Изучение NADH:хинон оксидоредуктазного сегмента электрон-транспортных цепей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Богачев, Александр Валерьевич

• Богачев, Александр Валерьевич
• доктор биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор биологических наук Богачев, Александр Валерьевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ]\Га+-транслоцирующая ИАВН:хинон оксидоредуктаза

2. Физиологическая роль несопряженной КАОН:хинон оксидоредуктазы 13 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 34 РЕЗУЛЬТАТЫ

1. 1Ча+-транслоцирующая ИАВН:хинон оксидоредуктаза

2. Несопряженная NADH:xинoн оксидоредуктаза

3. Н+-транслоцирующая НАОН:хинон оксидоредуктаза 101 ОБСУЖДЕНИЕ 112 ВЫВОДЫ 125 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография; ДМСО - диметилсульфоксид, ДТТ - 1,4-дитио-ОЬ-треитол; пиранин - 8-гидрокси-1,3,6-пиренетрисульфоновая кислота; капсаицин - 8-метил-Н-ваниллил-6-ноненамид; Кз - менадион (Витамин Кз); оксонол VI -1.5-бис[5-оксо-Зпропилизоксазол-4-ил]пентаметиноксонол; п.н. - пары нуклеотидов; ПЦР - полимеразная цепная реакция; СБЧ - суббактериальные частицы; ТМАО - триметил N-оксид; ЭПР - электронный парамагнитный резонанс; ЯМР - ядерный магнитный резонанс; AltOx - альтернативная оксидаза; СССР - м-хлоркарбонилцианид фенилгидразон; DM -додедил мальтозид; dNADH - восстановленный никотинамид гипоксантин динуклеотид; ЕТН-157 - М,Ы'-дибензил-М,Ы'-дифенил-1,2-фенилен диацетамид; F1 - окисленный флавин; FIH2 - восстановленный флавин; F1H* - нейтральный флавосемихинон; Fl*~ -анионный флавосемихинон; HQNO - 2-н-гептил-4-гидроксихинолин N-оксид; Н+/е' -нормированное на количество электронов количество протонов, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи; Q - убихинон; QH2 - убихинол; Qi - 2,3-диметокси-5 -метил-6-изопренил-1,4-бегоохинон; LDAO - лаурилдиметиламин N-оксид; Na+/e~ - нормированное на количество электронов количество ионов натрия, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи; NDex - внешняя NADH:xhhoh-оксидоредуктаза митохондрий растений; NDH-1 - бактериальная Н+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза, гомолог митохондриального Комплекса I; NDH-2 -бактериальная несопряженная NADH:xhhoh оксидоредуктаза; NDin - внутренняя несопряженная NАВР1:хинон-оксидоредуктаза митохондрий растений; NQR - Na+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза; SHAM - салицилгидроксамовая кислота, АрН - трансмембранная разность значений рН; Д//н+ ~ трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода; Д ~Ji ыа - трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов натрия; Av[/ - трансмембранная разность значений электрических потенциалов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение NADH:хинон оксидоредуктазного сегмента электрон-транспортных цепей»

В последние десятилетия достигнут значительный прогресс в понимании механизмов трансформации энергии в дыхательных цепях митохондрий и бактерий. Так, для многих ферментов электрон-транспортной цепи (таких как цитохром с оксидаза (комплекс IV), ¿>c i-комплекс (комплекс III), нитратредуктаза, формиатдегидрогеназа и многих других) на настоящий момент определена трехмерная структура. Более того, для этих ферментов выяснена последовательность окислительно-восстановительных реакций при осуществляемом ими катализе, а для некоторых из них - и механизм генерации протонного потенциала.

В тоже время, механизм протекания NADH:xhhoh оксидоредуктазной реакции -первой стадии в функционировании дыхательной цепи - на настоящий момент неизвестен, и эта реакция является наименее изученным участком электронного транспорта. В отличие от митохондрий высших животных, где функционирует лишь Н+-транслоцирующая NADH'.xhhoh оксидоредуктаза (комплекс I), окисление NADH в дыхательной цепи бактерий может осуществляться тремя различными типами ферментов: Н+-транслоцирующей (NDH-1), Ка+-транслоцирующей (NQR) и несопряженной (NDH-2) NADH:xhhoh оксидоредуктазами. У различных бактерий в дыхательной цепи могут функционировать NADH:xhhoh оксидоредуктазы одного, двух и даже всех трех вышеперечисленных типов. Для всех этих ферментов на настоящий момент не известен ни механизм окислительно-восстановительного катализа, ни способ генерации мембранного потенциала (для NQR и NDH-1), также неизвестна физиологическая роль различных NADH:xhhoh оксидоредуктаз в клетках микроорганизмов.

Целью данной работы являлось изучение NADH:xhhoh оксидоредуктазного сегмента дыхательных цепей. Особое внимание было уделено исследованию механизма функционирования Ыа+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазы из морской бактерии Vibrio harveyi. Исследование Ка+-транслоцирующих ферментов имеет ряд преимуществ по сравнению с протонными помпами. Прежде всего, при изучении Na^-помп можно свободно манипулировать концентрацией сопрягающего иона без существенного влияния на стабильность белка, что невозможно в случае Н+-транслоцирующих ферментов. В частности, можно исследовать каталитический цикл натрий-зависимого фермента при лимитировании его скорости низкими концентрациями Na+ и выявить в нем стадии, специфически ускоряющиеся этими ионами. Такой подход позволяет определить, какие именно окислительно-восстановительные переходы в ферменте сопряжены с транслокацией Иа+. С другой стороны, влияние концентрации Иа+ на термодинамические свойства натриевой помпы позволяет установить механизм преобразования энергии катализируемой редокс-реакции в трансмембранный натриевый потенциал.

Также исследовалась регуляция экспрессии генов, кодирующих различные ЫАОН:хинон оксидоредуктазы, и определялся фенотип мутантных по этим генам штаммов микроорганизмов, что позволяет приблизиться к пониманию физиологической роли данных ферментов в клетках бактерий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Бактериальные NADH:xuhoh оксидоредуказы

В дыхательной цепи большинства бактерий присутствуют ферменты, способные осуществлять NADH:xmhoh оксидоредуктазную реакцию. Бактериальные NADH дегидрогеназы можно разделить на три основных класса - протон-транслоцирующие NADHixhhoh оксидоредуктазы (NDH-1), натрий-транслоцирующие NADH:xhhoh оксидоредуктазы (NQR) и несопряженные NADH:xhhoh оксидоредуктазы (NDH-2) [Matsushita et al., 1987; Yagi, 1991; Calhoun and Gennis, 1993; Bertsova and Bogachev, 2004]. Эти ферменты значительно отличаются друг от друга по своей структуре, субстратной специфичности и чувствительности к различным ингибиторам. Основное отличие этих ферментов заключается в их различной способности к транслокации ионов через мембрану.

NADH:xhhoh оксидоредуктаза I (NDH-1) по многим своим характеристикам гомологична Комплексу I из митохондрий [Weiss et al., 1991; Гривенникова и Виноградов, 2003]. У Escherichia coli этот фермент представляет собой белок с молекулярной массой около 525 кДа. Он состоит из 13 субъединиц (NuoA-NuoN) и содержит нековалентно связанный FMN и 9 Fe-S кластеров в качестве кофакторов [Weidner et al., 1993; Leif et al., 1995; Гривенникова и Виноградов, 2003; Hinchliffe and Sazanov, 2005]. NADH:xhhoh-оксидоредуктазная активность этого фермента чувствительна к таким ингибиторам, как капсаицин, анонин и пирицидин A [Matsushita et al., 1987; Yagi, 1990; Satoh et al., 1996; Bertsova et al., 1998; Grivennikova et al., 2003; Bertsova and Bogachev, 2004]. Активность NDH-1 сопряжена с генерацией протонного потенциала [Matsushita et al., 1987; Bogachev et al., 1996; Bertsova et al., 1998; Bertsova and Bogachev, 2004]. Было показано, что соотношение Н /е" для митохондриального Комплекса I составляет 2 Н /е" [Wikstrom, 1984; Galkin et al., 1999]. Эффективность генерации Л// н+ бактериальными NDH-1 изучена в значительно меньшей степени, известно лишь, что соотношение Н+/е" для этого фермента из Е. coli составляет по крайней мере 1,5 [Bogachev et al., 1996].

NADH:xhhoh оксидоредуктазы II типа (NDH-2) устроены гораздо проще. Они состоят всего из одной субъединицы (Мг = 47 кД в случае фермента из Е. coli) и содержат только один кофактор (чаще всего - нековалентно связанный FAD) [Yagi, 1991]. Активность этих ферментов не сопровождается переносом ионов через мембрану [Matsushita et al., 1987; Bertsova et al., 1998; Bertsova and Bogachev, 2004]. Ферменты типа NDH-2 не известны в митохондриях высших животных, однако аналогичные белки функционируют в митохондриях некоторых простейших, грибов и растений [Yagi, 1991;

Берцова и Богачев, 2002]. При кажущейся простоте, этот фермент до сих пор малоизучен. На настоящий момент известно, что активность NDH-2, в отличие от NDH-1, практически нечувствительна к таким ингибиторам как пирицидин А и капсаицин [Yagi, 1990; Bertsova et al., 1998].

1. ]Ча+-транслоцирующая NADHíxhhoh оксидоредуктаза

Бактерии могут расти в широком диапазоне значений рН окружающей среды. В кислых и нейтральных условиях дыхательная цепь прокариот способна генерировать высокий протонный потенциал, достаточный для энергообеспечения различного вида работ. Однако, НГ-транслоцирующие ферменты дыхательной цепи алкалотолерантных или алкалофильных бактерий, перенося протоны из цитоплазмы во внешнюю среду против градиента рН, действовали бы в условиях, когда осмотическая компонента Д7/н+ противонаправлена электрической, что должно сильно понизить суммарную протон-движущую силу. В результате алкалофильные бактерии не смогли бы осуществлять зависимые от А~Ц н+ функции, прежде всего - окислительное фосфорилирование. В.П. Скулачевым был предложен принципиально новый механизм запасания энергии при высоких значениях рН, а именно, - функционирование натриевого цикла. Этот механизм подразумевает, что в щелочных условиях ферменты дыхательной цепи бактерий могут транслоцировать ионы натрия вместо протонов, а генерируемый первичными натриевыми помпами натриевый потенциал может быть использован для энергообеспечения основных типов работ, совершаемых клеткой: химической (синтез АТР), осмотической (накопление субстратов) и механической (движение) [Скулачев, 1989; Skulachev, 1984; 1989].

Впервые фермент, запасающий энергию окислительно-восстановительных реакций в виде натриевого потенциала, был открыт в дыхательной цепи морской бактерии Vibrio alginolyticus. В 1977 году Унемото с соавторами показали, что NADH-оксидазная реакция, катализируемая суббактериальными частицами из V. alginolyticus и V. costicola, специфически стимулируется ионами натрия [Unemoto et al., 1977]. Позднее было установлено, что данная №+-стимул:яция происходит на К!АОН:хинон-оксидорсдуктазном участке дыхательной цепи [Unemoto and Hayashi, 1979]. Более того, оказалось, что Na+-зависимость окисления NADH у V. alginolyticus связана не с какой-то аллостерической регуляцией N ADH: хин о 1i -оксидоредуктаз ы, а с тем, что активность этого фермента сопряжена с трансмембранной транслокацией ионов натрия [Tokuda and Unemoto, 1984]. То есть, ЫАОН:хиноп-оксидоредуктаза дыхательной цепи V. alginolyticus является первичной натриевой помпой [Tokuda et al., 1985].

Образованный натриевый потенциал может быть использован у V. alginolyticus для совершения механической (вращение полярного жгутика) [Dibrov et al., 1986] или осмотической (транспорт субстратов) [Tokuda et al., 1982] работы. Таким образом, пример этого микроорганизма подтверждает возможность функционирования у бактерий натриевого цикла преобразования энергии [Skulachev, 1989].

1.1. Первичная последовательность субъединиц ^+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазы.

В 1994 г. независимо в двух лабораториях был клонирован и секвенирован оперон, кодирующий у V. alginolyticus Ыа+-транслоцирующую МАОН:хинон-окспдоредуктазу (NQR) [Rich et al, 1995; Hayashi et al., 1995]. Было показано, что этот оперон содержит шесть открытых рамок считывания (nqrA-T). В последствии было установлено, что NQR состоит из шести субъединиц, соответствующих продуктам шести генов nqr-оперона [Nakayama et al., 1998].

Таблица 1. Физико-химические свойства субъединиц N(311 на примере фермента из V. Ьаг\>еу1 и их возможная роль при осуществлении ферментативной активности.

Субъединица Молекулярная Количество Связывание кофакторов и возможная роль в

NQR масса (кДа) трансмембранных ферментативной активности а-спиралей

Nqr А 48,4 0 ?

NqrB 45,4 8 Ковапентно связанный остаток FMN [Nakayama et al., 2000], возможно формирует хинонредуктазный центр фермента [Hayashi et al., 2002]

NqrC 27,5 1-2 Ковалентно связанный остаток FMN [Zhou et al.,

1999; Nakayama et al., 2000]

NqrD 22,7 б ?

NqrE 21,5 6 ?

NqrF 45,2 1 Место связывания NADH, содержит нековалентно связанный FAD, 2Fe-2S кластер

Rich et al, 1995; Turk et al., 2004]. Ответственна за осуществление NADH-дегидрогеназной активности фермента.

Три субъединицы NQR (^гВ, ^гБ и ^гЕ) очень гидрофобны, в то время как остальные три - относительно гидрофильны (см. табл. 1). Субъединица ЫцгР оказалась гомологичной многим белкам, осуществляющим окислительно-восстановительные реакции. С-концевой домен этой субъединицы сходен с ферредоксин:ЫАОР+ оксидоредуктазами, входящими в семейство FNR. В его первичной последовательности содержатся участки, ответственные за связывание NADH и FAD [Rich et al, 1995; Turk et al., 2004]. N-концевой домен NqrF гомологичен ферредоксинам, содержащим [2Fe-2S] кластер. Его последовательность содержит четыре консервативных остатка цистеина, принимающих участие в формировании железо-серного кластера [Rich et al, 1995; Barquera et al., 2004]. Таким образом, NqrF представляет собой полипептид, объединяющий в своем составе N A D Н: ф е р р е д о к с и н оксидоредуктазу и ферредоксин [Turk et al., 2004]. Остальные пять субъединиц NQR (NqrA-E) не обладают сколь-нибудь существенной гомологией по отношению к другим белкам с известными функциями. Хотелось бы отметить, что NQR полностью отличен как от ферментов класса протон-транслоцирующих NADH:xhhoh-оксидоредуктаз (NDH-1, Комплекс I), так и от ферментов класса несопряженных КАБН:хинон-оксидоредуктаз (NDH-2) [Rich et al., 1995; Hayashi et al., 1995; Bertsova and Bogachev, 2004]. Таким образом, белки типа NQR составляют третий класс NADH:xhhoh-оксидоредуктаз дыхательных цепей, который возник в ходе эволюции независимо от двух других классов этих ферментов.

Интересно отметить, что гены, гомологичные nqrA-F из V. alginolyticus, впоследствии были обнаружены в геномах многих бактерий [Zhou et al., 1999; Hase et al., 2001]. Таким образом, NQR широко распространен среди прокариот, в частности, этот белок содержится и у многих патогенных микроорганизмов, таких как V. cholerae [Hase and Mekalanos, 1999], Haemophilus influenzae [Hayashi et al., 1996], Klebsiella pneumoniae [Bertsova and Bogachev, 2004], Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Shewanella putrefaciens, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas ginginvalis и т.д. Более того, в случае V. cholerae было показано, что NQR играет существенную роль в индукции факторов вирулентности [Hase and Mekalanos, 1999].

1.2. Простетические группы NQR.

В течение последних лет кофакторный состав NQR изучался в различных лабораториях. Результаты этих исследований были очень противоречивы, а сделанные на сегодняшний день выводы, возможно, еще не являются окончательными. В 1986 году Токуда и Унемото выделили NQR из V. alginolyticus и показали, что он содержит лишь флавины в качестве кофакторов, а именно - один нековалентно связанный FAD и один нековалентно связанный FMN [Hayashi and Unemoto, 1986]. Однако, при анализе первичных последовательностей субъединиц NQR было установлено, что лишь в одной из них (в субъединице NqrF) присутствует мотив для связывания флавина [Rich et al., 1995]. Более того, Пфеннингер-Ли и Димрот показали, что в очищенном препарате NQR содержится лишь один нековалентно связанный флавин, а именно - FAD [Pfenninger-Li and

Dimroth, 1995]. Данное противоречие в результатах было разрешено позднее. Было установлено, что NQR из V. harveyi наряду с нековалентно связанным FAD содержит дополнительно еще один флавин (по-видимому - FMN), ковалентно связанный с субъединицей NqrC [Zhou et al., 1999]. Ковалентный тип связи флавина с белком подразумевает какой-то другой, отличный от классического мотив первичной последовательности флавин-содержащего домена, а также невозможность использования обычно применяемой методики экстракции для его обнаружения.

В последствии Накаяма с соавторами показали, что в состав NQR входит не один, а два ковалентно связанных флавина, и они присоединены к субъединицам NqrB и NqrC [Nakayama et al., 2000]. Было установлено, что эти флавины являются остатками FMN, и в обоих случаях они присоединены к остаткам треонина этих субъединиц посредством фосфоэфирной связи [Hayashi et al., 2001а; 2001Ь]. Хотелось бы отметить, что такой тип ковалентной связи флавина с белком является уникальным и, кроме NQR, не встречается в других ферментах [Hayashi et al., 2001b],

Изучение флавиновых кофакторов NQR получило неожиданное продолжение в самое последнее время. Оказалось, что данный белок наряду с FAD и FMN содержит также и нековалентно связанный рибофлавин [Barquera et al., 2002]. Рибофлавин обычно используется живыми организмами лишь как предшественник для синтеза FAD и FMN, и, за исключением NQR, неизвестны случаи его функционирования в качестве кофактора [Massey, 2000]. Правда, необходимо отметить, что еще не установлено, какая из субъединиц NQR ответственна за связывание рибофлавина. Таким образом, остается возможность, что NQR содержит лишь три флавина, а рибофлавин присутствует в этом ферменте в результате гидролиза фосфоэфирной связи остатков FMN.

Как описано выше, при анализе первичных последовательностей субъединиц NQR было предсказано, что NqrF может содержать железо-серный кластер [Rich et al., 1995]. В соответствии с этими предсказаниями 2Fe-2S кластер был обнаружен как в составе NQR-комплекса [Bogachev et al., 2001; Barquera et al., 2002], так и в изолированном фрагменте субъединицы NqrF [Turk et al., 2004]. Также, наряду с флавинами и 2Fe-2S кластером, NQR содержит одну молекулу прочно связанного убихинона-8 [Pfenninger-Li et al., 1996; Zhou et al., 1999, Barquera et al., 2002]. Таким образом, на сегодняшний день считается, что NQR в качестве кофакторов содержит один 2Fe-2S кластер, один нековалентно связанный FAD, два ковалентно связанных остатка FMN, а также, возможно, один убихинон-8 и один нековалентно связанный рибофлавин.

1.3. Каталитические активности NQR.

При функционировании in vivo NQR окисляет NADH и переносит два электрона на молекулу убихинона с образованием убихинола.

NADH + + Q+ 2Na+i„ NAD+ + QH2 + 2Na+0lIt (1)

Данная окислительно-восстановительная реакция сопряжена с векторным переносом двух ионов натрия через мембрану, т.е. соотношение Na+/e" для NQR равно 1 [Bogachev et al., 1997]. Хотелось бы отметить, что эффективность запасания энергии Na+-транслоцирующими КАВН:хинон-оксидоредуктазами в грубом приближении в два раза меньше по сравнению ВГ-транслоцируюгцими КАОН:хинон-оксидоредуктазами, в случае которых стехиометрия Н7е~ равна 2 [Wikstrom, 1984; Galkin et al., 1999].

Так как ионы натрия являются обязательными участниками катализируемой NQR реакции, то ее скорость зависит от концентрации Na+, и данный процесс практически полностью отсутствует в средах, истощенных по этому иону. При физиологических значениях ионной силы зависимость скорости реакции (1) от концентрации Na+ представляет собой гиперболу [Bogachev et al., 2001]. В этих условиях значения Km(Na+) для NQR из различных объектов находятся в миллимолярной области концентраций [Unemoto et al., 1977; Bogachev et al., 2001], и в случае фермента из V. harveyi это значение равно ~3 мМ [Bogachev et al., 2001]. NQR абсолютно специфичен по отношению к Na+. Все другие исследованные ионы не способны вызывать подобного активирующего действия на реакцию (1). Они лишь оказывают на нее неспецифическое стимулирующее воздействие, так как при увеличении ионной силы повышается сродство NQR к Na+ [Unemoto et al., 1977].

Важно отметить, что NQR даже в отсутствие ионов натрия не способен к транслокации протонов [Tokuda et al., 1985; Zhou et al., 1999]. Транспорт натрия ферментом сопровождается генерацией трансмембранного электрического потенциала (Ay) [Tokuda et al., 1985; Zhou et al., 1999]. В отсутствие Av|/, способного вызвать электрофоретический ток протонов через мембрану, не наблюдается какого-либо катализируемого NQR Na7H+-обмена. Это означает, что во время каталитического цикла NQR протоны, высвобождающиеся при окислении NADH, выделяются в цитоплазму, а протоны, необходимые для образования убихинола, также поглощаются с цитоплазматической стороны мембраны [Zhou et al., 1999]. Таким образом, NQR является первичной электрогенной натриевой помпой.

NQR довольно специфичен по отношению к NADH. Он не окисляет NADPH и из искусственных аналогов взаимодействует лишь с dNADH и тио-NADH [Zhou et al., 1999; Bourne and Rich, 1992].

На настоящий момент известно лишь относительно небольшое количество ингибиторов NQR. Недавно был описан антибиотик корормицин, специфически блокирующий NQR на уровне его взаимодействия с убихиноном [Hayashi et al., 2001b, Yoshikawa et al., 1999]. Корормицин действует на фермент неконкурентно по отношению к хинону, и константа ингибирования для него составляет -0,1 нМ [Yoshikawa et al., 1999]. Похожим действием на NQR обладает и HQNO [Tokuda and Unemoto, 1984], но сродство этого ингибитора к ферменту значительно хуже и приблизительно равно 0,3-0,4 мкМ [Zhou et al., 1999; Yoshikawa et al., 1999]. Также NQR чувствителен к действию низких концентраций ионов серебра [Asano et al., 1985] и некоторых других тяжелых металлов (Cd2+, Pb2+, Zn2+, Cu2+) [Bourne and Rich, 1992]. Эти ионы воздействуют на самые первые реакции каталитического цикла NQR, возможно препятствуя взаимодействию фермента с NADH [Bourne and Rich, 1992].

NQR кроме реакции (1) in vitro может осуществлять трансдегидрогеназную реакцию, перенося электроны с NADH на tho-NAD+. Данная активность не зависит от концентрации ионов натрия, ингибируется ионами тяжелых металлов и не чувствительна к HQNO [Bourne and Rich, 1992].

Выделенный фермент при взаимодействии с растворимыми хинонами кроме хинон-редуктазной реакции (реакции 1) может также осуществлять так называемую NADH-дегидрогеназную реакцию [Hayashi and Unemoto, 1984]. Данная активность заключается в одноэлектронном восстановлении растворимого хинона (менадиона, Qo, Qi и т.д.) или какого-то другого акцептора электронов (гексаамминорутения (III), феррицианида и т.д.). Как и трансдегидрогеназная активность, NADH-дегидрогеназная активность не зависит от концентрации ионов натрия, ингибируется ионами тяжелых металлов и не чувствительна к HQNO и корормицину [Hayashi et al., 2001b; Bourne and Rich, 1992; Hayashi and Unemoto, 1984]. Для осуществления данной реакции, по-видимому, достаточно функционирования одной субъединицы NqrF [Tan et al., 1996; Turk et al., 2004].

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Богачев, Александр Валерьевич

выводы

1. Предложен метод определения стехиометрии NaVe" для первичных натриевых помп в бактериальных клетках. С использованием этого метода установлено, что стехиометрия Na+/e" для N а+-транс л о цируюгцей NADH.xhhoh оксидоредуктазы равна 1.

2. Ка+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза из V. harveyi была очищена и охарактеризована. Показано, что фермент в дополнение к нековалентно связанному FAD содержит также остаток FMN, ковалентно связанный с субъединицей NqrC.

3. Очищенная Иа+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза была встроена в липосомы. На данной реконструированной системе была исследована генерация и ДрН. Показано, что необходимые для восстановления убихинона протоны захватываются ферментом с цитоплазматической стороны мембраны.

4. Иа+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза из V. harveyi была изучена с помощью ЭПР- и оптической спектроскопии. Показано, что в окисленных и полностью восстановленных препаратах этого белка присутствуют два флавиновых радикала с различными характеристиками. Один из них детектируется в окисленном ферменте и является нейтральным флавосемихиноном. Второй обнаруживается в полностью восстановленном ферменте и является анионным флавосемихиноном.

5. Исследована кинетика восстановления Ка+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазы в присутствии NADH при различных концентрациях Na+. Показано, что эта кинетика состоит из трех различных фаз. Установлено, что скорость первой фазы не зависит от концентрации Na+, в то время как скорости второй и третьей фаз являются натрий-зависимыми. Первая фаза восстановления NQR определена как процесс двух-электронного восстановления нековалентно связанного FAD до FADH2, в то время как вторая и третья фазы представляют собой поочередное одноэлектронное восстановление двух ковалентно-связанных остатков FMN (восстановление нейтрального флавосемихинона до FMNH2 для второй фазы и восстановление окисленнной формы FMN до анионного флавосемихинона для третьей фазы). Восстановление ковалентно связанных остатков FMN зависит от концентрации ионов натрия с измеряемой константой активации 3,4 мМ. Это значение близко к значению Км для Na+ при функционировании фермента в стационарных условиях.

6. Проведено окислительно-восстановительное титрование простетических групп Na+-транслоцирующей NADH:xmhoh оксидоредуктазы и установлены значения их среднегочечных потенциалов. Найдено, что значения редокс-потенциалов всех оптически-видимых кофакторов NQR не зависят от концентрации натрия в среде измерения.

7. Методом 23№-ЯМР определены параметры связывания ионов натрия с Na+-транслоцирующей NADH:xhhoh оксидоредуктазой. Установлено, что константа диссоциации по Na+ для окисленной формы белка составляет 24 мМ, тогда как для восстановленной NQR - 30 мкМ. Таким образом, восстановление NQR приводит к 1000-кратному увеличению сродства фермента к сопрягающему иону. Проведено окислительно-восстановительное титрование сродства NQR к ионам натрия при 2 мМ [Na4"]. Это титрование описывается законом Нернста с Ет около -300 мВ и n = 1. Полученные данные указывают на то, что механизм сопряжения NQR основан на модуляции его ионной аффинности редокс состоянием простетической группы этого фермента. На основе результатов исследования NQR предложен возможный механизм функционирования Na+-транслоцирующей NADHixhhoh оксидоредуктазы.

8. Показано, что такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию nqr генов V. harveyi и К. pneumoniae, кодирующих N а+- т р ан ело цир у ю щу ю NADH:xhhoh оксидоредуктазу. В то же время, экспрессия nqr V. harveyi и К. pneumoniae в значительной степени зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии. Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V. harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов.

9. При исследовании электрон-транспортных цепей азотофиксирующей бактерии А. vinelandii и термогенного растения A. orientate, показано, что скоординированная индукция активностей компонентов несопряженной альтернативной ветви дыхательной цепи является универсальным механизмом для осуществления ускоренного дыхания, что может быть использовано для теплопродукции, понижения внутриклеточной концентрации кислорода, регуляции метаболических потоков или каких-либо других функций.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Богачев, Александр Валерьевич, 2007 год

1. Берцова Ю.В., и Богачев А.В. (2002) Функционирование терминальной оксидазы ¿¿¿з-типа у Azotobacter vinelandii. Биохимия, 67,750-756.

2. Берцова Ю.В., Попов В.Н. и Богачев А.В. (2004) Окисление NADH митохондриями термогенного растения Arum orientale. Биохимия, 69, 712-718.

3. Берцова Ю.В., Демин О.В. и Богачев А.В. (2005) Дыхательная защита нитрогеназного комплекса у Azotobacter vinelandii. Успехи биол. химии, 45, 205-234.

4. Берцова Ю.В., Попов В.Н., и Богачев А.В. (2004) Окисление NADH митохондриями термогенного растения Arum orientale. Биохимия, 69,712-718.

5. Богачев А.В. и Верховский М.И. (2005) Иа+-транслоцирующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза достигнутый прогресс и перспективы исследований. Биохимия, 70, 177- 185.

6. Борисов В.Б. (1996) Цитохром bd: структура и свойства. Биохимия, 61, 786-799.

7. Григолава И.В., Константинов А.А., Ксензенко М.И., Рууге Э.К., и Тихонов А.Н. (1982) Взаимодействие убисемихинона с сукцинатдегидрогеназой и с цитохромной цепью митохондрий. Биохимия 47, 1970-1982.

8. Гривенникова В.Г., и Виноградов А.Д. (2003) Митохондриальный Комплекс I. Успехи биол. химии, 43, 19-58.

9. Львов Н.П. (1987) 43е ежегодные Баховские чтения. М.: "Наука", 7-14.

10. Манухов И.В., Берцова Ю.В., Трофимов Д.Ю., Богачев А.В., и Скулачев В.П. (2000) Изучение белка HI0220 из Haemophilus influenzae нового структурного и функционального аналога белка АгсВ из Escherichia coli. Биохимия, 65, 1564-1571.

11. Скулачев, В. П. (1989) Энергетика биологических мембран, М., Наука.

12. Тихонов А.Н., и Самарский А.А. (1972) Уравнения математической физики. М.: "Наука".

13. Хмель И.А., Габинская К.Н., и Иерусалимский Н.Д. (1965) Рост и азотфиксация Azotobacter vinelandii в условиях различной аэрации Микробиология. 34, 689-694.

14. Хмель И.А., и Габинская К.Н. (1965) Влияние аэрации на рост Azotobacter vinelandii при использовании различных соединений углерода. Микробиология, 34, 763-767.

15. Ackrell, В.А., and Jones, C.W. (1971) The respiratory system of Azotobacter vinelandii. I Properties of phosphorylating respiratory membranes. Eur. J. Biochem., 20, 22-28.

16. Ackrell, B.A., and Jones, C,W. (1971) The respiratory system of Azotobacter vinelandii. 2. Oxygen effects. Eur. J. Biochem., 20, 29-35.

17. Ackrell, B.A., Erickson, S.K., and Jones, C.W. (1972) The respiratory-chain NADPH dehydrogenase of Azotobacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 26, 387-392.

18. Affourtit, C., Albury, M. S., Crichton, P. G., and Moore, A. L. (2002) Exploring the molecular nature of alternative oxidase regulation and catalysis. FEBS Lett., 510, 121126.

19. Alexeyev, M.F. (1999) The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors for gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of gramnegative bacteria. Biotechniques, 26, 824-828.

20. Asano, M., Hayashi, M., Unemoto, T„ and Tokuda, H. (1985) Ag+-sensitive NADH dehydrogenase in the Na+-motive respiratory chain of the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Agric. Biol. Chem., 49, 2813-2817.

21. Barquera, B., Hase, C.C., and Gennis, R.B. (2001) Expression and mutagenesis of the NqrC subunit of the NQR respiratory Na+ pump from Vibrio cholerae with covalently attached FMN. FEBSLett., 492, 45-49.

22. Barquera, B., Zhou, W., Morgan, J.E., and Gennis, R.B. (2002) Riboflavin is a component of the Na+-pumping NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 10322-10324.

23. Bauer, C.E., Elsen, S., and Bird, T.H. (1999) Mechanisms for redox control of gene expression. Annu. Rev. Microbiol, 53, 495-523.

24. Bergman, B., Gallon, J.R., Rai, A.N., and Stal, L.J. (1997) N2 fixation by non-heterocystous cyanobacteria. FEMSMicrobiol. Rev., 19, 139-185.

25. Bertsova, Y.Y., Bogachev, A.V., and Slculachev, Y.P. (1997) Generation of protonic potential by the bd-type quinol oxidase of Azotobacter vinelandii. FEBS Lett., 414, 369372.

26. Bertsova, Y.V., Bogachev, A.V., and Skulachev, V.P. (1998) Two NADH ubiquinone oxidoreductases of Azotobacter vinelandii and their role in the respiratory protection. Biochim. Biophys. Acta, 1363, 125-133.

27. Bertsova, Y.V., Bogachev, A.V., and Skulachev, V.P. (2001) Noncoupled NADH:ubiquinone oxidoreductase of Azotobacter vinelandii is required for diazotrophic growth at high oxygen concentrations. J. Bacteriol, 183, 6869-6874.

28. Bertsova, Y.V., and Bogachev, A.V. (2004) The origin of the sodium-dependent NADH oxidation by the respiratory chain of Klebsiella pneumoniae. FEBS Lett., 563, 207-212.

29. Bilous, P.T., and Weiner, J.H. (1985) Dimethyl sulfoxide reductase activity by anaerobically grown Escherichia coli HB101. J. Bacteriol, 162, 1151-1155.

30. Bilous, P.T., and Weiner, J.H. (1985) Proton translocation coupled to dimethyl sulfoxide reduction in anaerobically grown Escherichia coli HB101. J. Bacteriol, 163, 369-375.

31. Bilous, P.T., Cole, S.T., Anderson, W.F., and Werner, J.H. 1988. Nucleotide sequence of the dmsABC operon encoding the anaerobic dimethylsulfoxide reductase of Escherichia coli. Mol. Microbiol., 2, 785-795.

32. Bjorklof, K., Zickermann, V., and Finel, M. (2000) Purification of the 45 kDa, membrane bound NADH dehydrogenase of Escherichia coli (NDH-2) and analysis of its interaction with ubiquinone analogues. FEBSLett., 467, 105-110.

33. Bogachev, A.V., Murtazina, R.A., and Skulachev, V.P. (1996) H+/e" stoichiometry for the NADH dehydrogenase I and dimethyl sulfoxide reductase in anaerobically grown Escherichia coli cells. J. Bacteriol, 178, 6233-6237.

34. Bogachev, A. V., Murtazina, R. A., and Skulachev, V. P. (1997) The Na+/e" stoichiometry of the Na+-motive NADH:quinone oxidoreductase in Vibrio alginolyticus. FEBSLett., 409, 475-477.

35. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Barquera, B., and Verkhovsky, M.I. (2001) Sodium-dependent steps in the redox reactions of the Na+-motive NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio hcirveyi. Biochemistry, 40, 7318-7323.

36. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Ruuge, E.K., Wikstrom, M., and Verkhovsky, M.I. (2002) Kinetics of the spectral changes during reduction of the Na+-motive NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochim. Biophys. Acta, 1556, 113120.

37. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Bloch, D.A., and Verkhovsky, M.I. (2006) Thermodynamic properties of the redox centers of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase. Biochemistry, 45, 3421-3428.

38. Brigle, K.E., Newton, W.E., and Dean, D.R. (1985) Complete nucleotide sequence of the Azotobacter vinelandii nitrogenase structural gene cluster. Gene, 37, 37-44.

39. Bull, T.E. (1972) Nuclear magnetic relaxation of spin-3/2 nuclei involved in chemical exchange. J. Magn. Reson., 8, 344-353.

40. Calhoun, M.W., and Gennis, R.B. (1993) Demonstration of separate genetic loci encoding distinct membrane-bound respiratory NADH dehydrogenases in Escherichia coli. J. Bacteriol, 175, 3013-3019.

41. Collins, M. J., Arciero, D. M., and Hooper, A. B. (1993) Optical spectropotentiometric resolution of the hemes of hydroxylamine oxidoreductase. Heme quantitation and pH dependence ofEn. </ Biol. Chem., 268, 14655-14662.

42. Cook, N. D., and Cammack, R. (1985) Effects of temperature on electron transport in Arum maculatum mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 827, 30-35.

43. Cornelis A., Laszlo P. (1979) Sodium binding sites of gramicidin A: sodium-23 nuclear magnetic resonance study. Biochemistry, 18, 2004-2007.

44. Cotter, P.A., Chepuri, V., Gennis, R.B., and Gunsalus, R.P. (1990) Cytochrome o (cvoABCDE) and d icydAW) oxidase gene expression in Escherichia coli is regulated by oxygen, pH and the fnr gene product. J. Bacteriol., 172, 6333-6338.

45. Cotter, P.A., and Gunsalus, R.P. (1989) Oxygen, nitrate, and molybdenum regulation of dmsABC gene expression in Escherichia coli. J. Bacteriol., 171, 3817-3823.

46. Cottingham, I. R., and Moore, A. L. (1984) Partial purification and properties of the external NADH dehydrogenase from cuckoo-pint {Arum maculatwri) mitochondria. Biochem. J., 224, 171-179.

47. Couperwhite, I., and McCallum, M.F. (1975) Polysaccharide production and the possible occurrence of GDP-D-mannose dehydrogenase in Azotobacter vinelandii. Antonie Van Leeuwenhoek, 41, 25-32.

48. Dalton, H., and Postgate, J.R. (1969) Growth and physiology of Azotobacter chroococcum in continuous culture. J. Gen. Microbiol., 56, 307-319.

49. DeLuca, G., Asso, M., Belaich, J.P., and Dermoun, Z. (1998) Purification and characterization of the HndA subunit of NADP-reducing hydrogenase from Desulfovibrio fructosovorans overproduced in Escherichia coli. Biochemistry, 37, 26602665.

50. Dimroth, P., and Thomer, A. (1989) A primary respiratory Na+ pump of an anaerobic bacterium: the Na+-dependent NADH:quinone oxidoreductase of Klebsiella pneumoniae. Arch Microbiol, 151, 439-444.

51. Duffy, E.B., and Barquera, B. (2006) Membrane topology mapping of the Na+-pumping NADH: quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae by PhoA-green fluorescent protein fusion analysis. J. Bacteriol., 188, 8343-8351.

52. Ellis, W. R„ Jr., Wang, H., Blair, D. F„ Gray, H. B., and Chan, S. I. (1986) Spectroelectrochemical study of the cytochrome a site in carbon monoxide inhibited cytochrome c oxidase. Biochemistry, 25, 161-167.

53. Erickson, S.K., Ackrell, B.A., and Jones, C.W. (1972) The respiratory-chain dehydrogenases of Azotobacter vinelandii. Biochem. J., 127, 73-74.

54. Fay, P. (1992) Oxygen relations of nitrogen fixation in cyanobacteria. Microbiol. Rev., 56, 340-373.

55. Ferguson, S.J. (1998) Nitrogen cycle enzymology. Curr. Opin. Chem. Biol., 2, 182-193.

56. Friedrich, T., and Scheide, D. (2000) The respiratory complex I of bacteria, archaea and eukarya and its module coMMon with membrane-bound multisubunit hydrogenases. FEBS Lett, 479, 1-5.

57. Fu, H.-A., Iuchi,S., and Lin, E.C.C. (1991) The requirement of ArcA and Fnr for peak expression of the cyd operon in Escherichia coli under microaerobic conditions. Mol. Gen. Genet., 226, 209-213.

58. Galkin, A.S., Grivennikova, V.G., and Vinogradov, A.D. (1999) H+/2e" stoichiometry in NADH-quinone reductase reactions catalyzed by bovine heart submitochondrial particles. FEBSLett., 451, 157-161.

59. Gemperli, A.C., Dimroth, P., and Steuber, J. (2002) The respiratory complex I (NDH I) from Klebsiella pneumoniae, a sodium pump. J. Biol. Chem277, 33811-33817.

60. Gemperli, A.C., Dimroth, P., and Steuber, J. (2003) Sodium ion cycling mediates energy coupling between complex I and ATP synthase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 839844.

61. Georgellis, D„ Kwon, O., Lin, E.C., Wong, S. M., and Akerley, B. J. (2001) Redox signal transduction by the ArcB sensor kinase of Haemophilus influenzae lacking the PAS domain. J. Bacteriol., 183, 7206-7212.

62. Goin, J.T., and Olson, J.S. (1979) The rate of oxygen uptake by human red blood cells. J. Biol. Chem., 254, 1178-1190.

63. Gostimskaya, I. S., Grivennikova, V. G., Zharova, T. V., Bakeeva, L. E., and Vinogradov, A. D. (2003) In situ assay of the intramitochondrial enzymes: use of alamethicin for permeabilization of mitochondria. Anal. Biochem., 313,46-52.

64. Grandjean, J., and Laszlo, P. (1977) Sodium complexation by the calcium binding site of parvalbumin. FEBS Lett., 81, 376-380.

65. Grivennikova, V. G., Kapustin, A. N., and Vinogradov, A. D. (2001) Catalytic activity of NADH-ubiquinone oxidoreductase (complex I) in intact mitochondria. Evidence for the slow active/inactive transition. J. Biol. Chem., 276, 9038-9044.

66. Haddock, B.A., and Jones, C.W. (1977) Bacterial respiration. Bacteriological Reviews, 41,47-99.

67. Hase, C. C., and Mekalanos, J. J. (1999) Effects of changes in membrane sodium flux on virulence gene expression in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 3183-3187.

68. Hase, C.C., Fedorova, N.D., Galperin, M.Y., and Dibrov, PA. (2001) Sodium ion cycle in bacterial pathogens: evidence from cross-genome comparisons. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 353-370.

69. Hayashi, M., and Unemoto, T. (1984) Characterization of the Na+-dependent respiratory chain NADH:quinone oxidoreductase of the marine bacterium, Vibrio alginolyticus, in relation to the primary H" pump. Biochim. Biophys. Acta, 767, 470-478.

70. Hayashi, M., Hirai, K., and Unemoto, T. (1995) Sequencing and the alignment of structural genes in the nqr operon encoding the Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 363,75-77.

71. Hayashi, M., Nakayama, Y., and Unemoto, T. (2001b) Recent progress in the Na+-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. Biochim. Biophys. Acta, 1505, 37-44.

72. Hill, S. (1988) How is nitrogenase regulated by oxygen? FEMSMicrobiol. Rev., 54, 111130.

73. Hill, S., Austin, S., Eydmann, T., Jones, T., and Dixon, R. (1996) Azotobacter vinelandii NIFL is a flavoprotein that modulates trancriptional activation of nitrogen-fixation genes via a redox-sensitive switch. Proc. Natl. Acad Set. USA, 93, 2143-2148.

74. Hinchliffe, P., and Sazanov, L.A. (2005) Organization of iron-sulfur clusters in respiratory complex 1. Science, 309, 771-774.

75. Hoefnagel, M. H. N., Rich, P. R., Zhang, Q., and Wiskich, J. T. (1997) Substrate kinetics of the plant mitochondrial alternative oxidase and the effects of pyruvate. Plant Physiol., 115, 1145-1153.

76. Hoffman, P.S., Morgan, T.V., and DerVartanian, D.V. (1979) Respiratory-chain characteristics of mutants of Azotobacter vinelandii negative to tetramethyl-p-phenylenediamine oxidase. Eur. J. Biochem., 100, 19-27.

77. Hoffman, P.S., Morgan, T.Y., and DerVartanian, D.V. (1980) Respiratory properties of cytochrome c-dificient mutants of Azotobacter vinelandii. Eur. J. Biochem., 110, 349354.

78. Hubbard, P.S. (1970) Nonexponential nuclear magnetic relaxation by quadrupole interactions. J. Chem. Phys., 53, 985-987.

79. Ingledew, W.J., and Poole, R.K. (1984) The respiratory chains of Escherichia coli. Microbiol. Rev., 48, 222-271.

80. Ito, K. (1999) Isolation of two distinct cold-inducible cDNAs encoding plant uncoupling proteins from the spadix of skunk cabbage (Symplocarpus foetidus). Plant Sci., 149, 167173.

81. Ito, K., Abe, Y., Johnston, S. D., and Seymour, R. S. (2003) Ubiquitous expression of a gene encoding for uncoupling protein isolated from the thermogenic inflorescence of the dead horse arum Helicodiceros muscivorus. J. Exp. Bot., 54, 1113-1114.

82. James, W. O., and Beevers, H. (1950) The respiration of Arum spadix. A rapid respiration, resistant to. cyanide. New Phytol, 49, 353-374.

83. Jasaitis, A., Borisov, V.B., Belevich, N.P., Morgan, J.E., Konstantinov, A.A., and Verkhovsky, M.I. (2000) Biochemistry, 39, 13800-13809.

84. Jones, R.W. (1979) Hydrogen-dependent proton translocation by membrane vesicles from Escherichia coli. Biochem. Soc. Trans., 7, 1136-1137.

85. Jones, R.W. (1980) Proton translocation by the membrane-bound formate dehydrogenase of Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett., 8, 167-171.

86. Jones, C.W., and Redfearn, E.R. (1966) Electron transport in Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 113, 467-481.

87. Jones, C.W., and Redfearn, E.R. (1967) The cytochrome system of Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 143, 340-353.

88. Jones, C.W., Ackrell, B.A., and Erickson, S.K. (1971) Respiratory control in Azotobacter vinelandii membranes. Biochim. Biophys. Acta, 245, 54-62.

89. Jones, C.W., Brice, J.M., Wright, V., and Ackrell, B.A. (1973) Respiratory protection of nitrogenase in Azotobacter vinelandii. FEES Lett., 29, 77-81.

90. Junemann, S. (1997) Cytochrome bd terminal oxidase. Biochim. Biophys. Acta, 1321, 107-127.

91. Junemann, S., Butterworth, P.J., and Wrigglesworth, J.M. (1995) A suggested mechanism for the catalytic cycle of cytochrome bd terminal oxidase based on kinetic analysis. Biochemistry, 34, 14861-14867.

92. Junemann, S., and Wrigglesworth, J.M. (1996) Cytochrome bd oxidase from Azotobacter vinelandii. Purification and quantitation of the oxygen reduction site. J. Biol. Chem., 270, 16213-16220.

93. Jurtshuk, P.Jr., Mueller, T.J., and Wong, T.Y. (1981) Isolation and purification of the cytochrome oxidase of Azotobacter vinelandii. Biochim. Biophys. Acta, 637, 374-382.

94. Kolonay Jr.J.F., Moshiri, F., Gennis, R.B., Kaysser, T.M., and Maier, R.J. (1994) Purification and chracterization of the cytochrome bd complex from Azotobacter vinelandii: comparison to the complex from Escherichia coli. J. Bacteriol., 176, 41774181.

95. Kolonay, J.F., and Maier, R.J. (1997) Formation of pH and potential gradients by the reconstituted Azotobacter vinelandii cytochrome bd respiratory protection oxidase. J. Bacteriol, 179,3813-3817.

96. Kranz, R.G., and Gennis, R.B. (1985) Immunological investigation of the destribution of cytochromes related to the two terminal oxidases of of Escherichia coli in the other gram-negative bacteria. J. Bacteriol, 161, 709-713.

97. Leif, H, Sled, V.D., Ohnishi T., Weiss, H., and Friedrich, T. (1995) Isolation and characterization of the proton-translocating NADH: ubiquinone oxidoreductase .rom Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 230, 538-548.

98. Lemasters, J.J., Grunwald, R., and Emaus, R.K. (1984) Thermodynamic limits to the ATP/site stoichiometrics of oxidative phosphorylation by rat liver mitochondria. J. Biol. Chem., 259, 3058-3063.

99. Lin, E.C.C., and Iuchi, S. (1991) Regulation of gene expression in fermentative and respiratory systems in Escherichia coli and related bacteria. Annu. Rev. Genet., 25, 361 -387.

100. Linkerhagner, K., and Oelze, J. (1996) Cellular ATP levels and Nitrogenase switchoff upon oxygen stress in chemostat cultures of Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol., 177, 5289-5293.

101. Malpica, R„ Sandoval, G.R., Rodriguez, C., Franco, B., and Georgellis, D. (2006) Signaling by the arc two-component system provides a link between the redox state of the quinone pool and gene expression. Antioxid. Redox. Signal., 8, 781-795.

102. Massey, V. (2000) The chemical and biological versatility of riboflavin, Biochem. Soc. Trans., 28, 283-296.

103. Massey, V., and Palmer, G. (1966) On the existence of spectrally distinct classes of flavoprotein semiquinones. A new method for the quantitative production of flavoprotein semiquinones. Biochemistry, 5, 3181-3189.

104. Matsushita, K., Ohnishi, T., and Kaback, H.R. (1987) NADH-ubiquinone oxidoreductases of the Escherichia coli aerobic respiratory chain. Biochemistry, 26, 7732-7737.

105. Maynard, R.H., Premakumar, R., and Bishop, P.E. (1994) Mo-independent nitrogenase 3 is advantageous for diazotrophic growth of Azotobacter vinelandii on solid medium containing molybdenum. J. Bacteriol, 176, 5583-5586.

106. Mcintosh, L. (1994) Molecular biology of the alternative oxidase. Plant Physiol., 105, 781-786.

107. M0ller, I. M. (2002) A new dawn for plant mitochondrial NAD(P)H dehydrogenases. Trends Plant Sci., 7, 235-237.

108. Monoi, H. (1985) Nuclear magnetic resonanceof Na ions interacting with thegramicidin channel. Biophys. J., 48, 643-662.

109. Moshiri, F., Chawla, A., and Maier, R.J. (1991) Cloning, characterization, and expression in Escherichia coli of the genes encoding the cytochrome d oxidase complex from Azotobacter vinelandii. J. Bacteriol, 173, 6230-6241.

110. Murataliev, M.B. (1999) Application of electron spin resonance (ESR) for detection and characterization of flavoprotein semiquinones. Methods Mol. Biol., 131, 97-110.

111. Nakamura, T., Tokuda, H., and Unemoto, T. (1982) Effect of pH and monovalent cations on the potassium ion exit from the marine bacterium Vibrio alginolyticus, and the manipulation of the cellular cation contains. Biochim. Biophys. Acta, 692, 389-396.

112. Nakamura, T., Tokuda, H., and Unemoto, T. (1986) N-ethylmaleimide desensitizes pH-dependence of K+/H+ antiporter in a marine bacterium, Vibrio alginolyticus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 136, 1030-1035.

113. Nakayama, Y., Hayashi, M., and Unemoto, T. (1998) Identification of six subunits constituting Na'-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. FEBSLett., 422, 240-242.

114. Nakayama, Y., Yasui, M., Sugahara, K., Hayashi, M., and Unemoto, T. (2000) Covalently bound flavin in the NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBSLett., 474, 165-168.

115. Osborne, J.P., and Gennis, R.B. (1999) Sequence analysis of cytochrome bd oxidase suggests a revised topology for subunit I. Biochim. Biophys. Acta, 1410, 32-50.

116. Padan, E., Venturi, M., Gerchman, Y., and Dover, N. (2001) Na+/H+ antiporters. Biochim. Biophys. Ada, 1505,144-157.

117. Palmer, G., Muller, F., and Massey, Y. (1971) Electron paramagnetic resonance studies on flavoprotein radicals, in: H. Kamin, (Ed.), Flavins and Flavoproteins, University Park Press & Butterworths, Baltimore & London, pp. 123-139.

118. Pfenninger-Li, X.D, and Dimroth, P. (1995) The Na+-translocating NADH-ubiquinone oxidoreductase from the marine bacterium Vibrio alginolyticus contains FAD but not FMN. FEBS Lett, 369, 173-176.

119. Pfenninger-Li, X.D., Albracht, S.P.J., van Belzen, R,, and Dimroth, P. (1996) NADH:ubiquinone oxidoreductase of Vibrio alginolyticus: purification, properties, and reconstitution of the Na+ pump. Biochemistry, 35, 6233-6242.

120. Poole, R.K. (1994) Oxygen reactions with bacterial oxidases and globins: binding, reduction and regulation. Antonie van Leewenhoek, 65, 289-310.

121. Poole, R.K., and Hill, S. (1997) Respiratory protection of nitrogenase activity in Azotobacter vinelandii roles of the terminal oxidases. Biosci. Rep., 17, 303-317.

122. Popov, V. N., Markova, O. V., Mokhova, E. N., and Skulachev, V. P. (2002) Effects of cold exposure in vivo and uncouplers and recouplers in vitro on potato tuber mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1553,232-237.

123. Post, E., Golecki, J.R., and Oelse, J. (1982) Morphological and ultrastructural variations in Azotobacter vinelandii growing in oxygen-controlled continous culture. Arch. Microbiol., 133, 75-82.

124. Post, E,, Kleiner, D., and Oelse, J. (1983) Whole cell respiration and nitrogenase activities in Azotobacter vinelandii growing in oxygen controlled continuous culture. Arch. Microbiol, 134, 68-72.

125. Pozzan, T., Miconi, V., DiVergilio, F., and Azzone, G.F. (1979) H+/site, charge/site, and ATP/site ratios at coupling sites I and II in mitochondrial e" transport. J. Biol. Chem., 254, 10200-10205.

126. Rey, L., and Maier, R.J. (1997) Cytochrome c terminal oxidase pathway of Azotobacter vinelandii-. analysis of cytochrome c4 and c5 mutants and up-regulation of cytochrome independent pathways with N2 fixation. J. Bacteriol, 179, 7191-7196.

127. Rich, P.R., Meinier, B., and Ward, B. (1995) Predicted structure and possible ion-motive mechanism of the sodium-linked NADH-quinone oxidoreductase of Vibrio alginolyticus. FEBSLett, 375, 5-10.

128. Roberts, T. H., Fredlund, K. M., and Moller, I. M. (1995) Direct evidence for the presence of two external NAD(P)H dehydrogenases coupled to the electron transport chain in plant mitochondria. FEBS Lett., 373, 307- 309.

129. Robson, R.L., and Postgate, J.R. (1980) Oxygen and hydrogen in biological nitrogen fixation. Annu. Rev. Microbiol., 34, 183-207.

130. Sabra, W., Zeng, A.P., Lunsdorf, H., and Deckwer, W.D. (2000) Effect of oxygen on formation and structure of Azotobacter vinelandii alginate and its role in protecting nitrogenase. Appl. Environ. Microbiol., 66, 4037-4044.

131. Sambasivarao, D., and Weiner, J.H. (1991) Dimethyl sulfoxide reductase of Escherichia coli: an investigation of function and assembly by use of in vivo complementation. J. Bacteriol, 173, 5935-5943.

132. Satoh, T., Miyoshi, H., Sakamoto, K., and Iwamura, H. (1996) Comparison of the inhibitory action of synthetic capsaicin analogues with various NADH-ubiquinone oxidoreductases. Biochim. Biophys. Acta, 1273, 21-30.

133. Seymour, R. S. (2001) Biophysics and physiology of temperature regulation in thermogenic flowers. Biosci. Rep., 21, 223-236.

134. Shah, V.K., and Brill, W.J. (1977) Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3249-3253.

135. Shen, J., Dean, D.R., and Newton, W.E. (1997) Evidence for multiple substrate-reduction sites and distinct inhibitor-binding sites from an altered Azotobacter vinelandii nitrogenase MoFe protein. Biochemistry, 36, 4884-4894.

136. Shi, N.Q., Cruz, J., Sherman, F., and Jeffries, T.W. (2002) SHAM-sensitive alternative respiration in the xylose-metabolizing yeast Pichia stipitis. Yeast, 19, 1203-1220.

137. Siedow, J. N., and Umbach, A. L. (1995) Plant mitochondria. electron transfer and molecular biology. Plant Cell, 7, 821-831.

138. Skulachev, V.P. (1984) Sodium bioenergetics. Trends Biochem. Sci., 9,483-485.

139. Skulachev, V. P. (1989) The sodium cycle: a novel type of bacterial energetics. J. Bioenerg. Biomembr., 21, 635-647.

140. Sled, V.D., Friedrich, T„ Leif, H., Weiss, H., Meinhardt, S.W., Fukumori, Y., Calhoun, M.W., Gennis, R.B., and Ohnishi, T. (1993) Bacterial NADH quinone oxidoreductases: iron-sulfur clusters and related problems. J. Bioenerg. Biomembr., 25, 347-356.

141. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem., 150, 76-85.

142. Spiro, S., Roberts, R.E., and Guest, J.R. 1989. Fnr-dependent repression of the ndh gene of Escherichia coli and metal ion requirement for /w-regulated gene expression. Mol. Microbiol., 3,601-608.

143. Stankovich, M.T., Schopfer, L.M., and Massey, V. (1978) Determination of glucose oxidase oxidation-reduction potentials and the oxygen reactivity of fully reduced and semiquinoid forms. J. Biol Chem., 253,4971-4979.

144. Steuber, J. (2001) The Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase (NDH I) from Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli: implications for the mechanism of redox-driven cation translocation by complex I. J. Bioenerg. Biomembr., 33, 179-186.

145. Steuber, J., Rufibach, M., Fritz, G„ Neese, F., and Dimroth, P. (2002) Inactivation of the Na+-translocating NADH ubiquinone oxidoreductase from Vibrio alginolyticus by reactive oxygen species. Eur. J. Biochem., 269, 1287-1292.

146. Svensson, A. S., and Rasmusson, A. G. (2001) Light-dependent gene expression for proteins in the respiratory chain of potato leaves. Plant J., 28, 73-82.

147. Svensson, A. S., Johansson, F. I., Moller, I. M., and Rasmusson, A. G. (2002) Cold stress decreases the capacity for respiratory NADH oxidation in potato leaves. FEBS Lett., 517, 79-82.

148. Suefuji, K., Lin, S.J., Wakagi, T., Matsuzawa, H., and Yoshimura, E. (2002) Sodium-23 and lanthanum-139 nuclear magnetic resonance studies of cation binding to aqualysin I, a thermostable serine protease. Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 1281-1286.

149. Thony-Meyer, L., Beck, C., Preisig, O., and Hennecke, H. (1994) The ccoNOQP gene cluster codes for a cb-type cytochrome oxidase that functions in aerobic respiration of Rhodobacter capsulatus. Mol. Microbiol., 14, 705-716.

150. Timonin, I.M., Dvoryantsev, S.N., Petrov, V.Y., Ruuge, E.K., and Levitsky, D.O. (1991) Interaction of alkaline metal ions with Ca -binding sites of Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum: Na-NMR studies. Biochim. Biophys. Acta, 1066, 43-53.

151. Tokuda, H., and Unemoto, T. (1981) A respiration-dependent primary sodium extrusion system functioning at alkaline pH in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 102,265-271.

152. Tokuda, H., and Unemoto, T. (1982) Characterisation of the respiration-dependent Na+ pump in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 257, 10007-10014.

153. Tokuda, H., and Unemoto, T. (1984) Na+ istranslocated at NADH:quinone oxidoreductase segment in the respiratory chain of Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 259, 7785-7790.

154. Tokuda, H., Sugasawa, M., and Unemoto, T. (1982) Roles of Na+ and K+ in a-aminoisobutyric acid transport by the marine bacterium Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 257, 788-794.

155. Turk, K., Puhar, A., Neese, F., Bill, E., Fritz, G., and Steuber, J. (2004) NADH oxidation by the Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae: functional role of the NqrF subunit. J. Biol Chem., 279,21349-21355.

156. Unden, G., Becker, S., Bongaerts, J., Holighaus, G., Schirawski, J.,-and Six, S. (1995) 02-Sensing and 02-dependent gene regulation in facultatively anaerobic bacteria. Arch. Microbiol., 164, 81-90.

157. Urry, D.W., Trapane, T.L., Venkatachalam, C.M., and McMichens, R.B. (1989) Ion interactions at membranous polypeptide sites using nuclear magnetic resonance: determining rate and binding constants and site locations. Methods Enzymol., 171, 286342.

158. Vercesi, A. E., Martins, I. S., Silva, M. A. P, Leite, H. M. F., Cuccovia, I. M., and Chaimovich, H. (1995) PUMPing plants. Nature, 375, 24.

159. Vinogradov, A.D. (1993) Kinetics, control, and mechanism of ubiquinone reduction by the mammalian respiratory chain-linked NADH-ubiquinone reductase. J. Bioenerg. Biomembr., 25, 367-375.

160. Wagner, A. M., and Moore, A. L. (1997) Structure and function of the plant alternative oxidase: its putative role in the oxygen defence mechanism. Biosci. Rep., 17, 319-333.

161. Werner, J.H., Maclsaac, D.P., Bishop, R.E., and Bilous, P.T. (1988) Purification and properties of Escherichia coli dimethyl sulfoxide reductase, an iron-sulfur molybdoenzyme with broad substrate specificity. J. Bacteriol., 170, 1505-1510.

162. Weiss, H., Friedrich, T., Hofhaus, G., andPreis, D. (1991) The respiratory-chain NADH dehydrogenase (complex I) of mitochondria. Eur. J. Biochem., 197, 563-576.

163. Wikstrom, M. (1984) Two protons are pumped from the mitohondrial matrix per electron transfered between NADH and ubiquinone. FEBSLett., 169, 300-304.

164. Wikstrom, M., and Penttila, T. (1982) Critical evaluation of the proton-translocating property of cytochrome oxidase in rat liver mitochondria. FEBS Lett., 144, 183-189.

165. Wikstrom, M., Bogachev, A., Finel, M., Morgan, J.E., Puustinen, A., Raitio, M., Verkhovskaya, M., and Verkhovsky, M.I. (1994) Mechanism of proton translocation by the respiratory oxidases. The histidine cycle. Biochim. Biophys. Acta, 1187, 106-111.

166. Williams, A.M., and Wilson, P.W. (1954) Adaptation of Azotobacter cells to tricarboxylic acid substrates. J. Bacteriol, 67, 353-360.

167. Wissenbach, U., Ternes, D., and Unden, G. (1992) An Escherichia coli mutant containing only demethylmenaquinone, but no menaquinone: effects on fumarate, dimethylsulfoxide, trimethylamine N-oxide and nitrate respiration. Arch. Microbiol, 158, 68-73.

168. Wu, G., Hill, S., Kelly, M.J.S., Sawers, G., and Poole, R.K. (1997) The cydR gene product, required for cytochrome bd expression in obligate aerobe Azotobacter vinelandii, is an FNR-like protein. Microbiology, 143, 2197-2207.

169. Yagi, T. (1990) Inhibition by capsaicine of NADH quinone oxidoreductases is correlated with the presence of energy-coupling site I in various organisms. Arch. Biochem. Biophys., 281, 305-311.

170. Yagi, T. (1991) Bacterial NADH-quinone oxidoreductases. J. Bioenerg. Biomembr., 23, 211-225.

171. Yates, M.G. (1988). The nitrogen and sulphur cycles. I.A. Cole and S.I. Ferguson (ed.), University Press, Cambridge, 42, 386-416.

172. Young, I.G., Rogers, B.L., Campbell, H.D., Jaworowski, A., and Shaw, D.C. (1981) Nucleotide sequence coding for the respiratory NADH dehydrogenase of Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 116, 165-170.

173. Zambrano, M.M., and Kolter, R. (1993) Escherichia coli mutants lacking NADH dehydrogenase I have a competitive disadvantage in stationary phase. J. Bacteriol., 175, 5642-5647.

174. В заключении мне хотелось бы выразить сердечную благодарность Владимиру Петровичу Скулачеву и Михаилу Иосифовичу Верховскому, которых я рассматриваю как основных моих научных Учителей, и без которых представленная работа была бы невозможной.