Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Ефремов, Ярослав Рейнгольдович

• Ефремов, Ярослав Рейнгольдович
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ефремов, Ярослав Рейнгольдович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Трансформация клеток и приобретение ими опухолевого фенотипа.

1.1.1. Молекулярные аспекты иммортализации.

1.1.2. Контактное торможение.

1.1.3. Рост в неприкрепленном состоянии, анойкис.

1.2. Реверсия опухолеродных клеток к неопухолеродному фенотипу.

1.2.1. Индуцированные реверсии.

1.2.2. Спонтанные реверсии .'.

1.2.3. Спонтанные реверсии как источник дремлющих метастазов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клеточные линии и культуры.

2.1.1. Оценка роста клеток в сингенных животных.

2.1.2. Оценка контактного торможения клеток по включению 3Н-тимидина.

2.1.3. Оценка способности клеток к росту в неприкрепленном состоянии.

2.2. Выделение суммарной РНК из клеток.

2.3. ДНКазная обработка и анализ выделенной РНК.

2.4. Обратная транскрипция.

2.5. Определение относительных концентраций полученной кДНК методом полуколичественного ПЦР.

2.6. Сравнение уровней экспрессии исследованных генов в различных клетках методом полуколичественного ПЦР.

2.7. Математическая обработка полученных данных.

2.8. Проточная цитофлюорометрия.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнение ростовых характеристик злокачественных и ревертантных линий и клонов in vitro и in vivo.

3.1.1. Оценка опухолеродности клеток по росту опухолей в сингенных животных.

3.1.2. Оценка опухолеродности клеток по основным параметрам роста in vitro.

3.2. Сравнение уровней мРНК различных ростовых факторов и их рецепторов в злокачественных и ревертантных линиях и клонах in vitro и in vivo.

3.2.1. Оценка уровней синтеза мРНК основных ростовых факторов клетками in vitro

3.2.2. Оценка уровней синтеза мРНК рецепторов ростовых факторов клетками in vitro и in vivo.

3.2.3. Оценка уровней синтеза мРНК Гепатоцитарного Ростового Фактора (HGF) опухолевыми и псевдонормальными клетками in vitro и in vivo.

3.3. Сравнение злокачественных и псевдонормальных клеток по содержанию белковых продуктов исследованных генов.

3.3.1. Сравнение опухолевых и псевдонормальных клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, по содержанию белковых продуктов HGF, HGFR и EGFR.

3.3.2. Сравнение количества белкового продукта HGF в псевдонормальных клетках, находящихся в логарифмической фазе роста и в GO, обусловленной контактным торможением (конфлюэнтные клетки).

3.4. Реакция клеток на HGF, EGF и PDGF АА.

3.4.1. Эффективность спасения клеток от алоптоза в присутствии HGF, EGF и PDGF АА.

3.4.2. Влияние антител против рецептора HGF на пролиферацию и апоптоз клеток

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу»

Актуальность исследования. Одной из наиболее серьезных проблем клинической онкологии является метастазирование опухолей и, особенно, молчащее метастазирование. Молчащие (дремлющие) метастазы практически не поддаются ранней диагностике, а клетки таких метастазов отличаются повышенной резистентностью к различным типам противоопухолевой терапии. Указанные проблемы являются следствием того, что метастазировавшие клетки очень долгое время способны находиться в состоянии покоя (GO). Данный феномен представляется труднообъяснимым в рамках классической теории канцерогенеза, которая гласит, что трансформированная клетка теряет все основные механизмы негативного контроля клеточного цикла и, соответственно," не способна прекращать деление. Однако, более поздние трактовки данной теории говорят о том, что злокачественность является количественным признаком и, соответственно, клетки могут не только прогрессировать по данному признаку, но и самопроизвольно возвращаться (ревертировать) к исходному фенотипу. Первые работы относительно возможности таких реверсий появились около 25 лет назад, однако, только в начале 90-х годов прошлого века было показано, что способность к спонтанной реверсии является универсальным свойством практически всех опухолевых линий in vitro. Более того, было показано, что спонтанные реверсии являются скорее результатом эпигенетических изменений, чем изменений на уровне генома. В пользу данного утверждения свидетельствуют высокие (в некоторых случаях до 50%), не сопоставимые с мутационными, частоты появления таких ревертантов.

Реверсия злокачественных клеток к неопухолевому фенотипу сопровождается i восстановлением основных механизмов, регулирующих пролиферацию нормальных клеток, таких как: контактное торможение, зависимость от ростовых факторов и внеклеточного матрикса, апоптоз. Однако, такие ревертанты обладают неустойчивым фенотипом и способны вторично трансформироваться через различные промежутки у времени, а их прививка сингенным животным приводит, с определенной вероятностью, к возникновению опухолей через достаточно длительный латентный период (сопоставимый с таковым при молчащем метастазировании). Поэтому, в случае ревертантов говорят не о нормальном, а о псевдонормальном фенотипе. Таким образом, источником дремлющих метастазов, по-видимому, являются опухолевые клетки, временно ревертировавшие к псевдонормальному фенотипу.

На данный момент времени практически ничего не известно о механизмах таких реверсий, и исследования в этой области могут дать ключ не только к пониманию неких фундаментальных законов клеточной биологии, но и дать толчок к развитию новых методов прогнозирования, диагностики и эффективной терапии молчащих метастазов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование эпигенетических изменений, сопровождающих процесс реверсии клеток in vitro, что и определило следующие задачи:

1. Разработать метод оценки степени трансформации клеток для последующего использования при определении фенотипа исследованных клеток.

2. Проследить изменения в интенсивности синтеза мРНК наиболее универсальных ростовых факторов и их рецепторов,. как основного инициирующего звена в формировании пролиферативных характеристик клеток, при изменении степени трансформированности как в сторону увеличения (опухолевая прогрессия), так и в сторону уменьшения (реверсия).

3. Сравнить профили содержания белковых продуктов генов, экспрессия которых наиболее достоверно коррелирует с тем или иным фенотипом, в клетках, различающихся как по степени трансформации, так и по ростовым характеристикам.

Научная новизна. Представляемая работа является первой попыткой выяснить, как изменяется экспрессия ростовых факторов и их рецепторов при спонтанной реверсии опухолевых клеток к псевдонормальному фенотипу с использованием наиболее адекватной для поставленных задач экспериментальной клеточной модели, которая на данный момент является уникальной.

Теоретическая значимость. Выявлены эпигенетические изменения, сопровождающие процесс реверсии опухолевых клеток фибробластического происхождения к псевдонормальному фенотипу. Даны оценки закономерностей между интенсивностью синтеза мРНК и белкового продукта гена HGF и формированием определенного фенотипа исследованных клеток, который оценивался по таким параметрам, как контактное торможение роста и зависимость от внеклеточного матрикса.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методов прогнозирования, ранней диагностики, а возможно и эффективной терапии молчащих метастазов.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Ефремов, Ярослав Рейнгольдович

выводы

1. Предложен метод количественной оценки степени трансформации клеток на основании их ростовых характеристик in vitro и in vivo.

2. Показано, что in vitro реверсия опухолевых клеток трех независимо полученных сарком FCBA2, FC3H3 и FBalb/c к псевдонормальному фенотипу сопровождается значительным, до 100 раз, снижением количества мРНК гепатоцитарнвго ростового фактора.

3. Количество мРНК HGF увеличивается в клетках опухолей, выросших in vivo по сравнению с теми же клетками, взятыми из культуры in vitro.

4. Показано, что клетки, содержащие повышенное количество мРНК HGF не способны к эффективному контактному торможению.

5. Активно делящиеся клетки, как злокачественные, так и незлокачественные, практически не отличаются между собой по концентрациям белковых продуктов HGF и его рецептора, а концентрации белкового продукта EGFR нельзя связать с каким-либо признаком.

6. Переход клеток в фазу GO при контактном торможении сопровождается снижением количества белка HGF, причем часть популяции теряет этот белок полностью, а оставшиеся клетки содержат его на 20-25% меньше. jf

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Реверсия злокачественных клеток к псевдонормальному фенотипу связана со значительными изменениями в их пролиферативной активности, способности к контактному торможению и зависимости от внеклеточного матрикса. Теоретически, такие изменения могут бьггь связаны с любым звеном в сигнальных каскадах клетки, однако на практике, по-видимому, реализуются преимущественно те, которые связаны с наиболее лабильными в эпигенетическом плане генами и их белковыми продуктами. Такое предположение косвенно подтверждается с одной стороны достаточно высокими, до 45%, частотами появления ревертантных клонов [Lavrovsky et al., 1992; Ефремов и др., 2001; Лавровский и др., 2002], а с другой - количественным характером, признака злокачественности. Исходя из этого, было логично предположить, что реверсия может быть связана с изменениями на уровне экспрессии одного или нескольких ростовых факторов или их рецепторов, как наиболее вероятных кандидатов, которые с одной стороны характеризуются достаточно высокой эпигенетической лабильностью, а с другой - обеспечивают тонкую модуляцию клеточной пролиферации и дифференцировки.

Результаты, представленные в данной работе, в целом подтверждают высказанную гипотезу, хотя и не могут быть признаны абсолютным ее доказательством. Наличие четкой корреляции между количеством мРНК гепатоцитарного ростового фактора и фенотипом клеток, а именно крайне высокое ее содержание у опухолевых клеток и практически полное отсутствие у ревертантов, безусловно говорит в пользу нашего предположения. С другой стороны, несколько типично неопухолевых клонов нашей модели отличаются крайне высоким, сравнимым с таковым у злокачественных клеток, содержанием данной мРНК. Мы предположили, что высокий уровень мРНК HGF является необходимым, но не достаточным условием наличия трансформированного фенотипа. Очевидно, что процесс трансформации связан с изменением очень большого набора клеточных характеристик, которые заключаются не только в усилении пролиферативных аутокринных сигналов, но и в ослаблении или полной потере антипролиферативных сигналов [Hanahan, Weinberg, 2000]. Таким образом, в рамках нашей теории первичная трансформация, сопровождаемая множественными изменениями, является более длительным и сложным процессом, чем реверсия или вторичная трансформация, которые могут быть результатом изменений значительно меньшего числа параметров.

Безусловно, рассматривать реверсию как простое снижение в уровне митогенных сигналов, опосредуемых ростовыми факторами, а в данном конкретном случае одним ростовым фактором, было бы несколько наивно. Очевидно, что формирование псевдонормального фенотипа является следствием более сложного, комплексного эффекта, который приводит, в частности, к восстановлению зависимости от внеклеточного матрикса. В этом плане интересно рассмотреть не митогенную, а мотогенную функцию ростовых факторов. Известно, что многие ростовые факторы в той или иной мере увеличивают подвижность клеток-мишеней [Rosen, Goldberg, 1989], однако только HGF и EGF обладают достаточно сильным эффектом и наиболее часто ассоциированы с инвазивным фенотипом [Wells, 2000]. Соответственно, подавление экспрессии HGF может приводить не только к снижению скорости пролиферации, но и к снижению подвижности клеток, которая регулируется посредством тех же механизмов, что и зависимость от внеклеточного матрикса и контактное торможение.

Анализ неопухолеродных клонов, различающихся по содержанию мРНК HGF, подтвердил, что клоны с высоким уровнем данной мРНК были неспособны к эффективному контактному торможению. Более того, мы показали, что при переходе у клеток в фазу G0, обусловленную контактным торможением, наблюдается значительное снижение в количестве белка HGF по сравнению с делящимися клетками. При этом, однако, достоверных отличий между активно пролиферирующими опухолевыми и неопухолевыми клетками по содержанию белкового продукта HGF обнаружено не было. Мы предположили, что указанный эффект связан с наличием неких механизмов, регулирующих эффективность трансляции мРНК HGF на разных этапах клеточного цикла. По-видимому, активно пролиферирующие клетки характеризуются достаточно высокой эффективностью трансляции указанной мРНК. В результате HGF нарабатывается в достаточных количествах не только в клетках с высоким содержанием соответствующей мРНК (опухолевые и некоторые неопухолевые клетки), но и в ревертантах, которые содержат ее на 1-2 порядка меньше. Однако когда клетки достигают конфлюэнтности, то запускаются определенные механизмы, блокирующие трансляцию соответствующих мРНК, в том числе и мРНК HGF. В результате клетки с низким содержанием данной мРНК начинают постепенно терять соответствующий белок и спокойно переходят в GO, а клетки с высоким содержанием продолжают нарабатывать HGF в количествах, достаточных для продолжения пролиферации.

Таким , образом, значительное снижение мРНК HGF представляется вполне достаточным для реверсии событием за одним исключением: все описанные эффекты HGF распространяются только на клетки эпителиального происхождения, в то время как фибробласты, являющиеся его источником, сами к нему практически нечувствительны [Stoker, Gherardi, 1989]. Однако данный феномен относится только к нормальным диплоидным фибробластам и некоторым неопухолевым линиям фибробластического происхождения типа ЗТЗ, хотя и на этот счет имеются достаточно противоречивые данные. С одной стороны показано, что нормальные человеческие фибробласты in vitro не экспрессируют HGFR вообще [Kawaguchi et al., 2002], а с другой стороны Vande Woude с сотрудниками показали изменение фенотипа клеток NIH ЗТЗ in vitro под'воздействием гельдамицинов (антибиотики из группы анизамицина), которые подавляют экспрессию с-Met (HGFR) [Webb et al, 2000]. Более того, Hirohashi с сотрудниками показали, что человеческие миофибробласты in vitro экспрессируют и HGF/SF, и c-Met не только на уровне мРНК, но и на уровне зрелого белка [Tokunou et al., 2000]. Результаты, полученные в нашей лаборатории также подтверждают, что эмбриональные фибробласты, как мышиные, так и человеческие, содержат и мРНК гена c-met, и его белковый продукт.

Таким образом, резистентность к действию HGF представляется достаточно странным и спорным явлением даже в случае нормальных фибробластов, и тем более в случае трансформированных клеток. Так, например, показано, что c-met очень часто амплифицирован и/или отличается повышенной экспрессией в спонтанных трансформантах клеток NIH ЗТЗ [Cooper et al., 1986]. Аналогично, клетки нашей модели, и опухолевые, и неопухолевые, отличались достаточно высоким содержанием как мРНК с-met, так и его белкового продукта. Тем не менее, мы не обнаружили существенного эффекта экзогенного HGF на неопухолевые клоны в экспериментах по спасению клеток от апоптоза. Более того, антитела против c-Met также не вызывали ни апоптоза, ни заметного снижения скорости пролиферации исследованных клеток.

Для объяснения наблюдаемых эффектов мы предложили две альтернативные гипотезы. Одна: из них предполагает, что клетки нашей модели обеспечивают функциональную аутокринную "петлю" за счет повышенного синтеза HGF, а нечувствительность к антителам против c-Met объясняется тем, что данная петля реализуется через стимуляцию внутриклеточных форм рецепторов. Другая гипотеза предполагает отсутствие какой либо чувствительности исследованных клеток к HGF, а снижение количества соответствующей мРНК является лишь маркером процесса реверсии, а не ее причиной. Однако, в любом случае, полученные результаты представляются весьма ценными, т.к. в будущем могут помочь в идентификации факторов транскрипции, отвечающих за такой характер экспрессии HGF и, соответственно, других генов, чья экспрессия регулируется аналогично HGF.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ефремов, Ярослав Рейнгольдович, 2004 год

1. Киселева Е.Г., 1988. "Гетерогенность опухоли и механизмы естественной резистентности при метастазировании." Эксп. Онкол. 10,3-8.

2. Лавровский В.А., Ефремов Я.Р., Пивоварова Е.Н., Мануйлов В.А., Хрипко Ю.И., 2002. "Случайное распределение уровня экспрессии ростовых факторов у злокачественных и ревертантных клонов мышиных и человеческих опухолей." Цитология 44, 702-711.

3. Afrakhte M., lleldin N.E., Westermark В., 1998. "Inhibition of G1 cyclin-dependent kinase activity in cell density-dependent growth arrest in human fibroblasts." Cell Growth Differ. 9,983-988.

4. Amstad P.A., Liu H., Ichimiya M., Berezesky I.K., Trump B.F., 1997. "Manganese superoxide dismutase expression inhibits soft agar growth in JB6 clone41 mouse epidermal cells." Carcinogenesis 18,479-484.

5. Aragona M., Maisano R., Panetta S., Giudice A., Morelli M., La Torre I., La Torre F., 2000. "Telomere length maintenance in aging and carcinogenesis." Int. J. Oncol. 17,981-989.

6. Bailey S.M., Meyne J., Chen D.J., Kurimasa A., Li G.C., Lehnert B.E., Goodwin Б.Н., 1999. "DNA double-strand break repair proteins are required to cap the ends of mammalian chromosomes." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,14899-14904.

7. Bhargava M., Joseph A., Knesel J., Halaban R., Li Y., Pang S., Goldberg I., Setter E., Donovan M.A., Zarnegar R., 1992. "Scatter factor and hepatocyte growth factor: activities, properties, and mechanism." Cell Growth Differ. 3,11-20.

8. Beerli R.R., Wels W. and Hynes N.E., 1994. "Intracellular expression of single-chain antibodies reverts ErbB-2 transformation." J. Biol. Chem. 269,23931-23936.

9. Bejcek B.E., Li D.Y., Deuel T.F., 1989. "Transformation by v-sis occurs by an internal autoactivation mechanism." Science 245,1496-1499.

10. Ben Ze'ev A., Farmer S.R., Penman S., 1980. "Protein synthesis requires cell-surface contact while nuclear events respond to cell shape in anchorage-dependent fibroblasts." Cell 21, 365-372.

11. Ben-Ze'ev A., 1997 "Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressors." Curr. Opin. Cell Biol. 9,99-108.

12. Bernard O., Reid H.H., Bartlett P.F., 1989. "Role of the c-myc and the N-myc protoyoncogenes in the immortalization of neural precursors." J. Neurosci. Res. 24,9-20.

13. Berndt N., Dohadwala M., Liu C.W., 1997. "Constitutively active protein phosphatase lalpha causes Rb-dependent G1 arrest in human cancer cells." Curr. Biol. 7,375-386.

14. Bogler O., Nagane M., Gillis J., Huang H.J., Cavenee W.K., 1999. "Malignant transformation of p53-deficient astrocytes is modulated by environmental cues in vitro." Cell Growth Differ. 10,73-86.

15. Boudreau N., Sympson C.J., Werb Z., Bissell M.J., 1995. "Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix." Science 267, 891-893.

16. Braun S., Pantel K., 1999. "Micrometastatic bone marrow involvement. detection and prognostic significance." Med. Oncol. 16, 154-165.

17. Brouty-Boye D., Gresser J., Baldwin C., 1979. "Reversion of the transformed phenotype to the parental phenotype by subcultivation of x-ray-transformed C3H/10T1/2 cells at low cell density." Int. J. Cancer 24,253-260.

18. Brugarolas J., Bronson R.T., Jacks Т., 1998. "p21 is a critical CDK2 regulator essential for proliferation control in Rb-deficient cells." J. Cell Biol. 141, 503-514.

19. Bryan T.M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., and Reddel R.R., 1995. "Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity." EMBO J. 14, 42404248.

20. Bryan T.M., and Cech T.R., 1999. "Telomerase and maintenance of chromosome ends." Curr. Opin. Cell Biol. 11,318-324.

21. Cabrera-Vera T.M., Vanhauwe J., Thomas Т.О., Medkova M., Preininger A., Mazzoni M.R., Hamm H.E., 2003. "Insights into G protein structure, function, and regulation." Endocr. Rev. 24,765-781.

22. Calabretta В., Kaczmarek L.t Selleri LM Torelli G., Ming P.M., Ming S.C., Mercer W.E., 1986. "Growth-dependent expression of human Mr 53,000 tumor antigen messenger RNA in normal and neoplastic cells." Cancer Res. 46,5738-5742.

23. Chakrabarty S., Jan Y., Levine A., McClenic В., Varani J., 1989. "Fibronectin/laminin and their receptors in aberrant growth control in FR3T3 cells transformed by Ha-ras oncogene and epidermal growth factor gene." Int. J. Cancer 44,325-331.

24. Chen P.L., Scully P., Shew J.Y., Wang J.Y., Lee W.H., 1989. "Phosphorylation of the retinoblastoma gene product is modulated during the cell cycle and cellular differentiation." Cell 58,1193-1198.

25. Chen C.S., Mrksich M., Huang S., Whitesides G.M., Ingber D.E., 1997. "Geometric control of cell life and death." Science 276,1425-1428.

26. Classon M., Salama S., Gorka C., Mulloy R., Braun P., Harlow E., 2000. "Combinatorial roles for pRB, pl07, and pl30 in E2F-mediated cell cycle control." Proc. Natl. Acad. Sci: USA. 97,10820-10825.

27. Comoglio P.M., 1993. "Structure, biosynthesis and biochemical properties of the HGF receptor in normal and malignant cells." EXS 65, 131-165.

28. Cooper C.S., Tempest P.R., Beckman M.P., Heldin C.H., Brookes P., 1986. "Amplification and overexpression of the met gene in spontaneously transformed NIH3T3 mouse fibroblasts." EMBOJ. 5,2623-2628.

29. Crepin M., Gamby C., Salle V., Souttou В., Tamboise A., Tamboise E., Hamelin R., 1993. "Phenotypes of human epithelial cell lines immortalized from benign mastopathies." Anticancer Res. 13,497-506.

30. Cutbill S., 1994. "Cellular epigenetics and the origin of cancer." Bioessays 16,393-394.

31. D'Ambrosio C., Hongo A., Li S., Baserga R., 1996. "The role of Grb2 in the growth and transformation of mouse embryo cells." Oncogene 12,371-378.

32. Dannenberg J.H., van Rossum A., Scbuijff L., te Riele H., 2000. "Ablation of the retinoblastoma gene family deregulates G(l) control causing immortalization and increased cell turnover under growth-restricting conditions." Genes Dev. 14,3051-3064.

33. Darnbrough C., Slater S., Vass M., MacDonald C., 1992. "Immortalization of murine primary spleen cells by v-myc, v-ras, and v-raf." Exp. Cell Res. 201,273-283.

34. Dedhar S., 1995. "Integrin mediated signal transduction in oncogenesis: an overview." Cancer Metastasis Rev. 14,165-1 72.

35. Deffie A., Hao M., Montes de Oca Luna R., Hulboy D.L., Lozano G., 1995. "Cyclin E restores p53 activity in contact-inhibited cells" Mol Cell Biol. 15,3926-3933.

36. Dodson M.G., Gelder F.B., Slota J., Lange C., 1983. "Fibronectin and anchorage-independent and anchorage-dependent growth of benign and malignant cell lines." Int. J. Cancer 32,211-217.

37. Dong Z., Lavrovsky V., Colburn N.H., 1995. "Transformation reversion induced in JB6 RT101 cells by AP-1 inhibitors." Carcinogenesis 16,749-756.

38. Ducray C., Pommier J.P., Martins L., Boussin F.D., Sabatier L., 1999. "Telomere dynamics, end-to-end fusions and telomerase activation during the human fibroblast immortalization process." Oncogene 18,4211-4223.

39. Dunaief J.L., King A., Esumi N., Eagen M., Dentchev Т., Sung C.H., Chen S., Zack D.J., 2002. "Protein Phosphatase 1 binds strongly to the retinoblastoma protein but not to pi07 or p 130 in vitro and in vivo." Curr. Eye Res. 24,392-396.

40. Durfee TV, Becherer K., Chen P.L., Yeh S.H., Yang Y., Kilburn A.E., Lee W.H., Elledge S.J., 1993. "The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic submit." Genes Dev 7,555-569.

41. Duncan E.L., Wadhwa R., Kaul S.C., 2000. "Senescence and immortalization of human cells." Biogerontology 1, 103-121.

42. Dykhuizen D., 1974. "Evolution of cell senescence, atherosclerosis and benign tumours." Nature 251,616-618.

43. Dyson N., 1998. "The regulation of E2F by pRB-family proteins." Genes Dev 12, 22452262.

44. Finlay C.A., 1993. "The mdm-2 oncogene can overcome wild-type p53 suppression of transformed cell growth." Mol. Cell. Biol. 13,301-306.

45. Folkman J., Moscona A., 1978. "Role of cell shape in growth control." Nature 273, 345349.У

46. Foulds L., 1954. "The experimental study of tumor progression." Cancer Res. 14,327-339. Foulds L., 1965. "Multiple etiologic factors in neoplastic development." Cancer Res. 25, 1339-1351.

47. Frisch S.M., Francis H., 1994. "Disruption of epithelial cell-matrix interactions inducesуapoptosis." J. Cell Biol. 124,619-626.

48. Frisch S.M., Ruoslahti E., 1997. "Integrins and anoikis." Curr. Opin. Cell Biol., 9, 701706.

49. Fusenig N.E., Boukamp P., 1998. "Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes." Mol. Carcinog. 23, 144-158.

50. Fushimi K., Iijima M., Gao C., Kondo Т., Tsuji Т., Hashimoto Т., Mihara K., Namba M., 1997. "Transformation of normal human fibroblasts into immortalized cells with the mutant p53 gene and X-rays." Int. J. Cancer 70, 135-140.

51. Gao Q., Hauser S.H., Liu X.L., Wazer D.E., Madoc-Jones H., Band V., 1996. "Mutant p53-induced immortalization of primary human mammaiy epithelial cells." Cancer Res. 56, 3129-3133.

52. Garbe J., Wong M., Wigington D., Yaswen P., Stampfer M.R., 1999. "Viral oncogenes accelerate conversion to immortality of cultured conditionally immortal human mammary epithelial cells." Oncogene 18,2169-2180.

53. Gendron R.L., Liu C.Y., Paradis H., Adams L.C., Kao W.W., 2001. "MK/T-1, an immortalized fibroblast cell line derived using cultures of mouse corneal stroma." Mol. Vis. 7, 107-113.

54. Gershey E.L., D'AIisa R.M., 1980. "Characterization of a CV-1 cell cycle. П. The role of cell-substrate attachment." J. CellSci. 42, 357-365.

55. Gherardi E., Sharpe M., Lane K., Sirulnik A., Stoker M., 1993. "Hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), the c-met receptor and the behaviour of epithelial cells." Symp. Soc. Exp. Biol. 47,163-181.

56. Giancotti F.G., Ruoslahti E., 1990. "Elevated levels of the a5pl fibronectin receptor suppress the transformed phenotype of Chinese hamster ovary cells." Cell 60,849-859.

57. Gregoire L., Rabah R., Schmelz E.M., Munkarah A., Roberts P.C., Lancaster W.D., 2001. "Spontaneous malignant transformation of human ovarian surface epithelial cells in vitro." Clin. Cancer Res. 7,4280-4287.

58. Greulich H., Hanafusa H., 1996. "A role for Ras in v-Crk transformation." Cell Growth Differ. 7,1443-1451.

59. Grobelny J.V., KuIp-McEIiece M., Broccoli D., 2001. "Effects of reconstitution of telomerase activity on telomere maintenance by the alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway." Hum. Mol. Genet. 10,1953-1961.A

60. Hall P., Coates P., Ansari В., Hopwood D., 1994. "Regulation of cell number in the mammalian gastrointestinal tract: the importance of apoptosis." J. CellSci. 107, 3569-3577.

61. Hart J.R., Fidler J.I., 1981. "The implications of tumor heterogeneity for studies on the biology and therapy of cancer metastasis." Biochem. et Biophys. Acta 651,37-50.

62. Hayflick L., Moorhead P.S., 1961. "The serial cultivation of human diploid cell strains." Exp. Cell Res. 25,585-621.

63. Hayflick L., 1997. "Mortality and immortality at the cellular level. A Review." Biochemistry 62, 1180-1190.

64. Hanahan D., Weinberg R., 2000. "The Hallmarks of Cancer. Review." Cell 100, 57-70. Harvey D.M., Levine A.J., 1991. "p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts." Genes Dev. 5,2375-2385.

65. Heinicke Т., Radziwill G., Nawrath M., Rommel C., Pavlovic J., Moelling K., 2000. "Retroviral gene transfer of dominant negative raf-1 mutants suppresses ha-ras-induced transformation and delays tumor formation." Cancer Gene Ther. 7, 697-706.

66. Heldin C., Westermark В., 1989. "Growth factors as transforming proteins." Eur. J. Biochem. 184,487-496.

67. Hirano M., Hirano K., Nishimura J., Kanaide H., 2001. "Transcriptional up-regulation of p27(Kipl) during contact-induced growth arrest in vascular endothelial cells." Exp. Cell. Res. 271, 356-367.

68. Holley R.W., Kiernan J.A., 1974. "Control of the initiation of DNA synthesis in 3T3 cells: serum factors." Proc Natl Acad Sci USA. 71,2908-2911.

69. Holley R.W., 1975. "Control of growth of mammalian cells in cell culture." Nature 258, 487-490.

70. Hsu T.-Ch., Young M.R., Cmarik J., Colburn N.H., 2000. "Activator protein 1 (AP-1)-and nuclear factor kB (NF-kB)-dependent transcriptional events in carcinogenesis.^' Free Radical Biology and Medicine 28, 1338-1348.

71. Huang R.P., Liu С., Fan Y., Mercola D., Adamson E.D., 1995. "Egr-1 negatively regulates tumor cell growth via the DNA-binding domain." Cancer Res. 55, 5054-5062.

72. Humphries M.J., 2000. "Integrin structure." Biochem. Soc. Trans. 28,311-339.

73. Jannot C.B., Beerli R.R., Mason S., Gullick W.J., Hynes N.E., 1996. "Intracellular expression of single-chain antibody directed to the EGFR leads to growth inhibition of tumor cells." Oncogene 13,275-282.4

74. Jazayeri A., McGee J., Shimamura Т., Cross S.B., Bejcek B.E., 2000. "SHP-2 can suppress transformation induced by platelet-derived growth factor." Exp. Cell Res. 254,197-203.

75. Kastan M.B., Onyekwere O., Sidransky D., Vogelstein В., Craig R.W., 1991. "Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage." Cancer Res. 51, 63046311.

76. Katakura Y., Alam S., Shirahata S., 1998. "Immortalization by gene transfection." Methods Cell Biol. 57,69-91.

77. Kataoka II., Gohda E., Matsunaga Т., Ishii Т., Нага H., Yamamoto I., 1993. "Stimulation of DNA synthesis in skin fibroblasts by human hepatocyte growth factor/scatter factor." Cell Biol Int. 17,65-73.

78. Kaul S.C., Wadhwa R., Sugihara Т., Obuchi K., Komatsu Y., Mitsui Y., 1994. "Identification of genetic events involved in early steps of immortalization of mouse fibroblasts." Biochim BiophysActa. 1201,389-396.

79. Kelekar A., Cole M.D., 1987. "Immortalization by c-myc, H-ras, and El a oncogenes induces differential cellular gene expression and growth factor responses." Mol. Cell. Biol. 7, 3899-3907.

80. Kieser A., Seitz Т., Adler H.S., Coffer P., Kremmer E., Crespo P., Gutkind J.S., Henderson D.W., Mushinski J.F., Koich W., Mischak H., 1996. "Protein kinase C-zeta reverts v-raf transformation of NTH-3T3 cells." Genes Dev. 10,1455-1466.

81. Kirkham P.A., Lam E.W., Takamatsu Eft, Parkhouse R.M., 1998. "Transcription factor E2F controls the reversible gamma delta T cell growth arrest mediated through WC1." J. Immunol 161, 1630-1636.

82. Kirsch M., Schackert G., Black P.M., 2000. "Angiogenesis, metastasis, and endogenous inhibition.'V. Neurooncol. 50, 173-180.

83. Keating M.T., Williams L.T., 1988. "Autocrine stimulation of intracellular PDGF receptors in v-sis-transformed cells." Science 239,914-916.

84. Krimpenfort P., Quon K.C., Mooi W.J., Loonstra A., Berns A., 2001. "Loss of pl6INK4a confers susceptibility to metastatic melanoma in mice." Nature 413, 83-86.

85. Kuerbitz S.J., Plunkett B.S., Walsh W.V., Kastan M.D., 1992. "Wild-type p53 is a cell cycle checkpoint determinant following irradiation." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,7491-7495.

86. Y., Basilico C., Mansukhani A., 1994. "Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors." Mol Cell Biol. 14, 76607669.

87. Ma L., Gauville C., Berthois Y., Millot G., Johnson G.R., Calvo F., 1999. "Antisense expression for amphiregulin suppresses tumorigenicity of a transformed human breast epithelial cell line." Oncogene 18,6513-6520.

88. Martinez J., Georgoff I., Martinez J., Levine A.J., 1991. "Cellular localization and cell cycle regulation by a temperature-sensitive p53 protein." Genes Dev. 5,151-159.

89. McGill G., Shimamura A., Bates R.C., Savage R.E., Fisher D.E., 1997. "Loss of matrix adhesion triggers rapid transformation-selective apoptosis in fibroblasts." J. Cell Biol. 138, 901911.

90. Mercer W.E., Shields M.T., Amin M., Sauve G.J., Appella E., Romano J.W., Ullrich S.J., 1990. "Negative growth regulation in a glioblastoma tumor cell line that conditionally expresses human wild-type p53." Proc Natl Acad Sci USA. 87,6166-6170.

91. Meredith J., Schwartz M., 1997. "Integrins, adhesion and apoptosis." Trends Cell Biol. 7, 146-150.

92. Messerle K., Schlegel J., Hynes N.E., Groner В., 1994. "NIH/3T3 cells transformed with the activated erbB-2 oncogene can be phenotypically reverted by a kinase deficient, dominant negative erbB-2 variant." Mol. Cell. Endocrinol 105,1-10.s

93. Mignatti P., Rifkin D.B., 1993. "Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion." Physiol Rev. 73, 161-195.

94. Mondal S., Embleton M.J., Marquardt H., Heidelberger C., 1971. "Production of variants of decreased malignancy and antigenicity from clones transformed in vitro by methylcholantrene." Int. J. Cancer 8,410-420.

95. Morris V.L., Schmidt E.E., MacDonald I.C., Groom A.C., Chambers A.F., 1997. "Sequential steps in hematogenous metastasis of cancer cells studied by in vivo videomicroscopy." Invasion Metastasis, 17,281-296.

96. Nakayama K., Ishida N., Shirame M., Inomata A., Inoue Т., Shishido N., Horii I., Loh D.Y., Nakayama K., 1996. "Mice lacking p27 (Kipl) display an increased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia and pituitary tumors." Cell 85, 707-720.

97. Nelson P.J., Daniel Т.О., 2002. "Emerging targets: Molecular mechanisms of cell contact-mediated growth control." Kidney Int. Suppl. 61 Suppl.l, 99-105.

98. Nickoloff B.J., Chaturvedi V., Bacon P., Qin J.Z., Denning M.F., Diaz M.O., 2000. "Id-1 delays senescence but does not immortalize keratinocytes." J. Biol Chem. 275,27501-27504.

99. Nicolson G.L., 1987. "Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression." Cancer Res. 47,1473-1487.

100. Noda M., 1993. "Mechanisms of reversion." FASEBJ. 7, 834-846.

101. Noltenius С., Noltenius H., 1985. "Dormant tumor cells in liver and brain. An autopsy study on metastasizing tumors." Pathol. Res. Pract. 179,504-511.

102. Nowell P.C., 1976. "The clonal evolution of tumor cell populations. Acquired genetic liability permits stepwise selection of variant sublines and underlies tumor progression." Science 194,23-28.

103. Onishi Т., Machida Т., Masuda F., Iizuka N., Shirakawa H., Hatano Т., 1992. "Clinical study of patients with renal carcinoma surviving for more than 10 years after nephrectomy." Br. J. Urol. 70,483-487.

104. Ossowski L., Reich E., 1983. "Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment." Cell 33,323-333.

105. Pantel K., Braun S., 2001. "Molecular determinants of occult metastatic tumor cells in bone marrow." Clin. Breast Cancer 2, 222-228.

106. Park N.H., Guo W., Kim H.R., Kang M.K., Park N.H., 2001 "c-myc and Spl/3 are required for transactivation of hamster telomerase catalytic subunit gene promoter." Int. J. Oncol. 19,755-761.

107. Parreno ML, Garriga J., Limon A., Mayol X., Beck G.R. Jr., Moran E., Grana X., 2000. "ElA blocks hyperphosphorylation of pi30 and pi07 without affecting the phosphorylation status of the retinoblastoma protein." J. Virol. 74,3166-3176.

108. Peeper D.S., Shvarts A., Brummelkamp Т., Douma S., Koh E.Y., Daley G.Q., Bernards R., 2002. "A functional screen identifies hDRILl as an oncogene that rescues RAS-induced senescence." Nat. Cell Biol. 4,148-153.

109. Plantefaber L.C., Hynes R.O., 1989. "Changes in integrin receptors on oncogenically transformed cells." Cell 56,281-290.

110. Polakowska R., Piacentini M., Bartlett R., Goldsmith L., Haake A., 1994. "Apoptosis in human skin development: morphogenesis, periderm and stem cells." Dev. Dyn. 3,176-188.

111. Pollack R., Wolman S., Vogel A., 1970. "Reversion of virus-transformed cell lines: hyperploidy accompanies retention of viral genes "Nature 228, 938-970.

112. Polyak K., Kato J., Solomon M.J., Sherr C.J., Massague J., Roberts J.M., Koff A.,1994. "p27Kipl, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contactfinhibition to cell cycle arrest." Genes Dev. 8,9-22.

113. Rabinowitz Z., Sachs L., 1968. "Reversion of properties in cells transformed by Polyoma virus." Nature 220, 1203-1206.

114. Re F., Zanetti A., Sironi M., Polentarutti N., Lanfrancone L., Dejana E., Colotta F., 1994. "Inhibition of anchorage-dependent cell spreading triggers apoptosis in cultured human endothelial cells." J. Cell Biol. 127,537-546.

115. Redpath N.T., Proud C.G., 1994. "Molecular mechanisms in the control of translation by hormones and growth factors." Biochim. Biophys. Acta 1220,147-162.

116. Reich N.C., Levine A.J., 1984. "Growth regulation of a cellular tumour antigen, p53, in nontransformed cells." Nature. 308,199-201.7 x

117. Riley D.J., Lee E.Y.-H.P., Lee W.-H., 1994. "The retinoblastoma protein: more than a tumor suppressor." Annu Rev Cell Biol 10,1-29.

118. Ritt M.G., Mayor J., Wojcieszyn J., Smith R., Barton C.L., Modiano J.F., 2000. "Sustained nuclear localization of p21/WAF-l upon growth arrest induced by contact inhibition." Cancer Lett. 158,73-84.

119. Roques C.N., Boyer J.C., Farber R.A., 2001. "Microsatellite mutation rates are equivalent in normal and telomerase-immortalized human fibroblasts." Cancer Res. 61, 8405-8407.

120. Rosen E.M., Goldberg I.D., 1989. "Protein factors which regulate cell motility." In Vitro Cell Dev. Biol., 25, 1079-1087.

121. Rosenmuller Т., Rydh K., Nanberg E., 2001. "Role of phosphoinositide ЗОН-kinase in autocrine transformation by PDGF-BB." J. Cell. Physiol. 188,369-382.

122. Rubin E., Tamrakar S., Ludlow J.W., 1998. "Protein phosphatase type 1, the product of the retinoblastoma susceptibility gene, and cell cycle control." Front Biosci 3, D1209-1219.

123. Sage J., Mulligan G.J., Attardi L.D., Miller A., Chen S., Williams В., Theodorou E., Jacks Т., 2000. "Targeted disruption of the three Rb-related genes leads to loss of G(l) control and immortalization." Genes Dev. 14,3037-3050.л

124. Schwartz M.A., Lechene C., Ingber D.E., 1991. "Insoluble fibronectin activates the Na/H antiporter by clustering and immobilizing integral alpha 5 beta 1, independent of cell shape." Proc Natl Acad Sci USA. 88, 7849-7853.

125. Shamah SM, Stiles CD, Guha A., 1993. "Dominant-negative mutants of platelet-derived growth factor revert the transformed phenotype of human astrocytoma cells." Mol Cell Biol. 13, 7203-7212.

126. Sharpless N.E., Bardeesy N., Lee K.H., Carrasco D., Castrillon D.H., Aguirre A.J., Wu E.A., Horner J.W., DePinho R.A., 2001. "Loss of pl6INK4a with retention of pl9ArfУpredisposes mice to tumorigenesis." Nature 413,86-91.

127. Sharpless N.E., Alson S., Chan S., Silver D.P., Castrillon D.H., DePinho R.A., 2002. "pl6(INK4a) and p53 deficiency cooperate in tumorigenesis." Cancer Res. 62,2761-2765.

128. Shay J.W., and Bacchetti S., 1997. "A survey of telomerase activity in human cancer." Eur. J. Cancer 33,787-791.

129. Sherr C.J. and Roberts J.M., 1995. "Inhibitors of mammalian Gi cyclin-dependent kinases." Genes Dev. 9, 1149-1163.

130. Selkirk J.K., He С., Merrick B.A., 1994. "Mouse cells with null p53 mutation have all p53 isoforms deleted and lose negative growth control." Appl. Theor. Electrophor. 4, 89-93.у

131. Simm A., Halle J.P., Adam G., 1994. "Proliferative and metabolic capacity of rat embryo fibroblasts immortalized by c-myc depends on cellular age at oncogenic transfection." Eur. J. Cell Biol. 65,121-131.

132. Sonoda H., Nishida K., Yoshioka Т., Ohtani M., Sugita K., 1996. "Oxamflattin: a novelуcompound which reverses malignant phenotype to normal one via induction of JunD." Oncogene 13,143-149.

133. Sporn M.B., Roberts A.B. 1985. "Autocrine growth factors and cancer." Nature 313, 745747.

134. Stoker M.G., and Rubin H., 1967. "Density dependent inhibition of cell growth in culture." Nature 215,171-172.

135. Stoker M., O'Neill C., Berryman S., Waxman V., 1968. "Anchorage and growth regulation in normal and virus-transformed cells." Int. J. Cancer 3,683-693.a

136. Stoker M., Gherardi E., Perryman M., and Gray J., 1987. "Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility." Nature 327,239-242.

137. Stoker M. and Gherardi E., 1989. "Scatter factor and other regulators of cell mobility." Br. Med. Bull. 45,481-491.

138. Stupack D.G., Cheresh D.A., 2002. "Get a ligand, get a life: integrins, signaling and cell survival."J. CellSci. 115,3729-3738.

139. Sun C., Antonionio R.J. and Redpath J.L., 1996. "Reversion of UVC-induced tumorigenic human hybrid cells to the non-tumorigenic phenotype." Europ. J. Cancer 32A, 322327.

140. Suzuki Т., Murakami M., Onai N., Fukuda E., Hashimoto Y., Sonobe M.H., Kameda Т., Ichinose M., Miki K., Iba H., 1994. "Analysis of AP-1 function in cellular transformation pathways." J. Virol 68,3527-3535.у

141. Thompson R.A. Jr., Campbell E.W. Jr., Kramer H.C., Jacobs S.C., Naslund M.J.,1993. "Late invasive recurrence despite long-term surveillance for superficial bladder cancer." J. Urol. 149,1010-1011.

142. Tobey R.A., Ley K.D., 1970. "Regulation of initiation of DNA synthesis in Chinese hamster cells. I. Production of stable, reversible G1-arrested populations in suspension culture." J. Cell Biol 46,151-157. f

143. Valentinis В., Reiss K., Baserga R., 1998. "Insulin-like growth factor-I-mediated survival from anoikis: role of cell aggregation and focal adhesion kinase." J. Cell Physiol. 176,648-657.

144. Valentinis В., Morrione A., Peruzzi F., Prisco M., Reiss K., Baserga R., 1999. "Anti-apoptotic signaling of the IGF-I receptor in fibroblasts following loss of matrix adhesion." Oncogene 18,1827-1836.

145. Varner J.A., Emerson D.A., Juliano R.L., 1995. "Integrin alpha 5 beta 1 expression negatively regulates cell growth: reversal by attachment to fibronectin." Mol Biol Cell. 6, 725740.

146. Vassbotn F.S., Andersson M., Westermark В., Heldin C.H., Ostman A., 1993. "Reversion of autocrine transformation by a dominant negative platelet-derived growth factor mutant." Mol Cell Biol. 13,4066-4076.

147. Voorhoeve P.M., Hijmans E.M., Bernards R., 1999. "Functional interaction between a novel protein phosphatase 2A regulatory subunit, PR59, and the retinoblastoma-related pi07 protein." Oncogene 18, 515-524.

148. Webb C.P., Taylor G.A., Jeffers M., Fiscella M., Oskarsson M., Resau J.H., Vandef

149. Woude G.F., 1998. "Evidence for a role of Met-HGF/SF during Ras-mediated tumorigenesis/metastasis." Oncogene 17, 2019-2025.

150. Wells A., 2000. "Tumor invasion: role of growth factor-induced cell motility." Adv. Cancer Res. 78,31-101.у

151. Whittenberger В., Raben D., Glaser L., 1979. "Regulation of the cell cycle of 3T3 cells in culture by a surface membrane-enriched cell fraction." JSupramol Struct 10,307-327.

152. Wieser R.J., Faust D., Dietrich C., Oesch F., 1999. "pl6INK4 mediates contact-inhibition of growth." Oncogene 18,277-281.

153. Yamamoto M., Ueno Y., Hayashi S., Fukushima Т., 2002. "The role of proteolysis in tumor invasiveness in glioblastoma and metastatic brain tumors." Anticancer Res. 22, 42654268.

154. Young J.S., 1959. "The invasive growth of malignant tumours: an experimental interpretation based on elastic-jelly models."./ Pathol. Bacteriol. 77,321-339.

155. Yuan В., Sun Z., 1997. "Transformation of rat hepatocytes in an in vitro primary culture by aflatoxin Bl." Zhongguo YiXue KeXue YuanXue Bao 19,6-10.

156. Zhan Q., Carrier F., Fornace A.J., 1993. "Induction of cellular p53 activity by DNA-damaging agents and growth arrest." Mol. Cell. Biol. 13,4242—4250.

157. Zhang H., Serrero G., 1998. "Inhibition of tumorigenicity of the teratoma PC cell line by transfection with antisense cDNA for PC cell-derived growth factor (PCDGF, epithelin/granulin precursor)Г Proc Natl Acad Sci USA 95,14202-14207.

158. Zindy F., van Deursen J., Grosveld G., Sherr C.J., Roussel M.F., 2000. "INK4ddeficient mice are fertile despite testicular atrophy." Mol. Cell. Biol. 20, 372-378.

159. Zutter M.M., Santoro S.A., Staatz W.D., Tsung Y.L., 1995. "Re-expression of the a2pl integrin abrogates the malignant phenotype of breast carcinoma cells." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 741 1-7415.t