Изучение нейропротективной активности рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в полимерные носители тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат биологических наук Солев, Игорь Николаевич

• Солев, Игорь Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Солев, Игорь Николаевич

Введение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Характеристика эритропоэтина.

1.1.5 Механизмы нейропротекторного действия ЭПО.

1.1.6 Препараты, созданные на основе молекулы эритропоэтина.

1.2 Системы используемые для доставки лекарственных препаратов в

ЦНС.;.

1.2.1 Характеристика поли(бутил)цианоакрилатных наночастиц.

1.2.2 Характеристики полилактидных наночастиц

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Препараты и вещества^ используемые в исследовании.

2.Т Животные используемые в исследовании.

2.3 Методики получения и анализа наносомальных форм РЭЧ.

2.3.1 Получение экспериментальной формы эритропоэтина включенного в ПБЦА наночастицы.

2.3.2 Получение экспериментальной формы эритропоэтина включенного в ПЛЕА наночастицы.

2.3.3 Определение размеров наночастиц

2.3.4 Электронно-микроскопическое изучение формы и размеров наночастиц.

2:3.5 Определение степени включения РЭЧ на наночастицы.

2.4 Методика определения содержания РЭЧ в головном мозге крыс.

2.4.1 Методика определения концентрации ЭПО методом иммуноферментного анализа.

2.5 Моделирование гипоксических состояний.

2.5.1 Моделирование гемической гипоксии.

2.5.2 Моделирование гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.

2.5.3 Моделирование гипоксической гипобарической гипоксии.

2.6 Модель и нтрацеребральной п осттравматической гематомы, геморрагического инсульта для изучения нейропротекторной активности веществ.

2.6.1 Исследование неврологического дефицита по шкале Stroke-index

McGrow.

2.6.2 Методика приподнятого крестообразного лабиринта.

2.6.3 Оценка ориентировочно - исследовательского поведения и двигательной активности в открытом поле.

2.6.4 Исследование нарушения координации движений в тесте вращающегося стержня.

2.6.5 Тест подтягивание на горизонтальной перекладине.

2.6.6. Условный рефлекс пассивного избегания.

2.6.7. Динамика веса животных.

2.7. Методы исследования влияния РЭЧ на. экспрессию нейротрофических факторов BDNF и NGF in vitro.

2.7.1 Получение первичной культуры клеток нейроглии.

2.7.2 Выделение тотальной РНК из культуры клеток астроцитов.

2.8' Методы исследования влияния РЭЧ и> РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы на экспрессию нейротрофических- факторов BDNF hNGF in vivo.

2.8.1 Подготовка образцов исследуемых отделов мозга in vivo.

2.8.2 Выделение тотальной РНК из исследуемых« отделов мозга крысы

2.9 Оценка вличния форм РЭЧ на экспрессию нейротрофинов NGF и

BDNF для методов in vitro и in vivo.

2.9.1 Определение обратной транскрипции с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.9.2 Оценка уровня экспрессии BDNF и NGF мРНК.

2.10 Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты исследования

3.1 Синтез наночастиц и приготовление экспериментальных форм РЭЧ.

3.1.1 Получение нанокапсулированных форм эритропоэтина на основе

ПБЦА.

3.1.2 Получение нанокапсулированных форм эритропоэтина на основе

ПЛГА.

3.1.3 Определение размеров наночастиц с помощью фотонной корреляционной спектроскопии.

3.1.4 Электронно-микроскопическое изучение формы и размеров наночастиц.

3.1.5 Определение степени включения РЭЧ в наночастицы.

Глава 4. Изучение фармакологической активности РЭЧ и его нанокапсулированных форм

4.1 Количественное определение РЭЧ в тканях мозга экспериментальных животных.

4.2 Изучение противогипоксических свойств1 новых наносомальных форм РЭЧ.:.

4.2.1 Изучение противогипоксической активности новых соединений РЭЧ на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.

4.2.2 Изучение противогипоксической активности новых соединений

РЭЧ на модели гипобарической гипоксии в барокамере.

4.2.3 Изучение противогипоксической активности новых соединений

РЭЧна модели гемической гипоксии.

4.3 Исследование эффективности новых форм РЭЧ на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта).

4.3.1 Исследование неврологического дефицита крыс с ИПГ.

4.3.2 Динамика выживания крыс с ИПГ.

4.3.3 Влияние веществ на координацию движ ений животных в тесте вращающегося стержня.

4.3.4 Влияние веществ на динамику веса крыс с ИНГ.

4.3.5 Влияние новых соединений на ориентировочноисследовательское поведение крыс с ИПГ в открытом поле.

4.3.6 Влияние веществ на поведение животных с ИПГ в условиях приподнятого крестообразного лабиринта.

4.3.7 Влияние веществ на обучение УРПИ крыс с ИПГ.

4.4 Изучение механизма нейропротекторного действия РЭЧ и его наносомальной формы.

4.4.1 Исследование влияния препаратов РЭЧ на экспрессию нейротрофических факторов BDNF и NGF in vitro.

4.4.2 Исследование влияния препаратов РЭЧ на экспрессию нейротрофических факторов BDNF и NGF in vivo.

Глава 5. Обсуждение результатов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение нейропротективной активности рекомбинантного эритропоэтина человека, включенного в полимерные носители»

Актуальностьтемы. Заболевания, сопровождающиеся нейродегенеративными процессами, такие как болезни Альцгеймера и Паркинсона, различные деменции, травматические и токсические поражения головного мозга, инсульты являются одной из ведущих причин инвалидицации и смерти пациентов. Несмотря на наличие значительного количества лекарственных средств для лечения этих состояний, проводимая в настоящее время* терапия недостаточно эффективна и требуются новые подходы к разработке препаратов с нейропротективной активностью. Один из современных подходов к поиску эффективных нейропротекторов основан на использовании патогенетических механизмов нейродегенерации и эндогенных защитных реакций организма.

В настоящее время накоплены обширные сведения о цитокинах -молекулах, которые: являются» посредниками межклеточных: взаимодействий; регулируют кроветворение; иммунный ответ, клеточный цикл в различных тканях, участвуют во многих физиологических и патологических процессах. Широко/известным и применяемым является гемопоэтический ростовой фактор

- эритропоэтин (ЭПО). В медицинской: практике для лечения анемий: различного генеза используется рекомбинантный эрйтропоэтин человека (РЭЧ). Помимо регуляции эритропоэза, ЭПО проявляет широкий спектр защитных функций в организме, участвует в защите мозга от повреждения. ЭПО и рецептор к нему (РЭПО) экспрессируются в центральной и периферической нервной системе, принимая активное участие в эмбриональном развитии млекопитающих и человека ^и Н., 1999]. Показано, что при периферическом введении РЭЧ оказывает выраженные протекторные эффекты на поврежденную различными факторами церебральную ткань через активацию антиапоптотических генов, запуская антиоксидантные и противовоспалительные механизмы в нейронах, глиальных и цереброваскулярных эндотелиальных клетках, стимулирует ангио- и нейрогенез [Siren A.L., 2001, Leist M., 2004, Belayev L., 2005]. Вместе с тем, в связи с низким проникновением РЭЧ через гематоэнцефалический барьер эти свойства препарата выявляются только в высоких дозах, в 20-100 раз превышающих терапевтические, что часто приводит к развитию побочных эффектов со стороны сердечно-сосудистой системы (повышение артериального давления), повышается риск тромбообразования [Ehrenreich H., 2009, Krapf R., 2009, Vaziri N.D., 2001].

В последнее время все большее внимание уделяется исследованиям, направленным на разработку т ранспортных систем для адресной доставки лекарственных препаратов в различные органы и ткани. Одним из таких способов является включение веществ в полимерные с истемы доставки [Аляутдин Р.Н., 2001, Воронина Т.А., 2008., Гельперина С.Э., Швец В.И., 2009], в частности, использование поли (бутил)цианоакрилатных наночастиц (ПБЦА) покрытых сурфактантами (полисорбатом-80) и наночастиц «на основе сополимера молочной и гликолевой кислот (ПЛГА) [Kim H.R., 2007, Гельперина С.Э., 2011]. На основе ПБЦА наночастиц в качестве полимерной матрицы для транспортировки в мозг разрабатываются такие препараты, как ванкамицин, ампициллин [Kreuter J., 1994], мет-энкефалин [Ramge, Kreuter,

2000], лей-энкефалин [Ramge, 2001] и доксорубицин [Gelperina., 2003], который, в настоящее время находится на III фазе клинического изучения в США и Европе. ПЛГА были использованы для доставки в мозг доксорубицина и лоперамида [Tosi G., 2007].

Показано, что при введении веществ в полимерные наночастицы (ПБЦА, ПЛГА) повышается биодоступность, увеличивается эффективность и продолжительность действия-лекарственных препаратов, а также снижаются их побочные эффекты и токсичность [Kreuter J., 2003, Воронина Т.А., 2008]. В НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН в течение многих лет проводятся исследования по созданию препаратов, обладающих нейропротективной активностью, разработана методология поиска нейропротективной активности у новых веществ и известных препаратов [Середенин С.Б., 2007, Гарибова Т .Л., 2008, Островская Р.У., Гудашева Т.А., 2009, Ковалев Г.И., 2009, Мирзоян P.C., 2010, Воронина Т.А., 2010]. В связи с этим представляется актуальным изучение нейропротективного действия РЭЧ и его наносомальных форм.

Целью исследования явилось экспериментальное изучение нейропсихофармакологической активности РЭЧ, включенного в наночастицы на основе ПБЦА и ПЛГА.

Задачи исследования.

1. Разработать методику включения РЭЧ в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и*сополимеров молочной и гликолевой кислот.

2. Разработать подходы к стандартизации наносомальных форм РЭЧ на основе поли (бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и? гликолевой кислот. '

3. Изучить возможность проникновения ПБЦА и ПЛГА наночастиц с включенным в их состав РЭЧ через гематоэнцефалический барьер, используя метод имму но ферментного анализа.

4. Исследовать противогипоксический эффект РЭЧ, включенного' в ПБЦА и ПЛГА наночастицы, в сравнении с нативным РЭЧ.

5. Изучить нейропротективные свойства РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы на модели интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) в сравнении с нативным РЭЧ.

6. Изучить влияние РЭЧ, включенного в ПБЦА наночастицы, на уровень экспрессии мРНК нейротрофических факторов BDNF и NGF.

Научная* новизна. Впервые разработаны методики включения РЭЧ в носители на основе ПБЦА и ПЛГА наночастиц; проведена стандартизация полученных наносомальных форм РЭЧ, включенного в ПБЦА и ПЛГА наночастицы. Показана возможность доставки РЭЧ в мозг. Методом иммуноферментного анализа (ИФА) установлено, что концентрация РЭЧ в головном мозге мышей при использовании наносомальной формы на основе ПБЦА наночастиц значительно превышает концентрацию нативного РЭЧ.

Впервые выявлены нейропсихофармакологические свойства наносомальных форм РЭЧ. Показано, что РЭЧ, включенный/в ПБЦА наночастицы, покрытые полисорбатом-80, как при внутривенном, так и при внутрибрюшинном введении обладает противогипоксическим эффектом и нейропротективными свойствами. На модели геморрагического инс ульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой1 выявлена способность наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц предотвращать гибель животных, у меныиать неврологические дефициты, улучшать ориентировочно-исследовательское поведение и память.

Выявлен один из механизмов нейропротективного действия новой наносомальной формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. С помощью метода полимеразной цепной реакции продуктов обратной транскрипции показано,- что наносомальная форма РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц в опытах in vivo значительно увеличивают экспрессию' генов’ нейротрофинов BDNF и NGF в фронтальной коре и гиппокампе крыс. ,

Научно-практическая^ значимость. Разработанные методики включения' ч

РЭЧ в полимерные наночастицы и подходы к стандартизации могут, быть в дальнейшем использованы для создания' новой формы РЭЧ на основе ПБЦА наночастиц. Результаты эффективности эритропоэтина, включенного в ПБЦА наночастицы, как нейропротектора, открывают перспективу для исследований по разработке и внедрению новой наносомальной формы эритропоэтина в качестве препарата для лечения заболеваний, сопровождающихся нейродегенерацией. •

Личный вклад автора: автором самостоятельно изготовлены две экспериментальные формы нанокапсулированного эритропоэтина и проведено их фармакологическое изучение, разработана и апробирована методика определения концентрации эритропоэтина в тканях головного мозга, изучены потенциальные механизмы нейропротективного действия РЭЧ, обработаны результаты, сформулированы выводы.

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на:

На втором международном форуме по нанотехнологиям (Москва 2009) Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург 2010)

VII Международной научно-практической конференции «Наука и современность» (Новосибирск 2010) ‘

11th European, college of neuropsychopharmacology Regional Meeting (St. Petersburg 2010) ' ,

III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых "Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии" (Волгоград 2011) •

Публикации ,

По материалам диссертации опубликовано 3- статьи и. 5 тезисов- в материалах российских и международных конференций.

Объемьи структура диссертации

Диссертация изложена на 167 страницах машинописного текста и состоит из: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающий 26 отечественных и 303 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 3 схемами и 21 рисунками. ю

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанные методики включения РЭЧ в наночастицы на основе поли(бутил)цианоакрилата и сополимеров молочной и гликолевой кислот позволяют получить новые формы РЭЧ, проникающие через ГЭБ.

2. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, обладает противогипоксическим действием на моделях гипоксии с гиперкапнией, гипобарической гипоксии и противоинсультным действием на модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой.

3. РЭЧ, включенный в ПБЦА наночастицы, при внутривенном введении способен стимулировать экспрессию нейротрофических факторов КОБ и ВОКБ во фронтальной коре и гиппокампе мозга крыс.