Изучение механизмов вирусингибирующего действия соединения 1-бораадамантана (БГ-12) на модели вируса гриппа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Погарская, Ирина Владимировна

• Погарская, Ирина Владимировна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Погарская, Ирина Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика семейства ОгйюхшхоушсЬе

1.2. Морфофункциональные особенности вируса гриппа

1.3. Классификация вирусов гриппа

1.4. Химиотерапия гриппа

1.4.1. Блокаторы М2 - каналов: производные адамантанов

1.4.2. Ингибиторы нейраминидазы

1.4.3. Препараты с расширенным спектром активности

1.4.4. Ингавирин и Триазавирин

1.4.5. Индукторы интерферона и другие химиопрепараты

1.5. Устойчивость вирусов гриппа к химиопрепаратам

1.6. Новый грипп типа А (Н1Ш) и грипп А

ГЛАВА 2. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ВИРУСОВ

2.1. Фосфолипидные монослои как модели клеточных мембран

2.2. Флуоресцентные методы исследования белковых молекул

2.3. Липосомы и их применение в медицине

2.4. Мицеллы

2.5.Эмульсии и их физико-химические характеристики

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МИЦЕЛЛЯРНЫЕ АЭРОЗОЛИ

3.1. Получение аэрозолей

3.2. Применение аэрозолей

ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Химиопрепараты

4.2. Лабораторные животные

4.3. Вирусы

4.4 Ведение культур клеток

4.5. Титрование вирусов гриппа по ЦПД в культуре клеток (MDCK) и в куриных эмбрионах

4.6. Электронная микроскопия

4.7. Определение противовирусной активности

4.8. Определение активности вирионной РНК - зависимой РНК -полимеразы вируса гриппа (А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (H5N2))63

4.9. Получение фосфолипидных монослоёв методом Ленгмюра-БлоджеттбЗ

4.9. Получение мицеллярных фосфолипидных эмульсий

4.10. Основные характеристики мицеллярных фосфолипидных эмульсий

4.11. Получение экспериментальных мицеллярных аэрозолей из фосфолипидных эмульсий

4.12. Статистическая обработка результатов

Глава 5. Результаты собственных исследований и их обсуждение

5.1. Определение количественных характеристик противовирусной активности БГ-12 в отношении вируса гриппа

5.2. Изучение кинетики изменения активности РНК - зависимой РНК -полимеразы при взаимодействии с БГ-12

5.3.Электронная микроскопия вируса гриппа после взаимодействия с БГ -12

5.4. Изучение влияния БГ-12 на вирусную мембрану с применением фосфолипидных монослоев

5.5. Разработка флуоресцентного метода для изучения структурно -функционального состояния вирусных белков на примере гемагглютинина вируса гриппа

5.6. Основные характеристики экспериментальных мицеллярных фосфолипидных эмульсий

5.7. Определение коэффициента осаждения мицеллярного аэрозоля с БГ-12 в респираторном тракте мышей с помощью частиц латекса

ВЫВОДЫ

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БИБЛИОГРАФИЯ

БЛАГОДАРНОСТИ

104

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

БГ-12 - 1 - бораадамантан

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота PIK - датчик - инфракрасный датчик Ка - константа оседания Ки - коэффициент ингибирования КЛ - кардиолипин

ПАВ - поверхностно-активные вещества РНК - рибонуклеиновая кислота ЦПД - цитопатогенное действие

ТРСК-трипсин - три-тозил-1-фенилаланилхлорэтилкетон

ТЦД5о — тканевая цитопатогенная доза, при которой погибает 50 % клеток от исходного количества

ФБР - фосфатно - буферный раствор

ФС - фосфотидилсерин

ФХ- фосфотидилхолин

H3UTP - урацил трифосфат, меченный тритием НА - гемагглютинин

MDCK - перевиваемая культура клеток почек спаниеля NA - нейраминидаза NP - нуклеопротеид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов вирусингибирующего действия соединения 1-бораадамантана (БГ-12) на модели вируса гриппа»

ВВЕДЕНИЕ

В диссертационной работе изложены результаты теоретических и экспериментальных исследований автора, посвященных изучению вирусингибирующего действия БГ-12 в культуре клеток МБСК и на фосфолипидных монослоях из фосфотидилхолина, а также разработке флуоресцентного метода для изучения структурно - функционального состояния вирусных белков на примере гемагглютинина вируса гриппа. В процессе работы был впервые получен экспериментальный мицеллярный аэрозоль в комплексе с противовирусным соединением 1- бораадамантаном (БГ-12) и была проведена оценка его эффективности на модели респираторных органов лабораторных животных (мышей), инфицированных различными штаммами вируса гриппа А. Также в работе представлены результаты использования этих методов для решения задач, связанных с разработкой эффективных противовирусных препаратов.

Актуальность проблемы

Острые респираторные вирусные инфекции, в том числе и грипп, образуют наиболее распространенную группу патологии, которая в структуре инфекционной заболеваемости занимает 95 - 97%. Ежегодно в России эти инфекции поражают от 10 до 40 % всего населения. Материальный ущерб от гриппа превышает затраты на все остальные инфекционные заболевания вместе взятые (6). Гриппозная инфекция у человека определяется сложными взаимодействиями нескольких факторов, включая вирулентность и генетическую специфичность вируса, иммунитет хозяина и, возможно, как генетические факторы, так и факторы внешней среды, которые влияют на передачу вируса в человеческой популяции. Для гриппа характерна определенная сезонность с наивысшей активностью зимой и ранней весной. Факторы окружающей среды в этот период могут иметь значение для передачи вируса гриппа(1, 12, 17). Такие часто возникающие

клинические осложнения, как пневмония, вторичные бактериальные инфекции или обострения имеющейся патологии, опасны для лиц дошкольного, младшего школьного возраста, беременных женщин, лиц пожилого возраста и пациентов с хроническими заболеваниями (4, 7, 20, 21). На сегодняшний день трудно назвать в мире страну, в которой не были отмечены случаи заболевания гриппом, вызванные пандемическим вирусом НШ1 - 2009 (8). Частота госпитализации взрослых с сопутствующими заболеваниями высокого риска возрастает во время крупных эпидемий в 2 - 5 раз, достигая максимальной частоты госпитализаций 800 на 100 000 субъектов из этих групп, что обусловит 1600 «дополнительных» госпитализаций на 1 миллион жителей, если взять за точку отсчета, что 20 % всего населения входят в группу высокого риска (9). В связи с быстрым распространением вирусных инфекций химиотерапия в текущей практике лечения инфекционных заболеваний начинает играть все возрастающую роль (4, 12, 17). За последние 20 лет существенно возросла смертность населения от вирусных заболеваний во всём мире. Анализ положения с разработкой противовирусных препаратов и вакцин против ведущих вирусных инфекций свидетельствует о том, что для большинства вирусных инфекций разрешённые к применению профилактические вакцины отсутствуют, и при этом характерен крайне ограниченный выбор противовирусных препаратов (1, 2). Вакцинопрофилактика единственный на сегодняшний день метод управления гриппозной инфекцией. Она наиболее эффективна (108, 126, 127). Однако, в связи с высокой способностью вируса к точечным мутациям, особенно поверхностных белков, вирус очень быстро уходит от вакцинного пресса (6, 9, 50, 54). Противовирусные препараты и стратегия лечения многих вирусных заболеваний не разработаны, а фундаментальные и клинические исследования в этой области проводятся небольшими группами специалистов. Эпидемия «птичьего» гриппа Н5Ш (1997-2006) и затем пандемия гриппа НШ1у-2009, вызванная вирусом свиного происхождения (НШ1у-2009), сделали настоятельно необходимой ревизию состояния

проблемы с разработкой вакцин и противовирусных препаратов (1, 4, 53, 69, 82, 119). На сегодняшний день медицина имеет в своем распоряжении относительно небольшой перечень высокоспецифических противовирусных средств (химиопрепаратов), которые получили международное признание (1, 61, 65, 101, 117). Противовирусное лекарственное средство, которое используется в медицинской практике, обязательно должно отвечать двум требованиям. Во-первых, оно должно действовать не только на определенный этап репродукции вируса, хотя в идеале этот эффект должен носить строго избирательный характер. Повреждение того или иного этапа репродукции вируса не должно затрагивать процесс жизнедеятельности клеток, органов и целого организма, или иметь другое побочное действие. Во-вторых, сочетание с такими уникальными свойствами должно иметь оптимальную биодоступность при его применении. Его концентрация должна поддерживаться постоянно в организме пациента в процессе всего курса применения препарата. Каркасные фрагменты (би- или полициклы, кольца которых содержат более 2 общих атомов) используются для создания физиологически активных веществ. За счёт этого в органоборанах происходит' ограничение конформационной подвижности молекулы, направленное увеличение липофильности соединения с целью улучшения его фармакологических характеристик (3, 5). Фактически на основе адамантанов за последние 10 лет сложилась стратегия молекулярного дизайна противовирусных препаратов (3-5, 142, 143). Первыми противовирусными препаратами, разрешёнными для лечения вирусных инфекций, были «Амантадин» и «Ацикловир» (11, 12, 13). «Амантадин», или 1-аминоадамантан, используется до настоящего времени в Японии, США и европейских странах. В России вместо «Амантадина» в практику лечения гриппозной инфекции был внедрён более совершенный и менее токсичный препарат «Ремантадин» (11, 12, 14). «Ремантадин» не рекомендуется «НИИ гриппа» РАМН для лечения пандемического гриппа, но на основании объективных данных вследствие циркуляции на территории Российской

Федерации чувствительных к этому препарату сезонных вирусов гриппа типа А, он может применяться с лечебной и профилактической целями в сезонные эпидемии (15, 16, 22-24). Так, вирусы гриппа H5N1, выделенные на территории России, оказались чувствительными к «Ремантадину» (63, 80, 84). Для ряда противовирусных препаратов уровень реализации в моменты пандемий достиг астрономических значений (1). Чрезмерно активные рекомендации ВОЗ по применению «Тамифлю» и других ингибиторов нейраминидазы не совсем соответствовали традициям лечения гриппозной инфекции, например, в России, а требование создания государственных резервов этих препаратов уже в течение 5 лет по мере развития эпидемической обстановки вызвало крайне негативную реакцию в мире (1, 17, 104). По настойчивым рекомендациям ВОЗ в большинстве стран активно использовались ингибиторы нейраминидазы (109, 115). Однако, в период применения этого препарата для лечения тяжёлых случаев «птичьего» гриппа у людей в 2006 году препарат был серьёзно скомпрометирован как в отношении клинической эффективности, так и по широкому спектру побочных эффектов, а позднее быстрым распространением генетических признаков резистентности к «Тамифлю» и другим ингибиторам нейраминидазы (1, 14, 94, 95). Имеются данные о том, что названные лекарственные средства вызывают ряд побочных действий, таких как тошнота, рвота, диарея, а также психические расстройства: нарушение сознания, галлюцинации, психозы (1, 95). Так, из Японии, где активно используется препарат Тамифлю, регулярно поступают сведения о самоубийствах подростков, возможно связанных с приемом данного препарата. Кроме того, имеются данные о появлении устойчивости многих штаммов вируса гриппа к Тамифлю (1, 134). В нашей стране полностью отсутствует- производство вирулицидных препаратов с доказанной способностью к инактивации патогенных вирусов (26, 27). Поэтому и возрос интерес к конструированию новых противогриппозных препаратов, в связи с декларацией ВОЗ 5-6 пандемии гриппа (17-21, 124, 133). Одним из таких

препаратов является борное производное адамантана - соединение 1-бораадамантан (БГ-12) (136-139). Атом бора - электрофильный центр молекулы. БГ-12 - это уникальная структура с тетраэдрическим (пирамидальным) атомом бора. В отличие от всех имеющихся на сегодняшний день химиопрепаратов, данное соединение изменяет физико-химические свойства постоянной в эволюционном отношении вирусной мембраны и обладает выраженными вирулицидными свойствами (5, 41, 4345, 143). Также БГ-12 обладает вирусостатическим действием, превосходящим «Ремантадин» в 10 раз (137). Важным аспектом является также выбор способа доставки данного соединения непосредственно в дыхательный тракт. Одним из способов доставки может быть аэрозольный. Поражения дыхательного эпителия при гриппе требуют внедрения в практику аэрозольных препаратов с высокой локальной эффективностью и низким резорбтивным действием. Причём с использованием именно мицеллярных аэрозолей, которые могут оказывать сами по себе вирусингибирующее действие по аналогии с липосомами.

Цель исследования

Исследование механизмов вирусингибирующего действия 1-бораадамантана (БГ-12) в отношении вируса гриппа, и разработка способа доставки БГ-12 в дыхательный тракт с помощью мицеллярных аэрозолей.

Задачи исследования

1. Определение количественных характеристик противовирусной активности БГ-12 в отношении вируса гриппа А.

2. Изучение кинетики изменения активности РНК - зависимой РНК -полимеразы вируса гриппа после взаимодействия с различными концентрациями БГ-12.

3. Изучение влияния БГ-12 на вирусную мембрану с помощью фосфолипидных монослоев.

4. Разработка флуоресцентного метода для изучения изменения структурно - функционального состояния вирусных белков после взаимодействия с различными химиопрепаратами на примере гемагглютинина вируса гриппа.

5. Получение экспериментального мицеллярного аэрозоля из мицеллярных фосфолипидных эмульсий в комплексе с БГ-12.

6. Оценка эффективности экспериментального мицеллярного аэрозоля в комплексе с БГ-12 в респираторных органах мышей, инфицированных А/ВЧП/Вейбридж (Н7Ш), А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (Н5Ы2), А/Ы1ВК£}-14 (Н5Ш).

Научная новизна

Проведена оценка вирусингибирующего действия БГ-12 в диапазоне концентраций 1-12 мкг/мл. Впервые подробно изучена кинетика изменения активности РНК - зависимой РНК - полимеразы вируса гриппа после взаимодействия с различными концентрациями БГ-12. Проведено изучение влияния БГ-12 на вирусную мембрану с помощью фосфолипидных монослоёв. Впервые разработан флуоресцентный метод для изучения структурно - функционального состояния вирусных белков на примере гемагглютинина вируса гриппа. Также в процессе работы создана модель экспериментального мицеллярного аэрозоля в комплексе с БГ-12 и определены основные физико-химические характеристики аэрозоля. Проведена • оценка эффективности экспериментального мицеллярного аэрозоля с БГ-12 на модели респираторных органов лабораторных животных (мышей), инфицированных А/ВЧП/Вейбридж (НЖ7), А/Маллард Пенсильвания/102/18/84 (ГОШ), А/МВ110-14 (Н5 N1).

Теоретическая и практическая ценность

Работа имеет прикладное значение. Возможное применение^ химиопрепарата 1-бораадамантана (БГ-12) для лечения и профилактики

гриппа может вызвать снижение заболеваемости в случае эпидемии и пандемии, а также сведет на нет необходимость прогнозирования появления нового штамма вируса за счёт мутаций, так как вектор вирусингибирующего действия, используемых в работе химиопрепаратов, направлен на фосфолипидную мембрану, а не на антигенные белки, как многие имеющиеся на сегодняшний день лекарственные препараты (1, 140). Адамантаны также являются мембранотропными агентами и препятствуют конформационным изменениям гемагглютинина (1, 3, 141-143). Разработанный в работе флуоресцентный метод позволит определять изменения структурно - функционального состояния вирусных белков при взаимодействии с различными химиопрепаратами. Изучение влияния противовирусного соединения БГ-12 на вирусную мембрану с применением фосфолипидных монослоев из фосфатидилхолина (из 20—24% массы вириона, Приходящихся на липиды, основную часть составляют фосфолипиды) позволило выявить невозможность слияния мембраны вирусной частицы и клетки, необходимого для дальнейшего размножения вируса. Впервые созданная модель экспериментальных мицеллярных аэрозолей из фосфолипидных эмульсий в комплексе с БГ-12 сделала возможным разработку противовирусного аэрозольного препарата, который в дальнейшем может найти своё применение при лечении гриппа. При данной инфекции основным механизмом передачи является воздушно-капельный, и происходят поражения дыхательного тракта, в дальнейшем при тяжёлом течении с развитием осложнений. Поэтому так необходимы разработки новых аэрозольных препаратов с высокой локальной эффективностью и низким резорбтивным действием.

Личный вклад автора

Автором был выполнен основной объём работ по всем разделам диссертации, проведён анализ использованной литературы и статистическая обработка полученных данных, подготовлены материалы по основным

публикациям, сформулированы выводы диссертации. Разделы диссертации 4.6 и 5.3 были сделаны совместно с лабораторией электронно-микроскопических исследований ФГБУ «НИИ ВС им. И.И. Мечникова» РАМН, разделы 4.8, 4.10, 4.11, 5.2, 5.6, 5.7 проведены в лаборатории изучения механизмов рецепции в Институте Биофизики Клетки РАН (г. Пущино, МО, РФ).

Апробация работы

Материалы диссертационной работы представлены на:

научных сессиях ФГУ "НИИ пульмонологии" ФМБА России (г. Москва, 2011 и 2012 гг.);

конференции молодых учёных и специалистов ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва, 2012 г.,2013г.);

научной сессии "Пироговские чтения" ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (г. Рязань, 2012 г.);

IV Съезде Биофизиков России (г. Нижний Новгород, 2012 г.);

научно-практической конференции "Простуда и Грипп" (г. Москва, 2012 г.);

22-м Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания (г. Москва, октябрь, 2012 г.);

17-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (г. Пущино, 2013 г.);

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объём диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований), заключения, выводов, списка публикаций по теме диссертационной работы, списка цитируемой литературы (143 источника, из них 67 отечественных и 76 зарубежных), раздела с благодарностями. Работа изложена на 105 страницах, включая 19 рисунков, 9 таблиц и 5 электронно-микроскопических фотографий.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общая характеристика семейства Orthomixoviridae

Начало системному изучению гриппа положило выделение вируса

гриппа в 1933году W.Smith, С.Н., Andrews, P.P. Laidlow (1,12, 66). Отличный по антигенным свойствам от вируса 1933 года изолят, выделеный T.Francis Jr. В 1940 году, классифицировали как вирус гриппа В (штамм B/Lee/40). Вирус гриппа С впервые изолировал в 1947 году R.M.Taylor. Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomixoviridae, включающее 3 рода вирусов гриппа:

1) Influensa вирус А;

2) Influensa вирус В;

3) Influensa вирус С;

Вирусы гриппа А вызывают заболевания у человека и животных.

Вирусы гриппа В выделены от человека, а вирусы гриппа С - также от свиней.

1.2. Морфофуикциональные особенности вируса гриппа

Вирион вируса гриппа имеет сферическую форму, иногда могут

встречаться нитевидные формы вириона (рис.1). Размер вириона - порядка 80-120 нм. Геном, расположенный в центре, представлен однонитчатой «-» РНК.

Рисунок 1. Строение вируса гриппа

Внутри вириона находится нуклеокапсид - молекула РНК, упакованная в оболочку из белка Ml. Нуклеокапсид окружён липидной мембраной. В эту мембрану погружены три белка: гемагглютинин, нейраминидаза и ионный канал (белок М2), играющие основную роль в инфекционном процессе (1,2, 4, 48, 66). Геном состоит из восьми фрагментов, из которых первые шесть кодируют по одному белку (гемагглютинин (НА), нейраминидазу (NA), субъединицы РНК - полимеразы (РВ1, РВ2, РА), нуклепротеид (NP) (1,2).

Белки РВ1, РВ2, РА

Известно, что ортомиксовирусы имеют 7-8 сегментированную геномную РНК, где сегменты 1-3 кодируют компоненты РНК-зависимой -полимеразы компонентами РА, РВ и РВ2, которые эволюционно консервативны (1, 2, 66). РВ1 выполняет функцию транскриптазы (РНК-зависимая РНК - полимераза), РВ2 выполняет функцию эндонуклеазы, РА

является репликазой (86, 105). Геммаглютинин (НА) первым вступает в контакт с рецепторами клетки хозяина (112). На поверхности вирусной оболочки он представлен в виде сложиоустроенных тримеров (1, 51, 81, 88). Каждый их мономер прочно заякорен в мембране и содержит две субъединицы. Одна из которых, обеспечивает первичный контакт с клеткой-мишенью, другая отвечает за слияние вирусной и клеточных мембран (1,2, 49, 89). В верхней части белка расположены участки, которые связываются с сиаловой кислотой, входящей в состав рецептора клетки хозяина. Фермент нейраминидаза отщепляет концевые группы сиаловой кислоты клеточных рецепторов, в результате чего клетка теряет способность распознавать антиген, и вирус проникает в неё путём эндоцитоза (102, 118). Эндоцитоз -активное поглощение клеткой веществ, частиц и микроорганизмов (вирусов, бактерий). Опосредуемый рецепторный эндоцитоз характеризуется поглощением из внеклеточной жидкости конкретных макромолекул (рис.2).

Ли га ю

/

/

Pentatop

Пдтмолемм»

Кщтщ

S Я

^unpt р«вигге|11М1 )|цмщ<1х (ei S tu r»i А, Im« * J)

MSCIBNCB.flU

Рисунок 2. Опосредуемый рецепторный эндоцитоз

В этом случае внеклеточные макромолекулы (вирусные частицы и мн. др.) связываются со своими рецепторами на поверхности окаймленной ямки, образуя, комплекс лиганд-рецептор, который погружается в клетку внутри

окаймленного пузырька. (Окаймленные пузырьки содержат белок клатрин, предотвращающий их слияние с лизосомами и переваривание ферментом). Кислая среда отпочковавшейся от клеточной мембраны эндосомы активирует ионный канал М2, который обеспечивает понижение рН внутри вирусной частицы, что приводит к разрушению белковой оболочки М1 (1, 3, 48, 81, 121). Одновременно активируется гемагглютинин. Он синтезируется в виде предшественника, который в кислой среде переходит в зрелое состояние — расщепляется протеолитическими ферментами на две субъединицы, при этом спрятанный внутри тримера пептид слияния меняет конформацию, выходит на свободу, перемещается в верхний конец молекулы и внедряется в мембрану (87, 132). Вирусная оболочка сливается с эндосомальной, образуется пора слияния, через которую в цитоплазму открывается путь для чужеродного генетического материала. Затем вирусная РНК проникает в клеточное ядро. В результате в клетке нарушаются процессы жизнедеятельности, и она сама, используя собственные ресурсы, начинает производить вирусные белки (1, 28, 33, 49, 81, 112). Тут же происходит репликация вирусной РНК и сборка новых вирусных частиц, с помощью нейраминидазы высвобождаются из повреждённых клеток (при этом продукты их распада вызывают интоксикацию организма и лихорадку) и с кровотоком разносятся по всему организму, развивается вирусемия (24, 52). Размножившийся вирус угнетает кроветворную и иммунную системы, повреждает эндотелий капилляров, что приводит к повышенной проницаемости сосудов и кровоизлияниям, развитию отёка мозга, что может привести к летальному исходу (10, 24, 96, 107, 122). Но так происходит довольно редко, поскольку в инфекционный процесс вовлекаются факторы врождённого (неспецифического) иммунитета, и через некоторое время начинают вырабатываться специфические антитела, освобождающие и при повторном заражении защищающие организм от вируса (33).

Репродукция вируса гриппа

При заболевании вирус прикрепляется к чувствительным клеткам верхних дыхательных путей с помощью гемагглютинина, проникает внутрь клетки, теряет часть оболочки. Отрицательная РНК вириона стремится к ядру, в ядре начинается процесс транскрипции и репликации вируса. Для

I

транскрипции РНК необходим КЭП — участок на 5- конце иРНК, который состоит из метилированного гуанида и 10-13 прилежащих нуклеотидов (66, 77, 78, 81). КЭП необходим для иРНК вируса, чтобы она распознала рибосому клетки. Не будет КЭП, не будет идти трансляция. В ядре с помощью РВ2 фермент откусывает КЭП от клеточной иРНК, а т.к. синтез клеточной, иРНК происходит в ядре, вирусная и РНК должна проникнуть в ядро (89).

В ядре синтезируется 3 типа вирусоспецифической РНК:

1. «+» РНК (иРНК, которая содержит на 5'- конце КЭП - клетки, а на З1 - конце - полиадениловые последовательности);

2. кРНК - матрица для синтеза вирусной РНК. КЭП и полиадениловая последовательность отсутствуют;

3. '«—» РНК синтезируется с помощью РА фермента на матрице к

РНК.

Вирусные полимеразы являются одно из центральных лекарственных мишеней при разработке лекарственных препаратов для лечения большинства вирусных инфекций (14, 59, 60). Расшифровка третичной структуры вирусной РНК - полимеразы позволяет надеяться на эффективную разработку более специфических и более эффективных ингибиторов этого ключевого фермента вирусов гриппа типа А (61-67, 93). Вирус гриппа не располагает системой ферментов для автономного синтеза 5/-концевых кэпов (68). В связи с этим действие вирусной полимеразы в первую очередь предусматривает просто распознавание кэпов клеточных м РНК и активность

эндонуклеазы, которая и отщепляет концевой фрагмент клеточных мРНК, необходимый для построения вирусных мРНК.

Сборка и высвобождение вирионов

Подобно другим РНК-содержащим вирусам с оболочкой, вирионы вируса гриппа состоят из двух основных структур, которые собираются в разных местах: нуклеокапсид - внутри клетки, а оболочка - на плазматической мембране. Точнее, сборка оболочки начинается внутри клетки, на мембране эндоплазматического ретикулума, куда внедряются синтезирующиеся гликопротеины НА и ЫА (49, 62, 81, 82). Мембранный аппарат обеспечивает их транспорт через комплекс Гольджи к клеточной поверхности, присоединение олигосахаридных цепей и их модификацию, формирование третичной структуры и окончательную укладку изолированных белковых молекул в тримеры НА и тетрамеры ИА, которые образуют «шипы» собирающихся и уже зрелых вирионов. Это обычный путь сборки оболочки РНК-содержащих вирусов. В отличие от других РНК-содержащих вирусов с наружной оболочкой нуклеокапсиды вируса гриппа, собираются не в цитоплазме, а в ядре (121, 135). При этом новосинтезированные нуклеокапсиды должны проделать путь от ядерной мембраны через цитоплазму к поверхности клеточной мембраны, где расположены вирусные гликопротеины. Пространство между нуклеокапсидом и новосинтезированной вирусной оболочкой заполняется М-белком. К сожалению, стадии взаимодействия М-белка с цитоплазматической поверхностью оболочки, с одной стороны, и нуклеокапсидом, с другой, всё ещё не известны (1, 4, 121). Нельзя также исключить, • что белки нуклеокапсида связываются с цитоплазматическими доменами гликопротеинов непосредственно, без участия М - белка. Кроме того, не выяснена роль М - белка и других компонентов оболочки в индукции процесса почкования (2, 48). Известно, что индивидуальные сегменты нуклеокапсида упаковываются в вирион не беспорядочно, а так,

как если бы они были соединены тандемно. Можно думать, что существует механизм, регулирующий набор сегментов, включающихся в каждый вирион. В то же время неясно, какие силы удерживают сегменты в тандеме. По-видимому, отбор сегментов РНК не опосредуется спариванием оснований, поскольку у всех сегментов РНК вируса гриппа концевые последовательности идентичны (2, 83). Объединение определённых сегментов могло бы определяться взаимодействием между капсидными белками. Но и тогда не существует химической основы для отбора сегментов (87). Поэтому остаётся предположить, что тандемное расположение нуклеокапсидов, есть результат произвольного комбинирования сегментов и что общее число сегментов, умещающихся в вирионе средних размеров, достаточно велико, чтобы заметная доля всех вирионов содержала по меньшей мере одну копию каждого гена (2). Внизу изображена секретируемая форма НА, полученная в результате генетических манипуляций и утратившая значительную часть карбоксильного конца (536 пар оснований в ДНК, кодирующей НА) (83).

Рисунок 3 Строение тетрамера NA вируса гриппа Токуо/3/67 (N2)

На рис.3 показано строение тетрамера ИА вируса гриппа Токуо/3/67 (N2) и кубическая головка, стебель и 1М- концевая область, заякоривающая всю структуру в вирусной оболочке. Каждая молекула ИА содержит в своей верхней части активный центр. Молекулы ИА формируют на поверхности

Активным центр

N

вирусной оболочки тетрамерные шипы. В отличие от тримеров НА, напоминающих колонну, тетрамер КА представляет собой небольшой стебель, увенчанный кубической головкой (рис.3). Стебель формируют аминокислотные остатки с 36-го по 73-й, а головку образует остальная часть молекулы. Головки, отделённые от вириона путём протеолитического расщепления стебля, исследовали с помощью рентгеноструктурного анализа (83). Оказалось, что внутри головки полипептидная цепь формирует несколько витков, образующих шесть четырёхцепочечных В- слоёв. Каталитический центр нейраминидазы расположен на поверхности головки в каждой из субъединиц, поэтому тетрамер имеет четыре активных центра, подобно тому, как каждый тример гемагглютинина имеет три участка связывания рецептора. В головке расположены также все сайты гликозилирования, причём один из них, по-видимому, участвует во взаимодействии между мономерами. Изменения антигенной структуры скорее всего ограничены петлями полипептидной цепи, соединяющими В-слои. Как ив случае НА, в таких петлях могут неограниченно накапливаться мутации, поскольку они не участвуют во взаимодействиях между В-цепями, формирующими каркас головки. Аминокислотные остатки вокруг каталитического центра также не вовлечены в образование В-структуры, но они консервативны (83). КА вируса гриппа не столь важна для эволюции вируса, как НА, но тем не менее играет в ней заметную роль. Ферментативное действие нейраминидазы - отщепление концевых сиаловых кислот от олигосахаридных цепей в составе поверхностных белков и гликолипидов - распространяется на соседние молекулы ЫА и на любые оказавшиеся поблизости поверхностные гликопротеины. Не исключено, что активность нейраминидазы проявляется уже в ходе миграции через эндоплазматический ретикулум. Поэтому кластеры новых синтезированных белков вирусной оболочки, расположенные на клеточной мембране, содержат гликопротеины, лишённые остатков сиаловой кислоты. Такая модификация предохраняет дочерние вирусные частицы от агрегации, и в

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Погарская, Ирина Владимировна, 2014 год

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Киселёв О.И. Химиоиреиараты и химиотерапия гриппа. Санкт Петербург//Росток//2012, 269 с.

2. Дроздов И.Г. Актуальные аспекты противодействия пандемиям гриппа (курс лекций) //Новосибирск//Информ-Экспресс, 2009, 135 с.

3. Морозов И.С., Петров В.И., Сергеева С.А., Фармакология адамантанов, BMA, Волгоград, 2001, 320 с.

4. Чучалин А.Г. Исторические аспекты эпидемий гриппа XX века. Пульмонология, выпуск 6, 2009.

5. Бубнов Ю.Н. Конструирование алкилированных производных 1-бораадамантана и 1-азаадамантана - потенциальных средств лечения

6. В.В. Зверев Новые аспекты химиотерапии обо л очечных вирусов, используя пример вирусов гриппа и кори. Тезисы БИТ 4й ежегодный конгресс «Вакцины», 2012, Китай.

7. Киселев О.И., Львов Д.К. На пути пресказательного конструирования пандемических вирусов гриппа типа А. Вопросы вирусологии. -2012. - Приложение 1, с. 137-147

8. Аллипер Т.И., Забережный А. Д., Гребенникова Т.В. Африканская чума свиней в Российской Федереции. Вопросы вирусологии. -2012. - Приложение 1, с. 127-136.

9. Зверев В.В., Юминова Н.В. Вакцинопрофилактика вирусных инфекций от Э. Дженнера до настоящего времени. Статья Журнал Вопросы вирусологии, 2012, с. 33- 42.

10. Злыдников Д.М. Клиника и лечение. Проблемы гриппа. Под ред. A.A. Смородинцева, М., 1971, с. 102-115.

11. Злыдников Д.М. Проблема профилактики и лечения гриппа. Клин.медицина. 1972, №8, с.9-16.

12. Деева Э.Г. Грипп. На пороге пандемии. М.: ГЭОТАР-Медиа,

2008. -208с.

13. Киселев О.И. Деева Э.Г., Слита A.B., Платонов В.Г. Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ. Дизайн препаратов на основе полимерных носителей. СПб. Информ.-аналитический центр «Время», 2000,- 132 с.

14. Рекомендации по химиотерапии гриппа птиц H5N1/ Федеральный центр по гриппу. СПб. изд. группа «НИИ гриппа» РАМН, 2005.

15. Киселев О.И, Ершов Ф.И, Быков А.Т., Покровский В.И. Пандемия гриппа 2009/2010: противовирусная терапия и тактика лечения. СПб. М.; Сочи: А - Принт, 2010. -97с.

16. Бюллютень проблемной комиссии РАМН по гриппу (HINlv) СПб. 2009.- 48 с.

17. Грипп и другие респираторные инфекции: эпидемиология, профилактика, диагностика и терапия. Под ред. О.И. Киселева, И.Г. Маринича, A.A. Соломиной. СПб. Боргес, 2003. -244с.

18. Деева Э.Г., Мельникова Т.И. антивирусные препараты для профилактики и лечения гриппа. Эпидемиология и вакцинопрофилактика.

2009. №4 (47). с. 37-43.

19. Киселев О.И. Деева Э.Г., Кутузов A.M. Натуральный вирулицидный препарат. Заявка на патент РФ, 2010.

20. Злыдников Д.М., Романов Ю.А., Сухова М.Ф. Организационные формы комплексного лечения больных гриппом и его осложнений (поликлиника, стационар, диспансерное, реабилитационное отделения) с применением этиотропных био- и химиопрепаратов. (Материалы 2-го совещания экспертов социалистических стран по гриппу, Ленинград, апрель, 1977). Л., 1978. с. 131-138.

21. Злыдников Д.М., Казанцев А.П., Старшов П.Д. Терапия вирусных инфекций. Л.: Медицина, 1979. с. 21-23.

22. Злыдников Д.М., Кубарь О.И., Ковалева Т.П. Химиопрофилактика и химиотерапия гриппа ремантадином. Вопр. вирусологии. 1981. №5. с.516-523

23. Карпухин Г.И. Профилактика и лечение гриппа. Л., 1989.-32с.

24. Грипп. Руководство для врачей. Под ред. Г.И. Карпухина. СПб. Гиппократ, 2001. с. 250-270

25. Покровский В.И. Киселев О.И., Лобанова Т.П. и др. Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф. СПб. Росток, 2005. - 270 с.

26. Ершов Ф.И. Антивирусные препараты. М.: Медицина, 1998. с. 141-160.

27. Галегов Г.А и др. Этиотропная лекарственная терапия вирусных инфекций /Г.А. Галегов// вопр. вирусол. -2004.-№3.-с. 123-140

28. Грипп: Руководство для врачей. - СПб. 2001. -360с

29. Киселёв О.И. Новые средства лечения и профилактики гриппа и других ОРВИ/ О.И. Киселёв и др.// Лечащий врач -2004. -№10.-с.70-74.

30. Малый В.П. Грипп: пособие для врачей / В.П. Малый. — Харьков, 2007.- 110с.

31. Захарченко В. H. Коллоидная химия: Учеб. для для медико-биолог. спец. вузов.— 2-е изд., перераб. и доп.— М.: Высш. шк., 1989.— 238 е.: ил. .

32. Суздалев И. П. Нанотехнология: физикохимия нанокластеров, наноструктур и наноматериалов. — М.: КомКнига, 2006. — 592 с.

33. Руководство по вирусологии «Вирусы и вирусные инфекции человека и животных» Под ред. академика РАН Д.К. Львова. - МИА, М., 2013.

34. Эмульсия // Энциклопедический словарь Брокгауза и Ефрона: В 86 томах (82 т. и 4 доп.). — СПб. 1890—1907.

35. Фосфолипидные наночастицы: получение, характеристика, использование для транспорта лекарственных веществ в организме. Стрекалова О.С. Автореф. к.б.н. // ИБМХ РАМН им. В.Н. Ореховича, 2010, 24с.

36. Основы физической и коллоидной химии / С.А. Балезин, Б.В. Ерофеев, Н.И. Подобаев. — Просвещение, 1975. — 398 с.

37. Способ получения фосфолипидных наночастиц в технологии производства нанолекарств. Стрекалова О.С., Платова О.М.// Сборник докладов 5-го московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» - Москва 2009. -Т. 1.- с. 203

38. Биофизическая химия Э. Маршелл Принципы, техника и приложения в 2- х томах, пер. с анг. к.хим. н. Б.Ю. Заславского под ред. д.хим.н. проф. C.B. Рогожина. М.: Мир, 1981

39. Небольсин В.Е. Изучение эффективности Ингавирина in vitro в отношении возбудителя гриппа В. - Антибиотики и химиотерапия, 2009, № 54: с.7-8.

i &ll Iii iiïi a i ((Biî&mtra 1Ш(Ш11Ш1ШЕЕИ11И винвшишшш ■ШШ^НВМКШ

92

40. Арчаков А.И. и другие Наноформа фосфолипидного препарата для пероральиого применения (саше) и способ ее получения (варианты) (патент РФ № 2463057)

41. Контаров H.A. Механизмы ингибирующего действия борных производных адамантана и липосом в отношении вирусов гриппа: Автореф. дисс. к.б.н. М., 2010.-25 с.

42. Жуков В.А. Методология прогнозирования восприимчивости хозяина к- вирусным инфекциям и её использование для выбора противовирусных препаратов. Мат. дисс. д.б.н. Кольцово, 2010, 324с.

43. Контаров H.A., Артюшенко C.B., Маркушин С.Г., Бубнов Ю.Н., Лотте В.Д. Изучение взаимодействия бораадамантана с вирусом гриппа птиц. // Биофизика. -2011. - том 55.

44. Контаров H.A., Изучение физико -химических механизмов противовирусной активности полиэлектролитов. Мат. IV съезда биофизиков России, симпозиум «Физико -химические основы функционирования биополимеров и клеток». - Нижний Новгород- 2012.

45. Маркушин С.Г., Контаров Н.А, Акопова И.И., Коптяева И.Б., Артюшенко C.B., Бубнов Ю.Н. 1- бораадамантаны - потенциальные средства лечения и профилактики гриппа человека и птиц. // Сборник научных трудов (вып. 9) «Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней». -Москва. - 2009.- с. 98-103.

46. Лакович Дж. Основы флюоресцентной спектроскопии. Пер. с англ. — М.: Мир, 1986. - 496 е., ил.

47. Мейхи Б. Вирусология. Методы. М. - Мир, 1988, 344с.

48. Иммуногенные свойства рекомбинантных белков, включающих эктодомен белка М2 вируса гриппа АСтепанова Л.А., Ковалева A.A.,

Потапчук М.В., Коротков A.B., Куприянов В.В., Блохина Е.А., Котляров Р.Ю., Цыбалова Л.М.Вопросы вирусологии. - 2013. - № 3. - С. 21-25.

49. Воздействие вирусов гриппа А и их поверхностных белков на метаболизм клеток эндотелия кровеносных сосудов человека Азаренок A.A., Еропкина Е.М., Прочуханова А.Р., Шалджян A.A., Козлова Н.М., Козелецкая К.Н., Жилинская И.Н. Вопросы вирусологии. - 2013. - № 3. - С. 25-27.

50. Вакцины против высокопатогенных вирусов гриппа птичьего происхождения Сергеева М.В., Романова Ю.Р. Вопросы вирусологии. - 2013. - № 4. - С. 4-9.

51. Участие цитоскелета клетки в инфекционном цикле вирусов гриппа А Смирнова Т.Д., Даниленко Д.М., Слита A.B. Цитология. - 2013. -Т.55, № 2. - С. 92-100.

52. Взаимосвязь цитокинового статуса и выраженности интоксикационного синдрома при гриппе Волощук Л.В., Головачева Е.Г., Мушкатина А.Л., Осидак Л.В., Заришнюк П.В., Го A.A. Инфекция и иммунитет. - 2013. - Т.З, № 3. - С. 263-268.

53. Эпидемия гриппа в России в сезон 2012-2013 годов Карпова Л.С., Соминина A.A., Пелих М.Ю., Поповцева Н.М., Столярова Т.П., Бурцева Е.И., Киселев О.И. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2013. - № 4 (71) . — С. 7-13.

54. Разработка и клиническое изучение отечественной живой гриппозной- вакцины против потенциально пандемических вирусов гриппа Руденко Л.Г., Исакова-Сивак И.Н., Найхин А.Н., Дешева Ю.А., Ларионова Н.В., Киселева И.В., Стукова М.А., Ерофеева М.К., Никифорова А.Н., Миронов А.Н. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2013. - № 4 (71). -С. 74-81.

di i ni i i ■( ■ i 11111 iau ii нш ii niu ii ни в ншш в ii iiiiiiiuh ш ml in ljlli ■ Ш1Ш1 u.l

94

55. Химиопрепараты для лечения гриппа - современное состояние Деева Э.Г., Мельникова Т.И., Сологуб Т.В., Киселев О.И. Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2013. - № 5. - С.26-32.

56. Арбидол и Тамифлю, лечение гриппа: как преодолеть комплекс неопределенности Осидак JT.B., Гончар В.В., Волощук Л.В., Зарубаев В.В., Суховецкая В.Ф., Дриневский В.П. Фарматека. - 2013. - № 11 (264). - С. 3340.

57. Актуальные вопросы профилактики гриппа и ОРВИ Максакова В.Л., Ерофеева М.К. Фарматека. - 2013. - № 15 (268). - С. 73-78.

58. Новый противовирусный препарат Триазавирин. Киселев О.И., Деева Э.Г., Мельникова Т.Н., Козелецкая К.Н., Киселев A.C., Русинов В.Л., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н. Вопросы вирусологии. - 2012. - № 6. - С. 9-12.

59. Развитие надзора за гриппом в России в системе национального центра ВОЗ по гриппу Соминина A.A., Грудинин М.П., Еропкин М.Ю., Смородинцева Е.А., Писарева М.М., Комиссаров А.Б., Коновалова Н.И., Даниленко Д.М., Гудкова Т.М., Киселев О.И. Вопросы вирусологии. - 2012. - № 6. - С. 17-21.

60. Пандемия гриппа в России как часть глобального распространения гриппа A(H1N1) pdm09 в 2009-2011 гг. Карпова Л.С., Пелих М.Ю., Столяров К.А., Поповцева Н.М., Столярова Т.П. Вопросы вирусологии. - 2012. - № 6. - С. 26-30.

61. Разработка новых препаратов против вируса гриппа на основе синтетических и природных соединений Зарубаев В.В., Анфимов П.М., Штро A.A., Гаршинина A.B., Мелешкина И.А., Карпинская Л.А., Козелецкая К.Н., Киселев О.И. Вопросы вирусологии. - 2012. - № 6. - С. 30-36.

62. Генетическое разнообразие и молекулярная эволюция вирусов гриппа А в России в 2006-2012 гг. Грудинин М.П., Комиссаров А.Б.,

Ii i Mii.il 11 Iii II I IUI« Ii III Hilt II I ■■■■ 11Ш1Щ1И1 ■ III ■ МИВИД11 ■ 1 ИМИ I—I.MJM-M-i.ll.B.-H H IM—^^им^—

95

Писарева M.M., Стукова M.A., Бузицкая Ж.В., Паянкова A.A., Елпаева Е.А., Задонская A.B., Иванов Я.В., Киселев О.И. Вопросы вирусологии. — 2012. — № 6. - С. 37-42.

63. Характеристика реассортантных штаммов вируса гриппа на основе нового донора AHongKong/1/68/162/35 (H3N2) Потапчук М.В., Репко И.А., Сергеева М.В., Коротков A.B., Комиссаров А.Б., Сандыбаев Н.Т., Червякова О.В., Хайруллин Б.М., Цыбалова JIM., Вопросы вирусологии. -2012.-№6.- С. 42-46.

64. Влияние Ингавирина® на ультраструктурные особенности морфогенеза аденовирусной инфекции in vivo Зарубаев В.В., Слита A.B., Сироткин А.К., Беляевская С.В., Небольсин В.Е., Киселев О.И. Вопросы вирусологии. -2012. -№ 3. - С. 17-23.

65. Применение комбинированных препаратов при острых респираторно-вирусных инфекциях Позднякова М.Г. Справочник поликлинического врача. - 2012. - № 3. - С. 11-13.

66. Грипп как проблема XXI века» Осидак JI. В., Дриневский В. П., Ерофеева М. К., Еропкин М. Ю., Коновалова Н. И., Смородинцева Е. А. , Головачева Е. Г., Дондурей Е. А., Байбус Д. М., Войцеховская Е. М., Цыбалова Л. М. Детские инфекции. - 2009.Т. 8, №3. - С. 3-9.

67. «Грипп типа A(H1N1) 2009 в России» Осидак Л. В., Еропкин М. Ю.,Образцова Е. В., Ерофеева М. К., Зарубаев В. В., Дондурей Е. А., Дриневский В. П. Terra Medica. - 2009. - №4-5(58-59). - С. 6-9.

68. Slita A.V., Kasyanenko N. A., Nazarova О. V., Gavrilova I. I., Eropkina E. M., Sirotkin A. K., Smirnova T. D., Kiselev О. I., Panarin E. F. 2007. DNA-polycation complexes. Effect of polycation structure on physico-chemical and biological properties. J. Biothechnol. 127 : 679—693.

69. H1N1 - Did WHO declare the pandemic under pressures? http//www.ennaharonline.com/en/international/2991 .html.

70. WHO. Clinical management of human infection with avian influenza A (H5N1) virus. August 15.2007.

71. WHO. Rapid advice guidelines on pharmacological management of humans infected with avian influenza A (H5N1) virus. WHO/PSM/PAR/2006/6.

72. WHO. Guidelines for pharmacological management if pandemic (H1N1) 2009 influenza and other influenza viruses. February 2010

73. Andradottir S., Chiu W., Goldsman D. et.al. Reactive strategies for containing developing outbreaks of pandemic influenza. BMC Public Health. 2011. Vol. ll.Suppl/1: SI.

74. Hsieh H.P., Hsu J.T. Strategies of development of antiviral agents directed against influenza virus replication. Curr.Pharm. Des. 2007.Vol. 13 P. 3531-3542.

75. Tamiflu And Relenza Should Have Psychiatric Side Effects Warning, Say Regulators Medical News Today, Saturday 24 November 2007 - 8am PST

76. Сайт ВОЗ, 20096 URL.http//www.who.int/csr/disease/swineflu/newsbriefs/hnl_antiviral_resistance_ 20090708/en/index.html (дата обращения 11.09.2009)

77. Evans D., Wennerstrom H. The Colloidal Domain: Where Physics, Chemistry, Biology, and Technology Meet. — 2. — N.Y.: Wiley, 1994. — 672 c.

78. IUPAC. Compendium of Chemical Terminology. / A.D. McNaught, A. Wilkinson. — 2. — Oxford: Blackwell Scientific Publications, 1997. — C. 9596.

79. Haldar J., Deqiang A., Luis A., Chen J., Klibanov A.M. Polymeric coatings that inactivate both influenza virus and pathogenic bacteria //

i i m a i in i n i u ¡is e e is ¡it ¡aainii i el illl lulll 11 tmm i kb ik i ib i hikihi ii k bbii kk 11

97

Departments of Chemistry, Biology, and Biological Engineering, and Center for Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge.

80. Chen H., Deng G., Li Z. et al. The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. P. 10452-10457.

81. Clerk J., Fuller F., Bishop D. Tick-borne viruses structurally similar to orthomyxoviruses // Virology. - 1983. Vol. 127. - P. 205-219.

82. De Jong M. D., Hein T.T. Vian influenza A // J. Clin. Virol. - 2006. -Vol. 35.-P. 2-13.

83. Fields and other// Virology, 5th Edition // Lippincott Williams & Wilkins ISBN: 978-0781760607, CHM,p. 3177

84. Guan Y., Poon L.L., Cheung C.Y. et al. H5N1 influenza: a protean pandemic threat // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 8156-8161.

85. Guan Y., Shortridge K. F., Krauss S., Webster R. G. Molecular characterization of H9N2 influenza viruses: were they the donors of the «internal» genes of H5N1 viruses in Hong Kong // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. -P.9363-9367.

86. Kawaoka Y., Krauss S., Webster R.G. Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza 1 viruses in the 1957 and 1968 pandemics //J. Viriol. - 1989. - Vol. 63. - P.4603-4608.

87. Velkov T. The antigenic architecture of the hemagglutinin of influenza Y5N1 viruses / T.Velkov, C. Ong, M.A. Baker//Mol.Immunol.-2013/-Vol. 56, 56,-P. 705-719

88. Stevens J., Corper A.L. Basler C.F., et al. Structure of the uncleaved human HI hemagglutinin from the extinct 1918 influenza virus //Science. - 2003. -Vol.21.-P. 1744-1748.

a ,'iiis í ííííi í ill ¡¡Sí i til UK I i ( IB! ili SIH liilliüBil ü lit II ■ HIKKrami

98

89. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T. et al. Evolution and ecology of influenza A viruses//Microbiol. Rev. - 1992.-Vol. 56.-P.152-179

90. Koopmans M, Wilbrink B., Conyn M. et al. Transmission of H7N7 avian influenza A virus to human during a large outbreak in commercial poultry farms in the Netherlands //Lancet. - 2004. - Vol. 393. - P. 587-593.

91. Oxvord J.S., Hockley D.J. Ortomyxoviridse. In: Animal virus structure. - London, 1987. - P. 213-232.

92. Semple A.B. Epidimiology of the influenza epidemic in Liverpool in 1950-1951 //Proc. R. Soc. Med. - 1951. - Vol.44. - P. 794-796.

93. Torrecilla J, Rodríguez-Gascón A, Solinis MA, Del Pozo-Rodríguez A. Lipid Nanoparticles as Carriers for RNAi against Viral Infections: Current Status and Future Perspectives. Biomed Res Int. 2014; Epub 2014 Aug 12.

94. Jefferson T, Doshi P. Multisystem failure: the story of antinfluenza drugs. Recenti Prog Med. 2014 May; 105 (5), Italian.

95. Freemantle N, Shallcross LJ, Kyte D, Rader T, Calvert MJ. Oseltamivir: the real world data. BMJ. 2014 Apr 9.

96. Ciuraszkiewicz K, Sielski J, Janion-Sadowska A, Stern A, Zychowicz J, Kaziród-Wolski K, Paluchowski M. Influenza infection in intensive cardiac care unit patients. Pol Merkur Lekarski. 2014 Mar; 36(213), Polish.

97. Mortada M, Neuenschwander P, Tekko SS. Influenza and oseltamivir phosphate (Tamiflu) in infants: what you need to know. Pediatr Nurs. 2014 Jan-Feb;40(l).

98. Oldstone MB, Rosen H Cytokine storm plays a direct role in the morbidity and mortality from influenza virus infection and is chemically treatable with a single sphingosine-1-phosphate agonist molecule. Curr Top Microbiol Immunol. 2014;378:129-47.

«iSIil ¡S!H ili [ il ! it a tit lull li Hit tmi illii Kil i I I K il EEIKHEIKR II BIBB I 11KB i IK I II t KIK 11 BUI ■ttHHlB^UI

99

99. Zhao P, Yang HZ, Lv HY, Wei ZM. Efficacy of Lianhuaqingwen capsule compared with oseltamivir for influenza A virus infection: a meta-analysis of randomized, controlled trials. Altern Ther Health Med. 2014 Mar-Apr; 20(2).

100. Voide C, Asner S, Giulieri S, Cavassini M, Merz L, Tissot F, Orasch C. Infectious diseases. Rev Med Suisse. 2014 Jan 15, French.

101. Pu JY, He L, Wu SY, Zhang P, Huang X. Anti-virus research of triterpenoids in licorice]. Bing Du Xue Bao. 2013 Nov; 29(6), Chinese.

102. Lou Z, Sun Y, Rao Z. Current progress in antiviral strategies. Trends Pharmacol Sci. 2014 Feb;35(2).

103. Russell CD, Schwarze J. The role of pro-resolution lipid mediators in infectious disease. Immunology. 2014 Feb;141(2):166-73.

104. Kamali A, Holodniy M. influenza treatment and prophylaxis with neuraminidase inhibitors: a review. Infect Drug Resist. 2013 Nov 19;6:187-9

105. Chenavas S, Crepin T, Delmas B, Ruigrok RW, Slama-Schwok A. Influenza virus nucleoprotein: structure, RNA binding, oligomerization and antiviral drug target. Future Microbiol. 2013 Dec; 8:1537-45.

106. Berera D, Zambon M. Antivirals in the 2009 pandemic—lessons and implications for future strategies. Influenza Other Respir Viruses. 2013 Nov;7 Suppl 3:72-9.

107. Hayden FG. Advances in antivirals for non-influenza respiratory virus infections. Influenza Other Respir Viruses. 2013 Nov;7 Suppl 3:36-43.

108. Esposito S, Passera S. Vaccination in patients with disorders of the muscle and neuromuscular junction. Expert Rev Vaccines. 2013 Nov;12(l 1): 13419.

, 4 ii us i m \ sm i !E uiig u 6 Mil i HIKIHU lilt ilElli liii ■ I in B B IK IIBK KIKI i Bill BB» U^n^^HH

100

109. Farrukee R, Mosse J, Hurt AC. Review of the clinical effectiveness of the neuraminidase inhibitors against influenza B viruses. Expert Rev Anti Infect Ther. 2013 Nov;l 1(11):1135-45.

110. Furuta Y, Gowen BB, Takahashi K, Shiraki K, Smee DF, Barnard DL. Favipiravir (T-705), a novel viral RNA polymerase inhibitor. Antiviral Res. 2013 Nov; 100(2):446-54.

111. Miller PE, Rambachan A, Hubbard RJ, Li J, Meyer AE, Stephens P, Mounts AW, Rolfes MA, Penn CR Supply of neuraminidase inhibitors related to reduced influenza A (H1N1) mortality during the 2009-2010 H1N1 pandemic: summary of an ecological study. Influenza Other Respir Viruses. 2013 Sep; 7 Suppl 2:82-6.

112. Krammer F, Palese P. Influenza virus hemagglutinin stalk-based antibodies and vaccines. Curr Opin Virol. 2013 Oct; 3(5):521-30.

113. Klein SL. Sex differences in prophylaxis and therapeutic treatments for viral diseases. Handb Exp Pharmacol. 2012 ;( 214):499-522. PMID:

114. Barik S. New treatments for influenza. BMC Med. 2012 Sep 13; 10:104.

115. Tsiodras S, Nikolopoulos G, Bonovas S. Antivirals used for influenza chemoprophylaxis. Curr Med Chem. 2012; 19(35):5947-56.

116. Saxena RK, Tripathi P, Rawat G Pandemism of swine flu and its prospective drug therapy. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2012 Dec; 31(12):3265-79.

117. De Clercq E. Human viral diseases: what is next for antiviral drug discovery? Curr Opin Virol. 2012 Oct; 2(5):572-9.

118. Cianci C, Gerritz SW, Deminie C, Krystal M. Influenza nucleoprotein: promising target for antiviral chemotherapy. Antivir Chem Chemother. 2012 Jul 26; 23(3):77-91.

i II > tía II i HI limn ¡i HI HUM IllilllUllllllII lili I II III IIIIIDIllill UIIIWB lllUimiUiajBH

101

119. Poulakou G, Pérez M, Relio J. Severe acute respiratory infections in the postpandemic era of H1N1. Curr Opin Crit Care. 2012 Oct; 18(5):441-50.

120. Feng E, Ye D, Li J, Zhang D, Wang J, Zhao F, Hilgenfeld R, Zheng M, Jiang H, Liu H. Recent advances in neuraminidase inhibitor development as anti-influenza drugs. ChemMedChem. 2012 Sep; 7(9): 1527-36.

121. Wang JF, Chou KC. Recent advances in computational studies on influenza a virus M2 proton channel. Mini Rev Med Chem. 2012 Sep 1; 12(10):971-8.

122. Metersky ML, Masterton RG, Lode H, File TM Jr, Babinchak T. Epidemiology, microbiology, and treatment considerations for bacterial pneumonia complicating influenza. Int J Infect Dis. 2012 May;16(5):e321-

123. Nguyen HT, Fry AM, Gubareva LV. Neuraminidase inhibitor resistance in influenza viruses and laboratory testing methods. Antivir Ther. 2012; 17(1 Pt B):l59-73. PMID:

124. DeVincenzo JP. The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses. Antivir Ther. 2012; 17(1 Pt B):213-25.

125. Hayden FG. Experimental human influenza: observations from studies of influenza antivirals. Antivir Ther. 2012; 17(1 Pt B):133-41.

126. Icardi G, Orsi A, Ceravolo A, Ansaldi F Current evidence on intradermal influenza vaccines administered by Soluvia™ licensed micro injection system. Hum Vaccin Immunother. 2012 Jan; 8(l):67-75. PMID:

127. Esposito S, Montinaro V, Groppali E, Tenconi R, Semino M, Principi N. Live attenuated intranasal influenza vaccine. Hum Vaccin Immunother. 2012 Jan;8(l):76-80

128. Hurt AC, Chotpitayasunondh T, Cox NJ, Daniels R, Fry AM, Gubareva LV, Hayden FG, Hui DS, Hungnes O, Lackenby A, Lim W, Meijer A,

>t 2 it ft UHlHIIIEilltl KIHKIIBiB HHI III B ill EiiilKK I —It Ml If —Ifii III g gf

102

Penn C, Tashiro M, Uyeki TM, Zambon M Antiviral resistance during the 2009 influenza A H1N1 pandemic: public health, laboratory, and clinical perspectives. Lancet Infect Dis. 2012 Mar; 12(3):240-8.

129. Cooper CL. Pandemic H1N12009 influenza and HIV: a review of natural history, management and vaccine immunogenicity. Curr Opin Infect Dis. 2012 Feb; 25(l):26-35.

130. Chen W, Lim CE, Kang HJ, Liu J. Chinese herbal medicines for the treatment of type A H1N1 influenza: a systematic review of randomized controlled trials. PLoS One. 2011;6(12):28093

131. Bavagnoli L, Maga G. The 2009 influenza pandemic: promising lessons for antiviral therapy for future outbreaks. Curr Med Chem 2011; 18(35):5466-75.

132. Dave K, Gandhi M, Panchal H, Vaidya M. Revision of QSAR, docking, and molecular modeling studies of anti-influenza virus A (H1N1) drugs and targets: analysis of hemagglutinins 3D structure. Curr Comput Aided Drug Des. 2011 Dec; 7(4):255-62.

133. Zhang T, Wang CY, Gao YW, Yang ST, Wang TC, Xia XZ. Development of anti-influenza drug]. Bing Du Xue Bao. 2011 Sep; 27(5):475-80. Chinese.

134. Ikematsu H, Kawai N. Laninamivir octanoate: a new long-acting neuraminidase inhibitor for the treatment of influenza. Expert Rev Anti Infect Ther. 2011 Oct; 9(10):851-7.

135. Robertson JS, Inglis SC. Prospects for controlling future pandemics of influenza. Virus Res. 2011 Dec; 162(l-2):39-46.

136. Vishnevskiy YV, Abaev MA, Rykov AN, Gurskii ME, Belyakov PA, Erdyakov SY, Bubnov YN, Mitzel NW. Structure and bonding nature of the strained Lewis acid 3-methyl-l-boraadamantane: a case study employing a new

< . i, 1..HII iiiinBiiii ■■■ « !i u i mttmmmi mt in ■ laui i ■■■ ■■ hu ■ ■ i ninf"wmhiwwubi——

103

data-analysis procedure in gas electron diffraction. Chemistry. 2012 Aug 20; 18(34): 10585-94. doi: 10.1002/chem.201200264. Epub 2012 Jul 12.

137. Kontarov NA, Artiushenko SV, Markushin SG, Lotte VD, Bubnov IuN. A study of the interaction of boraadamantane with liposomes. Biofizika. 2010 Mar-Apr; 55(2):269-70. Russian.

138. Erdyakov SY, Ignatenko AV, Potapova TV, Lyssenko KA, Gurskii ME, Bubnov YN Design of bicyclic and cage boron compounds based on allylboration of acetylenes with allyldichloroboranes. Org Lett. 2009 Jul 2; ll(13):2872-5. doi: 10.1021/ol900793r.

139. Wagner CE, Shea KJ.Synthesis and first molecular structure of a bis-2-spiro-l-boraadamantane derivative. Org Lett. 2004 Feb 5; 6(3):313-6.

140. Wagner CE, Mohler ML, Kang GS, Miller DD, Geisert EE, Chang YA, Fleischer EB, Shea KJ. Synthesis of 1-boraadamantaneamine derivatives with selective astrocyte vs C6 glioma antiproliferative activity. A novel class of antihepatitis C agents with potential to bind CD81.J Med Chem. 2003 Jul 3; 46(14):2823-33.

141. Wrackmeyer B, Milius W, Tok OL.Reaction of alkyn-l-yl (diorganyl)silanes with 1-boraadamantane: Si-H-B bridges confirmed by the molecular structure in the solid state and in solution. Chemistry. 2003 Oct 6; 9

(19):4732-8.

142. Wagner CE, Kim JS, Shea KJ. The polyhomologation of 1-boraadamantane: mapping the migration pathways of a propagating macrotricyclic trialkylborane.J Am Chem Soc. 2003 Oct 8; 125(40): 12179-95.

143. Wagner CE, Shea KJ. 1-Boraadamantane blows its top, sometimes. The mono- and polyhomologation of 1-boraadamantane.Org Lett. 2001 Oct 4; 3

(20):3063-6.

а п Н! ш I а а I II К шшиш 1Н В К ШК1 КШ К 1Е ШЕ ВКК К1 I 11ВНК I II К ШКНКИ1

104

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность директору

ФГБУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН, академику РАМН Звереву Виталию Васильевичу и заместителю директора по научной работе ФГБУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН, доктору биологических наук Надежде Васильевне Юминовой за предоставленную возможность саморазвития и вклада в научную деятельность. Также автор благодарит своего научного руководителя кандидата биологических наук Николая Александровича Контарова за практическую и теоретическую помощь на всех этапах работы.

Также автор выражает признательность всему коллективу лаборатории детских вирусных инфекций ФГБУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН и отдельно заведующему лабораторией клеточных гибридом, доктору медицинских наук Нагиевой Фирае Галиевне и заведующему лабораторией генетики РНК-содержащих вирусов, доктору медицинских наук Станиславу Георгиевичу Маркушину за сотрудничество.

Теплые слова благодарности хочется выразить заведующему лабораторией электронно-микроскопических исследований, к.б.н. Лотте Вере Даниловне за помощь в подборе материалов и подробный анализ всей работы с высказанными ценными замечаниями и советами.

Особую благодарность хочется выразить сотрудникам Института Биофизики Клетки РАН (г. Пущино, МО, РФ) лаборатории изучения механизмов рецепции: зав. лаб., член-корр. РАН профессору, д.б.н. Фесенко Евгению Евгеньевичу и к.б.н. Катаеву Анатолию Ахсарбековичу за плодотворное сотрудничество и предоставленные возможности для проведения практической части работы и высокий профессионализм.

Заведующему лабораторией биологии лентивирусов, к.б.н. Носик Марине Николаевне и к.б.н., ведущему сотруднику лаборатории диагностики вирусных инфекций Эбралидзе Лине Константиновне за рецензирование диссертации и подробный анализ материалов автореферата.

Моим оппонентам Гребенниковой Татьяне Владимировне и Лаврентьевой Ирине Николаевне за подробный анализ всей работы.

Выражаю глубокую признательность и благодарность М. Алёшиной за профессиональное мастерство, индивидуальный подход и помощь в разрешении проблем, а также за оказанную практическую и теоретическую помощь на всех этапах работы.

Также я благодарна всем соавторам моих работ за помощь в проведении исследований.

И отдельная особая благодарность всей моей семье и моим самым близким друзьям за поддержку и предоставленные возможности в реализации проектов, связанных с научной деятельностью.