутствуют нормативные документы по доклиническому изучению фотосенсибилизаторов в системе in vivo. Методические рекомендации по предклиническому изучению противоопухолевых препаратов, принятые различными фармакопеями мира, в том числе в России, могут быть использованы лишь частично, так как они не учитывают специфику методов ФД и ФДТ. Исследовательские группы з используют разнообразные модели опухолевого роста, различные параметры светового воздействия, а также различные критерии оценки противоопухолевой эффективности фотосенсибилизаторов при ФДТ, что не позволяет проводить корректное сравнение фотоактивности фотосенсибилизаторов.

Поэтому, на сегодняшний день актуальной задачей является разработка методики, позволяющей проводить оценку эффективности новых фотосенсибилизаторов с целью отбора наиболее перспективной субстанции.

Цели и задачи.

Целью данного исследования является оценка эффективности новых соединений для ФД и ФДТ с помощью разработанных методических подходов in vivo.

Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:

1. разработка методических подходов для оценки эффективности новых соединений на примере известного фотосенсибилизатора — фотосенса;

2. оценка эффективности экзогенных фотосенсибилизаторов классов фталоцианинов (дисульфофталоцианинов цинка и магния, безметального дисульфофталоцианина) и хлоринов (хлорина рб, ацетилхлорина рб и формилхлорина рб);

3. изучение биологической активности нового отечественного препарата «Аласенс» на основе 5-AJIK для ФД и ФДТ злокачественных новообразований.

Научная новизна исследования. В результате проведенных исследований:

- Разработаны методические подходы для оценки эффективности фотосенсибилизаторов в системе in vivo;

- Впервые проведено сравнительное изучение эффективности ряда производных фталоцианинов: дисульфофталоцианинов цинка и магния, безметального дисульфофталоцианина; выявлена высокая фотоактивность безметального дисульфофталоцианина;

- Впервые охарактеризованы производные ряда хлоринов: хлорин рб, ацетилхлорин рб, формилхлорин рб; показано преимущество формилхлорина рб перед другими соединениями по характеру накопления и удержания в опухолевой ткани в совокупности с его высокой фототоксичностью и быстрым выведением из организма животных.

Практическая ценность.

- Разработанные методические подходы могут быть использованы для оценки эффективности новых фотосенсибилизаторов in vivo в скрининговой системе, а также для проведения предклинических испытаний.

Данные о биораспределении и специфической активности «Аласенс»-индуцированных протопорфиринов включены в Фармакопейную статью. Препарат «Аласенс» находится в настоящее время на II фазе клинических испытаний.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на семинарах отделения модификаторов и протекторов противоопухолевой терапии МНИОИ им. П.А.Герцена; International Symposium on Biomedical Optics, г. Вена (1996); на II Всероссийской конференции фотобиологов г.Пущино (1998); на международном научном форуме "Онкология на рубеже XXI века. Возможности и перспективы" (1999); на конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» МНИОИ им. П.А.Герцена (1999); на II конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» ММА им. И.М.Сеченова (2001).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, подана 1 заявка на изобретение.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Введение

В последнее время во многих странах мира, в том числе и в России, интенсивно разрабатываются новые методы диагностики и консервативного лечения злокачественных новообразований. Среди них особое место занимают флюоресцентная диагностика и фото динамическая терапия, основанные на применении природных и синтетических фотосенсибилизаторов[9,26]. Несомненным преимуществом метода ФДТ перед другими методами лечения злокачественных новообразований (химиотерапия, лучевая терапия и др.) является локальное воздействие на опухоль без повреждения здоровых тканей, обусловленное повышенной концентрацией фотосенсибилизатора в опухоли.

100 лет назад студент Мюнхенского Фармакологического института О. Рааб впервые показал, что окрашенные акридином, эозином и другими красителями клетки парамеции гибнут при освещении [120]. Это явление было описано в статьях Рааба и Таппайнера в 1990 году. Таппайнер назвал это явление «фотодинамическим действием». Было показано, что фотодинамически активные красители интенсивно флюоресцируют, а глубина поражения опухолевых тканей соответствует спектру поглощения красителя [25]. Спустя 25 лет А.Поликард в своих работах сделал сообщение о способности эндогенных порфиринов накапливаться в опухолях как животных, так и человека, и флюоресцировать при облучении светом [117]. В 1960-66 гг. Липсоном была показана возможность использования для диагностики и лечения злокачественных опухолей производного гематопорфирина [85,86].

Позже в конце семидесятых - в начале восьмидесятых годов ряд исследователей (T.Dougherty, J. Moan et al.) использовали данный препарат для разработки нового метода в онкологии - ФДТ рака [43,44,99]. Положительный эффект, полученный при лечении больных с опухолями различных локализаций методом ФДТ, а также перспективность использования фотосенсибилизаторов для диагностики и лечения злокачественных новообразований стимулировало многочисленные исследования в этом направлении.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Фомина, Галина Ивановна

Выводы.

1. Для скрининга новых фотосенсибилизаторов отработаны две модели опухолевого роста, характеризующиеся высокой прививаемостью, локальностью и равномерным ростом опухолевых узлов. Это - солидные варианты опухоли Эрлиха и Р-388, прививаемые, соответственно, в подлопаточную область спины животного (500±250 тыс. кл/мышь) и в область икроножной мышцы на внешней стороне задней лапы (750±250 тыс. кл/мышь). Исследование кинетики роста опухоли показало, что ФДТ целесообразно проводить на 6-ой день после инокуляции опухолей Эрлиха и Р-388, когда диаметры опухолевых узлов, равные 0,6±0,1см и 0,5±0,1 см, соответственно, не превышают глубину проникновения в ткань света соответствующей длины волны.

2. Для оценки эффективности фотосенсибилизаторов в скрининговой системе in vivo разработана методика, включающая два обязательных этапа: 1-ый -изучение кинетики биораспределения фотосенсибилизатора при различных дозах в органах и тканях животного методом флюоресцентного анализа с целью выявления оптимального временного интервала между введением фотосенсибилизатора и облучением; 2-ой - исследование противоопухолевой эффективности ФДТ при различных дозах флюорохрома и условиях облучения с целью выявления безопасных и эффективных режимов.

3. Производные фталоцианинов ZnPcS2, MgPcS2 и H2PcS2 селективно накапливаются в опухолевой ткани с константой селективности: 9,0±0,7 у.е., 6,0±0,6 у.е. и 5,0±0,8 у.е., соответственно. Через 96 часов после введения фотосенсибилизаторов уровень флюоресценции в тканях снижался на 50%-70%.

4. ZnPcS2, MgPcS2 и H2PcS2 проявляли противоопухолевую активность при ФДТ в отношении опухолей Эрлиха и Р-388, что выражалось в стойком торможении роста опухоли в зависимости от дозы флюорохрома и дозы света. При проведении ФДТ с 2пРс82, ]\^Рс82 и Н2Рс82 наблюдалась гибель животных на ранние сроки после ФДТ при высоких дозах фотосенсибилизатора или дозах света, обусловленная общей токсичностью, которая коррелировала с противоопухолевой активностью фотосенсибилизаторов;

5. Сравнение 7пРс82, М§Рс82 и Н2Рс82 и фотосенса по противоопухолевой эффективности при ФДТ показало, что Н2Рс82 наиболее активен как фотосенсибилизатор, в то время как 2пРс82, ]У^Рс82 и фотосенс имеют сходную фотоактивность;

6. Хлорин рб и его производные ацетилхлорин рб и формилхлорин рб селективно накапливаются в опухолевой ткани. При этом, наиболее высокий флюоресцентный контраст и длительное удержание в опухоли наблюдался при применении формилхлорина рб. Через 96 часов после введения пигментов флюоресценция в тканях не регистрировалась;

7. Формилхлорин рб проявлял высокую противоопухолевую эффективность при ФДТ в широком диапазоне доз фотосенсибилизатора (от 5 мг/кг до 25 мг/кг) при отсутствии токсических эффектов;

8. Новый отечественный препарат «Аласенс» на основе 5-АЛК вызывает повышение уровня эндогенных протопорфиринов в опухоли и угнетение роста опухоли при ФДТ, как при пероральном, так и при аппликационном применении препарата.

Заключение.

Задачами данного исследования являлись разработка методических подходов для оценки эффективности новых фотосенсибилизаторов; скрининг ряда новых соединений, относящихся к двум различным классам фталоцианинов и хлоринов, с целью отбора наиболее перспективного фото сенсибилизатора; оценка эффективности нового отечественного препарата "Аласенс" на основе 5-аминолевулиновой кислоты, предназначенного для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии злокачественных новообразований.

Анализ литературы показывает, что отсутствуют единые методические подходы, предназначенные для систематического изучения новых фотосенсибилизаторов. Используются различные модели опухолевого роста, равно как и различные методы оценки биораспределения и эффективности фотодинамического воздействия.

Для наших исследований мы выбрали простые опухолевые модели, широко использующиеся в химиотерапии для первичного отбора цитостатиков. Это - солидные варианты опухолей Эрлиха и Р-388, обладающих рядом преимуществ: высокой прививаемостью, равномерным ростом опухолевого узла, чувствительностью к широкому спектру противоопухолевых препаратов. Кинетика роста опухолей показала, что подкожная прививка опухоли Эрлиха в количестве 500±250 тыс. кл/мышь и Р-388 в количестве 750+250 тыс. кл/мышь позволяет получить 100% выход локальных (с наименьшим разбросом среднего объема) опухолей с размерами, не превышающими глубину проникновения оптического излучения в ткань: 0,3±0,1 см.

Прививка опухоли Эрлиха в подлопаточную область на спину животного, а Р-388 - в область икроножной мышцы на внешную сторону задней лапы, создает условия для проведения успешной ФДТ: данные локализации удобны для подведения света и, в то же время, позволяют максимально исключить повреждения внутренних органов при фото динамическом воздействии. На данных моделях с использованием известного фотосенсибилизатора -фотосенса были отработаны методики оценки флюоресцентных и фототоксических свойств фотосенсибилизаторов.

Проведены сравнительные эксперименты с использованием различных условий регистрации флюоресценции: in vivo (через кожу) и ex vivo (с внутренней поверхности кожного лоскута, с разреза опухоли). Показано, что для оценки флюоресцентных свойств фотосенсибилизаторов при регистрации флюоресценции красителя в опухолевом очаге целесообразно использовать метод ex vivo, так как он позволяет получать более точные значения уровней флюоресценции и константы селективности, так как появляется возможность проводить регистрацию спектров с различных участков всей опухоли.

С помощью данного способа регистрации было проведено исследование биораспределения фотосенса в организме мышей с опухолями Эрлиха и Р-388. Сравнение полученных данных показало, что природа опухоли не оказывает влияние на характер распределения красителя в нормальных тканях и органах. Фотосенс селективно накапливался как в опухоли Эрлиха, так и в Р-388, однако, уровень накопления флюорохрома в данных опухолях и скорость его выведения из опухолевой ткани несколько различались. Обобщение полученных данных позволяет сделать вывод, что сравнительную оценку селективности накопления фотосенсибилизаторов в опухоли необходимо проводить на одинаковых моделях опухолевого роста, но для скрининга новых фотосенсибилизаторов возможно проведение флюоресцентного анализа на одной опухоли. При этом целесообразно использование дозы флюорохрома, позволяющей надежно регистрировать флюоресценцию без дополнительной математической обработки спектров.

По результатам наших исследований для фотосенса отмечена высокая константа селективности (Кс). Это объясняется низким накоплением фотосенса в тканях кожи и мышцы, относительно которых определяли величину Кс. При этом, по данным литературы, при использовании ортотопических моделей фталоцианины накапливаются в нормальных тканях в одинаковых или больших количествах, по сравнению с опухолевыми [34]. Это было подтверждено также нами при изучении накопления фотосенса в опухоли RS1 (альвеолярный рак печени), привитой в одну из долей печени (величина Кс составила 1-2 у.е.). Таким образом, при использовании опухолей Эрлиха и Р-388 не всегда можно провести корректную оценку флюоресцентных свойств фотосенсибилизаторов как агентов для ФД. Однако, флюоресцентный анализ распределения флюорохромов в тканях мы полагаем необходимым для определения оптимального временного интервала между введением фотосенсибилизатора и облучением, с одной стороны, для достижения максимального противоопухолевого эффекта, с другой стороны, для максимального исключения фотоиндуцированного повреждения нормальных тканей.

Показано, что опухоль Эрлиха и Р-388 чувствительны к фотодинамическому воздействию с фотосенсом. При оптимальных режимах воздействия величина критерия активности на модели опухоли Эрлиха достигала 60%, ТРО на модели Р-388 достигало 90%. Показано, что противоопухолевый эффект ФДТ возрастал с увеличением доз фотосенсибилизатора (от 1 до 2 мг/кг для карциномы Эрлиха и от 2 до 5 мг/кг для лейкоза Р-388) и дозы света (от 25 до 100 Дж/см2 для карциномы Эрлиха и от 200 до 400 Дж/см для лейкоза Р-388).

Отмечена обратная зависимость противоопухолевой эффективности ФДТ с фотосенсом от плотности мощности (от 50 до 170 мВт/см ). Полученные результаты согласуются с данными Rezzoug с соав., которые на ксенографтах аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29, привитых бестимусным мышам, также наблюдали снижение противоопухолевой эффективности мезотетра-т-гидроксифенилхлорина еб при ФДТ с увеличением плотности мощности от 50 до 150 мВт/см при постоянной плотности энергии. Авторы предполагают, что в случае применения излучения низкой интенсивности действуют два повреждающих опухоль фактора: прямое фототоксическое и опосредованное вазоконстриктивным эффектом повреждение опухолевых клеток. При высокой интенсивности оптического излучения вероятно на первых минутах облучения происходит повреждение кровеносных сосудов опухоли, наступает гипоксия и дальнейшее облучение уже не эффективно [126]. Более того, имеются данные о том, что при высокой интенсивности излучения быстро повреждаются клетки иммунной системы, инфильтрирующие опухоль и, таким образом, элиминируется часть противоопухолевого эффекта, обусловленного цитотоксичностью иммунокомпетентных клеток [41,67,124,125,160].

В наших исследованиях выявлено, что с увеличением дозы препарата, дозы света и плотности мощности увеличивается частота гибели мышей от фототоксического шока. Гибель животных от общей токсичности после ФДТ может указывать на то, что вещество обладает фототоксическими свойствами, но нет вероятности, что оно будет оказывать фотоинду цированный противоопухолевый эффект in vivo. Поэтому, целесообразно определять противоопухолевую эффективность ФДТ, используя переносимые дозы флюорохрома и режимы облучения. В нашем случае при использовании фотосенса в дозе 5 мг/кг при ФДТ в отношении опухолей Эрлиха и Р-388 в одинаковых условиях эксперимента наблюдали гибель 88% и 0%, соответственно. Это указывает на возможность использования более широкого диапазона переносимых доз фотосенсибилизатора при оценке фотоиндуцированного противоопухолевого эффекта.

Таким образом, в результате проведенного исследования были адаптированы две модели опухолевого роста: опухоль Эрлиха и лейкоз Р-388 к условиям фотодинамического воздействия, отработана методика изучения фотосенсибилизаторов в скрининговой системе in vivo, включающая два этапа: флюоресцентный анализ фотосенсибилизатора в опухолевых и нормальных тканях животного, а также фотоиндуцированную эффективность фотосенсибилизатора. Показано, что на указанных опухолевых моделях сохраняются основные закономерности, описанные для экспериментальной

ФДТ в литературе [19,30,70,104,118,123,126], что делает эти модели пригодными для скрининга и изучения эффективности новых фотосенсибилизаторов in vivo.

Отработанные методические подходы были апробированы при скрининге ряда новых соединений двух различных классов - фталоцианинов и хлоринов.

В числе фталоцианинов были изучены Zn-замещенный сульфофталоцианин (ZnPcS2), а также новые соединения - MgPcS2 и H2PcS2. Идентичное содержание сульфогрупп (~ 80% дисульфопроизводных) в составе данных соединений, позволяло корректно оценить зависимость эффективности фотосенсибилизаторов фталоцианинового ряда от координационого атома металла. Как препарат сравнения в исследованиях использовали фотосенс (сульфофталоцианин алюминия), проходящий в настоящее время клинические испытания.

Изучение биораспределения данных соединений в тканях мышей с опухолью Эрлиха показало, что все они селективно накапливаются в опухолевой ткани. По величине Кс выше указанные красители распределялись в следующем порядке: фотосенс > ZnPcS2 > MgPcS2 > H2PcS2. По характеру биораспределения в нормальных тканях фотосенс, ZnPcS2, MgPcS2, H2PcS2 практически не отличались друг от друга. Отмечался наиболее высокий уровень нормированной флюоресценции в печени, почках и селезенке, меньший уровень - в окружающих тканях: мышце, коже. Следует отметить, что, несмотря на понижение уровня флюоресценции в тканях на срок 48 часов после введения фотосенсибилизаторов, его величина оставалась достаточно высокой (30%-50%). Полученные данные согласуются с данными литературы о медленном выведении фталоцианиновых соединений из тканей [33,63].

Показано, что опухоли Эрлиха и Р-388 чувствительны к фотодинамическому воздействию при использовании ZnPcS2, MgPcS2 и H2PcS2 в качестве фотосенсибилизаторов, при этом, эффективность ФДТ зависит от дозы красителя, дозы света и режимов облучения.

Эффективность ФДТ с данными красителями убывает в следующей последовательности: H2PcS2 > ZnPcS2 > MgPcS2. Безметальный комплекс дисульфофталоцианина более активен как фотосенсибилизатор, в то время как фотосенс, дисульфофталоцианины цинка и магния проявляют сходную противоопухолевую активность при ФДТ. Результаты, полученные нами при изучении эффективности дисульфофталоцианина цинка, согласутся с данными литературы об фотоиндуцированной эффективности ZnPcS2 [31,32,113]. Это еще раз подтверждает адекватность использования выбранных моделей опухолевого роста и отработанных на них методик оценки эффективности фотосенсибилизаторов.

Высокая противоопухолевая активность H2PcS2 при ФДТ (возможность достижения более высокого противоопухолевого эффекта по сравнению с фотосенсом, ZnPcS2 и MgPcS2), а также способность поглощать в более длинноволновой части спектра (А,=695 нм) позволяют отнести новый фотосенсибилизатор H2PcS2 к перспективным субстанциям и рекомендовать его для углубленного изучения.

Далее нами была проведена оценка эффективности ряда сенсибилизаторов, принадлежащих к классу хлоринов: хлорина рб (Хл) и его производных: ацетилхлорина рб (аХл) и формилхлорина рб (фХл).

Изучение биораспределения данных соединений в организме мышей с опухолью Эрлиха показало их быстрое, по сравнению со фталоцианинами, выведение. В отличие от хлорина рб и ацетилхлорина рб, наиболее высокий флюоресцентный контраст и длительное удержание в опухоли наблюдается при применении формилхлорина рб.

На основании спектральных свойств фотосенсибилизаторов и данных по изучению фототоксичности хлорина рб и его производных in vitro, полученных в нашей лаборатории, для оценки эффективности был отобран только формилхлорин рб.

Показано, при ФДТ с использованием формилхлорина рб при оптимальных дозах пигмента и режимах облучения величина ТРО опухоли Эрлиха составляет 91%, величина ТРО Р-388 достигает 72%. Как и при использовании сульфофталоцианинов, противоопухолевая эффективность ФДТ с фХл в отношении опухоли Эрлиха зависела от дозы фотосенсибилизатора. Также выявлено повышение эффективности ФДТ при снижении плотности мощности.

Высокая противоопухолевая эффективность ФДТ с формилхлорином рб, его способность поглощать в более длинноволновой части спектра, а также быстрое выведение из организма (через 96 часов после введения флюоресценция в тканях и органах практически не обнаруживается) позволяют отнести новый фотосенсибилизатор формилхлорин рб к перспективным субстанциям и рекомендовать его для углубленного изучения.

На моделях опухоли Эрлиха и Р-388 с использованием разработанных методических подходов было проведено изучение биологической активности нового отечественного препарата "Аласенс" на основе 5-АЛК для флюоресцентной диагностики и фотодинамической терапии злокачественных новообразований. Показано, что введение «Аласенса» вызывает повышение уровня протопорфирина IX в ткани опухоли (с флюоресцентным контрастом -3,0±0,2 и 6,0±0,3 у.е., соответственно).

Охарактеризовано накопление и распределение 5-АЛК-индуцированного ПП1Х в тканях мышей с опухолью Р-388 после введения "Аласенса" как при системном (внутрь), так и при местном (аппликационном) его использовании. Показана эффективность ФДТ с «Аласенсом» в отношении опухоли Эрлиха при местном применении в составе мази (в дозах 7,5 и 30 мг/см2) и при применении внутрь (в дозе 500 мг/кг). При этом, эффективность ФДТ зависела от дозы препарата и от режима облучения. Полученные нами данные согласуются с данными литературы [23,42,65,70,118,122,141,142] и свидетельствуют о подобной специфической активности нового отечественного препарата "Аласенс" с его зарубежным аналогом - ЬЕУЦЬАМ (Би8А,118А), а также субстанциям 5-AJIK фирм "Sigma Chemical Со" (St. Louis, МО) и "Medoc" (Gamburg, Germany).

Таким образом, препарат "Аласенс" может быть использован для ФД и ФДТ злокачественных новообразований. Полученные данные, вошли в отчет по специфической активности субстанции 5-AJIK и препарата "Аласенс", представленный в Фармакологический Комитет. Препарат в настоящее время проходит II фазу клинических испытаний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фомина, Галина Ивановна, 2001 год

1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. // Программируемая клеточная смерть (апоптоз).//Рос.Онк. журнал, 1996, №1, с.58-61.

2. Белушкина H.H., Хасан Хамад А., Северин С.Е. // Молекулярные основы апоптоза. // Вопр. биол., мед. и фармац. химии, 1998, №45 с.15-24.

3. Доненко Ф.В. Резистентность опухолей к проводимому лечению и пути ее преодоления. Дисс. на соиск. уч. ст. д.м.н., Москва, 1994.

4. Жаркова H.H. // Лазерно-флюоресцентные исследования фотосенсибилизаторов в онкологической диагностике. Диссертация на соискание уч.степени к.ф.м.н. Москва, ИОФ РАН, 1992.

5. Зорин В.П., Хлудеев И.И., Горбацевич В.Н. // Механизмы проникновения и локализации производных порфирина в опухолевой ткани // В сб.: Современное состояние и перспективы развития фармакокинетики. III Всесоюз. конф. по фармакокинетике, 1991,с.98

6. Красновский A.A. // Синглетный молекулярный кислород и первичные механизмы фотодинамического действия оптического излучения // Итоги науки и техники,-1992.-t.3.-c.63-132.

7. Кузнецов C.B. // Апоптоз и некоторые механизмы его регуляции // Пробл. гематол. и переливания крови , 1998, №2, с 22-27.

8. Лукьянец Е.А. // Новые сенсибилизаторы для фото динамической терапии // Росс. хим. журнал №5, т. XLII, 1998.

9. Миронов А.Ф. // Фотосенсибилизаторы на основе порфиринов и родственных соединений для фотодинамической терапии рака.//Итоги науки и техники.-1990.-Т.З.-С.5-63.

10. Ю.Певницкий Л.А. // Программированная гибель клеток и апоптоз: значение для развития и функционирования иммунной системы // Вестник Росс. Акад. Мед. Наук, 1996, №6 с. 43-50.

11. Соколов В.В., Филоненко Е.В., Савинкин Ю.Н. и др. // Эндоскопическая лазерная хирургия и ФДТ больных со злокачественными опухолями органов дыхания и пищеварительного тракта: метод, рекомендации, М 1997.

12. Фут X. // Свободные радикалы в биологии // Под. Ред. Прайор. М: Мир -1979, т.2, С96-150

13. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В. и др.// Современные возможности и перспективы эндоскопической хирургии и ФДТ злокачественных опухолей // Российский онкологический ж-л, №4: 4-12, 1998

14. Чиссов В.И., Соколов В.В., Филоненко Е.В., Мененков В.Д., Жаркова H.H., Козлов Д.Н., Поливанов Ю.Н., Прохоров A.M., Пыхов Р.Л., Смирнов В.В. Хирургия, 1995, т.5, п. 37-41.

15. Экспериментальная оценка противоопухолевых препаратов в СССР и США. 1980., М., Медицина. С. 71-106.

16. Якубовская Р.И., Казачкина Н.И., Кармакова Т.А., Шитова Л.А. и др. Скрининг и медико-биологическое изучение новых отечественных фотосенсибилизаторов. // Росс. хим. ж. t.XLII, №5: 17-23, 1998.

17. Abels C., C.Fritsch, K.Bolsen et al // PDT with 5- aminolevulinic acid-induced porphyrins of an amelanotic melanoma in vivo // Photochem. Photobiol. 40:7683, 1997.

18. Abels C., P.Heil, M.Dellian et al.// In vivo kinetics and spectra of 5-aminolevulinic acid-induced fluorescence in an amelanotic melanoma of the hamster//Br.J.Cancer 70:826-833, 1994.

19. Agarwal M.L., Larkin H.E., Zaidi S.I.A. et al // Phospholipase activation triggers apoptosis in photosensitized mouse lymphoma cells / Cancer Res., 53: 5897-5902, 1993.

20. Athar M., Elmets C., Bickers D. Et al // A novel mechanism for the generation of superoxide anions in photosensitization // J. Clin.Invest.83:l 137-1143, 1989.

21. Bedwell J., A.MacRobert, D.Phillips et al.// Fluorescence distribution and photodynamic effect of ALA-induced PPIX in the DMH rat colonic tumor model //Br. J.Cancer 65:818-824, 1992.

22. Berg K., A. Western, J.Bommer et al.// Inracellular localization of photoactivated sulfonated meso-tetraphenylporphines in a human cell line // Photochem. and Photobiol. 52: 481-487,1990.

23. Blum H.F. // Photodynamic action and diseases caused by light // Hafner Publishing Co., New York 1964.

24. Bonnett R// Chemical aspects of PDT. 2000

25. Boogert J., R.van Hillegersberg, F.Rooij et al. // 5-ALA- induced protoporphyrin IX accumulation in tissues: pharmacokinetics afterboral or intravenous administration // J.Photochemistry and Photobiology. 1998. - B. Biol. - Vol. 44 -P.29-38.

26. Bown S., C.Tralau, P.Coleridge et al.// PDT with porphyrin and phthalocyanine sensitization: Quantitative studies in normal rat liver // Br. J. Cancer 54: 43-52, 1986.

27. Brasseur N., H.Ali, R.Langlois et al.// Biological activities of phthalocyanines. PDT of EMT-6 mammary tumors in mice with sulfonated phthalocyanines // Photochem. and Photobiol. 45: 581-586,1987.

28. Cairnduff F., D.Roberts, B.Dixon et al.// Response of a rodent fibrosarcoma to PDT using 5-ALA or polyhaematoporphyrin // Int. J. Radiat Biol. 67:93-99, 1995.

29. Canti G., P.Franco, O.Marelli et al.// Comparative study of the therapeutic effect of photoactivated hematoporphyrin derivative and aluminum sulfonated phthalocyanines on tumor bearing mice // Cancer Lett. 53: 123-127, 1990.

30. Chan W., J.Marshall, I.Hart // PDT of murine tumor following sensitization with chloro aluminum sulfonated phthalocyanine // Photochem. and Photobiol. 46: 867-871,1987.

31. Chan W., J.Marshall, G.Lam et al.// Tissue uptake, distribution and potency of the photoactivatable dye chloroaluminum sulfonated phthalocyanine in mice bearing transplantable tumors // Cancer Research, 48: 3040-3044, 1988.

32. Chan W., J.Marshall, I.Hart //Effect of location on selective uptake and retention of phthalocyanines // Cancer Lett 44: 73-77, 1989.

33. Chan W., J.Marshall, P.Svensen et al.// Effect of sulfonation on the cell and tissue distribution of the photosensitizer aluminum phthalocyanine // Cancer Research, 50: 4533-4538, 1990.

34. Chan W., N.Brasseur, C.La Madeleine et al.// Efficacy and Mechanism of Aluminium Phthalocyanine and its Sulphonated Derivatives Mediated Photodynamic Therapy on Murine Tumours // European Journal of Cancer, v. 33, 11, pp. 1855-1859, 1997.

35. Chang S., A.MacRobert, S.Bown et al.// Interstitial PDT of canine prostate with meso-tetra-(m-hydroxyphenyl) chlorin and 5-ALA: a preliminary study // SPIE 2625-78, 1995.

36. Chatterjee, Shampa R.; Murugesan, S.; Kamat, J.P. et al // Photodynamic effects induced by meso-tetrakis4-(carboxymethyleneoxy)-phenyl.porphyrin using rathepatic microsomes as model membranes./ Arch. Biochem. Biophys., 339 (1): 242-249, 1997.

37. Chen J., N. Mak, J.Wen et al. // A comparison of the photodynamic effects of Temoporfm (mTHPC) and MC540 on leukemia cells: efficacy and apoptosis // J.Photochemistry and Photobiology. 1998. - B. Biol. - Vol. 68(4). - P.545-554.

38. Cincotta L., J.W.Foley, A.H.Cincotta // Phototoxicity, redox behavior and pharmacokinetics of benzophenoxazine analogues in EMT-6 murine sarcoma cells // A.W.Hemming, N.L.Davis, B.Dubois et al.// Cancer Research 53: 2571-2580, 1993.

39. Crane S., Zuk M., Newman H. et al.// Tissue distribution of chloroaluminum sulfonatedphthalocyanine indogs//Proc. SPIE 1065: 182-189, 1989

40. Dougherty T.J., Boyle D.G.,Weishaupt K.R. // Photoradiation therapy of human tumors // in: "The Science of Photomedicine", J.D.Regan and J.A.Parrish eds., Plenum Press, New York 1982, p 625

41. Dummin H., Th.Cernay, H.W.Zimmermann //Selective photosensitization of mitochondria in HeLa cells by cationic Zn(II)phthalocyanines with lipophilic side-chains // Photochem. and Photobiol. 37: 219-229, 1997.

42. El Far M., Seteite A., El-Maadawy M. // Photodynamic therapy with aminolevulinic acid and meso-tetra-hydroxy phenyl chlorin.// Proc. SPIE.-1994.-V.2371.-P.236-242.

43. El-Far M., M.Ghoneim, E.Ibraheim //Biodistribution and selective in vivo tumor localization of endogenous porphyrins induced and stimulated by 5-aminolevulinic acid: a newly developed technique // J. Tumor Marker Oncol. 5:27-34, 1990.

44. Evensen J., J.Moan // A test of different photosensitizers for photodynamic treantment of cancer in a murine tumor model / Photochem. and Photobiol. 46 (5): 859-865, 1987.

45. Feofanov A., T.Karmakova, A.Grichine et al. // Distribution and interactions of photosens in murine ehrlich carcinoma fluorescent spectral imaging approach // Conference on fluorescence microscopy and fluorescent probes, 1999

46. Fernanda Richelli, Jori Giulio.// Faktor influencing the distribution pattern of porhyring in cell membranes // J.Photochem.and Photobiol. B., 1990, V.6, N 1-2,P.69-77.

47. Fingar V.H., Wieman T.J., Doak K.W.// Mechanistic studies of PDT-induced vascular damage: evidence that eicosanoids madiate this process // Int. J. Radiat. Biol.,1991, 60, N l-2,P.303-309.

48. Fischer F., W.Maier-Borst, W.Lorenz // PDT as a tool for suppressing the haematogenous dissemination of tumour cells // J.Photochemistry and Photobiology. 1998. - B. Biol. - Vol. 43 - P.27-33.

49. Fukuda H., A.Casas, F.Chueke et al. /Photodynamic action of endogenously synthesized porphyrins from ALA, using a new model for assaying the effectiveness of tumoral cell killing///Int.J.Biochem 25:1395-1398, 1993.

50. Fukuda H., S.Paredes, A.Batlle // In vivo studies using free and liposome encapsulated ALA // Comp.Biochem.Physiol. 102B:433-436, 1992.

51. Fukuda H., S.Paredes, A.Casas et al.// Potential of liposome-entrapped ALA in cancer therapy. Effect of prior injection of empty liposomes and different routes of administration // Cancer 5:295-299, 1992.

52. Gannon M.J., Vernon D.I., Holroyd J.A. // PDT of endometrium using ALA.// Proc. SPIE.-1997.-V.2972.-P.2-13.

53. Geiger P.G., W.Korytowski, A.W.Girotti // Photodynamically generated 3(3-hydroxy-5a-cholest-6-ene-5-hydroperoxide: toxic reactivity in membranes and susceptibility to enzymatic detoxification / Photochem. and Photobiol. 62: 580587, 1995.

54. Gelfond M., A.Barchuk, J.Mizgireuv et al.//Photodynamic and selective therapy. Experemental and clinical study // SPIE 2625:453-456, 1995.

55. Gibson S., J.Havens, T.Foster et al. // Timr-dependent intracellular accumulation of 5-ALA, induction of porphyrin synthesis and subsequent phototoxicity // J.Photochemistry and Photobiology. 1997. - B. Biol. - Vol. 65(3). - P.416-421.

56. Grant W.E., Hopper C., MacRobert A.J.et al. // Photodynamic therapy of oral cancer: photosensitisation with systemic aminolevulinic acid.// Lancet.-1993.-V.142.- P. 147-148.

57. H.L.van Leengoed, J.J.Schuitmaker, N.van der Veen et al.// Fluorescence and photodynamic effects of bacteriochlorin a observed in vivo in "sandwich" observation chambers // British J. of Cancer 67:898-903, 1993.

58. H.S. de Bruijn, N. van der Veen, W.M. Star, et al. Protoporphyrin IX fluorescence kinetics after 5-Amino-laevulinic-acid application on tape-stripped human skin (preliminary conclysion) // Abstact book. SPIE. Barselona, 1995. - P.72.

59. H.van Leengoed, N.van der Veen, A.Versteeg et al.// In vivo fluorescence kinetics of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of silfonation // Photochem. and Photobiol. 58 (2): 233-237, 1993.

60. Hemming A.W, N.L.Davis, B.Dubois et al.// PDT of squamous cell carcinoma. An evaluation of a new photosensitizing agent, benzoporphyrin derivative and new photoimmunoconjugate// Surgical Oncology 2: 187-196, 1993.

61. Henderson В., L.Vaughan, D.Bellnier et al.// Photosensitization of murine tumor, vasculature and skin by using 5- aminolevulinic acid-induced porphyrin // Photochem. Photobiol. 62:780-789, 1995.

62. Henderson B.W.// Biological background and implications of vascular damage in PDT. //Lasers Surg and Med.,1994,N6. P.39.

63. Hendrzak-Henion J., Knisely Т., Cicotta 1.// Role of the immune system in mediating the antitumor effect of benzophenothiazine PDT // Photochem. Photobiol. 69 (5):575-581, 1999.

64. Hetts S.W. // Умирать или не умирать // JAMA Russia, 1998, v.l - p. 12-25.

65. Hovanessian V., A.Lalaian //Laser fluorescence investigation of chlorin e6 pharmacokinetics // SPIE 2924: 125-129

66. Hua Z., S.Gibson, T.Foster et al.// Effectiveness of delta-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin as a photosensitizer for PDT in vivo// Cancer Res. 55:1723-1731, 1995.

67. Huber R.M., Gamarra A., Leberig H. Et al. // Inhaled 5-aminolevulinic acid (ALA) for photodynamic diagnosis and early detection of bronchial tumors: first experience in patients.// Abstract Book of 6th IPA meeting, Melburne, Australia.-1996.

68. J.C.Kennedy and R.H.Pottier. Endogenous protoporphyrin IX, a clinically useful photosensitizer for photodynamic therapy // J.Photochemistry and Photobiology. -1992. B. Biol. - Vol. 14. - P.275-292.

69. Johnson P., Bellnier D., Henderson et al. // Combination PDT targeting vessels and tumor cells using anionic and cationic photosensitizers // Photochem. Photobiol. 57:50, 1993.

70. Jori G., C.Fabris // Relative contributions of apoptosis and random necrosis in tumour response to PDT: effect of the chemical structure of Zn(II)-phthalocyanines//.//Photochem. and Photobiol. 47: 181-185, 1998.

71. Kessel D., H.H.Sun // Enhanced responsiveness to PDT-induced apoptosis after mitochondrial DNA depletion // J.Photochemistry and Photobiology. 1999. - B. Biol. - Vol. 70(6). - P.937-940.

72. Kessel D., K.Woodburn, C.Gomer et al.// Photosensitization wich derivatives of chlorin p6. //Photochem. and Photobiol. 28: 13-18, 1995.

73. Kessel D., Yu Luo / Mitochondrial photodamage and PDT-induced apoptosis./ Photochem. and Photobiol. 42: 89-95, 1998.

74. Kimel Sol, Gottfried Varda, Berns M.W.// Vascular response in photodynamic therapy // Lasers Surg.and Med.,1994, Suppl N 6,P.39

75. Kondo, M., N Hirota, T. Takaoka et.al.// Heme biosyntetic enzyme activities and porphyrin accumulation in normal liver and hepatoma cell line of rats. // Cell Biol. Toxicol, 1993, 9, 95-105.

76. Kriegmair M., Baumgartner R., Knuechel R., et al. //Detection of early bladder cancer by 5-aminolevulinic acid induced porphyrin fluorescence.// J.Urol.-1996,-V.155.-P. 105-110.

77. Leibovici, L., N. Schoenfeld, H.A. Yehoshua et.al.// Activity of porphobilinogen deaminase in peripheral blood mononuclear cells of patients with metastatic cancer .//Cancer, 1988, 62, 2297-2300.

78. Lin S.C., C.P.Lin, J.R.Feld et al // The photodynamic occlusion of choroidal vessels using benzoporphyrin derivative // Current Eye Research 13: 513-522, 1994.

79. Lipson R.L., Baldes E.J., Olsen A.W J/ A further evaluation of the use of hematoporphyrin derivative as a new aid for the endoscopic detection of malignant disease // Dis. Chest., 1964, vol.46, p 676

80. Lipson R.L., Baldes E.J., Olsen AN JI The use of a derivative of hematoporphyrin in tumor detection// J.Natl.Cancer Inst, 1961, vol.26, pp. 1-8.

81. Lofgren L., A.Ronn, M.Nouri et al. // Efficacy of intravenous delta-aminolevulinic acid PDT on rabbit papillomas // Br. J.Cancer 72:857-864, 1995.

82. Loh C., A.MacRobert, J.Regula et al. // Oral vs. i.v. administration of 5-ALA // Br.J.Cancer 68:41-51, 1993.

83. Losev A.P., I.Nichiporovich // The energetics of chlorines a potent photosensitizers of PDT// SPIE 2924:40-49.

84. Malik Z., G.Kostenich, L.Roitman et al.// Topical application of 5-ALA, DMSO and EDTA: protoporphyrin IX accumulation in skin and tumours of mice // Photochem. Photobiol. 28:213-218, 1995.

85. Malik Z., M.Dishi, Y.Garini //Fourier transform multipixel spectroscopy and spectral imaging of protopoiphyrin in single melanoma cells // Photochem. Photobiol. 63:608-614,1996.

86. Malik Zvi, Faraggi Ariela // Ultrastructural damage in photosensitizer endothelial cells: dependence on hematoporphyrin delivery pathways.// J. Photochem. and Photobiol. B., 1992, V.14,N 4 , P.359-368.

87. Marcus S.L., Sobel R.S., Golub A.L. et al. //Photodynamic therapy (PDT) and photodyagnosis (PD) using endogenous photosensitisation induced by 5-aminolevulinic acid (ALA): current clinical and development status.// Proc. SPIE.-1996.-V.2675.-P.32-42.

88. Margaron P., M-J.Gregoire, V.Scasnar et al.// Structure-photodynamic activity relationships of a series of 4-substituted zinc phthalocyanines // Photochem. and Photobiol. -63, №2: 217-223,1996.

89. Margaron P., R.Boyle, R.Ouellet et al.// PDT with topical phthalocyanine formulations on intradermally transplanted EMT-6 tumors in Balb/c mice // PDT and Biomedical Lasers 850-854.

90. Marshall J., W.Chan, I.Hart // Effect of PDT on anti immune defenses: comparison of the photosensitizers hematoporphyrin derivative and chloro aluminum sulfonated phthalocyanine // Photochem. and Photobiol. 49: 627632,1989.

91. Maziere J., R.Santus, P.Morliere // Cellular uptake and photosensitizing properties of anticancer porphyrins in cell membranes and low and high density lipoproteins // Photochem. And Photobiol. ,6 (1-2): 61-68,1990

92. Milanesi C., C.Zhou, R.Biolo, G.Jori // Zn(II)-phthalocyanine as a photodynamic agent for tumours. II. Studies on the mechanism of photosensitized tumour necrosis / Br. J. Cancer, 61: 846-850, 1990.

93. Moan J., K.Berg, J.Bommer et al.// Action spectra of phthalocyanines with respect to photosensitization of cells // Photochem. and Photobiol. 56, №2: 171175,1992.

94. Moan J., Q.Peng, J.Eversen et al // Photosensitizing efficiencies and cellular uptake of different photosensitizing drugs relevant for PDT of cancer // Photochem. and Photobiol. - 46: 713-721,1987

95. Morgan A.R., Hampton J.A.,Salman S.H.// Endothelial cell killing in cuitured rat liver slicer following low light photodynamic therapy (PDT) // Int. J. Radiat. Biol., 1991,60,N1-2.P.46

96. Morliere P., Maziere J-C., Santus R et al //Tolyporphirin: A natural product borm cyanobacteria with potent photosensitizing activity against tumor cells in vitro and in vivo / Cancer Res. 58, (№16): 3571-3578,1998.

97. Moser J.G., Ruck A., Schwarzmaier H-J. et. al. // Photodynamic cancer therapy: fluorescence localization and light absorption spectra of chlorophyll-derived photosensitizer inside cancer cells / Opt.Eng. 1992, 31- №7, 1441-1446

98. N. van der Veen, H.S. de Bruijn, W.M. Star, et al. Localisation and kinetics of PpIX fluorescence after topical and systemic ALA application observed in the skin of UV-B-treated hairless mice // Abstact book. SPIE. Barselona, 1995. - P. 65.

99. N.N.Zharkova, D.N.Kozlov, Yu.N.Polivanov, et al. // "Laser-excited fluorescence spectrometric system for tissue diagnostics" // SPIE, 1994, vol.2328, p.196-201.

100. N.van der Veen, H.van Leengord, W.Star // In vivo fluorescence kinetics and PDT using 5- aminolevulinic acid-induced endogenous porphyrin: increased damage after multiple irradiations // Br. J.Cancer 70:867-872, 1994.

101. Orenstein A., Kostenich G., Kopolovic Y at al.// Enhancement of ALA-PDT damage by IR-induced hyperthermia on a colon carcinoma model / Photochem. and Photobiol. 69, №6,1999, c.703-707.

102. Orth K., K.Konig, F.Genze et al.// PDT of experimental colonic tumours with 5- aminolevulinic acid-induced endogenous porphyrins // Cancer Res. 120, 657661,1994

103. Pass H.//PDT in oncology: Mechanisms and clinical use // J.Nat.Cancer Inst. 85 (6):443-456, 1993

104. Peng Q. Warloe T., Moan J., et al. // Distribution of 5-aminolevulinic acid -induced porphyrins in noduloulcerative basal cell carcinoma.// Photochemistry an dPhotobiology.-1995.-V.62, N 5.-P.906-913

105. Peng Q., J. Moan, G.Farrants et al. // Localization of potent photosensitizers in human tumor LOX by means of laser scanning microscopy // Career Letters 58: 17-27, 1991

106. Peng Q., J.Evensen, C.Rimington et al.// A comparison of different photosensitizing dyes with respect to C3H-tumors and tissues of mice // Cancer Lett. 36:1-10, 1987.

107. Peng Q., J.Moan // Correlation of distribution of sulfonated aluminum phthalocyanine with their photodynamic effect in tumour and skin of mice bearing CaD2 mammary carcinoma // Br. J. Cancer 72: 565-574, 1995.

108. Peng Q., J.Moan, G.Farrants et al. // Location of Photofrin II and A1PCS4 in human tumor LOX in vitro and in vivo by means of computer-enchanced video fluorescence microscopy// Career Letters 58: 37-47, 1991

109. Peng Q., J.Moan, T.Warloe et al.// Distribution and photosensitizing efficiency of porphyrins induced by application of exogenous 5-ALA in mice Bearing mammary carcinoma // Int. J. Cancer 52: 433-443, 1992.

110. Policard A. // Etudes sur les aspects offerts par des tumeurs experimentales examinee lumiere de woods // C.R.Soc. Biol. 1924, vol.91, pp. 1423-1434.

111. R.van Hillegersberg, J.Hekking-Weijma, J.Wilson et al.// Adjuvant intraoperative PDT diminished the rate of local reccurence in a rat mammary tumor model // Br. J.Cancer 71:733-737, 1995.

112. R.van Hillegersberg, J.Van den Berg, W.Kort et al. // Selective accumulation of endogenously produced porphyrins in a liver metastasis model in rats // Gastroenterology 103:647-651, 1992.

113. Raab O.// Ueber die Wirkung fluorescierender Stoffe auf Infusorien // Z.Biol., 1990, vol.39, pp.524-529.

114. Rebeiz N., S.Arkins, C. Rebeiz et al.// Induction of tumor necrosis by 6-ALA and 1.10-Phenanthroline PDT IJ Cancer Research 56, 339-344, 1996

115. Regula J., B.Ravi, J.Bedwell et al.// PDT using 5-ALA for experimental pancreatic cancer-prolonged animal survival // Br. J.Cancer 70:248-254, 1994.

116. Regula J., MacRobert J., Gorchein A., et al.// Photosensitisation and photodynamic therapy of oesophageal, duodenal, and colorectal tumors using 5-aminolevulinic acid induced protpporphyrin IX a pilot study.// Gut.-1995.-V.36.-P.67-75.

117. Reiter I., Schwamberger G., Krammer B // Activation of macrophage tumoricidal activity by PDT in vitro indirect activation of macrophages by photodynamically killed tumor cells // Photochem. and Photobiol. - 50: 99-107, 1999

118. Reiter I., Schwamberger G., Krammer B // Effect of photodynamic pretreatment on the susceptibility of murine tumor cells to macrophage antitumor mechanisms // Photochem. and Photobiol. 66 (№3): 384-388, 1997.

119. Rezzoug H., C.Vautrin, O.A'amar et al In vivo PDT with meso-tetra-(m-hydroxyphenyl) chlorin: influence of light intensity and optimization of photodynamic efficiency//.//SPIE 181-187, 1996.

120. Riesenberg R., C.Fuchs, M.Kriegmair //Photodynamic effects of 5-ALA-induced porphyrin on human bladder carcinoma cells in vitro // J. Cancer, 32 (2): 328-334, 1995.

121. Ris H., A.Giger, V.Hof et al. //Optimization of PDT with chlorins for chest malignancies // SPIE 2625:298-301, 1995

122. Roberts W., M.Smith, J.McCullough et al.// Skin photosensitivity and photodestruction of several potential photodynamic sensitizers// Photochem. and Photobiol. 49: 431-438,1989.

123. Rodal G., S. Rodal, J. Moan et al. // Liposome-bound Zn(II)-phthalocyanine. Mechanisms for cellular uptake and photosensitization // J.Photochemistry and Photobiology. 1998. - B. Biol. - Vol. 45. - P. 150-159.

124. Rousseau J., R.Boule, T.Truscott et al.// Biodisribution and tumor uptake of 67Ga. chlorogallium-tetraoctadecyloxyphthalocyanine and its sulfonation products in tumor bearing C3H mice // Appl. Radiat. Isot. Submitted, 1991.

125. Roy B., D.van Vugt, G.Weagle et al. // Effect of continuous and multiple doses of 5-ALA on protoporphyrin IX concentration in the rat uterus // J.Photochemistry and Photobiology. 1997. - B. Biol. - Vol. 41 - P. 122-127.

126. Schoenfeld, N., O. Epstein, M. Lahav et.al. // The heme biosynthetic pathway in lymphocytes of patients with malignant lymphoproliferative disorders. // Cancer, 1988, 43, 43-48.

127. Selman S., M.Kreimer-Birnbaum, K.Chaudhuri et al. // Photodynamic treatment of transplantable bladder tumors in rodent after pretreatment with chloroaluminum tetrasulfophthalocyanine // J. Urol. 136:141-145, 1986.

128. Shedlofsky S., P.Sinclair, H.Bonkovsky et al. 11 Haem synthesis from exogenous 5-Aminolaevulinate in cultured chick-embryo hepatocytes. Effects of inducers of cytochromes P-450.// Biochem J. 248:229-236, 1987

129. Siegel K., Fingar V., Wieman T et al // Mechanisms of tumor destruction using photofrin, HPPH and N Peb // Photochem. Photobiol. 57:20, 1993.

130. Sporn Lee Ann, Foster Thomas H. // Photofrin and light induces microtubuli depolimerazition in cultured human endothelial cells.// Cancer Res., 1992, V.52,N 12, P.3443-3448.

131. Sroka R., W.Reyer, L.Gossner et al.// Pharmacokinetics of 5- aminolevulinic acid-induced porphyrins in tumor-bearing mice // Photochem. Photobiol. 34:1319, 1996.

132. Steinbach P., H.Weingandt, R.Baumgartner et al.// Cellular fluorescence of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX following exposure to 5-ALA // Photochem. Photobiol, 62 (5): 887-895, 1995

133. Stepp H., Baumgartner R., Beyer W., et al.// Fluorescence imaging and spectroscopy of ALA-induced protoporphyrin IX preferentially accumulated in tumor tissue.// Proc. SPIE.-l995.-V.2627.-P. 13-24.

134. Stummer W., S.Stocker, A.Novothy et al. //In vitro and in vivo porphyrin accumulation by C6 glioma cells after exposure to 5-ALA // Photochem. Photobiol, 45: 160-169, 1998

135. Svanberg k., Wang I., Rydell R. Et al. // Fluorescence diagnostics of head and neck cancer utilizing oral administration of 5-aminolevulinic acid.// Proc.SPIE.-1994.-V.23 71.-P. 129-141.

136. Szeimies R., C.Abels, C.Fritsch et al.// Wavelength dependency of photodynamic effects after sensitization with 5-ALA in vitro and in vivo // J. of Investigative Dermatology 105:672-677, 1995.

137. Tabata K., S.Ogura, I.Okura // Photodynamic Efficiency of Protoporphyrin IX: Comparison of Endogenous Protoporphyrin IX Induced by 5-ALA and Exogenous Porphyrin IX / Photochem. and Photobiol. 66 (№6): 842-846,1997.

138. Tralau C., A.Young, N.Walker et al.//Mouse skin photosensitivity with dihaemotoporphyrin ether (DHE) and aluminum sulfonated phthalocyanine: A comparative study // Photochem. and Photobiol. 49: 305-312,1989.

139. Tralau C., Barr D., Sanderman T. et al.// Aluminum sulfonated phthalocyanine distribution in rodent tumors of the colon, brain and pancreas // Photochem. and Photobiol. 46: 777-781,1987

140. Tralau C., MacRobert A., Barr H. et al.//PDT with phthalocyanine sensitization : quantitative studies in a transplantable rat fibrocarcoma // Br. J. Cancer 55: 389395, 1987.

141. Trivedi N.S., H-W. Wang, A.L.Nieminen et al.// Quantitative analysis of Pc4 localization in mause lymphoma (LY-R) cells via double-label confocal fluorescence microscopy // Photochem. and Photobiol. 71 (5): 634-639, 2000.

142. Uberrigler K., E.Banieghbal, B.Krammer // Subcellular damage kinetics within co-cultivated WI38 and VA13-transformed WI38 human fibroblasts following 5-ALA-induced protoporphyrin IX formation // Photochem. Photobiol. 62:10521057,1995.

143. Warloe T., Peng Q., Heyerdahl H., et al.// Photodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid induced porphyrins and DMSO/EDTA for basal carcinoma // Proc.SPIE.-1994.-V. 2371 .-P.226-235.

144. Webber J., Kessel D., Fromm D.// On-line fluorescence of human tissues after oral administration of 5-aminolevulinic acid.// Photochemistry and photobiology B: Biology.-1997.-V.38.-P.209-214.

145. Wolf P., Rieger E., Kerl H. // Topical photodynamic therapy with endogenous porphyrins after application of 5-aminolevulinic acid.// J. Am. Acad. Dermatol.-1993.-V.28.-P.17-21.

146. Woodburn K.W., Vardaxis N.J., Hill J.S. et al // Evalution of porphyrin characteristics required for PDT / Photochem. and Photobiol. 55, (№5): 697704,1992.

147. Xu S., M.Aravind, A.Becker et al.// Endogenous porphyrins in murine skin and transplanted PAM-212squamous cell carcinoma tissues after injection 8-ALA // J. Chin.Med. 108:286-290, 1995.

148. Yu Luo, D.Kessel /Initiation of apoptosis versus necrosis by photodynamic therapy with chloroaluminim phthalocyanine / Photochem. and Photobiol. 66 (№4): 479-483, 1997.

149. Zhou C., C.Shunji, D.Jinsheng et al.// Apoptosis of mouse MS-2 fibrosarcoma cells induced by PDT with Zn(II)phthalocyanine // Photochem. Photobiol, 33: 219-223, 1996.

150. Ziolkowski P., Symonowicz K., Milach J.// In-vivo interleukin-1 -alpha induction following chlorin e6- PDT in Balb/c mice // SPIE vol. 2625 pp 426-432, 1995.