Изучение морфогенетического потенциала Withania somnifera L. и биологической активности его экзометаболитов in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Алрашиди Ашраф Айял Мутар

• Алрашиди Ашраф Айял Мутар
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Алрашиди Ашраф Айял Мутар

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Биохимическая характеристика Withania somnífera

1.2 Противовоспалительные свойства Withania somnífera

1.3 Противоопухолевые свойства Withania somnifera

1.4 Антистрессовый эффект Withania somnifera

1.5 Антиоксидантное действие Withania somnifera

1.6 Иммуномодулирующие свойства Withania somnifera

1.7 Гематопоэтический эффект Withania somnifera

1.8 Общетонизирующее действие Withania somnifera

1.9 Воздействие Withania somnifera на нервную систему

1.10 Влияние Withania somnifera на эндокринную систему

1.11 Воздействие Withania somnifera на сердечно-сосудистую и дыхательную системы

1.12 Исследование общей токсичности Withania somnifera

1.13 Особенности культивирования Withania somnifera in vitro

Глава 2. Материал и методы исследований

2.1 Биологическая характеристика объекта исследования

2.2 Методы исследований в лабораторных условиях

2.3 Математическая обработка данных

Глава 3. Изучение морфогенетического потенциала Withania

somnifera L. в условиях in vitro

3.1 Получение стерильной культуры

3.2 Влияние различных регуляторов роста на размножение ашваганды in vitro

3.2.1 Влияние БАП на размножение ашваганды in vitro

3.2.2 Влияние кинетина на размножение ашваганды in vitro

3.2.3 Влияние препарата Дропп на размножение ашваганды in

vitro

3.2.4 Влияние препарата Цитодеф на размножение ашваганды

in vitro

3.3 Получение каллусной культуры ашваганды

3.4 Регенерация растений из каллусной ткани

3.5 Получение суспензионной культуры

Глава 4. Получение растительных экстрактов Withania

somnífera L. и изучение их биологической активности

4.1 Определение антифунгицидного действия растительных экстрактов Withania somnifera на грибах рода Fusarium L

4.2 Действие изучаемых экстрактов Withania somnifera на раковые клетки человека

4.3 Тест система для определения биологической активности изучаемых экстрактов Withania somnifera

Выводы

Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение морфогенетического потенциала Withania somnifera L. и биологической активности его экзометаболитов in vitro»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В последнее время все больший интерес

исследователей привлекают работы с лекарственными растениям как

источниками веществ вторичного синтеза, которые широко применяются в

фармакологии, медицине, ветеринарии, пищевой и других отраслях

промышленности. Особый интерес заслуживают растения, вторичные

метаболиты которых обладают широким спектром действия, в частности

антимикробным, антифунгицидным, а также обладают противораковой

активностью. Однако, многие из таких ценных лекарственных растений на

сегодняшний момент находятся на грани исчезновения, являются редкими и

занесены в Красную книгу. Это обусловлено неконтролируемым сбором

растительного сырья, ограниченностью ареала распространения ценной

культуры, а также воздействием факторов абиотической и биотической

природы. Преодолеть постоянное сокращение запасов растительных

ресурсов возможно благодаря применению методов биотехнологии, и в

частности, клеточной инженерии растений. Среди известных методов

наибольшую популярность получил метод клонального микроразмножения

растений in vitro (Mohammad, Aliabbas, Kumar, Rajkumar, 2009), который

широко применяется для многих ценных лекарственных растений,

находящихся, например, на грани исчезновения. Это связанно с тем, что

данные технологии имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими

(традиционными) способами размножения растений в условиях in vivo.

Например, соматические клетки любых растений, таких как тропических или

альпийских, можно легко размножить в неограниченном количестве в

лабораторных условиях, чтобы в дальнейшем получить из них

специфические метаболиты в необходимых масштабах. В культуре in vitro

образуются дифференцированные или дедифференцированные клетки,

например, каллусные или суспензионные, из которых в дальнейшем легче

экстрагировать фитовещества, чем из соматических клеток интактного

растения. Кроме того, исследователями было показано, что у лекарственных

4

растений, размноженных in vitro, содержание вторичных метаболитов более стабильно и однородно, по сравнению с таковыми у их диких или культурных видов (Yamada, Shoyama, Nishioka, Kohda, Namera, 1991).

Кроме того, применение культуры изолированных тканей и органов растений позволяет решать вопрос о получении веществ вторичного синтеза путем выращивания в условиях in vitro дедифференцированных каллусных клеток и суспензионной культуры.

Одной из перспективных культур является ашваганда (Withania somnifera) (синонимы зимняя вишня, индийский женьшень или физалис солнечнолистный) (Singh, 1998). Растение относится к семейству Пасленовые (Solanaceae), в котором насчитывается 84 рода и около 3000 видов, произрастающих по всему миру. Представители этого семейства - растения родов Withania и Physalis - играют важную роль в народной медицине Юго-Восточной Азии, например, в системах медицины Унани и Аюрведы (Hepper,1991, Jaffer, 1988, Kirtikar, 1991, Asthana, 1989). Двадцать три известных вида Withania широко распространены в засушливых районах тропических и субтропических зон, от Канарских островов, Средиземноморского региона и Северной Африки до Юго-Западной Азии (Panwar, 2006, Sharma, 2004, Singh, 1998, Warrier, 1996). Среди них только два вида - W. somnifera и W. coagulans - имеют большое значение для медицины и произрастают в нескольких регионах (Sharma, 2004, Singh, 1998, Warrier, 1996).

Растения ашваганды (Withania somnifera) уже более 3000 лет

применяют в народной медицине при лечении физиологических заболеваний,

а также для поддержания молодости, выносливости, силы и здоровья

человека (Devi, Sharada, Solomon, Kamath, 1992, Furmanowa, Gajdzis-Kuls,

Ruszkowska, Czarnocki, 2001, Kirtikar,1991, Warrier, 1996). Это обусловлено

тем, что во всех частях растения (листьях, коре, плодах, семенах, и в большей

степени в корне) синтезируются такие вещества как сапонины, гликозиды,

стероидные лактоны, олигосахариды, витанолид, а также свободный

5

витаферин А (агликон), обладающий цитотоксическим (противоопухолевыми) действием. Все эти свойства делают данную культуру привлекательной для исследований как в условиях in vitro, так и in vivo. Однако, в связи с тем, что работы по культивированию Withania somnifera in vitro малочисленны, а приведенные результаты противоречивы и плохо воспроизводимы, исследования по разработке регламента клонального микроразмножения актуальны, особенно в рамках дальнейшего изучения вторичных метаболитов в растениях-регенерантах, каллусной и суспензионной культурах.

Цель работы - изучить морфогенетический потенциал растений ашваганды (Witania somnifera L.) и установить биологическую активность его экзометаболитов in vitro.

Для решения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

- получить хорошо растущую стерильную культуру Withania somnifera L. и установить оптимальные режимы предобработки семян;

- изучить влияние факторов гормональной природы на клональное микроразмножение, каллусогенез и морфогенез Withania somnifera L.;

- установить регламент культивирования дедифференцированных клеток Withania somnifera L. для получения суспензионной культуры и проанализировать ее основные характеристики;

- получить растительные экстракты из растений-регенерантов и каллусной ткани и изучить их биологическую активность на раковых клетках человека, грибах рода Fusarium, а также на семенах растений разных таксономических групп.

Научная новизна работы. Впервые в России проведены комплексные

исследования по изучению морфогенетического потенциала изолированных

эксплантов Withania somnifera in vitro, получены растительные экстракты и

изучена их биологическая активность. Показано, что морфогенетический

потенциал эксплантов зависит от предобработки семян, состава питательной

6

среды, а также типа первичного экспланта. Выявлено, что клонировать растения Withania somnifera возможно не только за счет активации развития существующих меристем, но и за счет индукции образования адвентивных почек непосредственно на изолированных листовых эксплантах.

На основании результатов исследований установлено, что исследуемые цитокинины оказали разное действие на морфогенез Withania somnifera in vitro. Испытанные цитокинины по своей активности можно ранжировать следующим образом: 1 - препарат Дропп (0,05 мг/л), 2 - БАП (0,5 мг/л), 3 -кинетин (1 мг/л) 4 - препарат Цитодеф (0,01 мг/л).

Экспериментально установлено, что для быстрого получения хорошо пролиферирующей каллусной ткани целесообразно добавлять в состав питательной среды 2,4-Д в концентрации 2 мг/л в сочетании с кинетином 0,5 мг/л, а для получения растений-регенерантов применять БАП в концентрации 0,5 мг/л.

Показано, что состав питательной среды, и в часности, гормональный и витаминно-минеральный комплекс (ВМК), оказывают существенное положительное влияние на получение суспензионной культуры Withania somnífera и ее ростовые характеристики. Установлено, что прирост биомассы клеток к концу пассажа увеличивается в среднем на 120%.

Впервые из дифференцированных и дедифференцированных клеточных культур получены растительные экстракты и изучена их биологическая активность на грибах рода Fusarium L., раковых клетках линии HeLa (рак шейки матки человека), а также на семенах растений разных таксономических групп. Установлено, что экстракты из дифференцированных клеток обладают большим антифунгицидным действием, цитотоксическим эффектом, а также рост стимулирующей активностью.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные

результаты могут быть использованы в работах по клонированию ценных

лекарственных растений, а также в исследованиях по получению и изучению

7

веществ вторичного синтеза. Кроме того, результаты могут быть применены в учебном процессе для студентов, обучающихся по направлению «Агрономия» и «Биотехнология», при чтении лекций и проведении практических занятий по таким дисциплинам как: «Культура тканей и органов растений», «Сельскохозяйственная биотехнология», «Прикладная биотехнология», «Основы биотехнологии», «Физиология растений».

Положения, выносимые на защиту.

1. Особенности условий культивирования первичных эксплантов для получения дифференцированных и дедифференцированных клеточных культур.

2. Биологическая активность растительных экстрактов, полученных из дифференцированных и дедифференцированных клеточных культур Withania somnifera.

Методология и методы исследования. Экспериментальная часть диссертационной работы выполнена с использованием методов культуры клеток и тканей, а также биохимических анализов, которые проведены на современном оборудовании.

Публикации по теме диссертации. Основные результаты диссертации изложены в 11 публикациях, из которых 4 статьи опубликованы в журналах из списка ВАК РФ.

Степень достоверности и апробация результатов работы.

Материалы диссертации были апробированы на международных и

российских конференциях: Международной научно-практической

конференции, посвященной 129-й годовщине со дня рождения академика

Н.И. Вавилова (Саратов, 2016); XVII Всероссийская молодежная научная

конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и

ветеринарии» (Москва, 2017 г.); Международный научный форум «Биология

и Биотехнология ХХ1 веке», (Астана, Казахстан, 2017 г.); Международный

симпозиум «8ЕАВ2017» (Минск, Белоруссия, 2017 г.); Российская

конференция «Агробиотехнологии» (Москва, 2017 г.); Международная

8

конференция «Актуальные проблемы ботаники и охраны природы», посвященной 150-летию со дня рождения профессора Г. Ф. Морозова, (Симферополь, 2017 г.).

Личный вклад автора. Все исследования на каждом этапе работы проведены диссертантом лично. Автором совместно с научным руководителем разработана программа, направление, выбраны методы исследований, а также проведено обсуждение результатов и подготовка публикаций.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах компьютерного текса, состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов исследования, экспериментальной части (2 главы), выводов и списка цитированной литературы, который включает 152 источников, из которых 115 на иностранном языке. Диссертационная работа содержит 2 таблицы и 56 рисунков.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Природные лекарственные вещества, полученные из растений, в отличие от искусственно созданных препаратов, играют важную роль в системе здравоохранения различных стран мира, а поиск альтернативных путей по производству целевых лекарственных соединений из растений остается актуальным направлением исследований.

В настоящее время для сохранения, массового производства и получения, необходимых для человека фитопрепаратов из ценных лекарственных растений, применяют методы биотехнологии. Среди известных методов наибольшую популярность получил метод культивирования каллусных и суспензионных культур в условиях in vitro, который широко применяется для многих ценных лекарственных растений, находящихся, например, на грани исчезновения.

Одним из перспективных растений для изучения в культуре in vitro является ашваганда (Withania somnifera), которое принадлежит к семейству Пасленовых (Solanaceae) и в диком виде произрастает в сухих частях субтропических районов Индии, Конго, Южной Африки, Египта, Иордании, Пакистана, Афганистана и т.д., а в Непале, например, осуществляется его плантационное выращивание. В традиционной системе это растение используется в качестве сильного афродизиака, для лечения нервного истощения, памяти, бессонницы, а также проблем с усталостью, заболеваниями кожи и при кашле. Биологически активными веществами Withania somnifera являются алкалоиды, стероидные соединения, сапонины, глюкозиды, крахмал, восстанавливающийся сахар, различные аминокислоты (аспарагиновая кислота, пролин, тирозин, аланин, глицин, глутаминовая кислота, триптофан) и большое количество железа. Кроме того, в корнях этого растения синтезируется свободный витаферин А, обладающий противоопухолевой активностью.

1.1 Биохимическая характеристика Withania somnifera

Растения ашваганды (Withania somnifera) широко используется в аюрведической и традиционной медицине Индии. Данное растение является одним из компонентов многих препаратов, использующихся для лечения различных заболеваний опорно-двигательной системы (например, артриты, ревматизм), в качестве общеукрепляющего и тонизирующего средства, для улучшения общего состояния здоровья и долголетия, а также профилактики заболеваний у спортсменов, пожилых людей, а также во время беременности (Chatterjee A, Pakrashi SC, 1995; Bone K.,1996).

Известно много фармакологических исследований, направленных на изучение вторичных метаболитов ашваганды с целью подтверждения ее использования в качестве многоцелевого лекарственного средства. Например, были изучены противовоспалительные свойства данного растения с целью его дальнейшего использования при воспалительном артрите (Anbalagan K, Sadique J., 1981, 1984; Somasundaram S, Sadique J, Subramoniam A., 1983), а также экспериментальным путем было установлено его антистрессовое, противоопухолевое, иммуномодулирующее, кроветворное, омолаживающее и радиосенсибилизирующее действие (Dadkar V.N., Ranadive N.U., Dhar H.L.,1983; Archana R., Namasivayan A., 1999; Dhuley J.N., 1998; Singh N., Nath R., Lata A., et al., 1982; Singh N., Singh S.P., Nath R., et al., 1987; Devi PU, Sharada A.C., Solomon F.E., Kamath M.S., 1992; Devi P.U., 1996; Devi P.U., Sharada A.C., Solomon F.E., 1995; Sharad A.C., Solomon F.E., Devi P.U., et al., 1996). Кроме того, ашваганда благотворно воздействует на эндокринную, сердечно-легочную и центральную нервную системы. Для подтверждения механизма действия этих эффектов были проведены предварительные исследования на животных.

Поскольку многие направления использования ашваганды не были

научно подтверждены, то среди ученых существует скептицизм

относительно того, что многие травы, должны быть, якобы, полезны при

11

различных заболеваниях. В аюрведической медицине существует класс трав, в состав которых входит и Withania somnifera, которые используются как адаптогены, т.е. повышают адаптивные реакции к болезням и вызывают состояние неспецифического повышенного сопротивления (Singh N., Nath R., Lata A., et al., 1982; Lazarev N.V., 1969) при неблагоприятном воздействии физических, химических и биологических стрессовых агентов. Эти вещества относительно безвредны, но на сегодняшний момент до конца еще не известен конкретный механизм их действия и нормализации патологических эффектов. Как правило, в растениях они представлены такими вторичными метаболитами, как гликозидами или алкалоидами (Brekhman I.I., 1967; Brekhman I.I., Dardymov I.V., 1969).

Химический состав Withania somnifera изучен довольно широко. Более 35 химических соединений на сегодняшний момент идентифицированы, извлечены и исследованы у данного растения (Rastogi R.P., Mehrotra B.N., 1988). Среди биологически активных химических составляющих наибольшее распространение получили алкалоиды (изопелетерин, анаферин), стероидные лактоны (витанолид, витанолид с глюкозой на 27 атоме углерода (ситоиндозид IX и X)). Кроме того, растения ашваганды богаты железом. На рисунке 1 изображена химическая структура витанолидов и ситоиндозид IX и X.

Рис. 1 Химическая структура витанолида А и витанолида В http://www.naturalremedy.com/withania-somnifera-ashwagandha.html

1.2 Противовоспалительные свойства Withania somnífera

Эффективность применения ашваганды в различных ревматологических условиях может быть отчасти из-за его противовоспалительных свойств, которые были изучены несколькими авторами. Так, например, в исследованиях Anbalagan и соавт. (Anbalagan K., Sadique J., 1981) корень Withania somnifera (1 г/кг) суспендировали в 2% смоле акации (50 мг/мл) и за один час до индукции воспаления полностью перорально вводили этот адъювант крысам. Эту процедуру осуществляли ежедневно в течение трех суток. В качестве контроля служил вариант с применением фенилбутазона (100 мг/кг). Экспериментально установлено, что использование суспензии Withania somnifera приводило к значительному снижению воспаления, за счет изменения в крови концентраций многих групп сывороточных белков (а2-гликопротеид, а1-белок основной острой фазы, преальбумин). Содержание а2-гликопротеина в сыворотке крови крысы было снижено до неопределяемого уровня только в варианте с использованием суспензии ашваганды. В контрольном варианте с применением фенилбутазона было отмечено увеличение содержания а2-гликопротеина как у здоровых, так и больных артритом крыс. Что касается белка острой фазы (пик 2, а-1- белок основной острой фазы), то при воспалении его содержание увеличилось приблизительно на 200% и снизилось до нормального уровня при лечении суспензией Withania somnifera. В контрольном варианте (применение фенилбутазона) уровень белка удалось снизить лишь только до уровня 132%. Кроме того, использование суспензии Withania somnifera оказало влияние у нормальных крыс и на несколько белковых модуляторов, что возможно, связанно с тем, что некоторые химические соединения растений ашваганды взаимодействуют в процессе синтеза белков печени.

Другие исследования, проведенные Anbalagan и соавт. (Anbalagan K., Sadique J., 1984) показали, что применение W. somnifera вызывало

13

дозозависимое подавление а2-макроглобулина (показатель для противовоспалительных препаратов) в сыворотке крови крыс, которые заранее были инфицированы путем подкожного введения суспензии каррагенана. В качестве тестируемого препарата использовали различные концентрации сухого порошка, полученного из корней ашваганды (500, 1000, 1500 и 1200 мг/кг), которые вводили в виде суспензии перорально за 3-4 часа до индукции воспаления. В результате исследований был отмечен максимальный эффект (около 75%) при концентрации 1000 мг/кг. Однако, следует отметить, что авторами не было проведено фактического измерения воспаления.

В исследованиях Begum и соавт (Begum V.H., Sadique J., 1987) показано, что гранулема возникает в воздушном мешке при подкожной инъекции 4 мл 2%-ого (масса/объем) каррагинана на тыльных крысах-самцах линии Вистар (150-200 г) за одни сутки до введения в спинку 6 мл воздуха. Порошок из корня ашваганды (1000 мг/кг) давали крысам перорально в

32

течение трех суток с 7 по 9 день. Радиоактивный раствор Na2 S04/100 г вводили внутрибрюшинно на 9 сутки, а в митохондриях гранулемной ткани

35

определяли включение S в гликозаминогликан, окислительное фосфорилирование (коэффициент АДФ/О), ферменты Mg - зависимые-Атфазы и активность сукцинат дегидрогеназы. Как показали исследования, в варианте с применением суспензии ашваганды содержание гликозаминогликанов в гранулемной ткани снизилось на 92% по сравнению с 43,6% в контрольном варианте, в котором для лечения применяли гидрокортизон (15 мг/кг). При лечении бутадионом (100 мг/кг) эффекта так же не было получено. Было показано, что лечение суспензией W. somnifera разобщает окислительное фосфорилирование путем значительного снижения соотношения в коэффициенте АДФ/О в митохондриях гранулемной ткани, что в последующем приводит к увеличению ферментов Mg - зависимых-АТФаз и снижению активности сукцинат дегидрогеназы. Никаких

физических измерений воспаления не проводилось.

14

Помимо исследований, приведенных выше, Begum и соавт (Begum V.H., Sadique J., 1988) в своих других исследованиях изучали влияние порошка корня W. somnifera (1000 мг/кг, при введении перорально ежедневно 15 суток) на отечность лапы и костные дегенеративные изменения в артритах, индуцированных адъювантом Фрейнда у крыс. Известно, что для лечения таких симптомов заболевания существует единственный лекарственный препарат - это гидрокортизон (15 мг/кг). Однако исследования Hindawi и соавт. (al Hindawi M.K., al Khafaji S.H., Abdul-Nabi MH.,1992) показали, что использование W. somnifera ингибирует образование гранулемы при имплантации пеллетов у крыс, и данный эффект сопоставим при лечении гидрокортизоном в концентрации 5 мг/кг. Метанольный экстракт W. somnifera (10 мг/кг, 0,1 доза ЛД50) был дан за один час до имплантации пеллетов и продолжалось до тех пор, пока гранулы не были собраны на 4-й день.

Из литературных данных установлено, что при лечении артрита было проведено клиническое исследование использования W. somnifera. В двойном слепом плацебо-контролируемом перекрестном исследовании 42 пациента с остеоартритом были рандомизированы для получения препарата, содержащего вторичные метаболиты ашваганды, или плацебо в течение трех месяцев. Первоначально, в течение одного месяца, до начала лечения проводили ежедневное наблюдение за пациентами, во время которого все предыдущие препараты были изъяты. На этапе предварительного лечения и в момент собственного лечения еженедельно оценивали такие показатели, как боль в суставах и инвалидность, а скорость седиментации эритроцитов (SED) и радиологические исследования проводили ежемесячно. Полученная вытяжка из растений ашваганды значительно уменьшала тяжесть боли (p<0,001) и показатель инвалидности (p <0,05), хотя существенных изменений в радиологических исследованиях состояния или скорости седиментации эритроцитов (SED) не было обнаружено (Kulkarni R.R., Patki P.S., Jog V.P., et al., 1991).

Стоит отметить, что изучение механизма действия растений W. somnifera на противовоспалительные процессы привлекает все большее внимание исследователей. Так, в одном из исследований, проведенном на крысах, было показано, что при применении препарата на основе W. somnifera или препарата оксифенбутазона (ингибитор циклооксигеназы) наблюдалось снижение абсорбции 14С-глюкозы в их тонкой кишке крысы (Somasundaram S, Sadique J, Subramoniam A., 1983) и этот показатель в двух вариантах поддерживался на нормальном уровне. Оба препарата показали противовоспалительный эффект. Аналогичные результаты были получены в параллельных исследованиях с использованием 14С-лейциновой абсорбции из тонкой кишки (Somasundaram S, Sadique J, Subramoniam A., 1983). Эти исследования свидетельствуют о том, что в процессе ингибирования циклооксигеназы может участвовать вторичные вещества ашваганды.

1.3 Противоопухолевые свойства Wthania somnifera

Для того чтобы выявить противоопухолевые и

радиочувствительные эффекты W. somnifera и в дальнейшем использовать ее

при лечении различных форм рака, были проведены некоторые

исследования. Так, была проведена оценка противоопухолевого эффекта

ашваганды на уретан-индуцированные аденомы легких у взрослых мышей-

альбиносов (Singh N., Singh S.P., Nath R., et al., 1986). В исследованиях

использовали несколько вариантов обработки: обработка уретаном (125

мг/кг, без еды 1 раз в 2 недели в течение семи месяцев), обработка W.

somnifera (этаноловый экстракт всего растения, 200 мг/кг, введение

перорально и ежедневно в течение 7 месяцев), одновременное применение

экзометаболитов W. somnifera и уретана, контроль (без обработки).

Исследования показали, что из всех исследуемых вариантов обработки

наиболее значимые результаты были получены в варианте совместного

применения экзометаболитов растения с уретаном, в котором наблюдалось

16

значительное снижение распространение опухоли. Гистологический вид легких животных, которым вводили только экстракт ашваганды, был похож на гистологический вид легких в контрольном варианте. Стоит отметить, что каких-либо неопластических изменений в головном мозге, желудке, почках, сердце, селезенке или яичниках во всех вариантах не было обнаружено. Помимо защиты от канцерогенных эффектов, лечение ашвагандой также предотвратило отрицательные эффекты действия уретана на общее количество лейкоцитов, лимфоцитов, на массу тела и смертность.

Ростингибирующий эффект применения W. somnífera также был обнаружен и при саркоме 180 (S-180) (Devi PU, Sharada A.C., Solomon F.E., Kamath M.S., 1992). Этанольный экстракт корня ашваганды (400 мг/кг и выше, ежедневное применение в течение 15 суток) после внутрикожной инокуляции вызывал полную регрессию опухоли у мышей после первоначального роста. Установлено, что при концентрации данного экстракта 1000 мг/кг была отмечена также полная регрессия (55%), но данная доза оказалась смертельной в некоторых вариантах. Также было обнаружено, что этанольные экстракты ашваганды действует как радио- и теплосенсибилизатор в саркоме S-180 и асцитной карциноме Эрлиха (Devi PU, Sharada A.C., Solomon F.E., Kamath M.S., 1992; Sharada A.C., Solomon F.E., 1995). Противоопухолевый и радиосенсибилизирующий эффекты витаферина (стероидный лактон) были отмечены в асцитной карциноме Эрлиха in vivo (Sharad A.C., Solomon F.E., Devi P.U., et al., 1996). Благодаря витаферину А, полученного из растений ашваганды, коэффициент радиочувствительности составил 1:5, у клеток in vitro, что способствовало гибели У79-клеток китайского хомячка при нетоксичной концентрации около 2 мМ/л (Sharada A.C., Solomon F.E., Kamath M.S., 1992; Devi P.U., 1996; Devi P.U., Sharada A.C., Solomon F.E., 1995). Эти работы еще раз подтвердили исследования ученых, свидетельствующие о наличии противоопухолевой активности вторичных метаболитов ашваганды.

1.4 Антистрессовый эффект Withania somnifera

Антистрессовый эффект ашваганды был наглядно продемонстрирован на мышах и других грызунах. Так, например, для оценки антистрессового эффекта W. somnifera был получен спиртовой экстракт из обезжиренных семян ашваганды, растворенных в нормальном физиологическом растворе, который из расчета 100 мг/кг в виде разовой дозы был введен внутрибрюшинно. Испытания проводили на мышах, которые находились на плаву в воде при температуре 28-30°C (Singh N., Nath R., Lata A., et al., 1982). Контрольный вариант мышей подвергался инъекции только физиологическим раствором. Испытания показали, что применение экстрактов ашваганды привело к двукратному увеличению времени плавания мышей по сравнению с контрольным вариантом. Кроме того, в исследованиях было установлено, что экстракты ашваганды предотвратил как увеличение веса надпочечников, так и снижение содержания аскорбиновой кислоты в надпочечниках, которые обычно возникают в результате эксперимента с плаванием. Ученые предположили, что экстракт W. somnifera индуцирует состояние неспецифического повышенного сопротивления во время стресса. Аналогичные исследования были проведены и на крысах (Archana R., Namasivayan A., 1999). У контрольных крыс показано значительное увеличение уровня кортикостерона в плазме, фагоцитарного индекса и индекса авидности, тогда как у крыс в варианте с W. somnifera , подвергшихся одному и тому же тесту, эти уровни были почти нормальными.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алрашиди Ашраф Айял Мутар, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алрашиди, А.А. Влияние условий культивирования на морфогенетический потенциал изолированных тканей ашваганды (Withania somnifera) in vitro / А.А. Алрашиди, Е.А. Калашникова, Р.Н. Киракосян // Вестник Рязанского государственного

агротехнологического университета им. П.А. Костычева.- 2017.- № 3.- С. 5-8.

2. Алрашиди, А.А. Влияние гормонального состава питательной среды на каллусогенез и морфогенез ашваганды (Witania somnifera L.) in vitro / А.А. Алрашиди, А.А. Соловьев, Е.А. Калашникова, Р.Н. Киракосян // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. -2017.- № 9.- Т. 20.- С. 3-7.

3. Алтанцэцэг, Э. Размножение астрагала монгольского (Astragalus mongholicus Bge.) в условиях in vitro / Э. Алтанцэцэг, Е.А. Калашникова // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2013. - № 6. - С. 40-48.

4. Астафьева, О.В. Исследование возможности применения биологически активных компонентов растительных экстрактов в производстве препаратов для нужд косметологии и фармакологии / О.В.Астафьева // Современные проблемы науки и образования. - 2012. - №6. - С. 106108.

5. Астафьева, О.В. Особенности экстрагирования и применения БАВ с противомикробным действием / О.В. Астафьева, Л.Т. Сухенко, М.А. Егоров // Биотехнологические процессы в народном хозяйстве: Материалы Региональной научной конференции, 15—16 апреля 2008 г. — Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», -2008. -С. 6—8.

6. Астафьева, О.В. Противомикробная активность выделенных биологически активных веществ и экстракта корня Glycyrrhiza glabra L. /

97

О.В. Астафьева, Л.Т. Сухенко, М.А. Егоров // Химия растительного сырья. -2013. - №3. - С. 67—70.

7. Барыкина, Р.П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы / Р.П. Барыкина [и др.]. - М.: Изд-зо МГУ. - 2004. - 312 с.

8. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко. М.: ФБК-Пресс, - 1999. - 160 c.

9. Бутенко, Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения / Р.Г. Бутенко // В сб: Культура клеток растений и биотехнология, под ред. Бутенко Р. Г. М.: Наука, -1986. -с. 3-20.

10. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений / Р.Г. Бутенко. М.: Наука, - 1964. - 350 с.

11. Вечернина, Н.А. Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений / Н.А. Вечернина. - Барнаул: Изд-во Алт. ун-та, - 2004. - 205 с.

12. Голышенков, П.П. Лекарственные растения и их использование / Голышенков, П.П. // Под общ. Ред. Проф. Назарова Г.С. - 4-е изд. -Саранск: Мордов. Кн. Изд.-во, -1982. - 312 с.

13. Евсеева, Т.И. Токсические и цитогенетические эффекты, индуцируемые у Allium cepa L. низкими концентрациями Cd и 232Th / Т.И. Евсеева [и др.] // Цитология и генетика. - 2005. -№ 5. - С. 73 - 80.

14. Калашникова, Е.А. Клеточная инженерия растений: Учебное пособие / Е.А. Калашникова. М.: Изд-во РГАУ-МСХА, - 2012. - 318 с.

15. Калашникова, Е.А. Практикум по сельскохозяйственной биотехнологии. / Е.А. Калашникова, Е.З. Кочиева, О.Ю. Миронова - М.: КолосС. - 2006. - 162 с.

16. Киракосян Р.Н. Влияние растительных экстрактов на морфогенетический потенциал изолированных органов Brassica oleracea L. in vitro / Р.Н. Киракосян, Е.А. Калашникова, Л.Л. Бондарева // Овощи России. - М.:Изд-во ФГБНУ ВНИИССОК, - 2015. - Вып.2. - С. 58-62.

98

17. Киракосян, Р.Н. Получение растений - регенерантов из репродуктивных органов растений капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) in vitro / Р.Н. Киракосян, Е.А. Калашникова // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. - 2015. - № 1. - С. 18-25.

18. Лабораторный практикум по сельскохозяйственной биотехнологии / Е.А. Калашникова, М.Ю. Чередниченко, Н.П. Карсункина, М.Р. Халилуев. Изд. 3-е, испр. и доп. - Изд-во РГАУ-МСХА, - 2014. - 147 с.

19. Носов, А.М. Использование клеточных технологий для промышленного получения биологически активных веществ растительного происхождения / А.М. Носов // Биотехнология, - 2010. -5, - с.8-28.

20. Носов, А.М. Культура клеток высших растений - уникальная система, модель, инструмент / А.М. Носов // Физиология растений, - 1999. -46. -с. 837-844.

21. Носов, А.М. Методы оценки и характеристики роста культур клеток высших растений / А.М. Носов // В сб: Молекулярно генетические и биохимические методы в современной биологии растений, под ред. Кузнецова Вл.В., Кузнецова В.В., Романова Г.А.. М.: БИНОМ, - 2011. -с. 386-403.

22. Носов, А.М. Регуляция синтеза вторичных соединений в культуре клеток растений / А.М. Носов // В сб: Биология культивируемых клеток и биотехнология растений, под ред. Бутенко Р.Г. М.: Наука, - 1991. - с. 5-20.

23. Сагайдак, Г.А. Исследование процесса соэкстракции ценных компонентов из растительного сырья / Г.А. Сагайдак, Г.И Касьянов // Изв. Вузов. Пищевая технология. - 2004. - № 2-3, - с. 192-193.

24. Сагайдак, Г.А. Математическое описание процесса соэкстракции / Г.А. Сагайдак, Г.И Касьянов // Изв. Вузов. Пищевая технология. - 2006. - № 6, - с. 80-81.

25. Сагайдак, Г.А. Совершенствование технологии получения и применения экстрактов из растительного сырья / Г.А. Сагайдак // Диссер. ... канд. техн. наук : 05.18.10 : Краснодар, -2004. -210 c.

26. Самыгин, Г.А. Сравнение разных методов для оценки жизнеспособности клеток суспензионных и каллусных культур / Г.А.Самыгин, Л.А.Волкова, А.С. Попов // Физиология pастений, - 1985. -32. - с. 813817.

27. Ханды, М.Т. Особенности образования стероидных гликозидов в культурах клеток Dioscorea deltoidea, Tribulus terrestris и Trigonella foenum-graecum /М.Т. Ханды. // Автореф. ...канд. биол. наук. - Москва, - 2016. - 23 с.

28. Ханды, М.Т. Влияние синтетических ауксинов на ростовые и биосинтетичекие характеристики суспензионных культур клеток якорцев стелющихся и пажитника греческого / М.Т. Ханды, С.В. Томилова, Д.В. Кочкин, И.М. Иванов, А.М. Носов // Сб. тезисов Научной конференции с международным участием и школы молодых ученых «Сигнальные системы растений: от рецептора до ответной реакции организма». Годичное собрание ОФР, С-Пб.: СПбГУ, - 2016. -с.142.

29. Ханды, М.Т. Получение и характеристика каллусных и суспензионных культур клеток якорцев стелющихся Tribulus terrestris L. - продуцентов стероидных гликозидов / М.Т. Ханды, Д.В. Кочкин, С.В.Томилова, Б.А. Галишев, Е.С. Суханова, А.Г. Клюшин, И.М. Иванов, А.М. Носов // Биотехнология, - 2016. - 32. - с. 21-30.

30. Юрин, В.М. Культура растительных клеток и тканей: технология получения, разнообразие фармакологически активных метаболитов и приемы регуляции их синтеза / В.М. Юрин, Т.И. Дитченко, О.В. Молчан, М.П. Шапчиц, С.Н. Ромашко, А.А. Булатова, А.О. Логвина // Труды БГУ. - 2010, -том 4. - выпуск 2. - с. 1-15.

31. Ahmad, N. Rapid plant regeneration protocol for cluster bean (Cyamopsis tetragonoloba L. Taub.) / N. Ahmad, M. Anis // J. Hortic. Sci. Biotechnol., -2007. - Vol.82. - P.585-589.

32. Altancehcehg, E.H. Razmnozhenie astragala mongol'skogo (Astragalus mongholicus Bge.) v usloviyah in vitro / E.H. Altancehcehg, E.A. Kalashnikova // Izvestiya Timiryazevskoj sel'skohozyajstvennoj akademii. -2013. - № 6. -P. 40-48.

33. Asthana, R. Pharmacology of Withania somnifera (L.) Dunal - a review. / R. Asthana, M.K. Raina // Indian Drugs - 1989. - 26. - P. 199-205.

34. Balakina, A. Astragalus mongholicus Bge. exctracts cytotoxic effect on Hela Cells / A. Balakina, A. Enkhtaivan, E. Kuzmina, E. Kalashnikova, A.Terentiev // 2nd International Symposium Secondary Metabolites. Chemistry, Biology and Biotechnology. 19-23 May. - 2014. -p. 110

35. Ateb, D.A., Antimicrobial activities of various medicinal and commercial plants extracts / D.A. Ateb, T. ErdoUrul // Turk J Biol, - 2003. -27. -p. 157162.

36. Bourrel, C. Chemical analysis and fungistatic properties of some essential oils in a liquid medium. Effects on hyphal morphogenesis / C. Bourrel // Rivista Italiana Eppos. - 1995. - №6. - 31-42 p.

37. De Silva1, M.A.N. In vitro mass propagation and greenhouse establishment of Withania somnifera (L.) Dunal (Solanaceae) and comparison of growth and chemical compounds of tissue cultured and seed raised plants / M.A.N. De Silva1, W.T.P.S.K. Senarath // J. Natn. Sci. Foundation, Sri Lanka. - 2009. -37 (4). - P. 249-255.

38. Devi, P.U. In vivo growth inhibitory effect of Withania somnifera (Ashwagandha) on a transplantable mouse tumor, Sarcoma 180 / P.U. Devi, A.C. Sharada, F.E. Solomon, M.S. Kamath // Ind. Jour. Exp. Biol. - 1992. -30. - P. 169-172.

39. Dharajiya, D. Preliminary phytochemical analysis of the Indian medicinal

plants for antibacterial activity against bovine mastitis pathogens /

101

D.Dharajiya, N.Moitra, B.Patel, R.K.Patel // Wayamba J of Animal Sci, -2012, - No. 1342590628.

40. Dharajiya, D. In vitro Antimicrobial Activity and Qualitative Phytochemical Analysis of Withania somnifera (L.) Dunal Extracts / D. Dharajiya, P. Patel, M. Patel, N. Moitra // Int. J. Pharm. Sci. Rev. Res., - 2014. - 27(2), - No. 60. - P. 349-354.

41. Faisal, M. Shoot multiplication in Rauvolfia tetraphylla L. using thidiazuron / M. Faisal, N. Ahmad, M. Anis // Plant Cell Tiss. Org. Culture, -2005. -Vol. 80. - P. 187- 190.

42. Fatima, N. Thidiazuron induced high frequency axillary shoot multiplication in Withania somnifera L. Dunal / N. Fatima, M. Anis // Journal of Medicinal Plants Research. -2011. -Vol. 5(30). - P. 6681-6687.

43. Furmanowa, M. In vitro propagation of Withania somnifera and isolation of withanolides with immunosuppressive activity / M. Furmanowa, D. Gajdzis-Kuls, J. Ruszkowska, Z. Czarnocki, G. Obidoska, A. Sadowska, R. Rani, S.N. Upadhyay // Planta Medica. - 2001. - 67. - P. 146-149.

44. Joshi, C. Comparative morphometric, physiological and chemical studies of wild and cultivated plant types of Withania somnifera (Solanaceae) / C. Joshi, N.Gajbhiye, A.Phurailatpam, K.A. Geetha, S. Maiti //Curr. Sci. -2010. - 99. -P. 644-650.

45. Gaurav, N. In vitro tissue culture studies from nodal and petiole explants of wild and cultivated traits of Withania somnifera in MS and B5 medium / Naveen Gaurav, AP Singh, Arun Kumar, Deepak Som, Deepak Kumar, Komal, Hira Singh Gariya // Journal of Medicinal Plants Studies. - 2016. -4(2). - P. 92-96.

46. Govindraju, B. High frequency plant regeneration in Ashwagandha (Withania somnifera (L.) Dunal): an important medicinal plant / B. Govindraju, R. Ramgopal, R.B. Venugopal, S.G. Kiran, C.P. Kaviraj, R. Srinath // Plant Cell Biotech. Mol. Biol. - 2003. - 4 (1-2) - P. 49-56.

47. Govindraju, B. High frequency plant regeneration in Ashwagandha (Withania somnifera (L.) Dunal): an important medicinal plant / B. Govindraju, R. Ramgopal, R.B. Venugopal, S.G. Kiran, C.P. Kaviraj, R. Srinath // Plant Cell Biotech. Mol. Biol. - 2003. - 4 (1-2). - P. 49-56.

48. Hepper, F.N. In: Solanaceae III: taxonomy, chemistry, evolution / J.G. Hawkes, R.N. Lester, M. Nee, E. Estrada // Royal Botanic Gardens. - Kew: UK. - 1991. - P. 211-227.

49. Huettman C.A. Thidiazuron: a potent cytokinin for woody plant tissue culture / C.A. Huettman, J.E. Preece // Plant Cell Tiss. Org. Cult., -1993. - Vol.33. -P.105-119.

50. Jaffer, H.J. Evaluation of antimicrobial activity of Withania somnifera extracts / H.J. Jaffer, A.L.M. Jawad, H.S. Saber, A. Al-Naib // Fitoterapia. -1988. - 59. - P. 497-500.

51. Kaileh, M., Withaferin A strongly elicits IkB kinase B hyperphosphorylation concomitant with potent inhibition of its kinase activity / M.Kaileh, W. V.Berghe, A.Heyerick, J.Horion, J.Piette, C.Libert, D.Keukeleire D., T.Essawi, G.Haegeman // J. Biol. Chem. -2007. -V.282, - P. 4253-4264.

52. Kirtikar, K.R. Indian Medicinal Plants / K.R. Kirtikar, B.D. Basu // Shiva Publishers: Dehradun, India. - 1991. - Vol. 3. - P. 1783.

53. Kulkarni, A. Direct in vitro regeneration of leaf explant of Withania somnifera (L.) Dunal. / A. Kulkarni, S. R.Thengane, K. V. Krishnamurthy // Plant Sci. -1996. -V.119, - P. 163- 168.

54. Kulkarni, A.A. Direct shoot regeneration from node, internode, hypocotyls and embryo explants of Witahnia somnifera L. / A.A. Kulkarni, S.R. Thengane, K.V. Krishnamurthy // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 2000. - V. 62. - P. 203-209.

55. Mishra, L.C. Scientific basis for the therapeutic use of Withania somnifera (Aswagaandha), a review / L.C. Mishra, B.B. Singh, S.Dagenais // Altern.Med. Rev. -2000. - V.5. - P. 334-346.

56. Mohammad, Y. K. Recent advances in medicinal plant biotechnology / Y. K. Mohammad, S. Aliabbas, V. Kumar, S. Rajkumar // Indian journal of Biotechnology. 2009. - №8(1). - C. 9-22.

57. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiol. Plant. - 1962. - 15 (13). -P. 473-497.

58. Panwar, J. Distribution of three endangered medicinal plant species and their colonization with arbuscular mycorrhizal fungi / J. Panwar, J.C. Tarafdar, // J. Arid Environ. - 2006. - 65. - P. 337-350.

59. Ramachandran, R. In vitro micropropagation of Withania somnifera (L.) Dunal by different concentrations of growth regulators / R. Ramachandran, K. Amutha // Int. J. Pharm. Bio. Sci. - 2013. - 4(3). - P. 1161 - 1167.

60. Rani, G. Callus induction and plantlet regeneration in Withania somnifera (L.) Dunal. / G. Rani, G. S.Virk, A. Nagpal // In Vitro Cell Dev. Biol.Plant. -2003. -V. 39, - P. 468- 474.

61. Ray, S. Production of withaferin A in shoot culture of Withania somnifera / S. Ray, S. Jha // Planta Med. -2001. -V. 67, - P. 432-436.

62. Rizwana, H. Antibacterial potential of Withania somnifera L. against human pathogenic bacteria / H. Rizwana, A.A. Al Hazzani, AI. Shehata, N.MS. Moubayed //Afr J of Microbiol Res. -2012. -6(22). - P. 4810-4815.

63. Sabir, F. In vitro Withanolide Production by Withania somnifera L. Cultures / F. Sabir, N.S. Sangwan, N.D. Chaurasiya et al. // In vitro Withanolide Production by Withania somnifera L. Cultures, -2008. -P. 409-412.

64. Sabir, F. Micro-propagation CSIR, Govt. of India for financial support as a nationally competitive grant and to the Director of CIMAP for the facilities and support of Withania somnifera L. accessions from axillary meristem for rapid propagation and withanolide production / F.Sabir, N. S.Sangwan, N. D.Chaurasiya, L. N.Misra, R.Tuli, R. S. Sangwan // J. Herbs Spices Med. Plant. -2007. -V.13, - P. 118-128.

65. Sahana, R. In vitro propagation of Wthania somnifera and estimation of withanolides for neurological disorders / R.Sahana, V.K.Teesta, B.Avnish, K.Krithika, B.Savithri // Journal of Pharmacognosy,- 2012. - V. 3, - № 2, -P.85-87.

66. Sangwan, R. S. Phytochemical variability in commercial herbal products and preparations of Withania somnifera (Ashwagandha) / R. S.Sangwan, N. D.Chaurasiya, L. N. Misra, P.Lal, G. C Uniyal, R.Sharma, N. S.Sangwan, K. A.Suri, G. N.Qazi, R.Tuli // Curr. Sci. -2004. -V.86, - P. 461-465.

67. Sathees Kannan, T. M. In vitro mass propagation of Withania somnifera Dunal using seaweed extract / T. M. Sathees Kannan, S. Sownthariya //Anbazhakan international letters of natural sciences, - 2014, - V. 24, - P. 814.

68. Siddique, N.A. Screening of Endangered Medicinal Plants Species by Questionnaire Survey in Barind Tract in Bangladesh. / N.A. Siddique, M.A. Bari, M.M. Pervin, N. Nahar, L.A. Banu et al // Pakistan Journal of Biological Sciences. -2005. -8 (12). - P. 1783-1793.

69. Sharma, N. Mass propagation and GC-MS analysis of critically endangered plant Withania coagulans / Nishesh Sharma, Indra Rautela, Manish Dev Sharma // International Journal of Applied Biology and Pharmaceutical Technology. - 2016. - V.7. - P. 62-70.

70. Sharma, R. Agro-Techniques of Medicinal Plants / Sharma, R. // Daya Publishing House: New Delhi, India. - 2004. - P. 31-33.

71. Singh, S. Withania somnifera: The Indian Ginseng Ashwagandha / S. Singh, S. Kumar // Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants: Lucknow, India. - 1998. - 293 p.

72. Smetanska, I. Production of secondary metabolites using plant cell cultures / I. Smetanska // Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, -2008. - V. 111, - P. 187-228.

73. Suraj, R. A. Induction and Proliferation of in vitro Mass of Callus of Withania somnifera (L.) Dunal. / R. A. Suraj, Pa. Bijaya // Research in Plant Sciences. 2013. - Vol. 1, No. 3. - C. 58-61.

74. Triphati, N., In vitro Micropropogation from nodal explants of Indian medicinal herb, Withania somnifera (L.) Dunal (Ashwaganda) / N. Triphati, T. Murab, A. Chaudhari, P. Chandurkar // International Journal of Advances in Pharmaceutical Research. - 2014. - Vol. 5. - P.91 - 95.

75. Wadegaonkar, P. A. Direct rhizogenesis and establishment of fast growing normal root organ culture of Withania somnifera Dunal. / P. A.Wadegaonkar, K. A.Bhagwat, M. K.Rai // Plant Cell, Tissue Organ Culture, - 2006. -V. 84, - P. 223-225.

76. Warrier, P.K. Indian Medicinal Plants: A Compendium of 500 species / P.K. Warrier, V.P.K. Nambiar, C. Ramankutty // Orient Longman: Hyderabad, India. - 1996. - Vol. 5. - P. 409.

77. Yamada, Y. Clonal micropropagation of Gentiana scabra Bunge var. buregeri Maxim. And examination of the homogeity concerning the gentiopicroside content / Y. Yamada, Y.Shoyama, I. Nishioka, H. Kohda, A. Namera, T. Okamoto // Chemical and pharmaceutical Bulletin. 1991. - №39. - C.204-220.

78. Chatterjee, A. The Treatise on Indian Medicinal Plants / A. Chatterjee, S.C.Pakrashi // -1995. - 4. - P. 208- 212.

79. Bone K. Clinical Applications of Ayurvedic and Chinese Herbs. Monographs for the Western Herbal Practitioner / K.Bone // Phytotherapy Press. -1996. -P. 137-141.

80. Anbalagan, K. Influence of an Indian medicine (Ashwagandha) on acutephase reactants in inflammation. / K. Anbalagan, J.Sadique // Indian J ExpBiol. -1981. -19. -P. 245-249.

81. Anbalagan, K. Role of prostaglandins in acute phase proteins in inflammation / K. Anbalagan, J.Sadique // Biochem Med. -1984. -31. -P. 236-245.

82. Somasundaram, S. Influence of extra-intestinal inflammation on the in vitro absorption of 14C-glucose and the effects of anti-inflammatory drugs in the jejunum of rats / S. Somasundaram, J. Sadique, A. Subramoniam // Clin Exp Pharmacol Physiol.-1983. -10. -P. 147-152.

83. Somasundaram, S. In vitro absorption of [14C] leucine during inflammation and the effect of anti-inflammatory drugs in the jejunum of rats / S. Somasundaram, J. Sadique, A. Subramoniam // Biochem Med. -1983. -29. -P. 259-264.

84. Dadkar, V.N. Evaluation of antistress (adaptogen) activity of Withania somnifera (Ashwagandha) / V.N. Dadkar, N.U. Ranadive, H.L.Dhar // Ind J. Clin Biochem. -1987. -2. - P. 101-108.

85. Archana, R. Antistressor effect of Withania somnifera / R. Archana, A. Namasivayan // J. Ethnopharmacol. -1999. -64. - P. 91-93.

86. Dhuley, J.N. Effect of ashwagandha on lipid peroxidation in stress-induced animals / J.N. Dhuley // J. Ethnopharmacol. -1998. -60. -P. 173-178.

87. Singh, N. Withania somnifera (ashwagandha), a rejuvenating herbal drug which enhances survival during stress (an adaptogen) / N. Singh, R. Nath, A. Lata, et al. // Int J. Crude Drug Res -1982. -20. - P. 29-35.

88. Singh, N. Prevention of urethane-induced lung adenomas by Withania somnifera (L.) Dunal in albino mice / N. Singh, S.P. Singh, R. Nath, et al. //Int J. Crude Drug Res. -1986. -24. - P. 90-100.

89. Devi, P.U. In vivo growth inhibitory effect of Withania somnifera (Ashwagandha) on a transplantable mouse tumor, Sarcoma 180 / P.U. Devi, A.C. Sharada, F.E. Solomon, M.S.Kamath //Indian J. Exp Biol. -1992.-30. -P. 169-172.

90. Devi, P.U. Withania somnifera dunal (ashwagandha): potential plant source of a promising drug for cancer chemotherapy and radiosensitization../ P.U.Devi // Indian J. Exp Biol. -1996. -34. -P. 927-932.

91. Devi, P.U. In vivo growth inhibitory and radiosensitizing effects of withaferin A on mouse Ehrlich ascites carcinoma / P.U. Devi, A.C. Sharada, F.E.Solomon //Cancer Lett. -1995. -95. -P. 189-193.

92. Sharad, A.C. Antitumor and radiosensitizing effects of withaferin A on mouse Ehrlich ascites carcinoma in vivo / A.C. Sharad, F.E. Solomon, P.U. Devi, et al. //Acta Oncol. -1996. -35. - P. 95-100.

93. Lazarev, N.V. Farmacol Toxicol / N.V. Lazarev // Med Sci Serv. -1958. -21.

- P. 81-86.

94. Brekhman, I.I. Panax Ginseng. / I.I. Brekhman // Med Sci Serv. -1967. -4. -P. 17-26.

95. Brekhman, I.I. New substances of plant origin which increase non-specific resistance. / I.I. Brekhman, I.V. Dardymov //Annu Rev Pharmaco.l -1969. -9.

- p. 419-430.

96. Rastogi, R.P. Compendium of Indian Medicinal Plants / R.P. Rastogi, B.N.Mehrotra // Central Drug Research Institute, New Delhi. -1998. - Vol.6.

97. Begum, V.H. Effect of Withania somnifera on glycosaminoglycan synthesis in carrageenin-induced air pouch granuloma / V.H. Begum, J.Sadique // Biochem Med Metabiol. -1987. -38. - P. 272-277.

98. Begum, V.H. Long term effect of herbal drug Withania somnifera on adjuvant induced arthritis in rats. / V.H. Begum, J.Sadique // Indian J Exp Biol. -1988. -26. - P. 877-882.

99. Hindawi, M.K. Anti-granuloma activity of Iraqi Withania somnifera / M.K. Hindawi, S.H. Khafaji, M.H.Abdul-Nabi //J. Ethnopharmacol. -1992. -37. -P. 113-116.

100. Kulkarni, R.R. Treatment of osteoarthritis with a herbomineral formulation: a double-blind, placebo-controlled, cross-over study / R.R. Kulkarni, P.S. Patki, V.P. Jog, et al. //J. Ethnopharmacol. - 1991. -33. - P. 91-95.

101. Bhattacharya, S.K. Antistress activity of sitoindosides VII and VIII, new

acylsterylglucosides from Withania somnifera / S.K. Bhattacharya, R.K. Goel,

R. Kaur, S.Ghosal //Phytotherapy Res. -1987. -1. - P. 32-39.

108

102. Grandhi, A. A comparative pharm acological investigation of Ashwagandha and Ginseng / A Grandhi, A.M. Mujumdar, B.Patwardhan //J. Ethnopharmacol .-1994. -44. - P. 131-135.

103. Halliwell, B. Free Radicals in Biology & Medicine / B. Halliwell, J.M.C.Gutteridge // 2nd ed. Oxford:Clarendon Press; -1989.

104. Ames, B.N. Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging / B.N. Ames, M.K. Shigenaga, T.M.Hagen //Proc Natl Acad Sci U S A. -1993. -90. - P. 7915-7922.

105. Jesberger,J.A. Oxygen free radicals and brain dysfunction./ J.A. Jesberger, J.S. Richardson // Int J Neurosci.- 1991. -57. - P. 1-17.

106. Scarfiotti, C. Free radicals, atherosclerosis, ageing, and related dysmetabolic pathologies: pathological and clinical aspects / C. Scarfiotti, F. Fabris, B.Cestaro, A.Giuliani //Eur J Cancer Prev. -1997. -6. -P. 31-36.

107. Bhattacharya, S.K. Effect of Trasina, an Ayurvedic herbal formulation, on pancreatic islet superoxide dismutase activity in hyperglycaemic rats / S.K. Bhattacharya, K.S. Satyan, A. Chakrabarti // Indian J Exp Bio.l -1997. -35. -P. 297-299.

108. Ghosal ,S. Immunomodulatory and CNS effects of sitoindosides IX and X, two new glycowithanolides from Withania somnifera / S. Ghosal, J. Lal, R. Srivastava, et al. // Phytotherapy Res. -1989. -3. - P. 201-206.

109. Ziauddin, M., Studies on the immunomodulatory effects of ashwagandha / M. Ziauddin, N. Phansalkar, P. Patki, et al. //J Ethnopharmacol. -1996. -50. -P. 69-76.

110. Dhuley, J.N. Effect of some Indian herbs on macrophage functions in ochratoxin A treated mice / J.N. Dhuley // J. Ethnopharmacol. -1997. -58. -P. 15-20.

111. Davis, L. Suppressive effect of cyclophosphamide-induced toxicity by Withania somnifera extract in mice / L. Davis, G.Kuttan //J Ethnopharmacol.-1998. -62. - P. 209-214.

112. Venkataraghavan, S. The comparative effect of milk fortified with aswagandha, aswagandha and punarnava in children - a double-blind study / S. Venkataraghavan, C. Seshadri, T.P. Sundaresan, et al. //J. Res Ayur Sid. -1980. -1. - P. 370-385.

113. Malhotra, C.L. Studies on Withania-ashwagandha, The effect of total alkaloids (ashwagandholine) on the central nervous system / C.L. Malhotra, V.L. Mehta, P.K. Das, N.S.Dhalla // Indian J. Physiol Pharmacol. -1965. -9. - P. 127-136.

114. Schliebs, R. Systemic administration of defined extracts from Withania somnifera (Indian Ginseng) and Shilajit differentially affects cholinergic but not glutamatergic and GABAergic markers in rat brain / R. Schliebs, A. Liebmann, S.K. Bhattacharya, et al. // Neurochem Int. -1997. -30. - P. 181190.

115. Malhotra, C.L. Studies on Withania ashwagandha, The effect of total alkaloids on the smooth muscles / C.L. Malhotra, V.L. Mehta, K. Prasad, P.K.Das // Indian J Physiol Pharmacol. -1965. -9. - P. 9-15.

116. Panda, S. Evidence for free radical scavenging activity of ashwagandha root powder in mice / S. Panda, A.Kar // Indian J. Physiol Pharmacol. - 1997. -41. - P. 424-426.

117. Panda, S. Changes in thyroid hormone concentrations after administration of ashwagandha root extract to adult male mice./ S. Panda, A.Kar// J. Pharm Pharmacol. -1998. -50. - P. 1065-1068.

118. Malhotra, C.L. Studies on Withania ashwagandha. The effect of total alkaloids on the cardiovascular system and respiration / C.L. Malhotra, P.K. Das, N.S. Dhalla, K.Prasad // Indian J. Med Res. -1981. -49. - P. 448-460.

119. Arseculeratne, S.N. Studies of medicinal plants of Sri Lanka. Part 14: Toxicity of some traditional medicinal herbs / S.N. Arseculeratne, A.A. Gunatilaka, R.G.Panabokke // J. Ethnopharmacol. -1985. -13. - P. 323-335.

120. Sharma, S. Effects of long-term administration of the roots of ashwagandha

(Withania somnifera) and shatavari (Asparagus racemosus) in rats / S.

110

Sharma, S. Dahanukar, S.M.Karandikar // Indian Drugs. -1986. -23. - P. 133139.

121. Sangwan, R.S. Withanolide A biogeneration in in vitro shoot cultures of Ashwagandha (Withania somnifera Dunal), a main medicinal plant in Ayurveda / R.S. Sangwan, N.D. Chaurasiya, P. Lal, L. Misra, G.C. Uniyal, R. Tuli, N.S.Sangwan // Chem Pharm Bull. -2007. -55. - P. 1371-1375.

122. Sangwan, R.S. Phytochemical variability in commercial herbal products and preparations of Withania somnifera (Ashwagandha) / R.S. Sangwan, N.D. Chaurasiya, P. Lal, L. Misra, G.C. Uniyal, R. Tuli, N.S.Sangwan // Curr Sci. -2007. -86. - P. 461-465.

123. Ray, S. Production of withaferin A in shoot cultures of Withania somnifera / S. Ray, S.Jha // Planta Med. -2001. -67:4. - P. 32-436.

124. Bandyopadhyay, M. Changes in morphological phenotypes and withanolide composition of Ri-transformed roots of Withania somnifera / M. Bandyopadhyay, S. Jha, D. Tepfer // Plant Cell Rep. -2007.-26. - P. 599-609.

125. George, E.F. Plant growth regulators II: Cytokinins, their analogues and antagonists. / E.F. George, M.A. Hall, G.J. De Klerk // In: George EF, Hall MA, De Klerk GJ (eds) Plant propagation by tissue culture, 3rd edition, Springer, Dordrecht, Netherlands. -2008. -P. 205-206.

126. Roja, G. Tissue cultures of Withania somnifera: morphogenesis and withanolide synthesis / G.Roja, M.Heble, A.Sipahimalani // Phytother. Res. -

1991-5. - P. 185-187.

127. Hussain, F. Germination behaviour of Withania somnifera L / F.Hussain, I.Ilahi // Dunal. Hambard. -1988. -№31, -P. 20-30.

128. Golegaonkar, P.G. High-frequency adventitious shoot bud induction and shoot elongation of chile pepper (Capsicum annuum L.) / P.G. Golegaonkar, A.S. Kantharajah // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. -2006.- 42. - P. 341-344.

129. Sen, J. Micropropagation of Withania somnifera from germinating seeds and shoot tips. / J. Sen, A.K. Sharma // Plant.Cell Tiss. Org. Cult. - 1991. -26. -P. 71- 73.

130. Govindaraju, B. High frequency plant regeneration in ashwagandha (Withania somnifera (L.) Dunal) / B. Govindaraju, S. R. Rao, R. B. Venugopal, S. G. Kiran, C. P. Kaviraj, S. Rao // An important medicinal plant. Pl Cell Biotech. Mol. Bio. -2003. -4. - P. 49-56.

131. Govindaraju, B. In vitro mass propagation of Withania somnifera (L.) Dunal./ B. Govindaraju, S. R. Rao, R. B. Venugopal, S. G. Kiran, C. P. Kaviraj, S. Rao // Nepal Journal of Science and Technology, -2010. -11. - P. 101-106.

132. Abhyankar, G.A., Response of Withania somnifera (L.) Dunal leaf explants in vitro. / G.A. Abhyankar, G.S. Chinchanikar // Phytomorphology.- 1996.-46. - P. 249- 252.

133. Kulkarni, A.A. Direct shoot regeneration from node, internode, hypocotyls and embryo explants of Withania somnifera / A.A. Kulkarni, S.R. Thengane, K.V. Krishnamurthy // Plant Cell. Tiss. Org. Cult. -2000.-62. - P. 203-209.

134. Siddique, N.A. Regeneration of Withania somnifera (L.) Dunal (Ashwagandha) from Nodal Segments Derived Callus an Endangered Medicinal Plant in Bangladesh Islam. / N.A.Siddique, M. A.Bari, S.Sharmin, M.H. Rahman, M.R. Hasan, M.H. Khan // Journal of Biological Sciences. -2004.-4(2). - P. 219-223.

135. Sivanesan, I. An efficient regeneration from nodal explants of Withania somnifera Dunal. / I.Sivanesan, K. Murugesan // Asian journal of Plant Sciences, -2008.-7(6). - P. 551-556.

136. Rani, G. Direct Rhizogenesis from in vitro Leaves of Withania somnifera (L.) Dunal./ G. Rani, S. Arora, A.Nagpal // J. of Herbs, Spices and Medicinal Plants.- 2003. -10(3). - P. 47-53.

137. Rafiq, S. K. Impact of automobile emissions on the productivity of Crocus sativus L. Inter / S. K. Rafiq, B. A. Ganai, G. A.Bhat // J. Environ. Res., -2008. -2(4). - P. 1735-6865.

138. Sharma, M. M.Plant regeneration through in vitro somatic embryogenesis in

ashwagandha (Withania somnifera L. Dunal)./ M. M.Sharma, D. J.Ali,

A.Batra // Researcher, -2010. - 2 (3). - P. 35-45.

112

139. Kalpesh, B. Study of Genetic Transformation of Medicinal Plants, Withania Somnifera (L.) Dunal / B Kalpesh, P.Tejas, B. Chauhan // By Agrobacterium Tumefaciens (MTCC-431)/ ASIAN J.EXP.BIOL.SCI-2012. - 3(3). -P. 536542.

140. Thomas, T.D. Thidiazuron induced high frequency shoot organogenesis from leaf derived callus of medicinal climbers, Tylophora indica (Burm F.) Merrill./ T.D. Thomas, B. Philip // In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. -2005.-41. - P. 124-128.

141. Thomas, T.D. Multiple shoots induction and callus regeneration in Sarcostemma brevistigma Wight & Arnott, a rare medicinal plant / T.D. Thomas, S. Shankar // Plant Biotechnol. -2009. -3. - P. 67-74.

142. Nagesh, K.S. High frequency multiple shoot induction of Curculigo orchioides Gaertn: shoot tip v/s rhizome disc / K.S. Nagesh // Taiwania. -2008. -53. - P. 242-247.

143. Offord, C.A. In vitro propagation of Pimelea spicata R. Br (Thymelaeaceae), an endangered species of the Sydney region, Australia. / C.A. Offord, J.L. Tyler // Plant. Cell. Tiss. Org. Cult. -2009. -98. - P. 19-23.

144. Wadegaonkar, P.A. Direct rhizogenesis and establishment of fast growing normal root organ culture of Withania somnifera Dunal. / P.A. Wadegaonkar, K.A. Bhagwat, M.K. Rai // Plant Cell Tiss. Org. Cult. - 2006. -84. - P. 223225.

145. Misra, H.O. Ashwagandha-Withania somnifera cultivation in India. / H.O. Misra, S. Singh, S. Kumar // Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow. -1997. -No. 5. - P. 22-25.

146. http://alternative-medicina.ru/ashvaganda

147. http://healthyliving.natureloc.com/amukkuram-ashwagandha-indian-ginseng-indian-winter-cherry

148. http://klumba.guru/lekarstvennye-rasteniya/lechebnye-svoystva-i-

org/ashwagandha

113

150. http : //lectrava.ru/herbal/ashvagandha.html.

151. http://www.entheoworld.ru/enteoistoriya/ashvaganda-withania-somnifera.html.

152. http://old.aur.ru/articles/item 234.